Luận văn Sử dụng phương pháp quang phổ phát hiện độc tố aflatoxin trong thực phẩm

nhất (chiếm khoảng 17% lượng aflatoxin của cơ thể) tiếp theo là ở thận, cơ, mô mỡ, tụy, lách... Trong vòng 24 giờ có khoảng 80% bị đào thải theo đường tiêu hóa qua mật, đường tiết niệu qua thận và đáng chú ý nó còn bài tiết qua tuyến sữa gây bệnh cho thai nhi đang bú sữa mẹ. Cho đến nay, các luận chứng khoa học công nhận khả năng tác động lên tế bào gan của aflatoxin qua 5 giai đoạn sau: - Ức chế các men polymerase mà chúng có vai trò tổng hợp DNA và RNA. - Làm chậm hoặc ngừng hẳn sự tổng hợp DNA. - Ngăn cản cơ chế sinh tổng hợp RNA truyền tin. - Biến đổi hình dạng nhân tế bào. - Hạn chế quá trình sinh tổng hợp protein. Hậu quả là gây ung thư biểu mô tế bào gan. Như vậy, aflatoxin có khả năng gây độc cấp tính và mãn tính ở người và động vật, nghiêm trọng nhất và nguy hiểm nhất là khả năng gây ung thư gan và xơ gan. Do vậy vấn đề bảo quản lương thực thực phẩm, an toàn lương thực thực phẩm, không sử dụng các thực phẩm đã bị hỏng, bị nấm mốc là một vấn đề hết sức quan trọng có ý nghĩa trong việc hạn chế tần suất xuất hiện bệnh ung thư gan nguyên phát. 17 1.2: CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÁT HIỆN AFLATOXIN 1.2.1: Phương pháp sử dụng kít thử nhanh độc tố nấm mốc aflatoxin Cơ sở để kiểm tra là dựa trên sự miễn dịch trên que thử. Trên que thử có chứa kháng nguyên- kháng thể (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) (ELISA) [19]. Kháng thể đặc hiệu chống lại độc tố aflatoxin và nhận ra aflatoxin trong các phân tử trong mẫu. Kết quả được đánh giá và đọc nhanh bằng hiển thị màu sắc trên kit thử. Phương pháp này đơn giản dễ sử dụng, tuy nhiên độ nhạy còn hạn chế và thường phải kết hợp với các phương pháp khác để phân tích. 1.2.2: Phương pháp sử dụng sắc ký kết hợp phổ khối Đây là phương pháp có độ chính xác rất cao cho phép phân tích rất nhiều chất [17], [23], [25]. Các phương pháp như sắc ký khí, sắc ký lỏng, sắc ký lỏng hiệu năng cao kết hợp phổ khối đều đáp ứng được yêu cầu và được các cơ quan thẩm quyền của các nước nhập khẩu chấp nhận. Tuy nhiên những phương pháp này đòi hỏi đầu tư, chi phí cao về thiết bị, chi phí vận hành, kỹ năng và trình độ của kỹ thuật viên. Do vậy nó không phù hợp cho các phòng kiểm nghiệm qui mô nhỏ hay những phòng kiểm nghiệm của địa phương. 1.2.2.1: Phương pháp sắc ký lớp mỏng (Thin layer chromatography – TLC) Phương pháp sắc ký lớp mỏng được sử dụng rộng rãi để xác định hàm lượng aflatoxin đầu tiên vào những năm 1960. Là một kỹ thuật sắc ký được dùng để tách các chất trong hỗn hợp. Phương pháp sắc ký lớp mỏng bao gồm pha tĩnh là một lớp mỏng các chất hấp thụ, thường là silicagel, aluminium oxide được phủ trên một mặt phẳng chất trơ. Pha động bao gồm dung dịch cần phân tích được hòa tan trong dung môi thích hợp và được hút lên bản sắc ký bởi mao dẫn, tách dung dịch thí nghiệm dựa trên tính phân cực của các thành phần trong dung dịch. Dung môi sử dụng cho dung dịch chạy bản mỏng là cloroform: methnol và clroform: aceton. Việc thêm nước vào hệ thống dung môi sẽ làm tăng khả năng hòa tan aflatoxin. 