Luận văn Tìm một số dòng vi khuẩn lactic kháng vi khuẩn Edwardsiella Ictaluri

MỤC LỤC Trang LỜI CẢM TẠI ..i TÓM TẮT ii MỤC LỤC iii DANH SÁCH HÌNH v DANH SÁCH CÁC BẢNG vi CHƯƠNG 1: ĐẶT VẤN ĐỀ. .1 1.1 Giới thiệu .1 1.2 Mục tiêu .2 1.3 Nội dung.. .2 CHƯƠNG 2: LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU .3 2.1 Tổng quan về vi khuẩn Edwardsiella ictaluri ( E. ictaluri) ....3 2.1.1 Một số nghiên cứu trên vi khuẩn E. ictaluri ....3 2.1.2 Đặc điểm sinh học vi khuẩn Edwardsiella ictaluri ....3 2.1.3 Bệnh do vi khuẩn E. ictaluri gây ra trên cá da trơn ....4 2.1.4 Ứng dụng vi sinh vật hữu ích trong phòng trị bệnh gan thận mủ trên cá da trơn. ....5 2.2 Vi khuẩn lactic ....7 2.2.1 Khái niệm vi khuẩn lactic ....7 2.2.2 Đặc tính chung ....7 2.2.3 Đặc điểm hình thái ....8 2.2.4 Đặc điểm sinh lý- sinh hóa ..13 2.2.5 Sản phẩm của quá trình lên men ở vi khuẩn lactic ..14 2.2.6 Vi khuẩn lactic với các sản phẩm mắm lên men ..16 CHƯƠNG 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ..18 3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu ..18 3.2 Vật liệu ..18 3.2.1 Giống vi sinh vật ..18 3.2.2 Hóa chất ..18 3.2.3 Dụng cụ và thiết bị ..19 3.3 Phương pháp nghiên cứu ..19 3.3.1 Bố trí thí nghiệm ..19 3.3.2 Phương pháp phân tích và xử lý số liệu ..24 CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ THẢO LUẬN ..25 4.1 Kết quả phân lập vi khuẩn lactic từ mẫu mắm và nước mắm ..25 4.1.1 Phân lập và tuyển chọn các dòng vi khuẩn trên môi trường MRS Agar dựa vào hình thái khuẩn lạc và khả năng sinh axít lactic ..25 4.1.2 Kết quả thử nghiệm catalase. ..29 4.1.3 Kết quả nhuộm gram và mô tả hình thái vi khuẩn. ..30 4.2 Kết quả đối kháng của vi khuẩn lactic đối với vi khuẩn E. ictaluri ..31 CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT ..43 5.1 Kết luận ..43 5.2 Đề Xuất ..43 TÀI LIỆU THAM KHẢO ..44 PHỤ LỤC A PHỤ LỤC B PHỤ LỤC H DANH SÁCH HÌNH Trang Hình 2.1: Tế bào của Edwardsiella ictaluri ..4 Hình 2.2: Tế bào của Lactobacillus acidophilus ..9 Hình 2.3: Tế bào của Streptococcus pneumoniae 10 Hình 2.4: Tế bào của Leuconostoc sp 11 Hình 2.5: Tế bào của Pediococcus sp 12 Hình 2.6: Tế bào của Bifidobacterium sp 12 Hình 2.7: Nước mắm 17 Hình 3.1: Các môi trường và hóa chất sử dụng trong thí nghiệm 18 Hình 3.2: Sơ đồ phương pháp giếng khuếch tán 23 Hình 3.3: Cách đo bề rộng vòng đối kháng 24 Hình 4.1: [A] Trước khi tăng sinh; [B] Sau khi tăng sinh 25 Hình 4.2: Mẫu bị nhiễm nấm 25 Hình 4.3: Khuẩn lạc của vi khuẩn lactic phát triển trên MRS agar. 27 Hình 4.4 [A] Vi khuẩn lactic catalase âm tính; [B] E. ictaluri catalase dương tính. 29 Hình 4.5: [A] Vi khuẩn lactic (gram +); [B] Vi khuẩn E. ictaluri (gram –). 