Luận văn Tổng hợp và phân tích đặc tính lý hóa của dẫn xuất carboxymethyl kappa – carrageenan từ rong đỏ kappaphycus striatum

g từ hạt nhân (NMR): phổ 1H-NMR của polysaccharide có thể khẳng định độ tinh khiết của mẫu (không có mặt của các tín hiệu các oligonucleotide, protein hay lipid) [70]. Phổ cũng có thể cho biết số monosaccharide thực từ số các cộng hƣởng proton anomer thông qua các tín hiệu trong khoảng 4,4 đến 5,8 ppm. Nhƣ vậy, dựa vào tỷ lệ tích phân tƣơng đối của các cộng hƣởng anome cũng có thể đánh giá tỷ lệ phân tử của các monosaccharide. Về mặt này kết quả phân tích hoá học có thể phù hợp với kết quả phân tích 1H NMR. Nhìn chung, kết quả tính tích phân NMR là chính xác so với kết quả phân tích hoá học. Nhiều nhóm thế có thể đƣợc xác định hoặc sự có mặt của chúng đƣợc dự đoán dựa vào phổ 1D 1H NMR. Tiếp theo, số lƣợng chính xác của các monosaccharide có thể đƣợc khẳng định chính xác nhờ vào việc khảo sát vùng anome của phổ 2 chiều dị hạt nhân 1H- 13 C HSQC. Độ dịch chuyển hoá học của proton anome (4,4 - 5,8ppm) đƣợc tách biệt một cách không hoàn toàn rõ rệt khỏi các cộng hƣởng 1H ở các vị trí khác (3,2 - 4,5ppm) trong khi độ dịch chuyển 13C anome (95 - 110ppm) lại tách biệt rất rõ, không hề trùng chập với các cộng hƣởng 13C ở các vị trí còn lại (60 - 85ppm). Các vị trí đƣợc thế của monosaccharide đƣợc gọi là vị trí aglycon tƣơng ứng với các nguyên tử C ở các vị trí không phải anome của liên kết glycosid. Từ dữ liệu NMR, vị trí liên kết đƣợc suy ra dựa trên sự tăng mạnh (> + 3ppm) về độ dịch chuyển hoá học của 13C so với độ dịch chuyển hoá học của các monome không thế. Việc phân tích này cũng mang lại thông tin giống với 36 những phân tích khi metyl hoá. Trật tự các đơn phân trong mạch của polysaccharide đƣợc xác định chính là chuỗi các liên kết glycosid, thể hiện thông tin cấu trúc chính cần xác định thu đƣợc từ hai loại phổ 1H- 13C HMBC và NOESY. + Phương pháp khối phổ (MS): một thời gian dài, đối với car nói riêng và các polysaccharide nói chung, phƣơng pháp khối phổ chỉ có thể đƣợc áp dụng sau khi đã có sự chuyển hoá hoá học. Trƣớc hết mẫu đƣợc thuỷ phân để tạo thành các mono hoặc disaccharide, sau đó các tiểu phân này cần đƣợc metyl hoá để có thể phân tích bằng GC/MS. Quá trình phân tích đòi hỏi nhiều thực nghiệm, thời gian và hoá chất, trong khi kết quả thu đƣợc chỉ cho biết gián tiếp về các đơn phân hình thành nên mạch mà không cung cấp nhiều thông tin về trật tự liên kết, do các đơn phân đã đƣợc metyl hoá nên có thể thông tin về nhóm thế của đơn phân sẽ bị mất đi. Chính vì thế, phƣơng pháp MS sử dụng kĩ thuật ion hoá thông thƣờng va chạm electron EI không phát huy sức mạnh đối với các mẫu car. 1.4.2. Nghiên cứu cấu trúc của carrageenan Theo Maitland W. McLean và cộng sự (1979), sản phẩm thủy phân κ- car bằng enzyme κ-carrageenan thu đƣợc trong môi trƣờng nuôi cấy Pseudomonas carrageenovora đƣợc tách bằng lọc gel, phân tích phổ cộng hƣởng từ hạt nhân 13C. Những kết quả này