18 Một vệt nhỏ dung dịch chứa mẫu thử được thấm lên bản sắc ký, khoảng 1cm từ dưới lên. Bản sắc ký sau đó được nhúng vào một dung môi thích hợp, như methanol hoặc nước, và được đặt vào một vật chứa có nắp. Dung môi di chuyển lên bản sắc ký bởi mao dẫn, gặp phải mẫu thử và dịch chuyển mẫu thử lên bản sắc ký. Các hợp chất khác nhau trong hỗn hợp mẫu thử dịch chuyển với tốc độ khác nhau do chúng có sức hút khác nhau đối với pha tĩnh và độ tan khác nhau trong dung môi. Các hợp chất được tách ra dựa trên sự cạnh tranh của chất tan và pha động để có chỗ liên kết với pha tĩnh. Nhược điểm của phương pháp là phụ thuộc vào người phân tích. Khi làm sắc ký một số hợp chất có thể tương tự aflatoxin. 1.2.2.2: Phương pháp sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao (high ferformane thin layer chromatography – HPTLC) Do những khuyết điểm trong phương pháp sắc ký lớp mỏng đơn thuần ở các khâu như chiết tách mẫu phân tích, chạy mẫu trong dung môi. Phương pháp HPTLC có tính thuyết phục cao hơn ở 3 khía cạnh sau: Đưa mẫu lên bản mỏng một các tự động, cải thiện được sự đồng nhất cả lớp hấp thụ, chạy ban mỏng trong dung môi có kiểm soát. Quá trình đưa mẫu vào bản mỏng được tự động hóa, do đó các vết được định đúng vị trí và đo lường độ huỳnh quang của vết cũng bằng máy densitimetess. Thể tích mẫu được dùng trong HPTLC có thể bằng 1 l (so với 5 – 10 l mẫu trong phương pháp TLC) như vậy sẽ làm giảm đi rất nhiều diện tích của vết (1mm). Nồng độ chất chuẩn có thể cần 5pg trong phân tích bằng HPTLC, do đó có thể xácđịnh tới 30pg aflatoxin. Sử dụng kỹ thuật HPTLC làm tăng tính thuyết phục của phương pháp TLC như một phương pháp định lượng aflatoxin có hiệu quả nhất. 19 1.2.2.3: Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (high ferformane liquid chromatography – HPLC) Hệ thống phân tích high ferformane tự động HPLC là hệ thống phân tích đắt tiền, chọn lọc dùng định lượng aflatoxin. Phương pháp HPLC sử dụng cả hai pha: Pha bình thường và pha phản. Hệ thống này dựa trên sự hấp thụ tia tím (uv) và xác định cường độ huỳnh quang. Mẫu phân tích được tách bằng chloroform: Nước. Ly tâm chất tác dụng làm sạch qua silicagel pha bình thường sử dụng cột nhối silicagel 0,5 m và pha động sử dụng benzen: acetonitrit: acid formic. Giới hạn xác định là 0,5 kgm / . Husst (1984) đã sử dụng pha phản kết hợp với TFA đồng phân để xác định được các aflatoxin B1, B2,G1, G2 ở nồng độ 5pg. Davis (1980) cũng sử dụng pha phản để xác định huỳnh quang của đồng phân iot của aflatoxin B1. Kết quả dẫn đến việc phát triển phương pháp đồng phân cột. 1.3: PHƯƠNG PHÁP QUANG PHỔ PHÁT HIỆN AFLATOXIN Là phương pháp dựa trên đặc trưng vật lý của Aflatoxin như phổ hấp thụ, huỳnh quang, hấp thụ hồng ngoại [9], [10], [13], [15]. Phương pháp này cho phép phát hiện nồng độ tương đối cao, có thể tới ppM, trong khi đó vận hành lại tương đối đơn giản và thời gian thực hiện nhanh. Gần đây phương pháp truyền năng lượng cộng hưởng huỳnh