30 Hình 4.6: Môi trường dày 5 mm (trái) và dày 3 mm (phải) 32 Hình 4.7: So sánh mật độ khuẩn lạc giữa 2 dòng 2 [A] và 19 [B] 33 Hình 4.8: Biểu đồ thể hiện bề rộng vòng kháng của các dòng vi khuẩn lactic có tính kháng yếu 37 Hình 4.9: Biểu đồ thể hiện bề rộng vòng kháng của các dòng vi khuẩn lactic có tính kháng trung bình 38 Hình 4.10: Biểu đồ thể hiện bề rộng vòng kháng của các dòng vi khuẩn lactic có tính kháng mạnh 39 Hình 4.11: Kích thước vòng kháng khuẩn của các dòng vi khuẩn phân lập với E. ictaluri sau 24 giờ bằng phương pháp giếng khuếch tán 41 DANH SÁCH BẢNG Trang Bảng 3.1: Danh sách mẫu mắm, nước mắm dùng trong thí nghiệm 20 Bảng 4.1: Kết quả quá trình cấy ria tách ròng 26 Bảng 4.2: Kết quả mô tả hình thái khuẩn lạc dưới kính hiển vi 27 Bảng 4.3: Kết quả đo bề rộng vòng kháng của 39 dòng vi khuẩn lactic có tính kháng với E. ictaluri 34 Bảng 4.5: Bề rộng vòng kháng của các dòng vi khuẩn lactic có tính kháng yếu 36 Bảng 4.5: Bề rộng vòng kháng của các dòng vi khuẩn lactic có tính kháng trung bình 37 Bảng 4.5: Bề rộng vòng kháng của các dòng vi khuẩn lactic có tính kháng mạnh 38 Bảng 4.7: Kết quả kiểm tra tính kháng của các dòng vi khuẩn lactic đối với E. ictaluri 40 TÓM TẮT Ứng dụng vi sinh vật hữu ích (probiotics) trong nuôi trồng thủy sản, đặc biệt là trong công tác phòng trị bệnh trên cá ngày càng phát triển. Điều này phải nói đến vai trò quan trọng của vi khuẩn lactic, đây là nhóm vi khuẩn đang được nghiên cứu sâu rộng bởi đặc tính kháng khuẩn của chúng đối với các loài vi khuẩn gây hại. Do đó, việc tìm một số dòng vi khuẩn lactic kháng với vi khuẩn Ewardsiella ictaluri nhằm tìm ra các dòng vi khuẩn lactic có tính chất đối kháng với vi khuẩn Edwardsiella ictaluri gây bệnh gan thận mủ trên cá Tra nuôi tại Đồng Bằng Sông Cửu Long. Kiểm tra tính kháng của 54 dòng vi khuẩn lactic được phân lập trên các sản phẩm thủy sản lên men (mắm và nước mắm) bằng phương pháp giếng khuếch tán (Well Diffusions Method, Tagg et al., 1976) với vi khuẩn chỉ thị là Edwardsiella ictaluri. Kết quả đã xác định được 39 dòng có tính kháng lại vi khuẩn Edwardsiella ictaluri được thể hiện qua giá trị trung bình bề rộng vòng kháng khuẩn. Trong đó, xuất hiện 11 dòng với bề rộng vòng kháng từ 0,5 – 1 mm (tính kháng yếu), 15 dòng có bề rộng vòng kháng 1,17 – 2 mm (tính kháng trung bình), 13 dòng có bề rộng vòng kháng từ 2,5 – 3,33 mm (tính kháng mạnh). Như vậy, có thể sử dụng vi khuẩn lactic ức chế vi khuẩn E. ictaluri. Từ khóa: Vi khuẩn lactic, Edwardsiella ictaluri, Giếng khuếch tán, Kháng khuẩn. LỜI CẢM TẠ Sau 2 tháng thực tập từ tháng 3 năm 2011 đến tháng 5 năm 2011, tại Phòng thí nghiệm Thủy sản-Sinh hóa-vi sinh-ký sinh-Hóa phân tích-kiểm nghiệm, Khoa Sinh học Ứng dụng , trường Đại học Tây Đô. Áp dụng những kiến thức đã học kết hợp với kinh nghiệm thực tế, nay luận văn đã được chỉnh sửa và hoàn thành. Trước hết em xin chân thành cảm tạ Ban Giám Hiệu Trường Đại Học Tây Đô đã tạo mọi điều kiện thuận lợi cho em trong suốt thời gian học tập tại trường. Em xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc đến Thầy Nguyễn Văn Bá, Thầy Nguyễn Thành Tâm đã tận tình chỉ dạy cho em trong quá trình học tập và hướng dẫn chỉ bảo em trong suốt quá trình thực hiện đề tài. Em xin chân thành cảm ơn đến tất cả quý Thầy Cô - Khoa Sinh Học Ứng Dụng – Trường Đại Học Tây Đô đã tận tình dạy bảo, truyền