Luận văn Tinh chế và phân tích đặc tính liên kết O - Glycan của lectin từ rong đỏ Hydropuntia eucheumatoides

gel Sephacryl S-200 (Pharmacia, Uppsala – Thụy điển). - Nhựa sắc kí trao đổi ion DEAE-sepharose Fast Flow (Pharmacia, Uppsala – Thụy điển) - Enzyme trypsine, papain (Sigma – Mỹ). - Thuốc thử Folin (Merck – Đức) - BSA (Bovine serume albumin – Đức). - Hóa chất phân tích các loại: NaH2PO4, Na2HPO4, NaCl, CuSO4, NaOH, Na2CO3, H2SO4, CH3COOH, glyxerol. Tất cả các hóa chất sử dụng trong nghiên cứu đều đạt hạng phân tích. 2.2.3. Thiết bị s dụng trong nghi n cứu Một số thiết bị sử dụng trong nghiên cứu gồm: Bảng 2.1. Các thiết bị chính đƣợc sử dụng trong thí nghiệm STT Thiết bị Model máy Xuất sứ 1 Máy đo quang phổ UV-Vis 6405UV/VIS Jenway-Anh 2 Máy ly tâm Z36HK Hermel-Đức 3 Máy ly tâm eppendorf 5417R Eppendorf – Đức 4 Máy đo pH 827pH Lab Metrohm-Thụy Sỹ 5 Bể ổn nhiệt B12 Heraeus-Đức 6 Bể siêu âm UTRASONIC Hàn quốc 7 Hệ thống sắc ký lọc gel GPC-2414 Waters-Mỹ 42 8 Thiết bị điện di đứng AJ-6530 Atto-Japan 9 Tủ ấm ON-11E Gallenkamp 10 Máy lắc (kiểu tròn) 3017 GFL – Đức 11 Cân phân tích CP224S Satorius – Đức 12 Bộ siêu lọc Toya-Roshi, UHP43 Nhật 13 Máy đo quang Spectro UV 2505/24RS Labomed 14 Cột sắc kí ion 1,6x20 (cm) GE Healthcare – Thụy điển 15 Các loại Micropipet 2 20 ;20 200 ;...l l Nichiryo – Nhật 16 Khay 96 giếng đáy chữ V Polystyrene Greiner – Đức 17 Hệ thống bơm và thu phân đoạn Frac-920 GE Healthcare – Thụy điển 2.3. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.3.1. Chuẩn bị huyền phù hồng cầu máu 2 % (hồng cầu máu thỏ, cừu, gà và các nhóm máu ngƣời A, B, O) : Mỗi mẫu máu đƣợc rửa từ 3 đến 5 lần với 50 thể tích dung dịch NaCl 0,15 M. Sau khi rửa, huyền phù hồng cầu máu 2 % (v/v) đƣợc chuẩn bị bằng cách thêm dung dịch đệm photphat 0,02 M có chứa NaCl 0,15 M, pH = 7,2 và đƣợc dùng nhƣ hồng cầu tự nhiên [13]. Hồng cầu các mẫu máu đƣợc xử lý enzyme tripsin hay papain đƣợc chuẩn bị nhƣ sau: 1 10 thể tích của dung dịch trypsin hay papain 0,5 % (w/v) đƣợc thêm vào huyền phù các mẫu máu tự nhiên 2% (v/v), trộn đều và đƣợc ủ ở 37 oC trong 60 phút. Sau khi ủ, hồng cầu các mẫu máu đƣợc rửa từ 3 đến 5 lần với dung dịch muối và hòa lại bằng dung dịch đệm photphat 0,02 M có 43 chứa NaCl 0,15 M, pH = 7,2. Ta thu đƣợc huyền phù hồng cầu các mẫu máu 2 % đã xử lý enzyme trypsin hay papain [13]. 2.3.2. Phân tích hoạt tính ectin bằng phƣơng pháp ngƣng kết hồng cầu (hồng cầu máu thỏ, cừu, gà và các nhóm máu ngƣời A, B, O). Hoạt tính của lectin đƣợc xác định dựa trên phƣơng pháp ngƣng kết hồng cầu [13]. Các thí nghiệm phân tích hoạt tính của lectin đƣợc thực hiện trong đĩa 96 giếng đáy chữ V. Đầu tiên, cho 25 µL dung dịch đệm photphat 0,02 M có chứa NaCl 0,15 M, pH = 7,2 vào mỗi giếng của đĩa 96 giếng đáy chữ V. Tiếp đến cho 25 µL mẫu dịch chiết lectin cần phân tích hoạt tính ngƣng kết hồng cầu vào giếng đầu tiên, trộn đều, pha loãng sang các giếng tiếp theo với tỷ lệ pha loãng là n 1 2 (n: số lần pha loãng) và giữ ở nhiệt độ phòng trong khoảng thời gian 1 giờ. Sau đó, tiếp tục