Luận văn Sự tăng trưởng in vitro của cây mầm lúa oryza sativa l. trong điều kiện ngập úng

với một tác nhân gây stress như thiếu nước, lạnh và đóng băng, nhiệt độ cao, nồng độ muối cao (nhiễm mặn), thiếu 25 oxy trong vùng rễ, hay sự nhiễm không khí (Bùi Trang Việt, 2002). Thực vật có khả năng thích nghi và thích ứng với các điều kiện stress. Nếu sự kháng stress gia tăng do thực vật chịu stress trước đó, ta nói thực vật thích nghi. Khác với thích nghi, thích ứng là sự kháng xác định về mặt di truyền, cần qua nhiều thế hệ chọn lọc (Bùi Trang Việt, 2002). 1.7.2. Hiện tượng ngập úng Theo công ước Ramsar (1971), đất ngập nước được coi là các vùng đầm lầy, than bùn hoặc vùng nước dù là tự nhiên hay nhân tạo, ngập nước thường xuyên hoặc từng thời kỳ, là nước tĩnh, nước chảy, nước ngọt, nước lợ hay nước mặn, bao gồm cả những vùng biển mà độ sâu mực nước khi thủy triều ở mức thấp nhất không vượt quá 6 m. Định nghĩa theo các thời kỳ thủy văn thì đất ngập nước ở những vùng canh tác lúa nước ở Việt Nam là đất ngập nước theo thủy triều và ngập theo mùa tức là ngập thời gian dài trong mùa sinh trưởng nhưng thường không có nước bề mặt vào cuối mùa sinh trưởng (Lê Văn Khoa và cs, 2008). Ngập úng gây thiệt hại nghiêm trọng cho sản xuất và nông nghiệp. Đầu tiên, hiện tượng này ảnh hưởng trực tiếp đến việc trao đổi khí O2 và CO2. Oxy trong không khí chiếm khoảng 20,6% nhưng trong nước oxy giảm khoảng 4 lần. Mức độ cung cấp oxy cho rễ phụ thuộc vào nhiều yếu tố như độ xốp của đất, lượng nước trong đất, nhiệt độ, mật độ rễ, thành phần và mật độ vi sinh vật đất. Các loại khí này hầu như rất ít hòa tan trong nước. Cây không hấp thụ được chúng qua môi trường nước gây ra tình trạng thiếu oxy. Vì vậy, ngập úng ảnh hưởng trực tiếp đến quang hợp và hô hấp của cây. Trong điều kiện thiếu oxy, cây phải thay đổi quá trình trao đổi chất để thích nghi với môi trường. Phụ thuộc vào thời gian sống được trong điều kiện ngập nước, thực vật có thể chia làm 3 loại: Cây sống trong môi trường ngập nước: ví dụ như lúa nước, lúa nổi. Cây đều có sự thay đổi căn bản về cấu trúc mô tế bào cũng 26 như các quá trình sinh lý để thích nghi với sự sống trong môi trường này. Rễ có dạng rễ bất định, có vùng dưới biểu bì phình to chứa các mô khí giữ O2 khỏi bị khuếch tán ra môi trường đất yếm khí bên ngoài. Thân cây lúa phát triển về chiều dài để một phần lá cây có thể nổi lên trên mặt nước. Quá trình hô hấp xảy ra trong cơ thể chủ yếu là chu trình acid citric hầu như bị ức chế. Trong tế bào chuyển sang quá trình glycolysis và lên men thành acid lactic; Cây chịu úng trung bình: ví dụ như ngô, đại mạch. Mầm ngô có thể sống trong điều kiện yếm khí khoảng 3 - 5 ngày. Rễ hạn chế phát triển. Hình thành mô khí trong rễ, quá trình tổng hợp protein cũng bị ức chế; Cây kém chịu úng, ví dụ như đậu tương, cà chua. Cây sống trong điều kiện ngập nước khoảng 24 giờ. Cây không có khả năng phát triển mô khí. Quá trình tổng hợp protein bị hạn chế, ty thể bắt đầu bị phân hủy, ức chế sự phân chia tế bào, lưu chuyển ion, tế bào thịt rễ chết dần. Ngập úng hủy hoại mô tế bào thực vật. Mô khí thường có hai dạng: mô khí được hình thành từ vùng các tế bào chết; mô khí phát triển từ khoảng không được tách ra giữa các tế bào trong quá trình phân bào hoặc phát triển về chiều dài. Mô khí thường phát triển ở nhiều cơ quan khác nhau của cây và đóng vai trò quan trọng trong việc vận chuyển khí từ chồi xuống rễ khi bị úng (Trần Thị Phương Liên, 2010). 