đạt cho em những kiến thức quý báu trong suốt thời gian học và tạo mọi điều kiện thuận lợi để luận văn được hoàn thành, tạo dựng hành trang để em bước vào cuộc sống sau này. Em xin cảm ơn chị Trần Ngọc Huyền, đã giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi để em thực hiện đề tài. Cuối cùng tôi xin cảm ơn đến gia đình, bạn bè, cùng tập thể lớp Thủy sản K2, tập thể lớp Thủy sản K3 đã giúp đỡ, động viên tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện đề tài. Em xin chân thành cảm ơn và ghi nhớ ! Cần thơ, ngày tháng năm Sinh viên thực hiện LÊ VĂN TOÀN CHƯƠNG 1 ĐẶT VẤN ĐỀ 1.1 Giới thiệu Sản lượng cá Tra tăng rất nhanh từ 52.248 tấn (2000) đến 1.128.014 tấn (2008), ước tính sản lượng tăng xấp xỉ 22 lần trong vòng tám năm (Viện Nuôi Trồng Thủy Sản II). Theo nguồn thông tin từ BBC-NEW, khối lượng xuất khẩu cá Tra năm 2010 đạt mức cao, khoảng 645.000 tấn . Sản lượng cá Tra ngày càng gia tăng đi đôi với sự suy thoái môi trường do nước thải và bùn ao nuôi cá Tra thâm canh thải trực tiếp ra sông, dẫn đến bùng phát dịch bệnh, gây thiệt hại cho người nuôi. Phương pháp phòng và trị bệnh truyền thống đã lạm dụng kháng sinh và hóa chất diệt khuẩn đồng thời tạo ra những chủng vi khuẩn gây bệnh kháng thuốc và tăng độc lực. Để thay thế dần phương pháp phòng trị bệnh truyền thống, phương pháp phòng và trị bằng liệu pháp sinh học ngày càng được ưa chuộng như vắc-xin, các chất tăng cường hệ miễn dịch từ vi sinh vật hữu ích. Nghiên cứu về vắc-xin ứng dụng trên cá Tra vẫn đang được nhiều nhà khoa học quan tâm. Vắc-xin được cho là phương pháp hiệu quả nhất trong phòng ngừa một số bệnh gây ra bởi vi khuẩn và vi rút nhưng chưa được sử dụng phổ biến có thể là do giá thành quá cao, thời gian nghiên cứu lâu, thường gây sốc cho cá. Những thành công đáng chú ý là việc sử dụng các chất tăng cường hệ miễm dịch thân thiện với môi trường và có phổ phòng ngừa bệnh rộng. Hơn thế nữa, phương pháp trị liệu sinh học bằng vi sinh vật có lợi (probiotic) được mong đợi và trở thành công cụ phòng ngừa, điều trị nhiều bệnh hiệu quả trong nuôi trồng thủy sản thông qua khả năng cải thiện môi trường nước và ức chế vi sinh gây bệnh. Đặc biệt là các vi sinh vật có lợi có khả năng tiết ra các sản phẩm làm giảm độc và đồng thời ức chế sự phát triển của các vi khuẩn gây bệnh. Trong đó nhóm vi khuẩn lactic được phân lập từ thực phẩm lên men truyền thống có nguồn gốc từ thủy sản (tôm, cua, cá, tép và các loài thủy sản khác) có tính đối kháng với vi khuẩn Edwardsiella ictaluri (nguyên nhân gây bệnh gan thận mủ trên cá da trơn, đặc biệt là cá Tra nuôi) đang là một giải pháp có triển vọng trong việc phòng trừ bệnh gan thận mủ trên cá Tra hiện nay. Do đó, đề tài “Tìm một số dòng vi khuẩn lactic kháng vi khuẩn Edwardsiella ictaluri” được thực hiện. 1.2 Mục tiêu nghiên cứu Nhằm tìm ra các dòng vi khuẩn lactic có tính chất đối kháng với vi khuẩn Ewardsiella ictaluri gây bệnh gan thận mủ trên cá Tra. 1.3 Nội dung nghiên cứu Dùng phương pháp giếng khuếch tán (Well Diffusion