phù hợp với sản phẩm thủy phân là neocarrabiose 4-O-sulphate [73]. Năm 1991, Potin và cộng sự phân tích các sản phẩm thủy phân của κ- car bằng lọc gel và phổ 13C-NMR cho thấy, enzyme thủy phân κ-car thành κ- neocarratetraose sulfate [74]. Theo Guangli Yu và cộng sự (2002), ba oligocar đƣợc tinh chế bằng sắc ký trao đổi anion hiệu suất cao; cấu trúc của nó đƣợc làm sáng tỏ bằng cách sử dụng dữ liệu quang phổ khối lƣợng và NMR. Sắc ký lỏng khối phổ có kết nối bộ phun điện (ESI-MS) cung cấp trọng lƣợng phân tử của các hợp phần và làm sáng tỏ các mô hình phân mảnh của các oligocar. Kỹ thuật 2D- NMR, bao gồm 1H-1H Cosy, 1H-1H TOCSY và 13C-1H-HMQC đƣợc thực 37 hiện để xác định cấu trúc của một pentasaccharide trisulfated. 1D NMR và ESIMS đã đƣợc sử dụng để xác định cấu trúc của pentasaccharide, heptasaccharide, và undecasaccharide có nguồn gốc κ-Car [75]. Năm 2003, Thành Thị Thu Thủy và cộng sự sử dụng phổ cộng hƣởng từ hạt nhân (NMR), hồng ngoại IR và sắc ký lọc gel (GPC)/sắc ký lỏng khối phổ có bộ kết nối phun điện (ESI-MS) đã xác định đƣợc car chiết xuất từ rong sụn nuôi trồng tại tỉnh Ninh Thuận là κ-car [76]. In Guangli (2004), thủy phân κ-car bằng acid HCl chỉ xảy ra tại liên kết α-(1→3) glycosidic. Sử dụng ESI-MS và FACE phân tích, chứng minh rằng các phân tử κ-car là một axit sulfuric galactan tuyến tính, không tồn tại phân nhánh [77]. Theo Guibet và cộng sự (2006), các sản phẩm thủy phân đƣợc phân tích bằng phổ 1H và 13C-NMR, tất cả các oligocar quan sát thuộc loại neo- carrabiose oligosaccharide chỉ ra rằng  -carrageenase thủy phân liên kết - (1-4) glycosidic [78]. Trần Đình Toại và cộng sự (2008), sử dụng acid HCl để thủy phân car chiết từ rong Hồng Vân Eucheuma gelatinae thuộc ngành rong đỏ Rhodophyta vùng biển Việt Nam) để tạo oligocar và dùng phƣơng pháp phổ cộng hƣởng từ hạt nhân (1H-NMR, 13C-NMR) và phổ khối kết hợp sắc ký lỏng (LC-MS) để xác định cấu trúc của sản phẩm, đƣa đến kết luận quan trọng: thủy phân car bằng acid HCl làm thay đổi không đáng kể cấu trúc của polymer, chỉ có tác dụng phá vỡ các liên kết glycoside làm cắt ngắn mạch polymer [79]. Bùi Huy Chích (2008), trên cơ sở xác định phổ cộng hƣởng từ hạt nhân NMR ( 1 H, 13C), chứng tỏ rằng enzym chỉ cắt mạch liên kết glycoside mà ít ảnh hƣởng đến sự phá vỡ cấu trúc phân tử car, sau khi đƣợc thủy phân bằng enzyme amylase, sản phẩm thu đƣợc vẫn có dạng là -car [80], [81]. Năm 2009, theo Loan Hui các oligosaccharide tách bằng cách sử dụng phân đoạn ethanol, các phân đoạn đƣợc sắc ký lọc gel qua cột lọc Bio-Gel P- 4, xác định phổ IR và phân tích hóa học, chứng minh rằng: quá trình thủy phân enzyme làm thay đổi không đáng kể cấu trúc của κ-car [82]. 