Luận văn Tách dòng và xác định trình tự nucleotit một số đoạn trong genome của virut vàng lùn lúa (RGSV) tại Việt Nam

22 Enzym DNA polymerase xúc tác sự tổng hợp DNA theo chiều 5’-3’. phần lớn các DNA polymerase dùng một bản mẫu là DNA đề làm khuôn cho sự tổng hợp (DNA polymerase I, T4 DNA polymerase, Taq polymerase). Một DNA polymerase đặc biệt là enzym phiên mã ngƣợc (Reverse Transciptase) sử dụng khuôn là RNA để tổng hợp DNA. Ngoài ra, còn có Terminal transferrase là một DNA polymerase không tổng hợp mạch mới từ mạch khuôn mà chỉ thêm các nucleotit vào đầu của một phân tử DNA có sẵn. Các DNA mồi, là một đoạn DNA hay RNA ngắn bắt cặp bổ sung với phần đầu của mạch khuôn (đầu 3’), để từ đó các polymerase mới nối dài tạo mạch bổ sung. Enzym cắt giới hạn (RE) là các endonuclease có khả năng cắt DNA mạch đôi một cách lặp lại ở những vị trí (trình tự) xác định. Do đặc tính cơ bản của các RE là khả năng nhận biết và cắt một trình tự xác định trên phân tử DNA, dựa vào khả năng này, ngƣời ta chia chúng làm ba loại: (1) Khi enzym nhận biết đƣợc trình tự, nó sẽ di chuyển trên phân tử DNA đến cách đó khoảng 1000 – 5000 nucleotit và giải phóng độ vài chục nucleotit; (2) Enzym nhận biết trình tự và cắt ngay tại vị trí đó; (3) Enzym nhận biết một trình tự và cắt DNA ở vị trí cách đó khoảng 20 nucleotit. Trình tự nhận biết của RE loại 2: Mỗi RE nhận biết một trình tự nucleotit đặc trƣng. Các trình tự này thƣờng bao gồm 4-8 nucleotit (thƣờng là 4 hoặc 6). Đối với một số RE, trình tự nhận biết không có tính chuyên biệt tuyệt đối – một số nucleotit của trình tự có thể đƣợc thay thế bởi nucleotit khác. Đặc trƣng quan trọng nhất của các trình tự nhận biết là chúng có cấu trúc palindromic, nghĩa là hai mạch của trình tự hoàn toàn giống nhau khi chúng đƣợc đọc theo cùng chiều 5’-3’. Nhƣ vậy, vị trí cắt là giống nhau trên hai mạch. 1.6.2. Kỹ thuật RT-PCR Kỹ thuật RT-PCR (Reverse Transcriptase - PCR) là sự kết hợp của hai phản ứng phiên mã ngƣợc (Reverse Transcriptase) và PCR để nhân lên đƣợc đoạn gen quan tâm từ RNA [3]. Kỹ thuật này gồm hai giai đoạn: - Tổng hợp sợi cDNA thứ nhất: Nguyên lý của phƣơng pháp này là sử dụng enzym phiên mã ngƣợc (reverse transcriptase) để tổng hợp sợi cDNA thứ nhất từ RNA. Tùy theo mục đích của thí nghiệm mà các loại RNA đƣợc sử dụng là khác nhau. Nếu muốn nhân một đoạn gen của sinh vật nhân chuẩn mà không muốn có intron thì ngƣời ta thƣờng tổng hợp cDNA từ mRNA với mồi oligo(dT)s. Nếu là sinh vật nhân sơ hoặc virrut ngƣời ta có thể tổng hợp cDNA từ RNA tổng số với mồi ngẫu nhiên hoặc mồi đặc hiệu cho gen cần nhân. Khi mồi gắn bổ sung với sợi RNA khuôn, enzym phiên mã ngƣợc sẽ xúc tác cho quá trình tổng hợp cDNA từ các Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 23 nucleotit tự do có trong thành phần phản ứng ở một nhiệt độ thích hợp. Phản ứng tổng hợp cDNA chỉ xảy ra trong một chu kỳ, theo lý thuyết sau khi kết thúc phản ứng ta sẽ thu đƣợc lƣợng cDNA tƣơng ứng với lƣợng RNA khuôn ban đầu. Để tăng hiệu quả của qua trình tổng hợp, lƣợng mồi đƣợc cho vào lớn hơn rất nhiều lƣợng RNA khuôn và chất kìm hãm RNase cũng đƣợc đƣa vào để bảo vệ cho RNA khỏi bị cắt bởi RNase. Khuếch đại gen bằng PCR: Sử dụng cDNA làm khuôn để khuếch đại gen quan tâm bằng phản ứng RT-PCR với cặp mồi đặc hiệu (gồm mồi xuôi và mồi ngƣợc). Nguyên tắc của kỹ thuật PCR đƣợc trình bày ở mục 1.6.3. 