thêm 25 µL hồng cầu 2 % vào tất cả các giếng, lắc nhẹ nhàng hỗn hợp và giữ ở nhiệt độ phòng trong 2 giờ. Đọc kết quả. Kết quả dƣơng tính đƣợc thể hiện khi hình thành một lớp chất keo đồng nhất trên bề mặt giếng. Kết quả thử nghiệm là âm tính khi tất cả hồng cầu lắng xuống đáy giếng thành chấm nhỏ. Hoạt tính của lectin (HU/mL) đƣợc thể hiện nhƣ là một tiêu chuẩn, và là giá trị nghịch đảo của độ pha loãng lớn nhất mà dịch chiết lectin còn có khả năng làm ngƣng kết hồng cầu cho vào phản ứng. Thí nghiệm đƣợc thực hiện 3 lần đối với mỗi loại hồng cầu đƣợc thử nghiệm. Hoạt tính lectin: đƣợc xác định theo 2 chỉ số: - Hoạt tính tổng (Utổng): là tổng số đơn vị hoạt tính có trong một thể tích nhất định. Đơn vị: HU Utổng = V. 2 n Trong đó: V: tổng thể tích (mL) n: số lần pha loãng - Hoạt tính riêng (Uriêng): là số đơn vị hoạt tính lectin có trong 1mg protein. 44 Đơn vị: HU/mg Pr toång rieâng toång U U otein Trong đó: Utổng: tổng số đơn vị hoạt tính. Proteintổng: tổng hàm lƣợng protein. MAC (minimum agglutination concentration): là nồng độ protein nhỏ nhất có khả năng gây ngƣng kết hồng cầu đã đƣợc xử lý enzyme. Đơn vị : µg/mL Haøm löôïng protein MAC HA 2.3.3. Xác định hàm ƣợng protein. Xác định hàm lƣợng protein bằng phƣơng pháp của Lowry và cộng sự [130], dùng albumin huyết thanh bò (BSA – Bovine serium albumin) làm chất chuẩn. * Nguyên tắc Trong môi trƣờng kiềm, ion Cu2+ tạo thành phức chất với các liên kết peptide trong protein, khi đó nó bị khử thành ion Cu+. Ion Cu+ và các gốc của Tyrosine, Tryptophan và Cysteine phản ứng với thuốc thử Folin để tạo ra một sản phẩm không bền rồi bị khử thành molipden/vonfram xanh. Cƣờng độ màu tỷ lệ thuận với nồng độ protein trong một phạm vi nhất định. Đo cƣờng độ màu bằng thiết bị đo màu quang điện ở bƣớc sóng 750nm. Dựa vào đồ thị protein chuẩn (BSA) có thể xác định đƣợc hàm lƣợng protein ở nồng độ vài chục µg. * Hóa chất - Dung dịch A: 4 gam NaOH (0,1 M) và 20 gam Na2CO3 2 % pha trong 1000 mL nƣớc cất. - Dung dịch B: 0,5 gam CuSO4.5H2O 0,5 % pha trong dung dịch Natri Xitrat (1 %) hoặc trong dung dịch Natri – Kali Tactrat 1 %. - Dung dịch C: hỗn hợp của 2 dung dịch A và B theo tỉ lệ 49:1 (v/v), pha trƣớc khi sử dụng. 45 Ghi chú: Thuốc thử Folin, pha loãng 2 lần với nƣớc cất trƣớc khi sử dụng. - Dung dịch gốc: Albumin huyết thanh bò (BSA) 1mg/mL. * Các bƣớc tiến hành - Cân 10 mg BSA hòa tan trong 10 mL nƣớc cất, thu đƣợc dung dịch gốc có nồng độ 1 mg/mL. - Sau đó, pha loãng dung dịch gốc bằng nƣớc cất thành các nồng độ 20, 40, 60, 80, 100 và 120 µg/mL để tiến hành xây dựng đƣờng chuẩn. - Lấy chính xác 0,5 mL dịch chứa protein với các nồng độ khác nhau cho vào ống nghiệm, thêm vào đó 2,5 mL dung dịch C, lắc đều để yên trong 20 phút. - Sau đó, thêm vào hỗn hợp trong ống nghiệm 0,25 mL thuốc thử Folin đã pha loãng 2 lần, lắc đều và để yên trong 60 phút. - Đem so màu của hỗn hợp trên máy so màu quang điện ở bƣớc sóng 750nm. Thực hiện thí nghiệm với mẫu kép, lấy giá trị trung bình, xây dựng đƣờng hồi quy. Kết quả đƣợc xử lý theo phƣơng pháp thống kê