quang (FRET) được sử dụng nhiều để xác định các độc tố có hàm lượng thấp bằng cách đưa vào mẫu thử chất huỳnh quang tương thích với chất cần phát hiện. Khi có mặt của chất độc, tính chất huỳnh quang sẽ thay đổi. Dựa vào sự thay đổi này người ta sẽ xác định được hàm lượng chất cần phát hiện. 20 1.3.1: Khái niệm hiện tượng truyền năng lượng cộng hưởng huỳnh quang (FRET) Hiệu ứng truyền năng lượng cộng hưởng huỳnh quang (Fluorescence Resonance Energy Transfer - FRET ) là một cơ chế truyền năng lượng xảy ra ở cấp độ nano thông qua tương tác lưỡng cực – lưỡng cực, đây là một hiện tượng vật lý quan trọng với nhiều lĩnh vực tiềm năng như lĩnh vực quang điện tử và rất nhiều lĩnh vực khác. FRET được đưa ra từ thập kỷ 50 của thế kỷ trước, hiện nay đang được ứng dụng rộng rãi trên nhiều lĩnh vực đặc biết trong nghiên cứu y sinh học [4], [15]. FRET là hiệu ứng phụ thuộc vào khoảng cách truyền năng lượng từ một chất cho huỳnh quang (donor) tới một chất nhận huỳnh quang (acceptor) phù hợp, là một trong số ít các công cụ có sẵn để đo khoảng cách nanomet và xác định những thay đổi trong khoảng cách cả trong in vitro lẫn trong cơ thể. Do có độ nhạy với khoảng cách cao, nên hiệu ứng FRET đã được sử dụng để nghiên cứu động học, tương tác nguyên tử. [3], [20], [24]. Cơ chế truyền năng lượng cộng hưởng huỳnh quang liên quan đến các chất phát huỳnh quang mà ở đây là điện tử ở trạng thái kích thích (donor), một phân tử huỳnh quang có thể truyền năng lượng kích thích của nó cho một phân tử huỳnh quang khác (acceptor) không phát xạ gần đó thông qua các tương tác lưỡng cực – lưỡng cực tầm xa. Lý thuyết truyền năng lượng được dựa trên khái niệm về một chất huỳnh quang kích thích như một dao động lưỡng cực có thể trải qua sự trao đổi năng lượng với một lưỡng cực thứ hai có tần số cộng hưởng tương tự. Vấn đề này, truyền năng lượng cộng hưởng tương tự như sự dao động cùng tần số. Ngược lại, năng lượng bức xạ yêu cầu phát xạ và tái hấp thụ một photon phụ thuộc vào kích thước vật lý và tính chất quang học của donor – acceptor, cũng như hình dạng của bề mặt và khoảng cách của donor – acceptor. Không giống như các cơ chế bức xạ, truyền năng lượng cộng hưởng có thể mang lại một lượng đáng kể thông tin về cấu trúc liên quan đến các phân tử donor – acceptor [5], [20], [24]. Một cặp phân tử tương tác với nhau thông qua hiệu ứng FRET được gọi là một cặp donor – acceptor. Hiện tượng FRET không qua trung gian là quá 21 trình phát xạ photon. Ngoài ra, nó thậm chí không yêu cầu chất màu nhận được phát huỳnh quang. Mặc dù trong hầu hết các ứng dụng, các donor và acceptor đều có khả năng phát huỳnh quang [3], [14]. Một cặp nguyên tử tạo ra một điện trường do sự tương tác lưỡng cực. Đầu tiên phân tử donor hấp thụ ánh sáng kích, các điện tử chuyển từ trạng thái cơ bản lên trạng thái kích thích. Nếu không có mặt của phân tử acceptor, phân tử donor có thể phát huỳnh quang và quay trở lại trạng thái cơ bản. Khi có mặt phân tử acceptor một phần năng lượng ở trạng thái kích thích được truyền cho lượng cho phân