Luận văn Sử dụng kỹ thuật fish để kiểm tra sự hội nhập của gen il – 6 phân lập từ người trong tế bào gốc phôi gà chuyển gen

g độ Fetal bovine serum 10% (v/v) Leukemia inhibitor factor 2000 U/ml Huyết thanh gà 1% (v/v) Non–essential amino acid 100 μM β–mercaptoethanol 100 μM Sodium pyruvate 1 mM Sodium bicarbonate 45 mM Penicillin 100 U/ml Streptomycin 100 μg/ml Opti–MEM® Thêm đến đủ lượng cần pha 2.2.2.2. Phương pháp chuyển gen vào tế bào gốc phôi gà  Khi tế bào sinh trưởng đạt khoảng 80–90% bề mặt đĩa nuôi cấy thì có thể tiến hành chuyển gen.  Lấy đĩa tế bào ra khỏi tủ nuôi cấy, vệ sinh đĩa bằng cồn 70o.  Loại bỏ môi trường nuôi cấy, rửa bằng PBS.  Thêm 0,5 ml Trypsin/EDTA 0,25% vào mỗi đĩa, ủ ở 37oC trong 5 phút.  Bất hoạt trypsin bằng 1 ml môi trường Opti–MEM® + 5% FBS.  Ly tâm ở 200 g trong 10 phút.  Loại bỏ dịch nổi, huyền phù hóa tế bào lắng đáy bằng 0,5 ml Opti–MEM®. Luận văn thạc sĩ khoa học 2013 Chương 2 – Phương pháp nghiên cứu Nguyễn Tiến Lung K20 Sinh học thực nghiệm 36  Đếm tế bào bằng buồng đếm hồng cầu, pha loãng bằng Opti–MEM® sao cho đạt nồng độ 0,5x106 tế bào/ml.  Chuyển huyền phù tế bào sang các ống ly tâm 15 ml (1 ml/ống).  Thêm 107 hạt virus vào mỗi ống (trung bình 20 virus/tế bào).  Ủ ở 37oC trong 15 phút.  Ly tâm 800 g trong 30 phút.  Loại bỏ hoàn toàn dịch nổi.  Huyền phù hóa tế bào lắng đáy bằng 2 ml môi trường nuôi cấy.  Chuyển huyền phù vào đĩa nuôi cấy 35 mm chứa sẵn lớp tế bào nuôi, nuôi ở tủ 37oC, 5% CO2.  Tiến hành thay môi trường sau 24 giờ kể từ khi chuyển gen bằng virus. Những ngày tiếp theo thay môi trường 2 ngày/lần. 2.2.2.3. Phương pháp cấy chuyển tế bào gốc phôi gà  Khi tế bào sinh trưởng đạt khoảng 80–90% bề mặt đĩa nuôi cấy thì có thể tiến hành cấy chuyển.  Lấy đĩa tế bào ra khỏi tủ nuôi cấy, vệ sinh đĩa bằng cồn 70o.  Loại bỏ môi trường nuôi cấy, rửa bằng PBS.  Thêm 0,5ml Trypsin/EDTA 0,25% vào mỗi đĩa nuôi cấy, ủ ở 37oC trong 5 phút.  Bất hoạt trypsin bằng 1 ml môi trường Opti–MEM® + 5% FBS.  Ly tâm ở 200 g trong 10 phút, loại bỏ dịch nổi.  Huyền phù hóa tế bào ở đáy bằng 4 ml môi trường nuôi cấy.  Chia đều huyền phù vào hai đĩa nuôi cấy mới chứa sẵn lớp tế bào nuôi, nuôi ở tủ 37oC, 5% CO2. 2.2.2.4. Phương pháp kiểm tra sự có mặt gen chuyển trong tế bào cESCs sau chuyển gen được phân tích PCR nhằm kiểm tra sự có mặt của gen chuyển trong tế bào. Cặp mồi IL6–F và IL6–R đã thiết kế ở trên được sử dụng để khuếch đại đoạn ADN 289 bp của gen IL–6. Cặp mồi khuếch đại đoạn ADN 321 bp Luận văn thạc sĩ khoa học 2013 Chương 2 – Phương pháp nghiên cứu Nguyễn Tiến Lung K20 Sinh học thực nghiệm 37 trong gen ribosome 18S (18S–For: GTC GGC GTC CAA CTT CTT; 18S–Rev: CGA TCC GAG GAC CTC ACT) cũng được sử dụng làm chứng nội. Các bước thực hiện như sau:  Thu tế bào cần phân tích, tách ADN hệ gen bằng bộ sản phẩm DNA Isolation Kit for Cells and Tissues (Roche) theo chỉ dẫn của nhà sản xuất.  