1.7.3. Ngập úng ở cây lúa Vùng trồng lúa bị ảnh hưởng bởi lũ lụt được gọi bằng thuật ngữ quốc tế là “flood prone rice”. Chúng có thể được chia thành 4 nhóm. Nhóm lúa chống chịu ngập hoàn toàn trong vòng 10 ngày, sau đó chúng có thể phục hồi sau khi nước rút. Đó là những vùng bị lũ quét, hay vùng bị ngập thình lình. Tiếng Anh gọi là “flash flood”, và tính chống chịu trong điều kiện như vậy được gọi là “complete submergence”; Nhóm lúa có khả năng vượt nước 5 – 10 cm/ngày, hoặc nhiều hơn trong vùng lũ lụt kéo dài 3 - 4 tháng/năm. Đó là vùng lúa nổi ở đồng bằng sông Cửu Long trước đây. Loại hình lũ lụt như vậy 27 được gọi với thuật ngữ quốc tế là “stagnant flood”, nước dâng từ từ, kéo dài nhiều tháng. Tính chống chịu trong điều kiện như vậy được gọi là “khả năng vươn lóng”; Nhóm lúa có khả năng thích nghi vùng đầm lầy ven biển, nơi đó thủy triều lên xuống trong ngày làm cây lúa bị ngập lúc triều cường. Đó là vùng bị ngập xen kẽ; Nhóm lúa không có khả năng vượt nước, nhưng thích nghi tốt trong vùng nước ngập sâu, lũ lụt kéo dài 2 - 3 tháng, thuật ngữ chung gọi là “deep water rice” (lúa nước sâu), lúa có tính cảm quang, thời gian trổ thường xảy ra khi nước rút (Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 2003). Để có thể sống được trong điều kiện ngập nước, cây lúa có những khả năng thích nghi đặc biệt. Cây lúa đã phát triển các tế bào và các cơ quan đặc biệt để vận chuyển không khí từ lá, thân xuống rễ. Bên cạnh đó, cây lúa có khả năng phát triển các rễ bất định trên mặt đất và trong nước. Hệ rễ lúa có năng lực oxid hóa nhờ sự khuếch tán oxy từ rễ ra ngoài môi trường xung quanh. Rễ lúa còn có khả năng hô hấp yếm khí cao hơn so với các loại cây trồng khác và có khả năng loại trừ các tác hại của một số độc chất ở một mức độ nhất định (Nguyễn Ngọc Đệ, 2009). 1.7.4. Sinh lý chống chịu ngập úng Khả năng vươn lóng là tính trạng quan trọng của giống lúa nổi, làm gia tăng chiều cao cây lúa nhờ đặc tính vươn dài lóng thân, vươn dài bẹ lá, và lá lúa, hoặc phối hợp tất cả những tính trạng này cùng một lúc. Hiện tượng vươn lóng thường xảy ra ở giai đoạn tăng trưởng, và ít thấy ở giai đoạn sinh sản. Bẹ lá và phiến lá non có thể vươn dài ra rất nhanh trong điều kiện cây lúa bị ngập hoàn toàn trong nước. Hiện tượng vươn dài của lá lúa nhờ nguồn năng lượng của sản phẩm quang hợp được tích lũy ở dạng cacbohydrat. Quá trình tiêu thụ năng lượng và tăng trưởng tỏ ra ít nhạy cảm hơn khi bị ngập hoàn toàn, trong khi khả năng vươn lóng rất cần năng lượng tích lũy. Chính khả năng vươn lóng được nhiều tác giả cho rằng đó là tính trạng quan trọng nhất của lúa nổi 28 giúp nó sống sót và phát triển. Khả năng vương lóng có thể do sự hoạt