tử acceptor gần nhất có trạng thái năng lượng kích thích thấp nhất qua sự trao đổi của một photon ảo. Phân tử donor trở về trạng thái cơ bản còn phân tử acceptor chuyển lên trạng thái kích thích [19], [22], [24]. Như vậy phân tử acceptor được kích thích nhờ vào quá trình gián tiếp nhận photon ảo, mặt khác đây cũng là hiện tượng xảy ra rất tự nhiên [5]. FRET là một hiện tượng tự nhiên đầy lý thú bởi vì nó không phụ thuộc vào sự tiếp xúc vật lý cũng như truyền điện tử. Hình 1.6. Mô hình hiệu ứng FRET r FRET Hấp thụ chấp nhận Donor Accepter Huỳnh quang chất cho Phát xạ Hấp thụ 22 1.3.2. Cơ sở lý thuyết của hiệu ứng FRET [5], [24] Khi cặp phân tử donor – acceptor thỏa mãn các điều kiện để xảy ra FRET, cơ chế truyền năng lượng được minh họa bởi giản đồ năng lượng Jablonski (Hình 1.7). Khi mẫu được kích thích các điện tử của donor chuyển từ trạng thái cơ bản trong vùng hóa trị lên trạng thích kích thích trong vùng dẫn. Tại đây, các điện tử sẽ hồi phục xuống trạng thái năng lượng thấp hơn trong vùng dẫn (thời gian hồi phục trong khoảng từ pico giây tới femto giây), thường khi hồi phục xuống trạng thái cơ bản trong vùng hóa trị và phát ra huỳnh quang. Một phần năng lượng kích thích sẽ truyền cho phân tử acceptor (không phát xạ) làm cho phân tử acceptor bị kích thích. Điện tử kích thích của phân tử acceptor cũng hồi phục và tái hợp với lỗ trống trong vùng hóa trị và phát ra huỳnh quang của acceptor. Hình 1.7. Giản đồ Jablonski mô tả hiệu ứng FRET Quá trình truyền năng lượng FRET làm giảm huỳnh quang của donor (dập tắt) và tăng cường độ huỳnh quang acceptor đồng thời giảm thời gian sống huỳnh quang donor [24]. 23 D + h → D*+ D* + A → D +A* A* → A + h’ D: donor; A: acceptor; Dấu “*” kí hiệu trạng thái kích thích Một số điều kiện cần phải được thỏa mãn để cho FRET xảy ra đó là: - Phổ phát xạ huỳnh quang của các phân tử donor phải chồng lên phổ hấp thụ hoặc kích thích của chất màu nhận. Mức độ chồng chập lên nhau được gọi là phổ chồng lên nhau tích hợp (J). - Donor phải có cường độ huỳnh quang mạnh. - Hai chất này (donor và acceptor) phải ở khoảng cách gần nhau (thường 1 đến 10 nanomet). - Các lưỡng cực điện (dipole) của các donor và acceptor phải gần như song song với nhau. - Thời gian sống huỳnh quang của các phân tử donor phải có khoảng thời gian đủ để cho hiệu ứng FRET xảy ra. Hình 1.8. Phổ hấp thụ và phổ huỳnh quang của một cặp chất Donor và Acceptor 24 Hình1.8 mô tả phổ hấp thụ và phổ huỳnh quang của một cặp chất donor và acceptor. Khu vực màu đậm là sự chồng quang phổ giữa quang phổ huỳnh quang của các donor và phổ hấp thụ của acceptor [24]. Hiệu suất truyền năng lượng FRET tỉ lệ với nghịch đảo mũ 6 khoảng cách donor – acceptor )/( 660 6 0 rRREFRET  (1.1) Trong đó 0R là bán kính Förster – là khoảng cách mà ở đó năng lượng truyền được 50%. Hình 1.9. Hiệu suất truyền năng lượng FRET được vẽ như hàm khoảng cách cặp donor – acceptor, khoảng cách 0R là khoảng cách mà hiệu suất truyền bằng 50%    6/1420 2108,0 JnKR D  (1.2) Bán kính Förster 0R phụ thuộc vào hiệu suất