Method; Tagg et al., 1976) để đánh giá khả năng đối kháng của các dòng vi khuẩn lactic (đã được phân lập từ các sản phẩm lên men truyền thống có nguồn gốc từ động vật thủy sản đối với vi khuẩn Edwardsiella ictaluri gây bệnh gan thận mủ trên cá Tra. CHƯƠNG 2 LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 2.1 Tổng quan về vi khuẩn Edwardsiella ictaluri (E. ictaluri) 2.1.1 Một số nghiên cứu trên vi khuẩn E. ictaluri Vi khuẩn E. ictaluri lần đầu tiên được phân lập trên cá Nheo Mỹ (Hawke, 1979) gây bệnh nhiễm trùng máu cấp tính trên cá Nheo Mỹ gây tỷ lệ hao hụt cao, với tên là Enteric Septicemia of catfish (ESC), gây thiệt hại lớn cho ngành công nghiệp nuôi cá Nheo. Vào năm 2001, Ferguson et al. đã phát hiện bệnh này và được ghi nhận xuất hiện lần đầu tiên trên cá Tra nuôi ở Đồng Bằng Sông Cửu Long (ĐBSCL) vào cuối năm 1998 và có tên là Bacillary Necrosis of Pangasius (BNP). Từ Thanh Dung và csv, 2001 (được trích dẫn bởi Huỳnh Chí Thanh, 2007) đã phân lập được vi khuẩn E. ictaluri trên cá Tra bệnh. Zilong Tan et al., (2003) cũng đã phân lập vi khuẩn E. ictaluri trên cá Tra nuôi bè ở Việt Nam với dấu hiệu bệnh có nhiều nốt trắng trên gan. Vi khuẩn E. ictaluri còn gây bệnh trên một số loài cá trong điều kiện thí nghiệm như: cá hồi (Chinook salmon Oncarhynchus tshauytscha) và cá hồi (Ranbow trout Oncorhynchus mykiss) (Trần Trọng Nguyễn, 2010). Ở Việt Nam, vi khuẩn E. ictaluri gây bệnh chủ yếu trên cá Tra (ở tất cả các giai đoạn phát triển). Tỷ lệ hao hụt lớn là trên cá Tra giống, nhưng gây thiệt hại về kinh tế lớn nhất ở giai đoạn cá Tra thịt cỡ 300 – 500g (Từ Thanh Dung và csv, 2004). 2.1.2 Đặc điểm sinh học vi khuẩn E. ictaluri Vi khuẩn E. ictaluri Vi khuẩn E. ictaluri được mô tả bởi Hawke et al. (1981) (được trích dẫn bởi Huỳnh Chí Thanh, 2007) là một loài đặc trưng thuộc nhóm Enterbacteriaceae, gram âm, hình que ngắn khoảng 0,75 x 1,5 µm, di động chủ yếu ở 25 oC và bất di động ở nhiệt độ 30 oC, oxidase âm tính, catalase dương tính , L-Lysin, L-Ornithin và Gas from Glucose dương tính, sinh H2S và Indol âm tính, có khả năng lên men, không có khả năng chịu được độ mặn cao hơn 1,5%. E. ictaluri phát triển trên môi trường thạch rất chậm, trên môi trường TSA (Tryptone sova agar) sau 48 giờ ở 28 oC hình thành khuẩn lạc nhỏ, tròn và trắng đục. Chúng có môi trường đặc trưng là EMB (Eosin Methylen Blue), EIA (Ewardsiella ictaluri Agar).
Hình 2.1: Tế bào của Edwardsiella ictaluri ( Nguồn: www.textbookofbacteriology.net) 2.1.3 Bệnh do vi khuẩn E. ictaluri gây ra trên cá da trơn Bệnh gan thận mủ trên cá Tra xuất hiện lần đầu tiên vào cuối năm 1998, tác nhân gây bệnh lúc đầu được xác định bởi nhóm nghiên cứu của trường Đại học Stirling phối hợp với trường Đại học Cần Thơ là Bacillus sp (Ferguson và et al., 2001). Đến năm 2002, nhóm nghiên cứu này đã đính chính lại tác nhân gây bệnh gan thận mủ trên cá Tra là vi khuẩn E. ictaluri (Crumlish et al., 2002). E. ictaluri được báo cáo đầu tiên trên cá nheo Mỹ (Ictalurus punctatus) vào năm 1979 (Hawke, 