1.6.3. Kỹ thuật PCR Kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction – chuỗi phản ứng trùng hợp) đƣợc Karl Mullis và cộng sự mô tả đầu tiên vào năm 1985. Đây là kỹ thuật in vitro tƣơng đối đơn giản, cho phép nhân một số lƣợng không giới hạn nguyên bản một đoạn DNA nhất định trong một khoảng thời gian ngắn, nhờ sự xúc tác của DNA polymerase. Tất cả các DNA polymerase khi hoạt động tổng hợp một đoạn DNA mới từ mạch khuôn đều cần sự có mặt của những mồi đặc hiệu. Mồi là những đoạn DNA ngắn có khả năng bắt cặp bổ sung với một đầu của mạch khuôn và DNA polymerase sẽ nối dài mồi để hình thành mạch mới. Quá trình nhân bản bằng enzym này bao gồm 3 bƣớc đƣợc lặp lại nhiều lần: 1> Biến tính (denaturation): DNA từ dạng sợi kép thành dạng sợi đơn bằng cách nâng cao nhiệt độ lên 94-95oC trong khoảng thời gian từ 0,5- 1 phút. 2> Lai (hybridization): Nhiệt độ đƣợc hạ thấp (thấp hơn Tm của các mồi) cho phép các mồi bắt cặp với khuôn; trong thực nghiệm, nhiệt độ này dao động trong khoảng 40oC – 70oC, tùy thuộc Tm của các mồi sử dụng và kéo dài từ 0,5- 1 phút. 3> Kéo dài (elongation): Phản ứng polymerase tổng hợp phân tử DNA kéo dài từ đoạn mồi. Hai phân tử DNA mới đƣợc tổng hợp theo nguyên tắc bổ sung từ hai đầu phân tử khuôn ban đầu. Thời gian kéo dài từ 30 giây đến vài phút. Để tránh hiện tƣợng bắt cặp không đặc thù, phản ứng thƣờng đƣợc thực hiện ở 72oC. Loại polymerase dùng trong PCR là loại chịu nhiệt, ví dụ nhƣ Taq- polymerase đƣợc tách triết từ vi khuẩn Thermus aquaticus, một loại vi khuẩn đƣợc phân lập từ suối nƣớc nóng. Hiện nay, enzym này chủ yếu đƣợc tổng hợp theo con đƣờng tái tổ hợp. Sau mỗi chu kỳ phản ứng lƣợng DNA cần nhân bản sẽ tăng gấp đôi, với N sợi khuôn ban đầu sau n chu kỳ sẽ có N*2n sợi DNA đƣợc tạo ra. Ví dụ, sau khoảng 20 chu kỳ, có khoảng 30 triệu bản đƣợc tạo ra từ một sợi khuôn ban đầu. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 24 1.6.4. Kỹ thuật biến nạp plasmit vào E.coli Lần đầu tiên biến nạp ở vi khuẩn đƣợc Frederick Griffith mô tả vào năm 1928 trong thí nghiệm nổi tiếng của ông về cái gọi là “nguyên lý biến nạp”. Tuy nhiên, không phải tất cả các vi khuẩn đều có thể biến nạp đƣợc một cách dễ dàng. Để có thể biến nạp ở E.coli có hiệu quả, các tế bào cần trở nên khả biến (competent). Để đạt đƣợc điều này, trƣớc khi biến nạp, ngƣời ta ngâm các tế bào trong dung dịch CaCl2 lạnh. Việc biến nạp các tế bào khả biến đƣợc thực hiện bằng cách trộn DNA plasmit tái tổ hợp với các tế bào, rồi ủ trong đá từ 20- 30 phút, sau đó tạo một sốc nhiệt ngắn ở 420C trong khoảng 1- 1,5 phút, làm nhƣ vậy DNA sẽ chui vào tế bào. Sau khi biến nạp, vi khuẩn đƣợc nuôi phục hồi trong môi trƣờng LB lỏng ở 370C trong khoảng 60- 90 phút. Sau đó, các tế bào đƣợc đƣa lên môi trƣờng chọn