thông thƣờng. Mẫu thí nghiệm cũng đƣợc chuẩn bị tƣơng tự nhƣ đã nêu trên. Sau đó, đem so màu ở bƣớc sóng 750nm, đối chiếu với đồ thị chuẩn BSA (Phụ lục 1) để tính hàm lƣợng protein trong các mẫu. 46 2.3.4. Sơ đồ bố trí thí nghiệm thực nghiệm: Rong H. eucheumatoides Xử lý Chiết Lọc, ly tâm thu dịch chịchie61t Kết tủa dịch chiết Ly tâm, thu tủa Hòa tan tủa, thẩm tách Ly tâm, thu dịch trong Sắc ký trao đổi ion Thu các phân đoạn có lectin cô đặc Sắc ký lọc gel Sephacryl S - 200 Điện di SDS - PAGE Lectin Bã Dịch Xác định: - Đặc tính liên kết cacbohiđrat - Các yếu tố ảnh hƣởng đến hoạt tính Lectin: pH, nhiệt độ, - Khả năng gây ngƣng kết hồng cầu. - Điện di SDS-Page, xác định: + Độ tinh sạch của lectin thu nhận đƣợc +Trọng lƣợng phân tử của Lectin thu đƣợc Cặn Khảo sát điều kiện chiết: - Dung môi chiết. - Tỷ lệ nguyên liệu: dung môi chiết (w/v). - Thời gian chiết (giờ). Khảo sát: Nồng độ ethanol C2H5OH (%). 47 Mô tả sơ đồ: Rong đỏ H. eucheumatoides sau khi thu về đƣợc rửa sạch, tiến hành xay rong thành bột mịn bằng cối xay inox có bổ sung nitơ lỏng. Cho rong đã xay vào túi nilon và bảo quản trong tủ đông -20 oC để chuẩn bị cho các thí nghiệm sau này. Quá trình chiết lectin đƣợc thực hiện trong các điều kiện tối ƣu nhƣ: tỷ lệ nguyên liệu:dung môi, nồng độ dung môi, thời gian chiết. Dịch chiết thô đƣợc lọc bằng túi vải, tiến hành ly tâm 6.000 vòng/phút trong 15 phút để loại bỏ cặn bã. Thêm ethanol với nồng độ thích hợp vào dịch chiết để kết tủa lectin. Sau khi tủa, tiến hành ly tâm dịch tủa ở 6.000 vòng/phút trong 30 phút. Loại bỏ dịch trong. Dùng lƣợng đệm ít nhất để hòa tan kết tủa. Dịch tủa sau đó đƣợc thẩm tách, rồi tiến hành ly tâm ở 6.000 vòng/phút trong 30 phút, thu phần dịch trong. Đây chính là chế phẩm của lectin. Tiến hành tinh sạch lectin bằng sắc ký trao đổi ion DEAE-sepharose, thu các phân đoạn có hoạt tính ngƣng kết hồng cầu, cô đặc dịch trong bằng màng siêu lọc kích thƣớc 10 kDa. Thẩm tách để loại muối. Tiếp tục tinh chế lectin bằng sắc ký lọc gel Sephacryl S-200, thu các phân đoạn có hoạt tính, cô đặc, thẩm tách trong nƣớc cất để tiến hành các thí nghiệm sau. Lectin thu đƣợc sau sắc ký lọc gel đƣợc dùng để khảo sát một số tính chất lý hóa nhƣ: ảnh hƣởng của nhiệt độ, ảnh hƣởng của pH, ảnh hƣởng của cation hóa trị 2 hay EDTA, đặc tính liên kết cacbohidrat; cũng nhƣ dùng để đánh giá độ tinh sạch, xác định khối lƣợng phân tử của lectin bằng phƣơng pháp điện di. 2.3.5. Phân tích các điều kiện tối ƣu để chiết ectin từ rong đỏ H. Eucheumatoides Nguyên tắc chung: Khi tiến hành phân tích một yếu tố nhất định trong quá trình tách chiết nhƣ: tỷ lệ nguyên liệu:dung môi chiết, nồng độ dung môi, thời gian 48 chiết,thì khi đó sẽ cố định các yếu tố khác và tiến hành thay đổi yếu tố chúng ta đang phân tích. Yếu tố nào phân tích xong thì sẽ đƣợc cố định ở giá trị tối ƣu để tiếp tục phân tích ảnh hƣởng của các yếu tố còn lại. Với mỗi yếu tố phân tích, khi giá trị hoạt tính tổng số và hoạt tính riêng của lectin đạt giá trị cực đại thì đó là điều kiện tối ƣu đối với yếu tố chúng ta đang