lượng tử huỳnh quang của donor ( D ) khi không có mặt acceptor (fd), chiết suất của dung môi ( n ), góc định hướng lưỡng cực của phân tử ( 2K ) và sự chồng chập phổ của donor – acceptor (J)        a AD dFJ 0 4  (1.3) 25 Hiệu suất truyền năng lượng cũng có thể xác định thông qua cường độ huỳnh quang theo biểu thức: D DA F F E 1 (1.4) Trong đó DF là cường độ huỳnh quang của donor; DAF cường độ huỳnh quang của donor khi có mặt acceptor Hiệu suất truyền năng lượng cũng có thể xác định thông qua thời gian sống huỳnh quang theo biểu thức D DAE   1 (1.5) Trong đó DA là thời gian sống huỳnh quang của donor khi có mặt acceptor; D là là thời gian sống huỳnh quang của donor khi không có mặt acceptor. Tóm lại, tỷ lệ FRET phụ thuộc vào mức độ chồng chập quang phổ giữa các cặp donnor – acceptor (hình 1.8), hiệu suất lượng tử của các chất cho, định hướng tương đối của các donor– acceptor, những khoảng cách chuyển tiếp lưỡng cực và khoảng cách từ các donor tới acceptor. Bất kỳ quá trình nào có ảnh hưởng đến khoảng cách giữa các cặp chất donor – acceptor cũng sẽ ảnh hưởng đến hiệu suất của FRET. Phát hiện hiệu ứng truyền năng lượng cộng hưởng huỳnh quang (FRET): Việc phát hiện và định lượng hiệu ứng FRET có thể được thực hiện trong một số cách khác nhau. Đơn giản chỉ cần hiện tượng này có thể được quan sát bởi một mẫu vật có chứa cả các donor và các phân tử acceptor khi đó sẽ quan sát được sự thay đổi cường độ huỳnh quang cũng như thời gian sống huỳnh quang của donor và acceptor, khi xác định tỷ lệ số liệu của hai tín hiệu cường độ huỳnh quang hay thời gian sống huỳnh quang có thể phát hiện được hiệu ứng FRET có xảy ra hay không [5]. Ưu điểm của phương pháp này là một thước đo của sự tương tác có thể được thực hiện là độc lập với nồng độ tuyệt đối của cảm biến. Bởi vì không phải tất cả các gốc acceptor đều phát huỳnh quang, nên chúng có thể được sử dụng như một phương tiện để dập tắt huỳnh quang. Trong trường hợp này, 26 những tương tác mà kết quả trong một phân tử các chất huỳnh quang cho đến gần phân tử như vậy sẽ dẫn đến một sự mất mát tín hiệu. Hình 1.10. Quang phổ huỳnh quang của donor và acceptor và dung dịch hỗn hợp của donor và acceptor Trong hình 1.10, huỳnh quang của acceptor tăng gần sáu lần khi có sự hiện diện của chất cho. Trong trường hợp, như huỳnh quang các donor trở thành 1/3 huỳnh quang các chất cho. Sự thay đổi cường độ huỳnh quang là bằng chứng hình ảnh rõ ràng của FRET. Các quang phổ huỳnh quang đã được ghi nhận là sự phát huỳnh quang của donor và accepter. Đây là hiệu ứng FRET sử dụng các chất 3 – octadecyl – 2[3 – octadecyl – 2(3H) – benzothizolidene)metyl] benzoth) metyl] benzothiazolium perchlorate (chất cho), Octadecyl rhodamine B (acceptor). 27 CHƯƠNG 2: KỸ THUẬT THỰC NGHIỆM 2.1: CHUẨN BỊ MẪU 2.1.1: Aflatoxin B1 Aflatoxin sử dụng để xác định đường chuẩn đo tương tác truyền năng lượng cộng hưởng huỳnh quang là Aflatoxin B1, Sigma Aldrich, độ tinh khiết 98.5%. Aflatoxin B1 được pha trong dung môi methanol với nồng độ 20g/ml sau đó pha trộn với chấm lượng tử CdSe/ZnS với tỉ lệ như trong bảng 2.1. 