Thành phần phản ứng PCR được trình bày trong Bảng 8. Bảng 8. Thành phẩn phản ứng PCR phát hiện gen chuyển trong tế bào Thành phần Nồng độ Nhân gen 18S Nhân gen IL–6 dATP, dTTP, dCTP, dGTP 0,25 mM 0,25 mM MgCl2 3 mM 3 mM 18S–For primer 0,5 mM 18S–Rev primer 0,5 mM IL6–F primer 0,5 mM IL6–R primer 0,5 mM Taq DNA polymerase 0,1 U/µl 0,1 U/µl PCR buffer 1 X 1 X Khuôn tổng hợp 2 ng/µl 2 ng/µl  Chu kỳ nhiệt: 94oC trong 7 phút trước chu kỳ đầu tiên 35 chu kỳ    biến tính 94 oC trong 30 giây gắn mồi ở nhiệt độ tối ưu trong 30 giây tổng hợp 72oC trong 30 giây 72oC trong 7 phút sau chu kỳ cuối cùng  Điện di sản phẩm PCR trên gel agarose 1,5% ở 100 V, 400 mA trong 40 phút. Luận văn thạc sĩ khoa học 2013 Chương 2 – Phương pháp nghiên cứu Nguyễn Tiến Lung K20 Sinh học thực nghiệm 38  Nhuộm bản gel điện di bằng Ethidium bromide 10 g/ml trong 10 phút, tráng nước rồi quan sát và chụp ảnh, phân tích kết quả. 2.2.3. Phương pháp lai huỳnh quang tại chỗ (FISH)  Chuẩn bị hóa chất:  Đệm SSC (Saline – sodium citrate buffer) 20X: Hòa tan 87,6 gam sodium chloride và 44,1 gam sodium citrate trong 450 ml nước cất, thêm nước đến đủ 500 ml, chuẩn pH bằng HCl cho đến khi đạt pH 7.  Đệm SSC 2X.  Dung dịch RNase nồng độ 100 µg/ml pha trong SSC 2X.  Ethanol lạnh ở các nồng độ 70%, 80%, 90%, 95%, 100%.  Hybridization Buffer: formamide 50% (v/v), SDS 0,1% (w/v), dextran sulfate 10% (w/v), đầu dò 5 ng/µl, ADN sợi đơn tinh trùng cá hồi 300 ng/ml, pha trong SSC 2X.  Wash Buffer: formamide 20% (v/v) pha trong SSC 0,1X.  Detection Buffer: Tween 20 nồng độ 0,2% (v/v) pha trong SSC 4X.  Blocking Buffer: BSA 5% (w/v) pha trong Detection Buffer.  Dung dịch HCl 10mM.  Pepsin 40 U/ml pha trong HCl 10 mM.  DAPI 2 µg/ml pha trong PBS.  Xử lý tế bào trước khi lai:  Thu tế bào bằng cách xử lý trypsin và ly tâm, huyền phù hóa trong PBS với nồng độ cuối cùng là 2x106 tế bào/ml.  Chuyển huyền phù tế bào lên lam kính đã xử lý ethanol (20 µl huyền phù/lam), trải đều tế bào lên diện tích khoảng 20x20 mm trên lam.  Định hình bằng dung dịch cố định (methanol và acetic acid với tỷ lệ tương ứng 3:1) trong 1 phút, để khô tự nhiên.  Ủ mẫu với 200µl dung dịch RNase 100 µg/ml trong 1 giờ ở 37oC. Luận văn thạc sĩ khoa học 2013 Chương 2 – Phương pháp nghiên cứu Nguyễn Tiến Lung K20 Sinh học thực nghiệm 39  Rửa hai lần qua SSC 2X, mỗi lần 5 phút.  Xả nhanh qua HCl 10 mM.  Ủ lam kính với 200 μl pepsin trong 10 phút ở 37oC.  Xả nhanh qua nước cất khử ion.  Loại nước bằng dãy nồng độ cồn 70%, 80%, 90%, 95% (mỗi lần 2 phút) và 100% (5 phút).  Để khô bằng cách đưa vào tủ ấm 60oC trong 60 phút, hoặc để qua đêm ở nhiệt độ phòng.  Tiến hành lai:  Biến tính Hybridization Buffer ở 70oC trong 10 phút, chuyển nhanh lên đá.  Chuyển 15µl dung dịch lai lên vị trí cần lai trên lam kính, đậy lamen nhựa, gắn keo để tránh bay hơi dung dịch.  Biến tính lam ở 70oC trong 5 phút.  Lai ở 65oC qua đêm, lắc trên máy lắc với tốc độ 50 vòng/phút.  Hạ dần nhiệt độ xuống 37oC, để ổn định mẫu ở 37oC trong 1 giờ.  Phát hiện  Rửa lam qua SSC 2X để loại bỏ lamen nhựa.  Rửa hai lần bằng Wash Buffer ở 40oC, mỗi lần 5 phút.  Rửa lần lượt qua SSC 0,1X và 2X ở 40oC, mỗi lần 10 phút.  Đưa lam kính về nhiệt độ phòng.  