động kéo dài tế bào. Tuy nhiên cơ chế chủ yếu trong sự vươn lóng là sự gia tăng số lượng tế bào, nó xảy ra một cách tích cực tại mô phân sinh ở cuối lóng thân rạ. Nồng độ oxy khá thấp trong lóng thân bị ngập nước (khoảng 3%) làm gia tăng hiện tượng tổng hợp etylen (C2H4) trong lóng thân của cây lúa nước sâu. Etylen tích lũy trong thân rạ bị ngập hoàn toàn, sẽ làm gia tăng sự tăng trưởng của lóng thân và ức chế sự tăng trưởng của lá lúa. Ảnh hưởng đồng thời của etylen về tăng trưởng lóng thân làm gia tăng nồng độ CO2 trong lóng thân (khoảng 6%). Sự thích nghi của cây lúa nước sâu với điều kiện ngập nước như vậy là phản ứng giảm oxy, tăng CO2 và etylen trong lóng thân bị ngập nước. Trong điều kiện cây lúa bị ngập nước, tốc độ phân bào xảy ra nhanh hơn làm gia tăng chiều dài ở vùng mô phân sinh. Khi tế bào đã già, lóng thân không thể vươn lóng vì thiếu hiện tượng phân bào tích cực. Khả năng vươn lóng còn do sự gia tăng mức độ phân bào ở vùng sinh mô, trong đó có sự tác động hỗ tương giữa kích thích tố sinh trưởng etylen và giberelin, mà những mức độ này thay đổi tùy theo tính chất ngập khác nhau (Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 2003). Cây lúa bị hủy hoại nếu ngập một phần hoặc hoàn toàn trong mùa lũ. Các loài lúa khác nhau thích ứng với chế độ ngập lụt khác nhau. Theo đó, các biểu hiện hình thái và sinh lý của các giống lúa thí nghiệm đã được nghiên cứu cũng thích ứng theo chế độ lũ khác nhau.Sự đa dạng di truyền của tính chịu ngập của lúa được nghiên cứu qua các thí nghiệm phân tích trên các bộ phận của cây. Khi bị ngập trong nước dù trong thời gian ngắn nhất, thì sự tăng trưởng chiều dài của lá, vỏ, diện tích lá, số lượng các đốt trong thân cây cũng như tăng trưởng chiều dài chồi đều bị ảnh hưởng. Số lượng chồi, diện tích lá cây bị ngập úng giảm so với cây không bị ngập úng. Cây ngập nước một phần có sự tăng độ giãn dài của tất cả các lóng trong khi cây hoàn toàn ngập nước 29 thì tăng trưởng nhanh chỉ ở lóng đầu. Ở lúa có sự tăng trưởng chồi kéo dài trong thời gian ngập nước là một cách thích nghi với điều kiện khó khăn để tiếp tục quá trình trao đổi chất hiếu khí và cải thiện sự cố định cacbon. Khả năng này biểu hiện khác nhau trong các điều kiện ngập lụt khác nhau (Sakagami và cs, 2012, Taiz và cs, 2010). Bên cạnh đó, lúa không giống như các loại ngũ cốc khác, lúa có thể phát triển tốt trong các khu vực ngập nước (ngập một phần hoặc ngập cả cây). Lúa đối phó với ngập nước bằng cách tăng cường vận chuyển khí trong cây và kiểm soát tăng trưởng. Lúa kháng lại điều kiện ngập úng bằng cách hình thành aerenchyma (mô khí) và rào cản đối với sự mất mát oxy trong rễ để cung cấp oxy vào đỉnh rễ (Nishiuchi và cs, 2012, Taiz và cs, 2010, Bùi Trang Việt, 2000). 