phân tích. 2.3.5.1. Phân tích tỷ lệ nguyên liệu:dung môi chiết Cân khoảng 5 gam rong đã xay cho vào các ống Falcon, tiếp tục cho vào dung dịch ethanol 20 % với các tỷ lệ nguyên liệu:dung môi (w/v): 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6, 1:7, 1:8, giữ ở 4 oC trong 6 giờ. Sau đó lọc thô qua túi vải rồi ly tâm với tốc độ 6000 vòng/phút trong 15 phút, thu dịch chiết thô (mỗi mẫu đƣợc tiến hành 3 lần lặp lại). Xác định hàm lƣợng protein, hoạt tính tổng số, hoạt tính riêng của từng dịch chiết thô. Phân tích, so sánh và chọn ra tỷ lệ nguyên liệu:dung môi chiết (w/v) thích hợp nhất. 2.3.5.2. Phân tích nồng độ ethanol chiết Cân khoảng 5 gam rong đã xay cho vào các ống Falcon, thêm tiếp dung môi etanol với các nồng độ khác nhau 10 %; 20 %; 30 %; 40 %, với tỷ lệ nguyên liệu:dung môi (w/v) thích hợp, giữ các ống này ở 4 oC trong 6 giờ. Sau đó lọc thô qua túi vải rồi ly tâm với tốc độ 6000 vòng/phút trong 15 phút, thu dịch chiết thô (mỗi mẫu đƣợc tiến hành 3 lần lặp lại). Xác định hàm lƣợng protein, hoạt tính tổng số và hoạt tính riêng của từng dịch chiết thô. Phân tích, so sánh và chọn ra nồng độ dung môi chiết thích hợp. 2.3.5.3. Phân tích thời gian chiết Cho vào các ống Falcon rong đã xay với tỷ lệ nguyên liệu:dung môi tối ƣu, thêm tiếp dung môi ethanol có nồng độ tối ƣu, giữ ở 4 oC và trong các khoảng thời gian khác nhau: 2, 4, 6, 8, 10, 12 (giờ). Sau từng khoảng thời gian 2, 4, 6,(giờ), tiến hành lọc sản phẩm qua túi vải rồi ly tâm với tốc độ 49 6000 vòng/phút trong 15 phút, thu dịch chiết thô (mỗi mẫu đƣợc tiến hành 3 lần lặp lại). Xác định hàm lƣợng protein, hoạt tính tổng số và hoạt tính riêng của từng dịch chiết. Phân tích, so sánh và chọn ra thời gian chiết thích hợp. 2.3.6. Phân tích nồng độ ethanol thích hợp để kết tủa ectin từ dịch chiết. Tiến hành phân tích khả năng tủa lectin từ dịch chiết thô bằng tác nhân tủa là ethanol ở các nồng độ khác nhau. Trƣớc hết cần xác định thể tích dịch chiết thô của lectin, sau đó tính toán theo công thức (*) để xác định thể tích ethanol tuyệt đối (đƣợc giữ lạnh ở -20 o C) cần thêm vào dịch chiết để sau khi trộn nồng độ của ethanol có các giá trị khoảng 50%, 60%, 70%, 80%. Tiến hành trộn và giữ lạnh ở 4 oC qua đêm. Phần kết tủa sẽ đƣợc thu lấy và ly tâm với tốc độ 6000 vòng/phút trong 20 phút ở 4 oC. Kết tủa đƣợc rửa 3 lần với cồn tuyệt đối (giữ lạnh ở -20 oC) và ly tâm ở 6000 vòng/phút trong 20 phút ở 4 oC (Các thí nghiệm đƣợc tiến hành 3 lần và lấy giá trị trung bình). Công thức xác định nồng độ ethanol dùng để kết tủa lectin ứng với thể tích 1,0 lít: 1000(y x) y (mL) (100 x)    [131] Trong đó: x: nồng độ ethanol trong dịch chiết thô. y: nồng độ ethanol thu đƣợc sau khi trộn. 100: nồng độ ethanol tuyệt đối (thực tế nồng độ ethanol tuyệt đối chỉ đạt 96o) Kết tủa lectin thu đƣợc đƣợc hòa với dung dịch đệm photphat 0,02 M không muối, pH= 7,5 (lƣợng ít nhất) để đƣa về cùng thể tích. Sau đó, tiến hành xác định hoạt tính tổng số, hoạt tính riêng, từ đó chọn ra nồng độ tủa thích hợp. 50 2.3.7. Tinh sạch ectin bằng phƣơng pháp