Cân bằng tiêu bản trong Detection Buffer với thời gian 5 phút.  Ủ lam với Blocking Buffer trong 20–30 phút.  Rửa lại bằng SSC 2X trong 5 phút.  Nhuộm DAPI trong 10 phút.  Rửa lại bằng cách xả từ từ qua PBS.  Gắn lamen và phân tích kết quả trên kính hiển vi huỳnh quang. Luận văn thạc sĩ khoa học 2013 Chương 3 – Kết quả và thảo luận Nguyễn Tiến Lung K20 Sinh học thực nghiệm 40 Chương 3 – KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. TỔNG HỢP ĐẦU DÒ HUỲNH QUANG BẰNG PHƯƠNG PHÁP PCR 3.1.1. Thiết kế cặp mồi nhân đoạn gen IL – 6 3.1.1.1. Kết quả thiết kế cặp mồi bằng chương trình Primer3 Nhằm tổng hợp và đánh dấu đầu dò cho phản ứng FISH, ba phương pháp thường được sử dụng là dịch chuyển điểm đứt (nick translation), kéo dài mồi ngẫu nhiên (random primed) và PCR. Phương pháp PCR được lựa chọn trong nghiên cứu này với những ưu điểm như độ đặc hiệu, độ nhạy cao hơn, hiệu suất tổng hợp lớn, đồng thời dễ dàng kiểm soát kích thước đầu dò [59]. Trong phản ứng PCR, mồi (primer) đóng vai trò quyết định, là nơi enzyme Taq polymerase bám và tổng hợp sợi ADN mới dựa trên trình tự mạch khuôn. Độ đặc hiệu của cặp mồi phụ thuộc vào nhiều yếu tố như kích thước, nhiệt độ tách mồi, thành phần nucleotide,... Kích thước mồi thường từ 18–30 nucleotide, có thể dài hơn hoặc ngắn hơn phụ thuộc vào độ dài đoạn gen đích. Tỷ lệ GC tối ưu của mồi thường được lựa chọn trong khoảng 50- 60% để đảm bảo sự liên kết bền vững với ADN khuôn. Nhiệt độ biến tính (melting temperature – Tm) thể hiện độ bền cấu trúc sợi đôi giữa mồi và ADN đích, có giá trị tối ưu trong khoảng 52–58oC, tỷ lệ thuận với thành phần GC. Mồi được lựa chọn cũng cần đảm bảo không tạo thành cấu trúc bậc hai (tự cuộn gấp), không tự bắt cặp cũng như không bắt cặp với mồi khác (dimer hóa), không lặp lại các base cùng loại nhiều hơn ba lần liên tiếp. Khoảng cách giữa hai mồi trên chuỗi đích (độ dài đoạn được khuếch đại) tương đối ngắn, thường không vượt quá 2kb [11, 17]. Chúng tôi tiến hành thiết kế cặp mồi đặc hiệu với cADN của gen IL–6 người sử dụng chương trình Primer3 – một trong những chương trình thiết kế mồi tương đối dễ sử dụng và tốt nhất hiện nay [11]. Độ dài đoạn khuếch đại được giới hạn trong khoảng 300 bp để đánh dấu huỳnh quang với cường độ đủ phát hiện dưới kính hiển vi quang học. Các yếu tố ảnh hưởng đến tính đặc hiệu của phản ứng PCR như đã nêu trên đều được xem xét đến. Kết quả đã thu được năm cặp mồi có thể được sử dụng để tổng hợp đầu dò được trình bày trong Bảng 9. Cặp mồi thứ nhất (có chất Luận văn thạc sĩ khoa học 2013 Chương 3 – Kết quả và thảo luận Nguyễn Tiến Lung K20 Sinh học thực nghiệm 41 lượng tốt nhất theo đánh giá của chương trình Primer3) được lựa chọn để tiếp tục nghiên cứu. Bảng 9. Kết quả thiết kế cặp mồi sử dụng chương trình Primer3 STT Trình tự Tm (oC) % GC Vị trí bắt cặp Kích thước sản phẩm 1 F: TGC TCC TGG TGT TG 46,2 57,1 53–67 289 R: TTC ACC AGG CAA GT 44,6 50,0 327–341 2 F: CTG CTC CTG GTG TTG 48,1 60,0 52–67 290 R: TTC ACC AGG CAA GT 44,6 50,0 327–341 3 F: GCT CCT GGT GTT GC 48,1 64,3 54–68 288 R: TTC ACC AGG CAA GT 44,6 50,0 