1.7.5. Sự thiếu oxy ở cây bị ngập úng Tất cả thực vật đất ngập nước đều có những có cơ chế phòng tránh sự thiếu oxy ở rễ. Điều duy nhất là có khoảng chứa không khí ở rễ (mô khí - aerenchyma) và ở thân tạo điều kiện khuếch tán oxy vào cây. Mô khí được hình thành do phân ly tế bào trong thời gian chín già của các cơ quan hoặc do suy thoái tế bào. Chúng tạo dạng cấu trúc kiểu tổ ong. Tuy nhiên, sự phân chia tế bào mỏng bên trong mô khí lỏng lẻo để ngăn cản sự khuếch tán bên trong. Sự phát triển mô khí trong rễ thực vật ngập nước có thể được kiểm soát bởi etylen. Sự ngập úng cũng kích thích sản sinh etylen (Lê Văn Khoa và cs 2008). Rễ nhận oxy cho sự hô hấp trực tiếp từ các khe đầy khí trong đất. Các khe đất đầy khí cho phép oxy khuếch tán tới độ sâu vài mét. Tuy nhiên, đất dễ bị ngập úng nếu dẫn nước kém và bị mưa hay tưới nước quá nhiều, khi đó khe đất đầy khí bị nước lấp đầy và cản sự khuếch tán của oxy, gây ra hiện tượng 30 thiếu oxy ở rễ, gây ảnh hưởng nặng nề đến sự sống của thực vật (Taiz và cs, 2010, Bùi Trang Việt 2000). Khi thiếu oxy, rễ bắt đầu sự glyco giải và lên men lactat chỉ tạm thời, sự lên men etanol được hoạt hóa. Sự lên men etanol chỉ cho 2 mol ATP/mol hexoz dẫn đến rễ thiếu ATP cho các quá trình biến dưỡng căn bản và vận chuyển hoạt động. Bên cạnh đó, khi thiếu oxy, sự vận chuyển H+ vào không bào nhờ ATPase bị cản, làm thay đổi pH, H+ thoát dần khỏi không bào và vào tế bào chất và acid hóa tế bào chất, dẫn đến gián đoạn quá trình biến dưỡng trong tế bào chất và dẫn đến sự chết của tế bào (Taiz và cs, 2010, Bùi Trang Việt, 2000). Khi thiếu oxy, ATP tạo ra không đủ và vận chuyển các chất tới lá bị ảnh hưởng, lá bị lão suy trước khi trưởng thành, các yếu tố dinh dưỡng linh động (N,P,K) theo libe tới lá non hơn. Sự hấp thu nước ở rễ giảm dẫn tới sự thiếu nước ở lá và lá bị héo (Taiz và cs, 2010, Bùi Trang Việt, 2000). 1.7.6. Vai trò của các chất điều hòa tăng trưởng thực vật trong ngập úng Ở lúa, etylen kích thích kéo dài thân cây mầm. Khi cây mầm lúa bị ngập nước, sự tăng trưởng lóng gia tăng đột ngột, sự kiện được giải thích như sau: mặc dù trong điều kiện thiếu oxy (do ngập nước), sự tổng hợp etylen giảm, nhưng cây lúa (chìm trong nước) có hàm lượng etylen cao vì etylen khuếch tán chậm trong đất ngập nước (Bùi Trang Việt, 2000). Lúa là một trong những cây trồng có thể tồn tại trong điều kiện ngập nước, nhưng không thể phát triển nếu thời gian ngập nước quá dài. Khi cây lúa bị ngập nước đột ngột nồng độ etylen trong cây tăng lên, lá tăng trưởng nhanh, chức năng chất diệp lục trong lá cây giảm. Sự tăng trưởng nhanh chóng kéo theo sự tiêu thụ năng lượng tăng, dẫn đến sự suy giảm lượng cacbohydrat. Tuy nhiên, một số giống lúa chịu được ngập nước hoàn toàn bằng cách ức chế sự kéo dài của thân và lá bằng cách hạn chế gia tăng nồng 31 độ etylen và giảm giberelin trong cây, do đó ức chế sự tiêu thụ cacbohydrat. Vì vậy, trong cây duy trì một sự cân bằng giữa sử dụng và sản xuất cacbohydrat (Anandan và cs, 2012, Bùi Trang Việt, 2000). Sự ngập nước làm giảm oxy trong lóng thân, nồng độ oxy thấp như vậy kích hoạt sự tổng hợp etylen. Etylen sẽ tích tụ nhiều trong lóng thân bị ngập. Nồng độ cao của etylen làm gia tăng mức độ mẫn cảm của mô đối với giberelin, hoặc làm gia tăng nồng độ giberelin hoạt động, dẫn đến sự đáp ứng sinh trưởng của cây trong điều kiện bị stress do ngập nước. Nồng độ etylen thay