1979 được trích dẫn bởi Lê Minh Dương, 2007). E. ictaluri gây bệnh nhiễm khuẩn đường ruột cấp tính trên cá da trơn, hội chứng này được gọi tắt là ESC (Enteric Septicaemia of Catfish) và có thể dẫn đến tỉ lệ chết cao ở cá Nheo Mỹ (Austin và Austin, 1999). Bệnh này được tìm thấy tại bất cứ nơi nào nuôi cá Nheo tại nước Mỹ. Bệnh xảy ra ở tất cả các kích cỡ cá nuôi nhưng tập trung ở giai đoạn cá hương và cá giống (USDA/APHIS, 2003). Sự thiệt hại cho nghề nuôi công nghiệp của cá da trơn do ESC được ước tính hàng năm khoảng 4 – 6 triệu USD tính từ năm 1990 và đã tăng nhanh sau đó. Khoảng 70% các hộ nuôi được khảo sát vào năm 1996 cho thấy nguyên nhân từ ESC đã gây ra thiệt hại cao nhất cho các hộ nuôi cá da trơn, với 57% số hộ nuôi bị thiệt hại nặng (USDA/APHIS, 1997) (được trích dẫn bởi Trần Trọng Nguyễn, 2010). Theo Tucker et al. (2004) thì bệnh ESC xảy ra theo mùa, đặc biệt xảy ra thường xuyên khi nhiệt độ nước nằm trong khoảng 20 – 29 oC . Cá bị bệnh ESC thường giảm ăn, lờ đờ, bơi dạng xoay vòng, xuất huyết xung quanh vùng miệng và phần bụng. Nhiều vết lở loét nhỏ màu trắng có thể xuất hiện trên bề mặt da. Cá nhiễm bệnh thường lồi mắt và bụng trương to. 2.1.4 Ứng dụng vi sinh vật hữu ích trong phòng trị bệnh gan thận mủ trên cá da trơn Trong những năm gần đây, một số nhóm nghiên cứu đã quan tâm đến việc phát triển các chế phẩm vi sinh và một số chế phẩm sinh học khác bổ sung vào thức ăn để phòng bệnh ESC ở cá Nheo Mỹ (Ictalurus punctatus). Theo Aboagye (2008) thử nghiệm ảnh hưởng của chế phẩm vi sinh Lymnozyme đến tỉ lệ sống của cá Nheo Mỹ sau khi được gây nhiễm thực nghiệm với E. ictaluri. Kết quả nghiên cứu cho thấy, ở nghiệm thức có bổ sung Lymnozyme vào nước hàng ngày liên tục trong hai tuần, tỷ lệ chết của cá là 45% sau khi gây nhiễm E. ictaluri, giảm một cách có ý nghĩa thống kê (p < 0,05) so với nghiệm thức đối chứng là 80%. Các nhà khoa học Na Uy và Mỹ đã nghiên cứu hiệu quả kháng khuẩn của hai lọai peptide tổng hợp cecropin B và cecropin P1 đối với một số chủng vi khuẩn gây bệnh trên cá, trong đó có E. ictaluri. Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của cecropin B dao động từ 0,3 – 1,3 µm. Các dẫn xuất của cecropin B đã được biết đến có họat tính kháng khuẩn đối với nhiều loài vi khuẩn gây bệnh, và có khả năng tăng cường tính đề kháng của cá Nheo Mỹ gây cảm nhiễm với E. ictaluri (Kelly et al., 1993). Hiện nay, một số chế phẩm vi sinh đã được ứng dụng trong sản xuất giống và nuôi thương phẩm cá Tra nhằm thay thế cho việc sử dụng kháng sinh. Các chế phẩm này được bổ sung vào trong thức ăn dưới dạng men vi sinh, đồng thời được bổ sung vào nước để xử lý môi trường. Gần đây, chế phẩm sinh học Bokashi được chiết xuất từ lá trầu của nhóm nghiên cứu Khoa Thủy sản, trường Đại học Nông Lâm Huế được xem là một trong những hướng nghiên cứu đột phá trong việc phòng và trị bệnh cho tôm cá. Thành phần hệ vi sinh vật trong chế phẩm này bao gồm vi khuẩn lactic 50%), vi khuẩn quang hợp (20%), nấm men (20%), xạ khuẩn (5%), nấm sợi (5%). Qua kết quả thử nghiệm của Công ty TNHH Hải Nông Phát thành phố Hồ Chí Minh trên một số ao nuôi cá Tra, Basa từ tháng 4 năm 2006 đến nay đã đạt được những thành công nhất định trong việc phòng bệnh gan thận mủ (Nguyễn Khoa Diệu Hà, 2009 được trích dẫn bởi Trần Trọng Nguyễn, 2010). Với mong muốn phòng trừ bệnh gan thận mủ trên cá Tra bằng cách sử dụng các dòng vi sinh đối kháng với vi khuẩn E. ictaluri được sàn lọc từ ba nhóm vi khuẩn khác nhau: Nhóm vi khuẩn phân hủy quorum sensing; Nhóm vi khuẩn sinh axít lactic; Nhóm Bacilus spp. Ngày 11/3/2010, Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản II đã tổ chức Hội thảo và triển khai đề tài ‛‛Tạo chế phẩm vi sinh đối kháng với vi khuẩn Ewardsiella ictaluri gây bệnh gan thận mủ ở cá Tra nuôi” do Võ Minh Sơn làm chủ nhiệm. Trong phần nội dung đề tài Nguyễn Ngọc Tĩnh đã trình bày phương pháp tiếp cận mới trong việc phân lập các dòng vi khuẩn phân hủy phân tử Quorum Sensing, các phân tử tín hiệu có liên quan đến độc lực của vi khuẩn gây bệnh và cho biết gần đây các nhà khoa học ở Viện Hải dương học Trung Quốc đã xác định được hai loại phân tử tín hiệu Quorum Sensing hiện diện ở vi khuẩn E. ictaluri là N-Hexanoyl homoserine lactone và N-Butyryl homoserine lactone (Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản II, 2010). Cũng trong năm 2010, đề tài đã thực hiện nội dung về: phân lập, tuyển chọn các dòng vi khuẩn có đặc tính đối kháng vi khuẩn E. ictaluri gây bệnh gan thận mủ trên cá Tra và đã đạt một số kết quả khả quan. Trong 6 tháng đầu năm (vào mùa khô), đề tài tiến hành 3 đợt thu mẫu (hệ tiêu hóa cá tra thịt và giống, nước, bùn) của cá Tra tại 3 tỉnh Tiền Giang, Vĩnh Long và Đồng Tháp. Tổng số mẫu thu được là 158 mẫu (nguyên liệu dùng sàng lọc vi khuẩn), trong đó hệ tiêu hóa cá thịt chiếm 27%, hệ tiêu hóa cá giống chiếm 30%, bùn 26%, nước 17%. Ngoài ra đề tài thu thêm 10 mẫu hệ tiêu hóa cá Tra giống và thịt tại Trà Vinh. Sàng lọc các vi khuẩn qua AHLs (N-acyl homoserine lactone), đề tài đã thu được 370 khuẩn lạc. Từ những khuẩn lạc trên đề tiếp tục sàng lọc để tìm ra những chủng vi khuẩn có khả năng đồng thời phân hủy phân tử tín hiện C6-HHL (N-Hexanoyl-DL-homoserine lactone) và hoạt động đối kháng (antagonistic activity) với vi khuẩn gây bệnh gan thận mủ E. ictaluri. Kết quả qua sàng lọc 50 khuẩn lạc đã có hơn 6 khuẩn lạc có khả năng phân hủy hoàn toàn phân tử tín hiệu C6-HHL và đối kháng vi khuẩn E. ictaluri có vòng vô khuẩn từ 18 – 40 mm (bằng phương pháp đục lỗ trên thạch, disc-diffusion method, well-diffusion method, cross-streak method) (Võ Minh Sơn và Nguyễn Thị Ngọc Tĩnh, 2010). Trong nghiên cứu “Giải pháp mới cải thiện tăng trưởng, hiệu quả sử dụng thức ăn và tình trạng sức khỏe của cá Tra (Pangasianodon hypophthalmus)“, Khoa Thủy sản - trường Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh có kết luận: khi gây cảm nhiểm bệnh với vi khuẩn gây bệnh gan thận mủ (E. ictaluri) bổ sung 0,2% AQUAVIANCE (một loại thức ăn có bổ sung tinh dầu thiết yếu và Prebiotics