38 1.4.3. Phƣơng pháp tổng hợp carboxymethyl -carrageenan Các phƣơng pháp tổng hợp carboxymethyl -carrageenan trên thế giới, phải kể đến: 1, Lihong Fan, Lobo Wang, Shulua Liu, Weiping Wang và các cộng sự nghiên cứu quá trình carboxymetyl hóa –carrageenan nhƣ sau: Kappa-carrageenan (5 g) rửa sạch và ngâm trong 100 ml 80% dung dịch ethanol – H2O. Sau đó thêm 10 ml dung dịch NaOH 20% nhỏ giọt trong khoảng thời gian 15 phút. Hỗn hợp phản ứng đƣợc khuấy mạnh bằng máy khuấy từ có tạo nhiệt giữ ổn định ở 35 ◦C trong 1 giờ. Sau khi khuấy ở nhiệt độ phòng trong 30 phút,ClCH2COOH đã đƣợc thêm tiếp vào hỗn hợp dung dịch trên, sau đó đƣợc làm nóng đến 55 ◦C trong 4 giờ. Tiếp theo, CH3COOH đƣợc thêm vào hỗn hợp để điều chỉnh pH đến 7,0. Muối cacboxymetyl - carrageenan thu đƣợc qua lọc chân không và rửa ba lần với 80% ethanol. Sản phẩm đƣợc làm khô trong lò ở 50◦C. Bằng cách này, ngƣời ta thay đổi hàm lƣợng tỷ lệ axit monoloroaxetic (MCA) với -carrageenan, một loạt các CMKC các DS khác nhau đã đƣợc chuẩn bị trƣớc đó để xác định mức độ thế DS lớn nhất [52]. 2, Quá trình cacboxymetyl hóa carrageenan theo Williamson's. Quy trình tổng hợp cacboxymetyl hóa carrageenan có thể đƣợc tìm thấy trong dữ liệu bổ sung (giấu nguồn). Quá trình tổng hợp đƣợc thực hiện với các tỷ lệ mol khác nhau của MCA: KC theo tỉ lệ (2: 1, 2,5: 1, 3: 1, 3,5: 1, 4: 1). Dẫn xuất KC đƣợc gọi là carboxymethyl-kappa-carrageenan và đƣợc kí hiệu là CMKC 0,8 đến 1,6, theo DS tính toán. Các điều kiện phản ứng coi là giống nhau cho cả năm sản phẩm thế. 3, Theo Charito Tranquilan-Aranillaa, Naotsugu Nagasawa, Aristea Bayquen, Alumanda Dela Rosa và các cộng sự: Kappa-carrageenan (80 g) ngâm vào 80% 2-propanol (720 mL) trong một bình phản ứng thủy tinh 3 cổ 1L đƣợc trang bị có bộ làm mát hồi lƣu và gắn với cánh quạt có thể điều chỉnh tốc độ. Trong khi khuấy mạnh ở nhiệt độ phòng, 40% NaOH (93,5 mL) đƣợc thêm vào từng giọt với sự hỗ trợ 39 của buret. Khuấy liên tiếp trong 1 giờ nữa ở 40◦C và sau khi hoạt hóa kiềm xong thì axit monoloroaxetic (MCA; 49,1 g) đã đƣợc thêm vào. Các phản ứng đƣợc phép tiến hành trong 3 giờ ở 40◦C. Sau khi cacboxymetyl hóa, hỗn hợp đƣợc lọc, làm sạch trong 80% dung dịch 2-propanol và trung hòa bằng axit axetic. Các sản phẩm đƣợc thu thập sau khi lọc, rửa sạch 3 lần với 80% 2- propanol, tiếp theo là 2-propanol tinh khiết và đƣợc làm khô trong tủ sấy chân không ở 40°C. Các bƣớc carboxymethyl hóa đƣợc thực hiện theo quy trình tƣơng tự. Các dẫn xuất đƣợc thay thế tỉ lệ tƣơng ứng DS là CMKC-1s, CMKC-2s và CMKC-3s. Mỗi quá trình tổng hợp theo các tỉ lệ khác nhau cách xử lý các mẫu –carrageenan trong cùng điều kiện phản ứng không có nhƣng MCA. Trong đề tài nghiên cứu của luận văn này, carboxymethyl - carrageenan đã đƣợc tổng hợp và phân tích cấu trúc đặc trƣng vởi phổ FT-IR, phổ 13C NMR và phổ 1H NMR, mức độ thay thế (DS) và xác định đƣợc trọng lƣợng phân tử (Mw). Các đặc tính bao gồm: hoạt tính chống đông máu, hoạt tính kháng khuẩn, khả năng hấp thụ độ ẩm và khả năng giữ ẩm của CMKC đã đƣợc các đánh giá và nghiên cứu trên thế giới về quá trình carboxymethyl hóa -carrageenan thành công [5], [55]. 