đổi tùy theo nhóm giống lúa nước sâu, đặc biệt nhóm giống lúa có nguồn gốc ở Thái Lan. Mặt khác, cây mạ của giống lúa nước sâu trong điều kiện bị ngập hoàn toàn sẽ sản sinh ra một lượng etylen lớn hơn nhiều lần so với điều kiện bị ngập không hòan toàn. Giberelin kích thích tế bào đầu tiên trong vùng mô phân sinh kéo dài ra và hoạt động phân bào tích cực. Cách thức hoạt động của các vi sợi cellulose (cellulose microfibrils = CMF) mới chính là yếu tố chủ yếu trong tăng trưởng của tế bào. Sự kéo dài lóng thân sẽ xảy ra khi CMF sắp xếp theo hướng tăng trưởng thuận chiều. Sự kéo dài gặp trở ngại khi CMF sắp xếp theo chiều nghiêng (Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 2003). Ba loại hormon thực vật xuất hiện cảm ứng với hiện tượng ngập úng là etylen, GB, ABA. Hiện tượng thiếu oxy đi đôi với gia tăng hàm lượng etylen trong tế bào. Etylen chính là tín hiệu tăng cường chiều dài cho mầm và thân cây. Quá trình tổng hợp etylen phụ thuộc vào oxy hóa với sự tham gia của ACC (1-aminocyclopropane-1-carboxylate) synthase và ACC oxydase. Hiện tượng ngập úng cảm ứng biểu hiện gen cảm ứng cho hai enzym này. Ngoài ra, ngập úng còn cảm ứng biểu hiện gen mã hóa cho thụ thể của etylen như RpERS1 từ R.palustrisOsERL1. Các protein thụ thể này điều chỉnh theo hướng làm hạn chế etylen trong mô tế bào (Trần Thị Phương Liên, 2010). 32 Mặt khác, etylen kích hoạt tổng hợp ABA. Tiếp theo đó ABA hoạt hóa enzym GA-3 oxydase, enzym chịu trách nhiệm chuyển hóa giberelin ở trạng thái ức chế thành giberelin ở trạng thái có hoạt tính sinh học. Giberelin tham gia điều hòa 3 quá trình quan trọng trong điều kiện này: quá trình làm giãn thành tế bào; phân chia tế bào và phân giải tinh bột. Nhóm protein làm tăng độ acid trong màng tế bào và làm giãn thành tế bào là expansin (EXP) và xyloglucan endotransglycosylase/hydrolase. Các gen chính là EXPA và EXPB. Protein SNORKEL 1 và SNORKEL 2 đều là các ERF và làm tăng chiều dài cây lúa khi bị úng thông qua GA (Trần Thị Phương Liên, 2010). Nhóm protein tăng cường phân chia tế bào- cyclin, được mã hóa bằng các gen CYC2Os1; CYC2Os2; enzym cyclin dependent kinase (CDC2Os2); các protein như Histone H3 và protein sao chép A1 (OsRPA1) (Trần Thị Phương Liên, 2010). Nhóm protein phân giải tinh bột cung cấp năng lượng cho các quá trình trao đổi chất trong tế bào: enzym α-amylase (do gen OsAmy3D) trong lá cây. Protein SUB1C (Submergence 1C) là yếu tố phản ứng với etylen ERF (ethylene response factor) tham gia điều hòa hoạt động gen amylase này. Ở lúa nước, etylen cảm ứng biểu hiện gen SUB1A-1, còn giberelin cảm ứng biểu hiện gen SUB1C (Trần Thị Phương Liên, 2010). 33 Chương 2 VẬT LIỆU – PHƯƠNG PHÁP 2.1. Vật liệu  Vật liệu dùng trong nuôi cấy in vitro và ươm cây tự nhiên Hạt lúa Oryza sativa L. giống nàng thơm chợ Đào được cung cấp từ Viện Khoa học Nông Nghiệp miền Nam Việt Nam.  Vật liệu dùng trong sinh trắc nghiệm Khúc cắt diệp tiêu cây mầm lúa (Oryza sativa L.) 72 giờ tuổi (kể từ khi nảy mầm). Tử diệp cây mầm dưa leo (Cucumis sativus L.) 24 giờ tuổi (kể từ khi nảy mầm). Trụ hạ diệp cây mầm xà lách (Lactuca sativa L.) 18 giờ tuổi (kể từ khi nảy mầm). 