2.1.2: Chấm lượng tử bán dẫn CdSe/ ZnS Chấm lượng tử sử dụng trong phép đo truyền năng lượng cộng hưởng huỳnh quang là chấm lượng tử cấu trúc lõi vỏ CdSe/ZnS có đỉnh huỳnh quang tại 545 nm và hấp thụ mạnh vùng tử ngoại tới 520nm. Chấm lượng tử được tổng hợp bằng phương pháp phản ứng hấp thụ từng lớp ion (Successive ionic layer adsorption and reaction - SILAR). Bảng 2.1. Chuẩn bị mẫu Aflatoxin B1- CdSe/ZnS Tên mẫu M0 M1 M2 M3 M4 M5 M6 CdSe/ZnS (l) 0 1000 1500 1900 1950 1990 2000 Aflatoxin (l) 2000 1000 500 100 50 10 0 Aflatoxin trong thực tế được chiết suất từ ngô bằng cách lấy 25 g ngô xay đồng nhất, chính xác đến 0,01 g, cho vào bình nón 250 ml. Thêm 5 g natri clorid và 125 mL hỗn hợp methanol: nước (70:30, v/v) và đồng nhất bằng máy trộn trong 2 phút ở tốc độ cao. Lọc hỗn hợp qua giấy lọc. Dùng pipet lấy 15 ml dịch lọc cho vào bình nón 100 ml có nắp đậy thủy tinh. Thêm 30 ml nước, đậy nắp bình và trộn. Lọc dịch chiết đã pha loãng 28 được lọc nhiều lần qua giấy lọc (có thể dùng ly tâm) để thu được dung dịch trong. Dùng pipet lấy 15 ml của dịch lọc cho vào phễu gắn với cột IAC (Vicam Aflatest P 1 ml). Cho đi qua cột tách với tốc độ 1-2 giọt/giây. Rửa tạp bằng 10 ml nước, tốc độ 1-2 giọt/giây. Rửa giải các Aflatoxin B1 bằng 1 ml methanol. Các mẫu aflatoxin trong ngô được chuẩn bị tại Viện Vệ sinh an toàn thực phẩm với 4 nồng độ khác nhau xác định bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao và không cho biết trước để so sánh với phương pháp FRET Mẫu sau khi chuẩn bị được đo phổ hấp thụ trên thiết bị Shimazu UV2600 (Shimazu), phổ huỳnh quang trên hệ phổ kế huỳnh quang Cary Eclipse (Variant) và phổ huỳnh quang phân giải thời gian trên cở sở đếm đơn photon tương quan thời gian (TCSPC) và được xử lý bằng phần mềm tính toán chuyên dụng viết trên Matlab, OriginLab. 2.2. PHỔ HẤP THỤ UV – VIS Phổ hấp thụ là một công cụ hữu ích trong việc nghiên cứu sự tương tác của vật liệu với ánh sáng chiếu vào, qua đó, có thể biết được thông tin về các quá trình hấp thụ xảy ra tương ứng với các chuyển dời quang học từ một số trạng thái cơ bản in đến một số trạng thái kích thích jn , từ đó có thể xác định được bước sóng kích thích hiệu quả cho quá trình quang huỳnh quang ( ij  ) quan tâm . Môi trường vật chất hấp thụ ánh sáng tuân theo định luật Beer– Lambert:      deII   0 (2.1) trong đó:  0I và  I là cường độ ánh sáng tới và cường độ truyền qua mẫu vật chất, d là độ dày của mẫu và   là hệ số hấp thụ vật liệu đối với photon có năng lượng h (hay /hc , với c là vận tốc ánh sáng). Muốn xác định hệ số hấp thụ   , người ta lấy ln hai vế (2.1), được:         ddII  /ln 0 (2.2) 29 Phổ hấp thụ biểu diễn đồ thị hệ số hấp thụ  (hay độ hấp thụ A) theo bước sóng hay năng lượng của photon đi qua vật chất. Như vậy, hệ số hấp thụ lớn tại một bước sóng nào đó cho thấy photon có năng lượng tương ứng bị vật chất hấp thụ mạnh, phần ánh sáng truyền qua có cường độ yếu. Ý nghĩa của hệ số hấp thụ bằng 1 là khi ánh sáng truyền qua một môi trường có