327–341 4 F: GCT GCT CCT GGT GT 47,4 64,3 51–65 291 R: TTC ACC AGG CAA GT 44,6 50,0 327–341 5 F: CTC CTT CTC CAC AAG C 48,9 56,2 6–22 336 R: TTC ACC AGG CAA GT 44,6 50,0 327–341 3.1.1.2. Kết quả kiểm tra độ đặc hiệu mồi  Kiểm tra độ đặc hiệu với cADN của gen IL–6 Chúng tôi sử dụng công cụ Nucleotide – BLAST (BLASTn) để đánh giá độ đặc hiệu (về lý thuyết) của cặp mồi được lựa chọn. Công cụ này cho phép tìm kiếm các chuỗi ADN gần giống nhất với trình tự mà người dùng chỉ định. Trình tự được chỉ định có nguồn gốc từ hệ gen người (Homo sapiens), thông tin mARN thể hiện cặp mồi kiểm tra được thiết kế dựa trên trình tự cADN của gen IL–6. “Score” là số điểm tương đồng giữa hai trình tự so sánh và “Expect” thể hiện số lượng các trình tự khác tương đồng với mồi được kiểm tra. Hai thông số này thường được quan tâm khi kiểm tra cặp mồi khuếch đại trình tự trong hệ gen: nếu “Score” càng cao và “Expect” càng thấp thì mức độ đặc hiệu càng cao. Trong nghiên cứu của chúng tôi, hai giá trị này không có ý nghĩa đánh giá vì cặp mồi được Luận văn thạc sĩ khoa học 2013 Chương 3 – Kết quả và thảo luận Nguyễn Tiến Lung K20 Sinh học thực nghiệm 42 sử dụng cho gen chuyển IL–6 người trong tế bào gà. Cả hai mồi đều cho mức độ tương đồng đạt 100% (Identities = 14/14), trong đó mồi IL6–F cùng chiều (Strand = Plus/Plus) còn mồi IL6–R ngược chiều (Strand = Plus/Minus) với trình tự mARN (Hình 10). Hình 10. Kết quả kiểm tra độ đặc hiệu của cặp mồi với cADN của gen IL–6 Thông tin về vị trí liên kết của mồi với trình tự chỉ định cho thấy vị trí bắt cặp của các mồi IL6–F và IL6–R với mARN lần lượt là 169–182 và 444–457 trên phân tử mARN. Mặt khác, cADN bắt cặp ở vị trí 117–755 của mARN (Hình 11). Từ đây, có thể xác định được vị trí bắt cặp của cặp mồi với cADN tương ứng là 53– 67 (IL6–F) và 327–341 (IL6–R). Kết quả kiểm tra hoàn toàn phù hợp với dự tính khi thiết kế bằng Primer3. Như vậy cặp mồi được thiết kế có độ đặc hiệu và độ nhạy cao với gen chuyển IL–6. Với cặp mồi này, đoạn đầu dò tổng hợp được có trình tự như sau: 1– 51– 101– 151– 201– 251– TGCTCCTGGT GTTGCCTGCT GCCTTCCCTG CCCCAGTACC CCCAGGAGAA GATTCCAAAG ATGTAGCCGC CCCACACAGA CAGCCACTCA CCTCTTCAGA ACGAATTGAC AAACAAATTC GGTACATCCT CGACGGCATC TCAGCCCTGA GAAAGGAGAC ATGTAACAAG AGTAACATGT GTGAAAGCAG CAAAGAGGCA CTGGCAGAAA ACAACCTGAA CCTTCCAAAG ATGGCTGAAA AAGATGGATG CTTCCAATCT GGATTCAATG AGGAGACTTG CCTGGTGAA –289 – 50 –100 –150 –200 –250 Luận văn thạc sĩ khoa học 2013 Chương 3 – Kết quả và thảo luận Nguyễn Tiến Lung K20 Sinh học thực nghiệm 43 Hình 11. Kết quả xác định vị trí tương đồng giữa cADN và mARN gen IL–6 cADN bắt cặp ở vị trí 117–755 của mARN. Các mồi IL6–F và IL6–R bắt cặp ở các vị trí 169–182 và 444–457 trên phân tử mARN, tương ứng với các vị trí 53–67 và 327–341 của phân tử cADN.  