2.2. Phương pháp 2.2.1. Khảo sát môi trường in vitro thích hợp để nuôi cấy lúa Bốn môi trường được chọn để khảo sát: MS (phụ lục), MS 1/2 (môi trường MS với thành phần đa lượng giảm 1/2), MS 1/5 (môi trường MS với thành phần đa lượng giảm 1/5), MS 1/10 (môi trường MS với thành phần đa lượng giảm 1/10). Hạt lúa sau khi tách vỏ trấu được rửa bằng cồn 700 trong 1 phút rồi ngâm trong natri hypoclorit 4% trong 30 phút. Sau đó, cấy hạt vào ống nghiệm trong điều kiện vô trùng. Điều kiện nuôi cấy: nhiệt độ 25 ± 20C, ánh sáng 2000 ± 200 lux. Mỗi ống nghiệm cấy 1 hạt, mỗi nghiệm thức gồm 3 ống nghiệm và lặp lại 3 lần. Theo dõi cây mầm lúa sau 8 ngày nuôi cấy qua các chỉ tiêu: 34 - Chiều cao phần khí sinh là chiều cao cây lúa non được đo từ gốc đến đỉnh lá cao nhất. - Chiều dài rễ được đo từ gốc đến đỉnh rễ của rễ dài nhất. - Tỉ lệ nảy mầm được tính là số hạt nảy mầm trên tổng số cây của một nghiệm thức vào thời điểm hạt bắt đầu nảy mầm (thời điểm hạt xuất hiện phần u lồi ra ở phôi khoảng 1 mm). Môi trường thích hợp sẽ được chọn để thực hiện các thí nghiệm tiếp theo. 2.2.2. Khảo sát thời gian bão hòa nước của hạt Ngâm hạt lúa Oryza sativa L. đã bóc vỏ trấu trong môi trường được chọn từ thí nghiệm ở mục 2.2.1 (MS 1/2). Cứ sau 30 phút dùng giấy thấm, thấm khô nước xung quanh hạt rồi đem cân để xác định trọng lượng tươi. Thời gian bão hòa nước của hạt được tính khi trọng lượng tươi của các hạt không thay đổi sau 3 lần cân.Mỗi nghiệm thức gồm 5 gam hạt lúa với 3 lần lặp lại. 2.2.3. Quan sát hình thái, giải phẫu Các hạt lúa in vitro được nuôi cấy trong môi trường MS 1/2 trong điều kiện nuôi cấy bình thường hoặc có xử lý được chụp hình và được cắt ngang hoặc cắt dọc bằng tay hoặc bằng máy cắt vi phẫu (microtome), sau đó được nhuộm hai màu bằng phẩm nhuộm đỏ carmine - xanh iod và quan sát dưới kính hiển vi quang học. * Cắt bằng tay Mẫu được cắt bằng tay theo chiều dọc hoặc chiều ngang. Mẫu được ngâm javen trong 20 phút rồi rửa lại 3 lần bằng nước cất. Sau đó ngâm mẫu trong axit acetic 20% trong 15 phút rồi rửa lại bằng nước cất 3 lần. Sau cùng nhuộm mẫu và quan sát mẫu. * Cắt bằng máy cắt microtome 1. Cố định mẫu 35 Mẫu được cố định ngay trong môi trường FAA (phụ lục). Sau 24 giờ, chuyển mẫu vào etanol 700. 2. Đúc mẫu Loại nước bằng cách đặt mẫu lần lượt trong: - Etanol 700: 3 lần, mỗi lần 20 phút. - Etanol 950: 3 lần, mỗi lần 20 phút. - Etanol 1000: 3 lần, mỗi lần 20 phút. Loại etanol bằng cách đặt mẫu lần lượt trong: - Butanol 1: 30 phút. - Butanol 2: 30 phút. - Butanol 3: 60 phút. - Butanol 4: 10 giờ hoặc qua đêm. Loại butanol bằng cách đặt mẫu lần lượt trong paraffin tan ở 56 - 600C: - Paraffin 1: 1 giờ. - Paraffin 2: 1 giờ. - Paraffin 3: 1 giờ. Đổ paraffin nóng chảy vào khuôn, đặt mẫu vào và đổ đầy paraffin. 