Fructo Oligosaccharides có tác dụng ức chế vi khuẩn có hại, làm gia tăng vi khuẩn có lợi đường ruột: Bacteroides, Lactobacilli, Bifidobacterium, giúp vật nuôi tăng cường sức đề kháng, gia tăng trọng lượng) giúp cá khỏe hơn và giảm chết so với lô đối chứng (Võ Thị Thanh Bình và Lê Thanh Hùng, 2008). Mannan-oligosaccharide, một loại hợp chất chiết xuất từ nấm men, đã được chứng minh là có hiệu quả tăng cường đáp ứng miễn dịch và tính đối kháng đối với vi khuẩn Edwardsiella ictaluri trên cá Nheo Mỹ Ictalurus punctatus (Welker et al., 2007). 2.2 Vi khuẩn lactic (Lactic acid bacteria = LAB) 2.2.1 Khái niệm vi khuẩn lactic Vi khuẩn lactic là nhóm vi khuẩn lên men hiđrat cacbon khi có hoặc không có oxy và tạo nên sản phẩm chính cuối cùng là axít lactic. LAB chịu đựng cao với điều kiện axít, tham gia tạo thành sữa chua, phomat, dưa muối và thức ăn ủ chăn nuôi, là nguyên nhân làm hư hại thực phẩm và một số là tác nhân gây bệnh nhiễm khuẩn ở vùng mũi họng. LAB được chia thành hai nhóm: nhóm lên men lactic đồng hình (sản phẩm lên men chỉ thuần axít lactic) và nhóm lên men lactic dị hình (sản phẩm lên men ngoài axít lactic còn có êtanol, CO2 hoặc axít axêtic). LAB đồng hình bao gồm ba nhóm: cầu khuẩn (Streptococcus lactic, S.faecalis, Pediococcus cerevisia), trực khuẩn ưa nhiệt (Lactobacillus lactic, L.helvetcus, L.bulgaricus), trực khuẩn ưa ấm (Lactobacillus casei, L. plantarum) (Từ điển Bách khoa toàn thư Việt Nam, 2011). LAB thuộc vi khuẩn Gram dương, không sinh bào tử, có khả năng lên men đường để tạo axít lactic. Nhóm vi khuẩn lactic được xếp chung vào họ Lactobacteriaccae và được xếp vào năm giống: Streptococcus, Pediococcus, Lactobacillus, Leuconostoc, và Bifidobacterium Aerococcus. Ngoài ra chúng còn có các chi khác như Carnobacterium, Aerococcus, Enterococcus, Vagococcus, Oenococcus, Tetragenococcus, và Weissella. LAB có rất nhiều hình dạng khác nhau: dạng trực khuẩn ngắn hoặc dài ở dạng đơn, đôi hoặc xếp thành chuỗi; hình cầu hoặc cầu trực khuẩn ở dạng đơn, đôi, đám hoặc xếp thành chuỗi. Ngoài ra vi khuẩn lactic còn có dạng hình que. Khuẩn lạc của LAB tròn nhỏ, trong bóng, có màu môi trường, màu trắng đục hoặc màu vàng kem hoặc khuẩn lạc có kính thước to hơn tròn lồi trắng đục. Đặc biệt khuẩn lạc tỏa ra mùi chua của axít (Nguyễn Thị Bích Thùy, 2009) Vi khuẩn lactic có vai trò quan trọng trong công nghiệp sữa, muối chua rau quả, làm yaourt, cũng như trong nông nghiệp và dược phẩm. Và một đặc tính khác của vi khuẩn lactic đã được xem trọng là chúng có khả năng tạo ra bacteriocin (chất kháng khuẩn) như lactacin, brevicin, lacticin, helveticin, sakacin, plantacin, có tác dụng ức chế một số vi sinh vật gây bệnh, ngăn chặn sự phát triển của các nguồn bệnh trong thực phẩm (Batt, 1999; Dubernet et al., 2002) 2.2.2 Đặc tính chung LAB có thể lên men được các đường monosaccharid, đường disaccharid, protein tan, peptone và axít. Phần lớn chúng không lên men được tinh bột và các polisaccharid khác. Theo khóa phân loại của Bergey (1974) giới