lọc để nhân lên các tế bào có plasmit tái tổ hợp. Trong quá trình biến nạp, chỉ một phần rất nhỏ các tế bào khả biến đƣợc biến nạp. Mặc dù có nhƣợc điểm rất lớn này, biến nạp vẫn là một kỹ thuật quan trọng, nó có thể tạo ra tới 109 các tế bào biến nạp (tức cá thể biến nạp) khi đƣa 1µg DNA vào thí nghiệm. Trong thực tế, với 1µg DNA ngƣời ta tạo ra đƣợc 106 đến 107 tế bào biến nạp. 1.6.5. Kỹ thuật tách dòng gen Tách dòng gen là một công cụ hữu hiệu đƣợc sử dụng trong kỹ thuật di truyền và là bƣớc khởi nguồn cho các kỹ thuật sau này. Mục đích của việc tách dòng là nhằm thu đƣợc một lƣợng lớn bản sao của trình tự gen quan tâm. Đầu tiên, DNA ngoại lai đƣợc nối vào một vectơ nhằm tạo ra DNA tái tổ hợp. Vectơ sử dụng là plasmit thích ứng của vi khuẩn E.coli. Sau đó, vectơ tái tổ hợp đƣợc biến nạp vào tế bào chủ và tế bào chủ đƣợc nuôi cấy trong môi trƣờng thích hợp để nhân vi khuẩn lên nhiều lần. Tế bào chủ ở đây là vi khuẩn E.coli. Cuối cùng qua các bƣớc tách chiết DNA, ngƣời ta sẽ thu đƣợc một lƣợng lớn plasmit tái tổ hợp. Các nhân tố nhƣ vectơ, tế bào chủ có thể thay đổi nhƣng tiến trình tách dòng nói chung đƣợc thực hiện qua 4 bƣớc: xử lý DNA cần tạo dòng, tạo vectơ tái tổ hợp, biến nạp vectơ tái tổ hợp vào tế bào chủ, chọn dòng. - Xử lý DNA cần tạo dòng Trƣớc hết DNA cần tạo dòng đƣợc khuếch đại bằng PCR với cặp mồi đặc hiệu. Sản phẩm PCR sau đó đƣợc làm sạch để thu đƣợc phân đoạn DNA có kích thƣớc nhƣ mong muốn, loại bỏ mồi và các thành phần khác trong phản ứng PCR. Bƣớc này nhằm tạo điều kiện cho bƣớc chọn dòng đƣợc thực hiện nhanh và hiệu quả, tránh những plasmit tái tổ hợp có kích thƣớc không mong muốn. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 25 - Tạo vectơ tái tổ hợp Vectơ tái tổ hợp đƣợc tạo ra bằng cách gắn gen quan tâm (đoạn DNA cần tạo dòng) vào vectơ tách dòng. Thông thƣờng, sau khi chạy PCR với enzym Taq- polymerase, enzym này sẽ gắn thêm một nucleotit là Adenin vào đầu 3’ của đoạn gen đƣợc nhân lên. Lợi dụng tính chất này, các nhà khoa học đã nghiên cứu, thiết kế các thế hệ vectơ tách dòng có mang 1 nucleotit là Thymin ở đầu 5’ của vectơ đã đƣợc mở vòng sẵn tại PCS (polycloning site- vùng nhân dòng đa điểm cắt). Hiện nay, có rất nhiều vectơ tách dòng có điểm cắt này, nhƣ pBT, pCR®2.1- TOPO, pGEM ® -T... Vectơ tách dòng và DNA cần tạo dòng đƣợc trộn chung theo một tỷ lệ nhất định dƣới sự xúc tác của enzym T4 ligase, DNA sẽ đƣợc gắn vào vectơ theo nguyên tắc bổ sung A – T tại vị trí mở vòng. - Biến nạp vectơ tái tổ hợp vào tế bào chủ Trong quá trình gắn gen vào vectơ sẽ hình thành nên các vectơ tái tổ hợp khác nhau. Bƣớc này nhằm sử dụng bộ máy của tế bào chủ để sao chép vectơ tái tổ hợp thành một số lƣợng lớn bản sao. - Chọn dòng Chọn dòng vi khuẩn tái tổ hợp theo hai cách thông dụng: chọn lọc theo phƣơng pháp kháng sinh (kanamycin, ampicillin,...) nhằm loại trừ các tế bào vi khuẩn không đƣợc biến nạp và các loại vi khuẩn nhiễm tạp khác và chọn lọc theo phản ứng với cơ chất (X-gal) nhằm loại trừ những vi khuẩn có mang vectơ nhƣng không có đoạn gen nào đƣợc gắn vào. 1.6.6. Kỹ thuật PCR trực tiếp từ khuẩn lạc (colony- PCR) Nguyên tắc kỹ thuật colony- PCR dựa trên nguyên tắc của kỹ thuật PCR, chỉ khác ở mẫu DNA đƣợc thay bằng DNA plasmit giải phóng từ khuẩn lạc ở nhiệt độ cao 94 0C đến 950C, màng tế bào vi khuẩn bị phá vỡ, giải phóng plasmit tái tổ hợp. Plasmit tái tổ hợp sẽ làm khuôn cho phản ứng PCR nhân gen bằng cặp mồi đặc hiệu. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 26 Chƣơng 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. VẬT LIỆU - Vật liệu thực vật sử dụng trong nghiên cứu là các mẫu lá lúa nghi nhiễm bệnh VL&LXL đƣợc thu từ các tỉnh đại diện có tỷ lệ nhiễm bệnh từ trung bình đến cao ở khu vực Nam Trung Bộ, mỗi tỉnh thu mẫu từ 2- 3 địa điểm khác nhau (Hình 2.1). STT Tên tỉnh thu mẫu Ký hiệu mẫu 1 Bình Định BĐ 2 Phú Yên PY 3 Khánh Hòa KH 4 Ninh Thuận NT 5 Bình Thuận BT Hình 2.1. Các điểm thu mẫu lúa nghi nhiễm bệnh VL&LXL tại Nam Trung Bộ 1 2 3 5 4 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 27 2.2. HÓA CHẤT, THIẾT BỊ, ĐỊA ĐIỂM 2.2.1. Hóa chất - Các cặp mồi dùng để tách dòng gen mã hóa protein vỏ và các phân đoạn khác đƣợc tổng hợp bởi hãng Invitrogen (Mỹ). Các hóa chất sinh học phân tử và các thiết bị đều đƣợc các hãng nổi tiếng nhƣ Fermentas (Đức), QIAGEN (Đức), Invitrogen (Mỹ), BIONEER (Hàn Quốc)... cung cấp. - Thang DNA chuẩn (Fermentas, Invitrogen) - QIAamp ® Viral RNA Mini Kit (QIAGEN). - Bộ hóa chất sử dụng cho RT-PCR (Invitrogen- Super ScriptTM III One- Step RT-PCR system with Platinium ® Taq High Fidelity) (Invitrogen). - Kit tinh sạch DNA (QIAquick Gel Extraction Kit- QIAGEN). - Kit tách và tinh sạch plasmit (QIAprep Spin Miniprep- QIAGEN) - Các hóa chất thông dụng khác nhƣ: Ampicillin, IPTG, X-gal, agarose, ... (Merck, Sigma, Amersham Pharmacia Biotech). - Các hóa chất cho phản ứng PCR, H2O khử DEPC. - Vectơ pBT (Viện Công nghệ Sinh học). 2.2.2. Thiết bị Máy ly tâm, máy soi gel, bộ điện di, tủ cấy vô trùng, máy chụp ảnh, pipet man, máy PCR, máy xác định trình tự nucleotit tự động và các trang thiết bị khác. 2.2.3. Địa điểm nghiên cứu - Phòng Công nghệ tế bào thực vật, Viện Công nghệ sinh học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam. - Phòng thí nghiệm Di truyền học và Công nghệ gen, Trƣờng Đại học Sƣ phạm, Đại học Thái Nguyên. 2.3. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.3.1. Thu mẫu thí nghiệm Mẫu lúa đƣợc thu tại các địa phƣơng nghi có hiện tƣợng nhiễm bệnh, do các chuyên gia tại địa phƣơng trực tiếp dẫn đi thu mẫu. Mẫu lúa đƣợc thu là những cây lúa có nhiều biểu hiện khác biệt so với những cây bên cạnh: lá vàng, xoắn, lùn hơn Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 28 bình thƣờng. Mẫu lúa đƣợc chứa trong các ống đã khử trùng và bảo quản trong điều kiện -840C đến khi sử dụng. 2.3.2. Thiết kế mồi đặc hiệu Quy trình thiết kết mồi đƣợc thực hiện theo các bƣớc sau. i) Thu thập các trình tự gen quan tâm từ Ngân hàng gen (GenBank); ii) Sử dụng các phần mềm thiết kết primer chuyên dụng nhƣ Primer3 để thiết kế các đoạn primer đặc hiệu cho các đoạn gen quan tâm. i) Thu