3. Cắt và dán mẫu Mẫu được cắt dọc hoặc cắt ngang thành từng lát mỏng 7 μm nhờ máy cắt microtome. Băng paraffin có chứa mẫu được cắt thành từng đoạn ngắn và được dán lên lam chứa dung dịch gelatin 1%. Đặt mẫu trên bếp ở nhiệt độ khoảng 350C. Mẫu giãn ra dán chặt vào lam. Giữ mẫu trong tủ ấm ở 300C trong hai ngày để cho mẫu thật khô. 4. Loại parafin Loại parafin bằng cách đặt mẫu lần lượt trong: - Metylcyclohexan 1: 10 phút. - Metylcyclohexan 2: 10 phút. 36 Rửa mẫu bằng etanol 1000. Sau đó, đặt mẫu lần lượt trong: - Etanol 1000: 5 phút. - Etanol 950: 5 phút. - Etanol 700: 5 phút. - Nước cất: 5 phút. 5. Nhuộm mẫu và quan sát mẫu. (Lê Thị Trung 2003) 2.2.4. Khảo sát sự nảy mầm và tăng trưởng in vitrocủa cây mầm lúa Hạt lúa sau khi tách vỏ trấu được rửa bằng cồn 700 trong 1 phút, rồi ngâm trong natri hypoclorit 4% trong 30 phút. Sau đó, cấy hạt vào ống nghiệm trong điều kiện vô trùng. Môi trường được chọn từ kết quả thí nghiệm mục 2.2.1 (MS 1/2). Điều kiện nuôi cấy: nhiệt độ 25 ± 20C, ánh sáng 2000 ± 200 lux. Mỗi ống nghiệm cấy 1 hạt với 3 lần lặp lại. Quan sát sự nảy mầm của hạt và theo dõi sự tăng trưởng của cây mầm sau 8 ngày nuôi cấy qua các chỉ tiêu: Chiều cao phần khí sinh như mục 2.2.1 Chiều dài bẹ lá được đo từ gốc đến mắt phần gối bẹ ở lá dài nhất. Chiều dài phiến lá được đo từ gối bẹ đến đỉnh lá của lá cao nhất. Chiều dài rễ như mục 2.2.1. Số lá được tính là số lá có trên cây ở thời điểm khảo sát. Số rễ được tính là số rễ có trên cây ở thời điểm khảo sát. 2.2.5. Khảo sát thời điểm gây stress ngập úng in vitro ảnh hưởng đến sự tăng trưởng của cây mầm lúa Hạt lúa sau khi được cấy vào ống nghiệm chứa môi trường MS 1/2, tiến hành gây ngập nước cho cây vào các thời điểm khác nhau ở mỗi nghiệm thức là 0 giờ, 5 giờ, 10 giờ, 15 giờ và 24 giờ với chiều cao cột nước thay đổi ở mỗi nghiệm thức là 0 mm (không bổ sung nước), 1 mm, 15 mm, 30 mm. Ống 37 nghiệm được sử dụng có đường kính là 25 mm.Điều kiện nuôi cấy: nhiệt độ 25 ± 20C, ánh sáng 2000 ± 200 lux.Mỗi ống nghiệm cấy 1 hạt lúa, mỗi nghiệm thức gồm 3 ống nghiệm với 3 lần lặp lại. Theo dõi cây mầm ở các điều kiện ngập nước qua các chỉ tiêu: chiều cao phần khí sinh, chiều dài rễ. Đối chứng với cây mầm trong môi trường MS 1/2 và ghi nhận kết quả sau 4 ngày cấy. Thời điểm gây stress thích hợp sẽ được chọn cho các thí nghiệm tiếp theo. 2.2.6. Khảo sát ảnh hưởng của mực nước ngập úng in vitro đến sự tăng trưởng của cây mầm lúa Từ kết quả tìm hiểu thời điểm gây stress ảnh hưởng đến sự tăng trưởng cây mầm lúa ở mục 2.2.5, tiếp tục khảo sát ảnh hưởng của các mực nước khác nhau đến sự tăng trưởng cây mầm lúa. Hạt lúa được cấy vào môi trường MS 1/2 sau 24 giờ được gây ngập úng. Các nghiệm thức về chiều cao cột nước được chọn như sau: 0 mm, 0,5 mm, 1mm, 3 mm, 15 mm, 30 mm, 75 mm, 120 mm. Ống nghiệm được sử dụng có đường kính là 25 mm. Điều kiện nuôi cấy: nhiệt độ 25 ± 20C, ánh sáng 2000 ± 200 lux. Mỗi ống nghiệm cấy 1 hạt lúa, mỗi nghiệm thức gồm 3 ống nghiệm với 3 lần lặp lại. Theo dõi cây mầm ở các điều kiện ngập nước qua các chỉ tiêu: chiều cao phần khí sinh, chiều dài rễ. Đối chứng với cây mầm trên môi trường MS 1/2 và ghi nhận kết quả sau 4 ngày nuôi cấy. Mực nước gây stress thích hợp sẽ được chọn cho các thí nghiệm tiếp theo. 2.2.7. Khảo sát sự nảy mầm và tăng trưởng của