độ dày 1cm, cường độ sẽ bị suy giảm đi e (~2,7) lần. Hai đại lượng  0I và  I đo được bằng thực nghiệm. Phương pháp đo phổ hấp thụ trong từng vùng phổ đòi hỏi nguồn sáng phát xạ liên tục trong vùng phổ đó, một phổ kế hoặc là máy đơn sắc lựa chọn bước sóng hay tần số, thiết bị thu tín hiệu để đo sự truyền qua của ánh sáng đơn sắc. Nguồn sáng thường được sử dụng là đèn hydrogen và deuterium đối với vùng tử ngoại và đèn dây tóc (volfram + halogen) cho vùng nhìn thấy và vùng gần hồng ngoại. Trong thí nghiệm đo phổ hấp thụ, chúng tôi dùng đèn halogen phát xạ trong vùng nhìn thấy. Bằng cách ghi phổ trải trong vùng năng lượng photon rộng, có thể biết được các quá trình hấp thụ xảy ra tương ứng với các chuyển dời quang học. Nguyên lý hoạt động của hệ đo: Một chùm ánh sáng được phát ra từ nguồn sáng, là đèn phát sáng trong vùng tử ngoại UV hoặc phát trong vùng nhìn thấy VIS , được đưa qua hệ máy đơn sắc là hệ lăng kính hoặc cách tử nhiễu xạ , để được tách ra thành các bước sóng đơn sắc. Mỗi tia sáng đơn sắc này sẽ lần lượt được chia thành hai tia để so sánh, có cường độ như nhau nhờ một gương phản xạ bán phần. Một trong hai tia sáng trên truyền qua một cuvet trong suốt bằng thạch anh chứa dung dịch mẫu cần nghiên cứu, cường độ của tia sáng sau khi truyền qua mẫu là I . Tia sáng còn lại là tia sáng so sánh truyền qua một cuvet tương tự nhưng chỉ chứa dung môi không chứa chấm lượng tử, cường độ của nó sau khi truyền qua dung môi là 0I . Cường độ của các tia sáng sau đó được các detector ghi lại và so sánh trực tiếp trong cùng điều kiện đo. 30 Hình 2.1. Sơ đồ nguyên lý của hệ đo hấp thụ quang học UV-VIS Hình 2.2. Máy đo quang phổ UV – VIS Nếu mẫu không hấp thụ ánh sáng ở một bước sóng đã cho thì 0II  . Tuy nhiên nếu mẫu hấp thụ ánh sáng thì 0II  . Các phổ có thể được vẽ dưới dạng phổ truyền qua :       0/ IIT  (2.3) hoặc phổ hấp thụ :        IIA /log 010 (2.4) 31 2.3: PHỔ HUỲNH QUANG Hệ đo phổ huỳnh quang Cary Eclipse phân giải cao được đặt tại Viện Vật Lý, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Nguyên tắc hoạt động của phổ kế Cary Eclipse được cho trên hình 2.3. Nguyên lý hoạt động của hệ đo: Nguồn kích thích của Cary Eclipse là đèn Xenon flash có thể phát bước sóng từ 200 đến 1000nm, nguồn sáng từ đèn xenon đi qua một máy đơn sắc để chọn bước sóng đơn sắc kích thích. Ánh sáng đơn sắc này được đưa vào buồng mẫu và hội tụ lên mẫu đo. Tín hiệu huỳnh quang phát ra từ mẫu được hội tụ lên lối vào của máy đơn sắc thứ hai và thu nhận ở lối ra bằng đầu thu quang điện. Một phần của ánh sáng kích thích được trích ra đưa vào đầu thu quang điện thứ hai để đồng bộ với tín hiệu thu. Xeno flash hoạt động ở chế độ xung nên Cary Eclipse cò có thể đo thời gian sống huỳnh quang của mẫu có thười gian sống dài (lân quang) Nguồn sáng đèn Xê-non Máy đơn sắc kích thích hai cách tử Cửa sập Kính lọc Tấm chia chùm Tấm phân cực Ref - Cell Môđun quang học Máy đơn sắc phát xạ Buồng đựng mẫu Điều khiển máy đơn sắc Máy tính Hiển thị Hình 2.3. Sơ đồ nguyên lý của máy phổ kế huỳnh quang