sắc ký trao đổi ion DEAE-Sepharose * Nguyên tắc: Nhựa DEAE – Sepharose là nhựa trao đổi anion yếu. Hỗn hợp mẫu qua cột sắc ký chứa nhiều loại protein với khả năng tích điện tích âm khác nhau, do đó, khả năng liên kết với nhựa cũng sẽ khác nhau. Trong quá trình rửa giải, khi thay đổi nồng độ muối, những protein nào liên kết yếu với cột sẽ bị đẩy ra trƣớc, còn những protein liên kết chặt hơn sẽ bị đẩy ra ở nồng độ muối cao hơn. * Quy trình chạy sắc ký trao đổi ion: Lectin từ dịch chiết sau khi kết tủa đƣợc thẩm tách trong dung dịch đệm cacbonat 0,02 M, pH = 9,0. Phần dịch trong đƣợc tiến hành chạy qua cột sắc ký trao đổi ion, dùng pha động là dung dịch đệm cacbonat 0,02 M, pH = 9,0 (loại khí) để rửa giải các protein không liên kết và các chất màu, đến khi đo đƣợc A280nm gần bằng 0. Lectin sẽ đƣợc rửa giải bằng dung dịch đệm cacbonat 0,02 M có chứa NaCl 0,5 M, pH = 9,0, thu các phân đoạn. Tiến hành đo A280nm, xác định hoạt tính ngƣng kết hồng cầu của các phân đoạn, từ đó thu nhận các phân đoạn có hoạt tính và tiến hành cô đặc nồng độ bằng màng siêu lọc kích cỡ 10 kDa. Vẽ đồ thị biểu diễn sự tƣơng quan giá trị A280 nm, hoạt tính ngƣng kết hồng cầu và thứ tự các phân đoạn. Các thông số đƣợc thiết lập trong quá trình chạy sắc ký trao đổi ion DEAE – Sepharose: - Nhựa trao đổi ion DEAE – Sepharose - Kích thƣớc cột: 1,6 x 20 cm - Pha động: dung dịch đệm cacbonat 0,02 M; pH = 9,0 (loại khí); dung dịch đệm cacbonat 0,02 M, có chứa NaCl 0,5 M, pH = 9,0 (loại khí). - Thể tích mẫu: 10 mL - Tốc độ dòng: 10 mL/phút - Thể tích mỗi phân đoạn: 5 mL/phân đoạn - Số lƣợng phân đoạn: 54 phân đoạn. - Tổng thể tích dung dịch đệm rửa giải: 270 mL. 51 2.3.8. Tinh sạch ectin bằng phƣơng pháp sắc ký ọc ge Sephacry S – 200 . * Nguyên tắc: Sephacryl S-200 là gel agarose có khả năng phân tách những protein có kích thƣớc từ 5,0.103 – 2,5.105 Da. Do đó, khi cho dịch chiết chứa protein qua cột, những chất có kích thƣớc lớn đi len lõi ở bên ngoài các hạt gel, di chuyển nhanh và ra ngoài trƣớc; trong khi đó những phân tử có kích thƣớc nhỏ thì bị hấp thụ vào bên trong lỗ gel nên di chuyển chậm, ra khỏi cột sau. * Quy trình chạy sắc ký lọc gel: Dịch thu đƣợc sau khi chạy sắc ký trao đổi ion DEAE-sepharose có hoạt tính ngƣng kết hồng cầu đƣợc cô đặc bằng màng siêu lọc có kích thƣớc cỡ 10 kDa, sau đó tiến hành thẩm tách trong đệm photphat 0,05M có chứa NaCl 0,15M, pH = 7,0 ở 4 oC (để qua đêm) để cân bằng nồng độ muối và pH. Tiến hành tinh sạch lectin bằng cách bơm mẫu vào cột sắc ký, sử dụng pha động là dung dịch đệm photphat 0,05M có chứa NaCl 0,15M, pH = 7,0 (loại khí), rửa giải một thể tích cột, thu các phân đoạn. Sau đó đo A280nm và xác định hoạt tính ngƣng kết hồng cầu của từng phân đoạn. Thu nhận các phân đoạn có hoạt tính và cô đặc nồng độ dịch thu đƣợc bằng màng siêu lọc kích cỡ 10 kDa. Vẽ đồ thị biểu diễn sự tƣơng quan giá trị A280nm, hoạt tính ngƣng kết hồng cầu và thứ tự các phân đoạn. * Các thông số kỹ thuật đƣợc thiết lập khi tinh sạch lectin bằng sắc ký lọc gel: - Gel: Sephacryl S – 200 - Kích thƣớc