cây mầm trong điều kiện ngập úng in vitro Từ kết quả khảo sát ở mục 2.2.5 và 2.2.6 về thời điểm gây stress và mực 38 nước ngập úng in vitro ảnh hưởng đến sự tăng trưởng của cây mầm, tiếp tục khảo sát sự tăng trưởng của cây mầm trong điều kiện ngập úng in vitro. Hạt lúa được cấy trong môi trường MS 1/2, sau 24 giờ (mục 2.2.5) được gây ngập với chiều cao mực nước 15 mm (mục 2.2.6). Ống nghiệm được sử dụng có đường kính là 25 mm. Điều kiện nuôi cấy: nhiệt độ 25 ± 20C, ánh sáng 2000 ± 200 lux. Mỗi ống nghiệm cấy 1 hạt với 3 lần lặp lại. Quan sát sự nảy mầm của hạt qua 8 ngày nuôi cấy và theo dõi các chỉ tiêu chiều cao phần khí sinh, chiều dài rễ, số lá, số rễ. 2.2.8. Khảo sát ảnh hưởng của thời gian xử lý nhiệt độ đến sự tăng trưởng của cây mầm lúa trong điều kiện ngập úng in vitro Để theo dõi sự kháng chéo của cây mầm lúa trong điều kiện ngập úng, yếu tố nhiệt độ 450C và thời gian xử lý nhiệt độ 450C được khảo sát. Hạt lúa được cấy vào môi trường MS 1/2, sau 24 giờ được bổ sung 15 mm nước. Sau đó, các hạt lúa được xử lý 450C bằng cách đặt các ống nghiệm trong tủ nhiệt với thời gian khác nhau là 0 phút, 30 phút, 60 phút, 120 phút. Ống nghiệm được sử dụng có đường kính là 25 mm. Điều kiện nuôi cấy: nhiệt độ 25 ± 20C, ánh sáng 2000 ± 200 lux. Mỗi ống nghiệm cấy 1 hạt lúa, mỗi nghiệm thức gồm 3 ống nghiệm với 3 lần lặp lại. Theo dõi cây mầm ở các điều kiện xử lý qua các chỉ tiêu: chiều cao phần khí sinh, chiều dài rễ. Đối chứng với cây mầm trong môi trường MS 1/2 ngập 15 mm không kèm nhiệt độ (0 phút) và ghi nhận kết quả sau 6 ngày nuôi cấy. Thời gian thích hợp để xử lý 450C sẽ được chọn cho các thí nghiệm tiếp theo. 2.2.9. Xác định trọng lượng tươi và trọng lượng khô Cây mầm lúa qua 4, 6, 8 ngày được nuôi cấy trên môi trường MS 1/2 có hoặc không gây ngập úng, hoặc ngập úng kèm xử lý 450C (15 mm - 450C) được xác định trọng lượng tươi và trọng lượng khô để khảo sát sự tăng 39 trưởng. Mẫu được lấy ra khỏi ống nghiệm, rửa sạch, thấm khô và cân để xác định trọng lượng tươi. Sấy mẫu trong 6 giờ ở 800C để loại nhanh hoạt động của enzym sau đó sấy mẫu liên tục ở 600C cho đến khi trọng lượng không đổi và cân để xác định trọng lượng khô (Bùi Trang Việt 1992). Ghi nhận kết quả sau 3 lần cân ở mỗi mẫu. 2.2.10. Đo hàm lượng đường và hàm lượng tinh bột trong cây mầm lúa Hàm lượng đường và hàm lượng tinh bột trong cây mầm lúa ở 0, 4, 8 ngày sau khi nuôi cấy trên môi trường MS 1/2 có hoặc không gây ngập úng hoặc ngập úng kèm xử lý 450C được ly trích và đo để khảo sát khả năng thích nghi của cây mầm trong điều kiện stress. Xây dựng đường chuẩn Dung dịch sucaroz và glucozo được pha chế theo các nồng độ 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100 µg/l. Nhuộm dung dịch đường bằng phenol 5% và H2SO4 đậm đặc theo tỉ lệ dung dịch đường : phenol : H2SO4 đậm đặc là 1 : 1 : 5 theo thể tích. Sau khi nhuộm màu dung dịch đường, lắc đều, để yên 15 phút, tiến hành đo mật độ quang ở bước sóng 490 nm. Thu các giá trị đo được và vẽ đường chuẩn của sucaroz và glucozo theo 10 nồng độ khác nhau. Đo hàm lượng đường trong