Kiểm tra khả năng bắt cặp của trình tự đầu dò (theo lý thuyết) với vector chuyển gen Trong nghiên cứu này, gen IL–6 người được chuyển nhiễm vào tế bào gốc phôi gà thông qua vector pLenti6/V5–DEST (Gateway). Khi vector được đưa vào Luận văn thạc sĩ khoa học 2013 Chương 3 – Kết quả và thảo luận Nguyễn Tiến Lung K20 Sinh học thực nghiệm 44 trong tế bào và hoạt động, toàn bộ phân đoạn ADN nằm giữa 2 trình tự LTR được chèn vào nhiễm sắc thể tế bào đích. Vì vậy, đầu dò được tổng hợp phải bắt cặp với vector tại vị trí duy nhất nằm trong gen IL–6 để đảm bảo tính đặc hiệu trong phản ứng lai FISH. Hình 12. Kết quả kiểm tra vị trí chèn của gen IL–6 trên vector Vector mang gen chuyển có kích thước 7722 nucleotide. Trình tự cADN được kiểm tra với trình tự vector để xác định vị trí cài nhập của gen vào vector bằng công cụ BLASTn, kết quả cho thấy gen IL–6 được chèn ở vị trí 2485 – 3123 của vector (Hình 12). Kết quả kiểm tra khả năng bắt cặp của đầu dò (tổng hợp từ cặp Luận văn thạc sĩ khoa học 2013 Chương 3 – Kết quả và thảo luận Nguyễn Tiến Lung K20 Sinh học thực nghiệm 45 mồi đã thiết kế) với vector chuyển gen chứng minh đầu dò bắt cặp vector ở vị trí duy nhất 2537–2835 của vector (Hình 13). Như vậy đoạn đầu dò chỉ tương đồng với trình tự gen chuyển mà không có khả năng bắt cặp với bất kỳ trình tự nào khác trên vector. Hình 13. Kết quả kiểm tra vị trí bắt cặp của đầu dò trên vector Đầu dò bắt cặp vector ở vị trí duy nhất 2537–2835 trên vector chuyển gen, nằm trong gen chuyển IL–6 (2485 – 3123 của vector).  Kiểm tra khả năng bắt cặp của đầu dò với hệ gen tế bào gà Phản ứng lai huỳnh quang sử dụng đầu dò được thực hiện với tế bào gốc phôi gà (chicken Embryonic Stem Cells – cESCs), vì vậy để đảm bảo tính đặc hiệu thì yêu cầu với đầu dò là không bắt cặp với hệ gen gà. Kết quả kiểm tra bằng BLASTn cho thấy đầu dò được tổng hợp từ cặp mồi lựa chọn đáp ứng được yêu cầu đó (Hình 14). Những kết quả về mặt lý thuyết ở trên đã cho thấy cặp mồi được lựa chọn hoàn toàn phù hợp cho mục đích phát hiện gen chuyển IL–6 người trong hệ gen gà. Cặp mồi đều có kích thước 14 bp, đặc hiệu với cADN của gen, đoạn ADN được khuếch đại dài 289 bp, bắt cặp với vector tại vị trí duy nhất nằm trong gen chuyển Luận văn thạc sĩ khoa học 2013 Chương 3 – Kết quả và thảo luận Nguyễn Tiến Lung K20 Sinh học thực nghiệm 46 và không tương đồng với hệ gen gà. Cặp mồi này được đặt tổng hợp tại hãng Intergrated DNA Technologies (IDT – Hàn Quốc) để phục vụ cho những nghiên cứu tiếp theo. Hình 14. Kết quả kiểm tra khả năng bắt cặp giữa đầu dò với hệ gen gà bằng BLASTn 3.1.2. Tối ưu hóa điều kiện phản ứng PCR Trong nghiên cứu này, hai thông số được tối ưu hóa là nhiệt độ bắt cặp mồi và nồng độ ion Mg2+. Nhiệt độ bắt cặp mồi (Annealing template – Ta) là nhiệt độ cho phép mồi bắt cặp bổ sung với mạch khuôn, thường lớn hơn nhiệt độ biến tính mồi (Tm) khoảng 5 – 10oC. Cặp mồi được thiết kế có Tm = 44,6–46,2oC nên chúng tôi tiến hành thử nghiệm với các giá trị Ta trong khoảng 45oC – 55oC. Thông số được tối ưu hóa thứ hai là nồng độ Mg2+, có ảnh hưởng đến hoạt tính enzyme Taq DNA polymerase, từ đó ảnh hưởng đến độ đặc hiệu của phản ứng. Nồng độ Mg2+ cao làm tăng độ đặc hiệu nhưng lại làm giảm hiệu suất phản ứng, trong khi giá trị này thấp làm tăng sản phẩm không đặc hiệu. Chúng tôi tiến hành thử nghiệm trên khoảng nồng độ Mg2+ từ 1,00 – 4,00 mM (các phản ứng PCR thường sử dụng trong khoảng này).  