thập các trình tự gen quan tâm từ GenBank: Trƣớc khi thiết kế đoạn mồi đặc hiệu cho gen và các trình tự cần phân lập của các chủng virut nghiên cứu (Ví dụ: trình tự gen CP của RGSV), trình tự đoạn gen này đƣợc thu thập từ GenBank tại địa chỉ www.ncbi.nlm.nih.gov [63]. Trình tự của các đoạn gen quan tâm có thể tìm kiếm thông qua tên của gen hoặc số hiệu của gen đƣợc đăng kí trong ngân hàng gen. Sau khi có đƣợc trình tự của gen quan tâm, các đoạn primer sẽ đƣợc thiết kế bằng việc sử dụng các chƣơng trình thiết kế. ii) Sử dụng các phần mềm thiết kết primer chuyên dụng nhƣ Primer3 để thiết kế các đoạn primer đặc hiệu cho các đoạn gen quan tâm. Chƣơng trình Primer3 đƣợc đăng kí tại địa chỉ bin/primer3plus/primer3plus.cgi [67]. Trong quá trình thiết kế mồi cần căn cứ vào một số điểm sau: Mồi phải có độ đặc hiệu và hiệu suất khuếch đại cao. Cố gắng chọn trình tƣ̣ mồi có khoảng 50% GC khi đó Tm trong khoảng 56- 62 0C sẽ tạo điều kiện để quá trình ủ đạt kết quả tốt. Tránh G và C ở đầu 3’ của mồi vì nó có thể làm tăng cơ hội tạo ra hiện tƣợng primer-dimers (hai primer bắt cặp với nhau ). Tránh chọn các vùng có trình tự tƣơng đồng để hạn chế các mồi tƣ̣ gắn với nhau . Tính toán nhiệt độ nóng chảy (Tm) của primer với tổng số 40C cho GC và 20C cho AT theo công thức Tm = 4(G+C) + 2(A+T), sau đó trƣ̀ đi 50C tƣ̀ giá trị này và đây chính là nhiệt độ ủ (Ta) của primer [30], [39]. 2.3.3. Tách chiết RNA tổng số của virut ở lúa RNA tổng số từ các mẫu lá lúa nghi nhiễm bệnh VL&LXL đƣợc tách chiết theo hƣớng dẫn sử dụng hóa chất trizol reagents. Lá lúa (khoảng 200g) đƣợc nghiền trong nitrogen thành bột mịn; Bổ sung 1 ml trizol reagents, đảo nhẹ ở nhiệt độ phòng trong 10 phút; Bổ sung 200 µl chloroform : isoamyl (24:1), đảo nhẹ và ly tâm 10.000v/p trong 10 phút; Hút dịch nổi, kết tủa RNA bằng Isopropanol. Ly tâm Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 29 ở 10.000v/p trong 10 phút, bỏ dịch nổi, thu tủa; Rửa tủa bằng cách bổ sung 700µl ethanol 70%, ly tâm ở 7000v/p trong 5 phút (lặp lại 2 lần), làm khô và pha loãng RNA trong nƣớc khử DEPC 0,01%; Cất mẫu ở -840C. 2.3.4. Phản ứng RT-PCR - Thành phần: Thành phần phản ứng RT-PCR (one-step) trong thể tích 25l: 5l đệm RT-PCR 5X; 10pg- 5g RNA tổng số (1l); 75pmol mỗi loại mồi đặc hiệu (0,75l); 1l 10mM dNTP mix (10mM mỗi loại dATP, dGTP, dTTP và dCTP, ở pH trung tính); 1l hỗn hợp enzym (Reverse transcriptase và Taq polymerase); 0,2 l chất ức chế Ribonuclease tái tổ hợp RNase OUTTM (40u/l); Bổ sung nƣớc khử ion đã đƣợc khử trùng tới thể tích 25l. - Chu kỳ nhiệt: Thực hiện phản ứng RT-PCR theo chu kỳ nhiệt sau: bƣớc 1: 50 0C, 30 phút; bƣớc 2: 950C, 15 phút; bƣớc 3: 940C, 30 giây; bƣớc 4: 530C, 30 giây; bƣớc 5: 720C, 3 phút; từ bƣớc 3 đến bƣớc 5 lặp lại 10 chu kỳ; bƣớc 6: 940C, 30 giây; bƣớc 7: 550C, 30 giây; bƣớc 8: 720C, 5 phút; từ bƣớc 6 đến bƣớc 8 lặp lại 30 chu kỳ; bƣớc 9: 720C, 10 phút; bƣớc 10: 40C, bảo quản mẫu. Sản phẩm PCR đƣợc điện di trên gel agarose 1% trong đệm 1X TAE [45], nhuộm gel trong dung dịch ethidium bromide và thôi gel bằng bộ Kit của QIAGEN. 