40 CHƢƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. VẬT LIỆU, ĐỊA ĐIỂM VÀ THỜI GIAN NGHIÊN CỨU 2.1.1. Vật liệu nghiên cứu: Rong đỏ thuộc ngành tảo hồng (Rhodophyta), Ngành phụ: Rhodophytina Lớp: Florideophyceae Lớp phụ: Rhodymeniophycidae Bộ: Gigartinales Họ: Areschougiaceae Giống: Kappaphycus Loài: bao gồm các loài alvarezii, cottonii, inermis, interme, procrusteanum, striatum. Trong đó loài Kappaphycus striatum là loài có sản lƣợng cao nhất. [83] Mẫu rong nguyên liệu Kappaphycus striatum đƣợc thu ở vịnh Vân Phong, Khánh Hòa vào tháng 9 năm 2018. Sau khi thu, rong đƣợc rửa sạch bằng nƣớc biển loại bỏ tạp chất, giữ lạnh và chuyển về phòng thí nghiệm. Rong đƣợc phơi khô ở nhiệt độ phòng, sau đó xay nhuyễn thành bột trong nitơ lỏng, cho vào các túi nilon và cất giữ lạnh ở - 20 oC cho đến khi dùng. Hình 2.1: Hình ảnh rong Kappaphycus striatum 41 2.1.2. Dụng cụ - thiết bị - hóa chất 2.1.2.1. Dụng cụ Các dụng cụ dùng trong thí nghiệm nhƣ: ống nghiệm, bình tam giác, cốc thủy tinh, ống đông, pipet, cuvet, ống ly tâm 2.1.2.2. Thiết bị sử dụng trong nghiên cứu Một số thiết bị sử dụng trong nghiên cứu gồm: Bảng 2.1: Các thiết bị chính đƣợc sử dụng trong thí nghiệm STT Thiết bị Model máy Xuất sứ 1 Máy ly tâm Z36HK Hermel-Đức 2 Máy ly tâm eppendorf 5417R Eppendorf – Đức 3 Máy đo pH 827pH Lab Metrohm-Thụy Sỹ 4 Bể ổn nhiệt B12 Heraeus-Đức 5 Cân phân tích CP224S Satorius – Đức 6 Máy đo quang Spectro UV 2505/24RS Labomed 7 Các loại Micropipet 2 20 ;20 200 ;...l lm m- - Nichiryo – Nhật 2.1.2.3 Hóa chất Các hóa chất đƣợc sử dụng nhƣ sau: rhodizonate natri, acetal, resorcinol, D-fructose (Merck, Đức). KOH, KCl, NaCl, HCl, CH3COOH, BaCl2, NaHCO3, C2H5OH, ClCH2COOH và Na2SO4 (Trung quốc). 2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.2.1. Phƣơng pháp chiết carrageenan Chiết carrageenan đƣợc tiến hành theo phƣơng pháp đƣợc mô tả bởi Ohno và cộng sự [1]. 42  Rong khô sạch đƣợc nghiền thành bột trong nitơ lỏng, 10 g bột rong đƣợc xử lý với 200 mL dung dịch KOH 6% ở 80°C trong 2 giờ, ly tâm tách bỏ phần dịch, bột rong đƣợc rửa với nƣớc cất để loại kiềm dƣ.  Bột rong đƣợc chiết với 700 mL nƣớc cất ở 90°C trong 2 giờ. Sau khi chiết, hỗn hợp dịch chiết đƣợc lọc sơ bộ qua túi vải và lọc tinh bằng lọc hút chân không.  Tạo đông gel từ dịch lọc với dung dịch KCl 0.2%, lạnh đông gel ở -20 o C.  Làm tan đá, rửa 3 lần với ethanol 80% và sấy khô ở 60°C đến khối lƣợng không đổi. Sơ đồ tóm tắt quá trình chiết carrageenan: Ngâm - Rửa Chiết bằng nƣớc cất Lọc Bã Tạo đông gel với KCl 0,2% Cắt sợi, để đông Rã đông, rửa 3 lần với ethanol 80% phơi - sấy Carrageenan [1] Bột rong sụn khô 43 2.2.2. Tổng hợp dẫn xuất carboxymethyl kappa-carrageenan Tổng hợp dẫn xuất carboxymethyl kappa-carrageenan đƣợc tiến hành theo phƣơng pháp đƣợc mô tả bởi Lihong Fan, Lobo Wang, Shulua Liu, Weiping Wang và các cộng sự [52]. Ngâm 10 gram κ-carrageenan trong dung dịch 80% ethanol và khuấy đảo liên tục bằng máy khuấy từ có ra nhiệt ở nhiệt độ phòng. Thêm từ từ 10ml dung dịch NaOH 10N từng giọt vào bình qua một buret. Khuấy hỗn hợp liên tục trong