Đánh giá hiệu suất phản ứng PCR Các mẫu sản phẩm PCR được định lượng ADN khuếch đại bằng máy đo Biophotometer Plus (Eppendorf). Kết quả phân tích thể hiện trên Hình 15 (xem Luận văn thạc sĩ khoa học 2013 Chương 3 – Kết quả và thảo luận Nguyễn Tiến Lung K20 Sinh học thực nghiệm 47 thêm Phụ lục 1). Khi nồng độ Mg2+ tăng dần (1,00–3,25 mM), lượng sản phẩm được khuếch đại càng nhiều, nhưng khi nồng độ Mg2+ lên quá cao (4,00 mM) thì phản ứng PCR bị ức chế, lượng sản phẩm thu được ít hơn. Nhiệt độ gắn mồi Ta = 49,3oC cho kết quả khuếch đại ADN tốt nhất trong các nhiệt độ được thử nghiệm. Trong tất cả các mẫu sản phẩm PCR, mẫu được tổng hợp với nồng độ Mg2+ 3,25 mM và Ta = 49,3oC có hàm lượng ADN cao nhất (1.445 ± 253 ng/μl). Hình 15. Biểu đồ ảnh hưởng của nhiệt độ gắn mồi và nồng độ ion Mg2+ tới hiệu suất phản ứng PCR Thanh sai số thể hiện độ lệch chuẩn. Mẫu được tổng hợp ở điều kiện Ta = 49,3oC, Mg2+ 3,25 mM có hàm lượng ADN lớn nhất (1.445 ± 253 ng/μl).  Đánh giá độ chính xác trình tự của sản phẩm PCR Ngoài việc thu được lượng sản phẩm lớn, yêu cầu quan trọng trong việc tổng hợp đầu dò là đoạn được khuếch đại phải đảm bảo có trình tự chính xác. Vì vậy chúng tôi thu một số mẫu sản phẩm PCR có hàm lượng ADN được khuếch đại khác nhau để tiến hành giải trình tự nucleotide: nồng độ Mg2+ 1,75 mM và 3,25 mM, mỗi nồng độ đó chọn hai mẫu với Ta có giá trị 45,9oC và 49,3oC. Kết quả được phân tích bằng chương trình BioEdit và so sánh với trình tự gốc sử dụng chương trình Ape plasmid editor – APE. Luận văn thạc sĩ khoa học 2013 Chương 3 – Kết quả và thảo luận Nguyễn Tiến Lung K20 Sinh học thực nghiệm 48 Kết quả giải trình tự nucleotide cho thấy các sản phẩm PCR đều có trình tự tương đồng cao với trình tự đầu dò theo lý thuyết. Mặc dù vậy, các mẫu đó cho mức độ tín hiệu khác nhau khá rõ rệt: sản phẩm tổng hợp ở nồng độ Mg2+ 3,25 mM, Ta = 49,3oC cho tín hiệu rõ nét nhất, độ nhiễu thấp; các mẫu còn lại có độ nhiễu cao hơn hoặc tín hiệu không rõ bằng, trong đó sản phẩm tổng hợp ở nồng độ Mg2+ 3,25 mM, Ta = 49,3oC (Hình 16, xem thêm Phụ lục 2). Hình 16. Kết quả giải trình tự nucleotide các sản phẩm PCR và so sánh với trình tự đầu dò theo lý thuyết (A) Kết quả giải trình tự nucleotide các mẫu sản phẩm PCR ở một số điều kiện tổng hợp khác nhau; (B) Kết quả so sánh các trình tự đó với trình tự đầu dò theo lý thuyết. Luận văn thạc sĩ khoa học 2013 Chương 3 – Kết quả và thảo luận Nguyễn Tiến Lung K20 Sinh học thực nghiệm 49 Từ những phân tích trên, kết hợp kết quả tối ưu hóa điều kiện phản ứng PCR, chúng tôi xác định nhiệt độ gắn mồi 49,3oC và nồng độ Mg2+ 3,25 mM là điều kiện tốt nhất cho phản ứng khuếch đại với cặp mồi đã thiết kế. Sản phẩm PCR thu được có hàm lượng ADN cao, trình tự nucleotide chính xác so với trình tự khuôn mẫu, đáp ứng được yêu cầu làm đầu dò cho phản ứng lai FISH. 3.1.3. Kết quả tổng hợp đầu dò bằng phản ứng PCR Đầu dò được tổng hợp bằng phương pháp PCR trong đó thành phần phản ứng được