2.3.5. Tạo plasmit tái tổ hợp mang gen mong muốn (Ligation) Sản phẩm PCR của gen quan tâm đƣợc kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 1% và đƣợc làm sạch theo bộ kit QIAquick Gel Extraction rồi gắn vào vectơ tách dòng pBT (Hình 2.2). Các bƣớc tiến hành nhƣ sau: - Thôi gel sản phẩm PCR: Điện di sản phẩm PCR trên gel agarose 1% và cắt lấy băng quan tâm, có kích thƣớc khoảng 1kb; bổ sung dung dịch QG theo tỷ lệ: Vmẫu : VQG = 1 : 3 (1mg mẫu tƣơng ứng với 1µl); ủ ở 50 0 C trong 10- 15 phút, cứ 3 phút đảo mẫu nhẹ một lần, sau khi gel tan hết ủ thêm 5 phút để đảm bảo gel tan hoàn toàn; chuyển hỗn hợp dung dịch lên cột thôi gel Qiaquick spin, ly tâm 13.000 v/p trong 1 phút, loại bỏ dịch chảy qua cột; bổ sung 500µl dung dịch QG, ly tâm 13.000v/p trong 1 phút; thêm 750µl dung dich PE vào cột, để ở nhiệt độ phòng trong 5 phút; ly tâm 13.000 v/p trong 1 phút, đổ dịch chảy qua cột, ly tâm bổ sung 1 phút để loại bỏ hết dung dịch PE; hòa tan DNA trong 30- 50µl nƣớc cất hoặc dung dịch EB, đã đƣợc làm ấm đến 500C, để ở nhiệt độ phòng 1 phút, ly tâm 13.000v/p để thu DNA. - Gắn gen vào vectơ: Sản phẩm thôi gel đƣợc gắn vào vectơ pBT với sự xúc tác của T4 ligase. Phản ứng gắn dựa vào sự hình thành mối liên kết photphodieste Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 30 giữa nucleotit Adenin của sản phẩm PCR và nucleotid Thymin của vectơ. Các thành phần của vectơ pBT đƣợc thể hiện trong hình 2.2. Hỗn hợp phản ứng đƣợc ủ ở nhiệt độ phòng trong 02 giờ để phản ứng xảy ra hoàn toàn. Vectơ tái tổ hợp sau đó đƣợc biến nạp vào tế bào khả biến E.coli DH5α và đƣợc cấy trải trên môi trƣờng LB đặc có bổ sung ampicillin 0,01mg/l ampicillin, X-gal 0,004‰, IPTG 100µM. Thành phần phản ứng gắn gen vào vectơ pBT: Buffer T4 ligase 10X (2µl); DNA (8µl); plasmit pBT (1µl); T4 ligase 2u/µl (1µl); H2O (8µl). Tổng thể tích 20µl. Hỗn hợp đƣợc ủ ở 220C trong 2 giờ, sau đó đƣợc biến nạp vào tế bào khả biến E.coli DH5α bằng phƣơng pháp sốc nhiệt. Hình 2.2. Sơ đồ vectơ pBT. 2.3.6. Biến nạp vectơ tái tổ hợp vào tế bào khả biến E.coli DH5α bằng phƣơng pháp sốc nhiệt - Chuẩn bị tế bào khả biến: Tế bào E.coli DH5α đƣợc cấy ria trên môi trƣờng LB đặc và nuôi qua đêm ở 370C. Chọn một khuẩn lạc nuôi cấy trong 3ml LB lỏng, lắc 200 v/p, ở 370C trong 2- 3 giờ, đo OD600nm đạt 0,4- 0,6 thì chuyển dịch nuôi cấy sang ống ly tâm, để 15 phút ở trong đá (hoặc ở 40C). Ly tâm 4000v/p, ở 40C, trong 15 phút (lặp lại ba lần, để trong đá lần thứ hai 30 phút, lần thứ ba 60 phút). Đổ dịch CaCl2, hòa tan trong 1ml CaCl2/100ml LB ban đầu. Bổ sung 15- 20% glycerol. Chia 50µl dịch tế bào khả biến vào mỗi ống eppendorf 1,5ml. Bảo quản tế bào khả biến trong tủ lạnh -840C. - Biến nạp: Bổ sung 20µl vectơ tái tổ hợp vào ống đựng tế bào khả biến và trộn nhẹ, đặt ngay vào đá trong 30 phút rồi ủ ở 420C chính xác trong 1,5 phút, sau Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 31 đó đặt vào đá 5 phút. Bổ sung 700µl môi trƣờng LB lỏng, hỗn hợp đƣợc nuôi ở 37 0C, lắc 200v/p trong 1 giờ. Sử dụng que cấy trải, trải 150- 250µl dịch khuẩn