thiệu về các giống của LAB, thì có 5 giống phù hợp với mô tả chung về vi khuẩn lactic: Streptococcus, Pediococcus, Lactobacillus, Leuconostoc, Aerococcus. Trong 5 giống thuộc vi khuẩn lactic thì có 4 giống được mô tả và nghiên cứu nhiều nhất đó là: Streptococcus, Pediococcus, Lactobacillus, Leuconostoc, đây là những trực khuẩn hoặc cầu khuẩn không tạo bào tử. Tất cả vi khuẩn lactic đều không chuyển động, Gram dương, hô hấp yếm khí tùy nghi. Đường kính của các dạng cầu khuẩn lactic từ 0,5 – 1,5 μm. Các tế bào hình cầu xếp thành cặp hoặc hình chuỗi có chiều dài khác nhau. Kích thước tế bào trực khuẩn lactic từ 1– 8 μm. Trực khuẩn đứng riêng rẻ hoặc kết thành chuỗi. Các loài LAB có khả năng rất khác nhau khi tạo thành axít lactic trong môi trường, và sức chịu axít (hay độ bền axít) cũng rất khác nhau. Đa số các trực khuẩn lactic đồng hình tạo thành axít lactic cao hơn liên cầu khuẩn. Các trực khuẩn này có thể phát triển ở pH 3,8 – 4 (cầu khuẩn không thể phát triển được ở môi trường này), hoạt lực lên men tốt nhất của trực khuẩn ở vùng pH 5,5 – 6. Nhiệt độ sinh trưởng tối thích của vi khuẩn lactic ưa ấm là 25 – 35 oC, ưa nhiệt là 40 – 45 oC và ưa lạnh là thấp hơn 5 oC. Khi gia nhiệt khoảng 60 – 80 oC thì hầu hết chúng bị chết sau 10 – 30 phút. Trong tự nhiên, vi khuẩn lactic thường gặp ở trong đất, trong nước, trong không khí, nhưng chủ yếu là ở thực vật và các sản phẩm thực phẩm (trên các loại rau, quả, sữa, thịt). 2.2.3 Đặc điểm hình thái Theo Ring và Gatesoupe (1998), chia vi khuẩn lactic thành dạng hình cầu và hình que. Kích thước của chúng thay đổi tùy từng loài. 2.2.3.1 Giống Lactobacillus Đặc điểm: Tế bào có dạng hình que. Tùy vào điều kiện của môi trường sống mà hình dạng của chúng thay đổi từ hình que ngắn đến dài. Sắp xếp thành chuỗi hay đứng riêng lẽ. là giống được sử dụng rộng rãi, là loài có khả năng chịu đựng pH acid thấp. Kích thước tế bào 0,5 – 1,2 x 1,0 – 10,0 μm. Ở pha tăng trưởng, tế bào thường tạo chuỗi. Không di động, không tạo bào tử, tế bào non gram dương và gram âm khi tế bào già. Trên môi trường agar, khuẩn lạc lồi, mép trơn, đục có đường kính 2 – 5 mm. Hiếm khi tạo sắc tố nhưng khi tạo sắc tố thì thường là màu vàng, màu cam hay màu gỉ sắt và màu đỏ gạch. Lactobacillus kỵ khí tùy ý, một vài chủng vi hiếu khí hay kỵ khí nghiêm ngặt. Phát triển mạnh trong môi trường agar, kỵ khí có 5 – 10% O2. Các thử nghiệm catalase, cytochrome và benzidine âm tính. Hình 2.2: Tế bào của Lactobacillus acidophilus ( Nguồn: www.textbookofbacteriology.net) Các loài thuộc giống Lactobacillus lên men lactic đồng hình Lactobacillus acidophilus Lactobacillus bulgaricus Lactobacillus plantarum: là loài vi sinh hữu ích, hiện diện trong nước bọt và đường tiêu hóa của người (Lonnermark et al., 2009), được sử dụng phổ biến trong việc lên men thực phẩm. Lactobacillus plantarum NCDO 1193 sinh ra một dạng bacteriocin có tên là Plataricin B hoạt động ức chế đáng kể các loài vi khuẩn gram âm và gram dương (Charlotte A. West and Philip J. Warner, 1998).