bổ sung thêm Alexa Fluor® 568–5–dUTP (phát huỳnh quang màu đỏ) sao cho tỷ lệ dUTP : dTTP = 2:1. Trong phản ứng PCR, giai đoạn tổng hợp ở 72oC được cài đặt diễn ra trong 60 giây ở chu kỳ đầu tiên và tăng thêm 2 giây sau mỗi chu kỳ để tăng hiệu quả gắn dUTP (mang cấu trúc Alexa Fluor® 568 khá cồng kềnh). Sản phẩm sau khi điện di được quan sát dưới máy soi gel Cleaver UV Transilluminator mà không nhuộm Ethidium bromide, kết quả thể hiện ở Hình 17. Hình 17. Kết quả điện di sản phẩm PCR tổng hợp đầu dò (–) Đối chứng âm; (1),(3) khuôn tổng hợp là vector chuyển gen; (2) khuôn tổng hợp là ADN hệ gen gà. Sản phẩm chạy ở giếng (3) được tổng hợp với dNTP bổ sung Alexa Fluor® 568–5–dUTP và không nhuộm Ethidium bromide trước khi điện di. Kết quả điện di cho thấy chỉ có một băng duy nhất với kích thước 289 bp (xấp xỉ băng 300 bp của thang chuẩn) được khuếch đại khi sử dụng khuôn là vector Luận văn thạc sĩ khoa học 2013 Chương 3 – Kết quả và thảo luận Nguyễn Tiến Lung K20 Sinh học thực nghiệm 50 pLenti6/V5–DEST đã chèn gen IL–6 (giếng 1), ngoài ra không phát hiện được bất kỳ băng nào khác khi sử dụng khuôn là ADN hệ gen gà (giếng 2). Kết quả này chỉ ra tính đặc hiệu của cặp mồi được chúng tôi thiết kế. Bên cạnh đó, mẫu tổng hợp sử dụng Alexa Fluor® 568–5–dUTP thu được băng duy nhất có kích thước tương đương và độ sáng đủ quan sát bằng mắt thường mà không thông qua các thuốc nhuộm đặc hiệu (giếng 3), chứng tỏ sản phẩm đã được đánh dấu với cường độ huỳnh quang tương đối lớn (Hình 17). Sản phẩm này sau đó được tinh sạch bằng Kit Wizard® SV Gel & PCR Clean–Up System (Promega) để chuẩn bị cho những nghiên cứu tiếp theo. 3.2. THU NHẬN TẾ BÀO GỐC PHÔI GÀ CHUYỂN GEN IL–6 NGƯỜI 3.2.1. Phân lập và nhân nuôi tế bào gốc phôi gà Động lực chính thúc đẩy việc phân lập và nuôi cấy cESCs là hy vọng rằng chúng có thể được sử dụng để tạo ra gia cầm chuyển gen nhằm tận dụng ưu thế của việc tạo lượng lớn protein albumin trong lòng trắng trứng. Năm 1970, Marzullo là người đầu tiên chuyển cESCs tới đĩa phôi khác và chỉ ra rằng sau 14 ngày ấp, một số tế bào đã hợp nhất vào phôi nhận. Hai thập kỷ sau, Petitte và cộng sự đã chứng minh rằng kỹ thuật đó có thể được sử dụng nhằm tạo ra các cơ thể khảm dòng sinh dục [68]. Chúng tôi tiến hành phân lập cESCs từ đĩa phôi giai đoạn X (0 giờ ấp) theo phương pháp của Horiuchi và cộng sự [32] (ở giai đoạn này phôi chứa khoảng 40.000–60.000 tế bào, đây là những tế bào gốc đa tiềm năng). Tế bào sau khi phân lập được huyền phù hóa bằng môi trường nuôi cấy và chuyển vào các đĩa nuôi cấy đường kính 35 mm đã phủ gelatin (khoảng 0,3 x 106 tế bào/đĩa), duy trì trong tủ ấm 37oC, 5% CO2, độ ẩm 90%. Sau 24 giờ nuôi cấy, cESCs đã bám dính tốt vào đáy đĩa nuôi cấy và kết hợp với nhau thành quần lạc ESC với những đặc điểm hình thái đặc trưng: tế bào tròn, nhân lớn, chiếm hầu hết tế bào chất, các tế bào liên kết không chặt chẽ với nhau. cESCs lúc này là tập hợp của ba loại tế bào có kích thước khác Luận văn thạc sĩ khoa học 2013 Chương 3 – Kết quả và thảo luận Nguyễn Tiến Lung K20 Sinh học thực nghiệm 51 nhau: lớn, trung bình và nhỏ (Hình 18). Những đặc điểm này tương đồng với các công bố trước đây về cESCs nhân nuôi in vitro [64, 69, 88]. Hình 18. cESCs 24 giờ nuôi cấy in vitro sau khi phân lập Trong những điều kiện nuôi cấy cụ thể, bổ sung các yếu tố tăng trưởng (Bảng 7) cũng như có sự góp mặt của lớp tế bào nuôi, cESCs có khả năng duy trì in vitro trong thời gian dài mà vẫn giữ được đặc điểm đa tiềm năng [45, 64]. Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng nguyên bào sợi thai chuột (đã bị bất hoạt phân bào bằng Mitomycin C 10 μg/ml) để nuôi cấy cESCs. Những nghiên cứu trước đây trên thế giới cũng như tại phòng thí nghiệm của chúng tôi đã chứng minh loại tế bào này có khả năng hỗ trợ ESCs tốt nhất [1, 24, 69]. Khi đó cESCs có xu hướng xâm lấn xuống dưới lớp tế bào nuôi và bám trực tiếp vào bề mặt đĩa nuôi cấy (Hình 19), điểm này khá tương đồng với kết quả nghiên cứu trước đây của Pettite và cộng sự [69]. Hiện tại chúng tôi đã duy trì được cESCs qua 28 ngày nuôi cấy với ba lần cấy chuyển mà vẫn giữ được những đặc điểm của tế bào gốc phôi. Việc duy trì cESCs in vitro trong thời gian dài mà vẫn giữ được trạng thái đa tiềm năng có ý nghĩa lớn trong việc hình thành cơ thể khảm khi tiêm chúng vào phôi nhận, tiền đề cho việc tạo gà chuyển gen thông qua tế bào gốc. Luận văn thạc sĩ khoa học 2013 Chương 3 – Kết quả và thảo luận Nguyễn Tiến Lung K20 Sinh học thực nghiệm 52 Hình 19. cESCs nuôi cấy trên lớp tế bào nuôi (A) Nguyên bào sợi thai chuột đã bất hoạt phân bào trước khi được sử dụng làm tế bào nuôi; (B) Quần lạc cESCs ở lần cấy chuyển thứ hai (F2) sinh trưởng trên lớp tế bào nuôi. 3.2.2. Thu nhận và duy trì tế bào gốc phôi gà chuyển gen Trong nghiên cứu này, vector có nguồn gốc lentivirus là pLenti6/V5–DEST (Gateway) đã chèn gen IL–6 người được lựa chọn sử dụng. Khi tế bào sinh trưởng có độ che phủ trên 90% diện tích bề mặt đĩa nuôi cấy thì được thu nhận để thực hiện chuyển gen. Những tế bào này được phân tách bằng trypsin và thu nhận bằng ly tâm, sau đó được ủ cùng các hạt virus (trung bình 20 virus/tế bào). Tế bào sau Luận văn thạc sĩ khoa học 2013 Chương 3 – Kết quả và thảo luận Nguyễn Tiến Lung K20 Sinh học thực nghiệm 53 chuyển gen được cấy vào đĩa nuôi cấy đường kính 35 mm (có sẵn lớp tế bào) với mật độ 0,5x106 tế bào/đĩa, nuôi bằng môi trường nuôi cấy tương ứng trong tủ ấm 37oC, 5% CO2, độ ẩm 90%. Ngoài ra, một đĩa tế bào không qua xử lý lentivirus được nuôi cấy song song làm đối chứng nhằm đánh giá ảnh hưởng của lentivirus tới cESCs. Cả hai đĩa tế bào đều được quan sát hằng ngày và so sánh dưới kính hiển vi soi ngược. Kết quả đánh giá cho thấy: tế bào được xử lý cùng virus cũng như đối chứng vẫn phát triển bình thường, không xuất hiện các tế bào chết nổi trên bề mặt, cESCs vẫn giữ được những đặc điểm hình thái của tế bào gốc đa tiềm năng (Hình 20). Kết quả này bước đầu chứng minh được vector lentivirus hầu như không ảnh hưởng tới sự sinh trưởng của cESCs. Tuy nhiên để có kết luận chính xác cần những nghiên cứu sâu hơn nữa. Hiện nay chúng tôi đã t