lên đĩa môi trƣờng LB đặc có chứa 0,1mg/l ampicillin, X-gal 0,004‰, IPTG 100µM. Ủ đĩa ở 370C trong 16 giờ. 2.3.7. Colony-PCR Sau khi nuôi khuẩn đã biến nạp trên môi trƣờng chọn lọc, thu đƣợc những khuẩn lạc xanh và trắng. Nguyên lý của khuẩn lạc xanh và trắng: Toàn bộ khuẩn lạc phát triển trên môi trƣờng có ampicillin đều là khuẩn lạc mang plasmit (vectơ). Vì sự có mặt của gen kháng ampicillin trong plasmit giúp vi khuẩn có khả năng kháng kháng sinh ampicillin. Những khuẩn lạc xanh xuất hiện do trong vectơ mang gen lac-operon hoạt động bình thƣờng, không có đoạn gen đƣợc xen vào, khi có chất cảm ứng của IPTG sẽ tổng hợp enzym β-galactosidase, enzym này sẽ chuyển hóa cơ chất X-gal thành hợp chất có mầu xanh. Còn những khuẩn lạc trắng có thể là do nhận đƣợc plasmit mang lac-operon không hoạt động, chính vì vậy khi có chất cảm ứng IPTG thì gen không tổng hợp enzym β-galactosidase và không xảy ra hiện tƣợng chuyển hóa X-gal. Lac-operon bị bất hoạt là do đoạn DNA ngoại lai xen vào giữa promoter của operon gen lacZ. Do đó, lac-promoter không thể điều khiển gen cấu trúc phiên mã, nên không cóc sự dịch mã thành enzym. Tuy nhiên, không phải tất cả các khuẩn lạc trắng đều mang plasmit tái tổ hợp chứa đoạn DNA quan tâm. Mặc dù vậy, việc chọn khuẩn lạc trắng để nghiên cứu tiếp đã loại bỏ đƣợc phần lớn các trƣờng hợp không mong muốn. Để phản ứng hiệu quả hơn cần kiểm tra bằng cách chạy phản ứng colony-PCR. Khuẩn lạc trắng của mỗi mẫu đƣợc chọn lọc và đánh số thứ tự, thực hiện phản ứng colony-PCR với cặp mồi pUC18 để xác định khuẩn lạc có plasmit mang gen quan tâm. Sản phẩm colony-PCR đƣợc điện di kiểm tra trên gel agarose 0,9% để chọn ra các khuẩn lạc mang gel có kích thƣớc nhƣ mong muốn, đồng thời nuôi những khuẩn lạc này trong 3ml LB lỏng có bổ sung ampicillin 100mg/l để tách plasmit. Thành phần phản ứng colony-PCR: Dung dịch đệm PCR 10X (2µl); MgCl2 25mM (2µl); dNTPs 2,5mM (2µl); Mồi pUC18-xuôi 10 pmol/µl (1µl); Mồi pUC18- ngƣợc 10 pmol/µl (1µl); DNA polymerase 1u/1µl (1 µl); H2O khử ion (11µl). Tổng thể tích là 20µl. Chu kỳ nhiệt của phản ứng colony-PCR: bƣớc 1: 950C, 5 phút; bƣớc 2: 940C, 30 giây; bƣớc 3: 520C, 30 giây; bƣớc 4: 720C, 3 phút; từ bƣớc 2 đến bƣớc 4 lặp lại Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 32 10 chu kỳ; bƣớc 5: 940C, 30 giây; bƣớc 6: 550C, 30 giây; bƣớc 7: 720C, 5 phút; từ bƣớc 5 đến bƣớc 7 lặp lại 25 chu kỳ; bƣớc 8: 720C, 10 phút; bƣớc 9: 40C, bảo quản mẫu. 2.3.8. Tách chiết plasmit Sử dụng bộ kit QIAprep Spin Miniprep và chỉ dẫn của nhà sản xuất để tách chiết plasmit. Đây là phƣơng pháp tách plasmit lƣợng nhỏ từ 1 – 1,5 ml dịch khuẩn E.coli, có số bản sao plasmit cao. Qui trình bao gồm: Hút 1,5ml dịch khuẩn E.coli đã nuôi qua đêm trong môi trƣờng LB lỏng cho vào ống eppendorf 1,5ml. Ly tâm 8.000v/p trong 5 phút để thu tế bào vi khuẩn. Hòa tan tế bào trong 250µl buffer RS có bổ sung RNase (sản phẩm tách không còn RNA). Bổ sung 250µl BL, đảo ống nhẹ nhàng 4-6 lần để trộn đều hỗn hợp. Cần thiết có thể đảo ống cho đến khi nhìn thấy dịch trắng sữa. Không để phản