cột: 1x30cm - Pha động: dung dịch đệm photphat 0,05M có chứa NaCl 0,15M, pH = 7,0 (loại khí) - Thể tích mẫu: 1,0 mL - Tốc độ dòng: 0,8 mL/phút - Thể tích mỗi phân đoạn: 2,5 mL/phân đoạn - Số lƣợng phân đoạn: 52 phân đoạn. - Tổng thể tích dung dịch đệm rửa giải: 130 mL. 52 2.3.9. Kiểm tra độ tinh sạch và xác định khối ƣợng phân t ectin bằng phƣơng pháp điện di SDS-PAGE [132] Nguyên tắc: Điện di là sự di chuyển các chất mang điện tích trong điện trƣờng, tốc độ di chuyển phụ thuộc vào điện tích, hình dạng và kích thƣớc của chất đó. SDS – PAGE (sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis) là một kỹ thuật điện di trên gel polyacrylamide khi có sự hiện diện của SDS, đây là một tác nhân làm biến tính và âm tính hóa các phân tử protein. Trong kỹ thuật này protein đƣợc xử lý với SDS và tác nhân khử cầu nối disulfite là 2-mercapto ethanol (HS-CH2-CH2-OH). Với tác nhân này, protein từ cấu trúc bậc 2, 3, 4 đƣợc biến đổi thành chuỗi polypeptide (bậc 1) và tất cả các protein đều đƣợc tích điện âm. Ví dụ: cysS-Scys + 2 HOCH2CH2SH → 2 cysSH + HOCH2CH2S-SCH2CH2OH Nhờ đó, sự di chuyển trong gel của các phân tử protein chỉ phụ thuộc vào kích thƣớc, những phân tử có kích thƣớc lớn sẽ di chuyển chậm hơn những phân tử có kích thƣớc nhỏ khi đi qua một lỗ gel có kích thƣớc nhất định. Dƣới tác dụng của điện trƣờng các phân tử tích điện âm sẽ di chuyển về cực dƣơng của điện trƣờng. Để xác định phân tử lƣợng của một protein, ngƣời ta thƣờng so sánh với một thang phân tử lƣợng chuẩn, là một hỗn hợp các protein có trọng lƣợng phân tử khác nhau đã biết. 53 * Thực hiện: + Chuẩn bị mẫu: Mẫu Khối ƣợng protein cần dùng Protein thô 100 g Protein kết tủa 50 g Protein sau sắc ký trao đổi ion 20 g Protein sau sắc ký lọc gel 10 g Tất cả các mẫu đƣợc thẩm tách trong nƣớc cất để loại bỏ sự ảnh hƣởng của muối, sau đó cho mẫu vào các ống eppendorf (1,5 hay 2,0 mL) và cô chân không lạnh hoặc sấy 40 oC đến khô. Thêm vào mỗi ống 15 L dung dịch đệm mẫu, trộn đều đến tan hoàn toàn. Đun các ống mẫu ở 100 oC trong 5 phút của trƣờng hợp có và không có chất khử 2-mercapto ethanol. Sau 5 phút tiến hành làm lạnh các ống. + Chuẩn bị dung dịch monome: Cân 46,5 gam acrylamide và 3,0 gam biacrylamide, tất cả hòa tan trong nƣớc cất thành 100 mL, lọc và giữ ở 4 oC. + Dung dịch đệm gel (Tris HCl 3,0 M, SDS 0,8%, pH = 8,8) Cân 72,7 gam Tris [tris(hydroxymethyl)aminomethane] hòa tan trong nƣớc cất thành 200 mL, dùng axit HCl đậm đặc chuẩn về pH = 8,8, thêm 1,6 gam SDS khuấy cho tan, giữ ở nhiệt độ phòng. + Dung dịch đệm cathode 10x (upper buffer) (Tris-HCl 0,25 M, glycine 1,92 M, SDS 1,0%, pH = 8,3). 