trong 1 giờ ở 40oC để hoạt hóa kiềm κ- carrageenan, thêm acid monochloroacetic với các tỉ lệ mol khác nhau so với polysaccharide. Tiến hành giữ hỗn hợp phản ứng trong bình cầu bằng máy khuấy từ trong 3 giờ ở 50oC. Sau khi carboxymethyl hóa, trung hòa hỗn hợp với acid acetic đậm đặc. Thu hồi sản phẩm bằng lọc hút chân không, rửa sản phẩm 3 lần với dung dịch 80% ethanol và làm khô ở 70oC, nghiền thành bột (Leong và cs, 2011; Tranquilan-Aranilla và cs, 2012). Khuấy hỗn hợp liên tục bằng máy khuấy từ có ra nhiệt Thu hồi sản phẩm bằng bộ lọc hút chân không 44 2.2.3. Xác định nhiệt độ đông vào nhiệt độ tan của carageenan Xác định nhiệt độ tạo gel và nhiệt độ tan gel theo phƣơng pháp của Hellebust, Craige (1978). Nhiệt độ tạo gel Nhiệt độ tan gel • Đun nóng mỗi 10 mL dung dịch κ-carrageenan 1,5% có chứa KCl 0,2% trong các ống nghiệm trong bể điều nhiệt cho đến khi tan hoàn toàn. • Hạ nhiệt độ của máy khuấy từ có ra nhiệt, đặt các viên bi thuỷ tinh (đƣờng kính: 4,30 mm) trên bề mặt dung dịch trong ống nghiệm cho đến khi nào viên bi rơi xuống giữa ống nghiệm và dừng lại, ghi nhận nhiệt độ đông gel. • Mẫu đƣợc đo 3 lần để tính giá trị trung bình. • Đun nóng mỗi 10 mL dung dịch κ-carrageenan 1,5% có chứa KCl 0,2% trong các ống nghiệm bằng máy khuấy từ có ra nhiệt cho đến khi tan hoàn toàn và giữ các ống nghiệm ở nhiệt độ phòng để tạo gel hết. • Đặt lại các ống nghiệm trong máy khuấy từ có ra nhiệt, đặt các viên bi thuỷ tinh (đƣờng kính: 4,30 mm) trên bề mặt gel và tiến hành nâng nhiệt độ máy khuấy từ cho đến khi nào viên bi rơi xuống đáy ống nghiệm, ghi nhận nhiệt độ tan gel. • Mẫu đƣợc đo 3 lần để tính giá trị trung bình. 2.2.4. Xác định độ bền gel (1,5 %) Độ bền gel (1,5%) Cân mỗi mẫu 1,5 g κ-carageenan, thêm vào 100 mL dung dịch KCl 0,2%. Đun ở 100oC cho tan hoàn toàn. Đổ dung dịch vào đĩa petri để tạo gel. Mẫu đƣợc đo 3 lần bằng thiết bị đo gel của Nhật và tính giá trị trung bình. 45 2.2.5. Xác định tính chất, cấu trúc của mẫu carrageenan Trƣớc khi phân tích đặc tính hóa lý và cấu trúc, mẫu carrageenan đƣợc thẩm tách qua nƣớc cất dùng màng Spectrapor với Mw cut-off 12,000–14,000 Da trong 24 giờ và lọc qua màng lọcr (0,45 µm) nhƣ hình ảnh sau đây: Sau đó mẫu đƣợc kết tủa với ethanol tuyệt đối, làm khô ở 40oC và nghiền thành bột. 2.2.5.1. Xác định hàm lượng 3,6-anhydro-D-galactose Xác định hàm lƣợng 3,6-anhydro-D-galactose của carrageenan theo phƣơng pháp Yaphe, Arsenault (1965), dùng D-fructose làm chuẩn. * Chuẩn bị dung dịch gốc: a) Resorcinal (1,36 mmol): cân 150 mg hòa tan trong 100 mL nƣớc cất. Bảo quản trong chai màu, giữ trong tủ lạnh. b) 1,1-Diethoxyethane (acetal): Lấy 100μL (695 μmol) hòa tan trong 10 mL nƣớc cất. Giữ trong chai màu, bảo quản trong tủ lạnh. Lấy 1 mL pha loãng với nƣớc cất thành 25 mL trƣớc khi trộn với thuốc thử. c) Dung dịch gốc D-fructose chuẩn: cân 27 mg hòa tan trong 50 mL của nƣớc cất đã cho bảo hòa acid benzoic. Bảo quản trong tủ lạnh. Mẫu carrageenan đƣợc thẩm tách qua nƣớc cất dùng màng Spectrapor. Lọc qua filter. 