ứng phân giải quá 5 phút. Các dung dịch RS và BL có tác dụng phá vỡ thành tế bào, màng sinh chất... và giải phóng ra các thành phần trong tế bào. Bổ sung 350µl NE, đảo ống ngay lập tức nhƣng nhẹ nhàng 3- 4 lần. Tránh kết tủa cục bộ, đảo đều dung dịch nhẹ nhàng nhƣng liên tục ngay khi bổ sung NE. Dung dịch trở nên có màu trắng sữa. Dung dịch NE có tác dụng kết tủa protein, polysaccarit... tạo kết tủa bám vào thành ống eppendorf. Ly tâm 13.000v/p trong 15 phút. Hút dịch nổi cho vào cột QIAprep Spin Miniprep. Ly tâm 13.000v/p trong 1 phút, loại bỏ dịch chảy qua cột, rửa cột QIAprep Spin Miniprep bằng cách bổ sung 0,5ml buffer PB và ly tâm 13.000v/p trong 1 phút. Loại bỏ dịch chảy qua cột. Bƣớc này là rất cần thiết để loại bỏ hoạt tính của nuclease khi sử dụng chủng endA + nhƣ JM, HB101 hoặc các thế hệ khác của nó hoặc các chủng dại mà có mức độ hoạt tính cao của nuclease hoặc nồng đọ carbohydrate cao. Chủng tế bào chủ nhƣ XL-1 và DH5α không cần thiết phải thực hiện bƣớc rửa này. Rửa cột QIAprep Spin Miniprep bằng cách bổ sung 0,75ml buffer WP và ly tâm ở 13.000v/p. Loại bỏ dịch chảy qua cột, và ly tâm bổ sung 13.000v/p trong 1 phút để loại bỏ hết buffer rửa. Chuyển cột sang một ống eppendorf 1,5ml mới. Hòa tan DNA bằng cách bổ sung 50µl EL hoặc nƣớc cất tới tâm của mỗi cột QIAprep Spin Miniprep, để ở nhiệt độ phòng 1 phút rồi ly tâm ở 13.000v/p trong 1 phút. Tiến hành điện di kiểm tra sản phẩm tinh sạch plasmit trên gel agarose 0,9%. 2.3.9. Cắt gen bằng enzym giới hạn Bƣớc đầu tiên trong quá trình cắt gen bằng enzym giới hạn, chúng ta phải xác định những enzym có thể sử dụng để cắt đƣợc đoạn gen quan tâm. Những enzym đƣợc lựa chọn là những enzym dự tính không có điểm cắt trên đoạn gen quan tâm, không có quá nhiều vị trí cắt trên vectơ. Đặc biệt, những enzym cắt Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 33 không cho các đoạn gen có kích thƣớc chênh lệch nhỏ, vì nhƣ vậy, không thể xác định đƣợc đoạn gen quan tâm. Sau khi đã xác định đƣợc enzym cắt giới hạn, đối chiếu với bảng enzym để xác định đƣợc đệm phù hợp nhất, cho khả năng cắt cao nhất. Tiến hành cắt enzym, cho lần lƣợt các thành phần theo thứ tự: Đệm cho enzym cắt, chất phụ trợ (nếu có), plasmit, enzym. Hỗn hợp đƣợc cắt ở 37oC trong 02 tiếng, bất hoạt enzym ở 65oC trong 20 phút. Thành phần phản ứng cắt bằng enzym giới hạn : DNA plasmit 2,5- 3 µg/µl (5µl); Enzym 10u/µl (1µl); Dung dịch đệm 10X (1µl); H2O khử ion (3,5µl ). Tổng thể tích là 10µl. 2.3.10. Xác định trình tự và so sánh trình tự gen thu đƣợc với các trình tự tƣơng ứng trên GenBank Tách dòng và xác định trình tự gen: Sản phẩm PCR đƣợc gắn vào trong vector tách dòng pBT [4] và biến nạp vào tế bào khả biến E. coli DH5α. Chọn lọc các khuẩn lạc xanh/trắng trên môi trƣờng thạch LB có bổ sung 50 mg/l Ampicilin, 0,004% X-gal và 0,1 mM IPTG. Tách chiết plasmit theo hƣớng dẫn sử dụng của Plasmit Extraction Kit. Kiểm tra sự có mặt của DNA tái tổ hợp bằng phƣơng pháp colony-PCR với cặp mồi pUC18-xuôi và pUC18-ngƣợc. Chọn các mẫu plasmit tái tổ hợp có kích thƣớc nhƣ mong muốn