54 Cân 15,1 gam Tris, hòa tan trong nƣớc cất, thêm 72,0 glycine, thêm nƣớc cất thành 500 mL, dùng axit HCl đậm đặc chuẩn về pH = 8,3, thêm 5,0 gam SDS hòa tan và giữ ở nhiệt độ phòng. + Dung dịch đệm anode 10x (lower buffer) (Tris HCl 2,0 M, pH = 8,9). Cân 121,1 gam Tris hòa tan trong 300 mL nƣớc cất, dùng axit HCl đậm đặc chuẩn về pH = 8,9, thêm nƣớc cất đến 500 mL (10x) và giữ ở nhiệt độ phòng. + Dung dịch đệm mẫu (Tris HCl 50 mM, pH = 6,8, SDS 4 %, glyxerol 12 % (v/v), Bromophenol blue (BPB) 0,02 %) Cân 0,6 gam Tris hòa tan trong 25 mL nƣớc cất, thêm 4,0 gam SDS, 12,0 mL glycine, khuấy đều; thêm 0,02 gam Bromophenol blue, khuấy tan; dùng axit HCl đậm đặc chuẩn về pH = 6,8, thêm nƣớc cất đến 100 mL và giữ ở nhiệt độ phòng. + Dung dịch nhuộm Coomassie Blue R-250 (0,25%) Cân 2,5 gam Coomassie brilliant blue R-250, lấy 500 mL ethanol và 100 mL axit axetic, thêm nƣớc cất đến 1 lít và khuấy đều. Giữ ở nhiệt độ phòng. + Dung dịch giải nhuộm I: gồm 400 mL methanol, 70 mL axit axetic, rồi thêm nƣớc cất đến 1 lít. Khuấy đều và giữ ở nhiệt độ phòng. + Dung dịch giải nhuộm II: gồm 50 mL methanol và 70 mL axit axetic, thêm nƣớc cất đến 1 lít. Khuấy đều và giữ ở nhiệt độ phòng. + Đổ gel: a. % (Separating gel) Cho các thành phần sau theo thứ tự vào cốc 25 mL sạch: Acrylamide/Bis (biacrylamide) (15,5/1) : 3,0 mL Tris – HCl 3M; pH 8,8; 0,8 % SDS : 5,0 mL Glycerine : 2,0 gam (1,45 mL) Nƣớc cất : 5,0 mL 55 APS (amonium persulfate) 10% : 50,0 µL TEMED : 5,0 µL Sau khi cho TEMED (N,N,N’,N’-tetramethylethylenediamine) vào, khuấy nhẹ, tiến hành đổ gel (tránh tạo bọt khí). Sau đó cho thật cẩn thận một lớp nƣớc cất lên trên lớp mặt gel để mặt gel đƣợc phẳng và không bị khô. Chờ gel đông (khoảng 2 giờ). b. Gel chồng (g ược) (Stacking gel) Cho các thành phần sau theo thứ tự vào cốc 25 mL sạch khác: Acrylamide/Bis (biacrylamide) (15,5/1) : 1,0 mL Tris – HCl 3M; pH 6,8; 0,8 % SDS : 3,1 mL Nƣớc cất : 8,4 mL APS 10% : 100,0 µL TEMED : 10,0 µL Sau khi gel phân tách đã trùng ngƣng hoàn toàn, đổ hết nƣớc bên trên. Tiến hành đổ lớp gel gom bằng cách dùng pipetteman bơm dung dịch gel gom vào khuôn. Đồng thời đƣa lƣợc vào khuôn để tạo các giếng mẫu (tránh tạo bọt khí trong khuôn gel). Sau khi gel trùng ngƣng, tháo lƣợc, lắp đĩa gel vào bộ phận điện di, cho dung dịch điện di vào buồng điện di. Tiến hành chạy điện di Cho vào buồng 300 mL dung dịch đệm anode (pha loãng 10 lần), tránh tạo bọt khí. Lắp đặt thiết bị điện di, cho vào buồng 80 mL dung dịch đệm cathode (pha loãng 10 lần), tránh tạo bọt khí. Tiến hành tiêm khoảng 7 µL mẫu chuẩn và các mẫu phân tích (từ 15 – 20 µL) vào các giếng. 56 Tiến hành chạy điện di với dòng điện ổn định có hiệu điện thế 100V. Quá trình điện di kết thúc dựa vào sự dịch chuyển của vạch màu xanh (bromophenol) khi cách đáy gel khoảng 1 cm. Sau khi kết thúc điện di, cho gel vào khay, cho 20 – 25 mL dung dịch nhuộm Coomassie Brilliant Blue R-250, đặt lên máy lắc trong 2 giờ, sau đó đổ bỏ dung dịch nhuộm. Tiến hành tẩy màu bằng cách ngâm gel trong dung dịch giải nhuộm (hỗn hợp methanol: acid acetic). Protein sẽ đƣợc phát hiện nhờ các vạch màu xanh lam trên nền gel trong suốt. Xác định trọng ƣợng phân t của protein Tiến hành đo khoảng cách di chuyển của các dải protein từ gel phân tách tới các dải protein và khoảng cách từ gel phân tách tới vạch màu bromophenol (vạch màu cuối cùng). Tính giá trị Rf Rf = Trọng lƣợng phân tử của các vạch protein có thể xác định thông qua giá trị Rf trên, nhờ phƣơng pháp nội suy theo đồ thị. Dựa vào thang chuẩn trên gel điện di, tiến hành xác định giá trị Rf của từng vạch protein. Kết quả đƣợc trình bày trong bảng phụ lục 2. Từ đó, xây dựng phƣơng trình hồi quy tuyến tính giữa giá trị Rf và lgM (lg trọng lƣợng phân tử) của các protein trong thang chuẩn bằng phần mềm Excel. 