Cary Eclipse 32 Với cấu hình này Cary Eclipse cho phép đo phổ huỳnh quang, phổ kích thích huỳnh quang, thời gian sống huỳnh quang và phổ thời gian sống huỳnh quang (với mẫu có thời gian sống huỳnh quang lớn). Toàn bộ hệ thống được điều khiển bằng phần mềm chuyên dụng. Hình 2.4. Máy đo phổ huỳnh quang Cary 2.4: PHỔ HUỲNH QUANG PHÂN GIẢI THỜI GIAN SỐNG 2.4.1. Quang phổ phân giải thời gian và thời gian sống phát quang Trong khi phép đo huỳnh quang trạng thái dừng là đơn giản, phép đo phân giải thời gian thông thường yêu cầu thiết bị đo đạc phức tạp và tốn kém. Tuy nhiên phép đo phân giải thời gian cung cấp nhiều thông tin hơn là từ dữ liệu huỳnh quang trạng thái dừng. Một ví dụ điển hình của phép đo phân giải thời gian cung cấp những thông tin mà phép đo huỳnh quang trạng thái dừng không thể thực hiện được đó là thống kê phân biệt và quá trình dập tắt động học trạng thái kích thích sử dụng phép đo thời gian sống [18]. Thời gian sống hay thời gian suy giảm phát quang là một thông số động học có ý nghĩa quan trọng. Giả sử một mẫu phát quang được kích thích bằng một xung ánh sáng, kết quả là có một độ tích lũy ban đầu  0n trên trạng thái 33 kích thích. Độ tích lũy trên trạng thái kích thích sẽ giảm dần với tốc độ suy giảm: nrk [4]:      tnk dt tdn nr (2.5) với  tn là độ tích lũy trạng thái trên trạng thái kích thích tại thời điểm t .  là tốc độ phát xạ nrk là tốc độ suy giảm không phát xạ Sự phát xạ là ngẫu nhiên và mỗi trạng thái kích thích cho cùng xác suất phát xạ trong cùng thời gian. Độ tích lũy trạng thái trên trạng thái kích thích do đó giảm dần theo hàm exponential:             t ntn exp0 (2.6) Với   1 nrk là thời gian sống tổng cộng trên trạng thái kích thích. Trong thực nghiệm, chúng ta không thể quan sát được độ tích lũy trên trạng thái kích thích nhưng chúng ta có thể quan sát thông qua cường độ phát xạ tương ứng tỷ lệ với  tn . Bởi vậy phương trình trên có thể viết lại dưới dạng sự phụ thuộc vào thời gian của cường độ phát xạ  tI :             t ItI exp0 (2.7) Trong đó  0I là cường độ phát quang tại thời điểm ban đầu, chúng ta thường biểu diễn thang cường độ theo thang logarit cơ số 10,  tIlog :     0loglog 1 log ItetI   (2.8) Theo đó ta có thể tính được thời gian sống phát quang  . Thời gian sống phát quang  được tính tại thời điểm cường độ phát quang cực đại giảm đi e lần  eI /0 hoặc từ độ dốc của đường thực nghiệm theo thang logarit cơ số 10 (phương trình 2.8). Tuy nhiên thời gian sống phát quang đo được không phải khi nào cũng có dạng đơn hàm e mũ (single exponential) như 34 phương trình 2.7, nó có thể có dạng đa hàm e mũ (multi exponential function) hay dưới dạng không phải đơn hàm e mũ (non-single exponential). Do đó từ giá trị thực nghiệm chúng ta phải đưa ra các giả thuyết phù hợp và khớp dữ liệu thực nghiệm theo nó [18]. Thời gian sống là tổng số thời gian trung bình trên trạng thái kích thích sau khi mẫu được kích thích. Điều này có thể được thấy được bằng cách tính thời gian trung bình t trong trạng thái kích thích. Giá trị này được tính bằng