2.3.10. Phƣơng pháp phân tích ảnh hƣởng các đặc tính ý, hóa đến ectin từ rong đỏ H. eucheumatoides * Nguy n tắc: Khi tiến hành phân tích các yếu tố ảnh hƣởng đến đặc tính lý, hóa của lectin (nhiệt độ, pH, cation hóa trị 2), nếu hoạt tính ngƣng kết hồng cầu của lectin không đổi so với hoạt tính ngƣng kết hồng cầu của lectin thu đƣợc sau sắc ký lọc gel thì chứng tỏ phạm vi yếu tố đang phân tích không Khoảng cách di chuyển của protein lectin Khoảng cách từ gel phân tách đến dung môi (vạch màu Brommophenol) blue 57 ảnh hƣởng đến hoạt tính ngƣng kết hồng cầu, ngƣợc lại, nếu có sự thay đổi thì chứng tỏ phạm vi yếu tố đang phân tích đã ảnh hƣởng đến hoạt tính ngƣng kết hồng cầu của lectin. 2.3.10.1. Phương pháp phân tích ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính ngưng kết hồng cầu [13] Để tiến hành phân tích ảnh hƣởng của nhiệt độ đến hoạt tính của lectin từ rong đỏ H. eucheumatoides, ta lấy mỗi 0,5 mL dung dịch chứa lectin thu đƣợc sau sắc ký lọc gel cho vào mỗi ống nghiệm, tiến hành đun nóng ở các nhiệt độ khác nhau: 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100 oC trong 30 phút. Sau đó làm lạnh nhanh bằng nƣớc đá và kiểm tra lại hoạt tính ngƣng kết hồng cầu của các mẫu bằng hồng cầu máu thỏ 2 % đã xử lý trypsin, so sánh với hoạt tính ngƣng kết hồng cầu của lectin sau sắc ký lọc gel. Các thí nghiệm đƣợc tiến hành lặp lại 3 lần. 2.3.10.2. Phương pháp phân tích ảnh hưởng của pH đến hoạt tính ngưng kết hồng cầu [13] Để tiến hành phân tích ảnh hƣởng của pH đến hoạt tính của lectin từ rong đỏ H. eucheumatoides, ta lấy 0,5 mL mỗi dung dịch chứa lectin thu đƣợc sau sắc ký lọc gel thẩm tách qua đêm trong các dung dịch đệm có pH khác nhau: 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ở 4 oC. Sau đó, tiến hành thẩm tách ngƣợc lại với dung dịch NaCl 0,15 M trong 4 giờ để loại bỏ ảnh hƣởng của pH, lấy phần dịch này đem ly tâm với tốc độ 10.000 vòng/phút trong 5 phút. Thu lấy phần dịch trong và tiến hành kiểm tra hoạt tính ngƣng kết hồng cầu của các mẫu bằng hồng cầu máu thỏ 2 % đã xử lý trypsin, so sánh với hoạt tính ngƣng kết hồng cầu của lectin sau sắc ký lọc gel. Các thí nghiệm đƣợc tiến hành lặp lại 3 lần. Các dung dịch đệm đƣợc sử dụng: + Đệm axetat pH: 3, 4 và 5 axit axetic/natri axetat + Đệm photphat pH: 6 và 7 Na2HPO4.12H2O/NaH2PO4.2H2O + Đệm Tris HCl pH: 8 Tris/HCl + Đệm cacbonat pH: 9 và 10 Na2CO3/NaHCO3 58 2.3.10.3. Phương pháp phân tích ảnh hưởng của cation hóa trị 2, EDTA đến hoạt tính ngưng kết hồng cầu [13] Để phân tích sự ảnh hƣởng của các ion kim loại đến hoạt tính của lectin từ rong đỏ H. eucheumatoides, ta tiến hành lấy 1,0 mL dịch lectin sau sắc ký lọc gel cho tƣơng tác với muối của các ion kim loại hóa trị hai nhƣ: Ca2+, Mg 2+ ở nồng đ