46 * Chuẩn bị dung dịch làm việc: a) Thuốc thử resorcinol-acetal: thêm 100 mL HCl đậm đặc vào 9 mL dung dịch gốc resorcinol và thêm 1 mL của dung dịch gốc acetal đã đƣợc pha loãng, trộn đều. Chuẩn bị dung dịch này trƣớc khi phân tích. b) Chuẩn D-fructose: hòa tan 3 mL dung dịch gốc chuẩn fructose thành 100 mL trong nƣớc cất, tƣơng ứng với nồng độ fructose là 16,2 g/mL. c) Chuẩn bị mẫu: cân 10 mg carrageenan hòa tan trong 100 mL nƣớc cất nóng, tƣơng ứng với 100 g/mL. * Tiến hành phân tích: Lấy 2 mL dung dịch chuẩn (fructose), dung dịch mẫu carrageenan và mẫu nƣớc cất cho vào các ống nghiệm. Làm lạnh các ống nghiệm trong đá, sau đó thêm 10 mL thuốc thử resorcinal-acetal lạnh vào mỗi ống nghiệm. Trộn đều các ống nghiệm và làm lạnh các ống nghiệm lên 20oC trong 4 phút, sau đó đun ở 80oC trong 10 phút. Làm lạnh ống nghiệm trong chậu đá trong 1,5 phút và đo độ hấp thụ ở bƣớc sóng 555 nm trong khoảng thời gian là 15 phút. Tránh xa việc phơi dung dịch màu ra nơi có ánh sáng mạnh. Hàm lƣợng của 3,6-anhydro-D-galactose đƣợc xác định so với chuẩn D-fructose và nhân với giá trị 1,087. Mẫu đƣợc phân tích 3 lần để tính giá trị trung bình. Máy đo độ hấp thụ 47 2.2.5.2. Xác định hàm lượng sulfate Xác định hàm lƣợng sulfate trong carrageenan theo phƣơng pháp của Terho, Hartiala (1971), dùng Na2SO4 làm chuẩn. Thuốc thử: * Dung dịch đệm BaCl2: Acid acetic 2M: 10 mL BaCl2 0,005 M: 2 mL NaHCO3 0,02 M: 8 mL Ethanol 96%: 80 mL * Dung dịch rhodizonate natri: hòa tan 5 mg rhodizonate natri trong 20 mL nƣớc cất, thêm vào dung dịch 100 mg acid ascorbic và trộn đều cho đến khi tan hoàn toàn. Thêm ethanol 96% vào hỗn hợp đến 100 mL. Dung dịch có màu nâu nhạt và có thể dùng sau 30 phút. * Dung dịch sulfate chuẩn: 4 – 24 µg sulfate/mL. * Tiến hành phân tích:  Lấy 0,5 mL mẫu polysaccharide (100 – 120 µg/mL), mẫu chuẩn và nƣớc cất cho vào các ống nghiệm, thêm 2 mL ethanol 96% vào các ống nghiệm, trộn đều.  Sau đó, thêm 1,0 mL dung dịch đệm BaCl2 và 1,5 dung dịch rhodizonate natri, trộn đều.  Giữ các ống nghiệm trong tối ở nhiệt độ phòng trong 10 phút và đo độ hấp thụ ở bƣớc sóng 520 nm trong 30 phút. Hàm lƣợng sulfate trong mẫu carrageenan đƣợc xác định dựa trên đƣờng chuẩn sulfate.  Mẫu đƣợc phân tích 3 lần để tính giá trị trung bình. 2.2.5.3. Xác định khối lượng phân tử trung bình bằng phương pháp đo độ nhớt Khối lƣợng phân tử trung bình (Mw) đƣợc xác định bằng phƣơng pháp đo độ nhớt và ngoại suy. Hòa tan mẫu carrageenan 0,1 g trong 100 mL dung dịch NaCl 0,1 M và pha loãng ở các nồng độ tƣơng ứng 0,08, 0,06, 0,04 và 0,02 g/100 mL trong 48 dung dịch NaCl 0,1 M, tiến hành đo độ nhớt ở 25 ± 0,1oC bằng nhớt kế Ubbelohde. T là thời gian chảy của carrageenan ở các nồng độ khác nhau, To là thời gian chảy của dung môi NaCl 0,1 M. Độ nhớt tương đối ηrel = T/To. Độ nhớt đặc hiệu đƣợc tính từ mối quan hệ với độ nhớt tƣơng đối theo công thức sau ηsp = ηrel - 1. Độ nhớt nội tại ηint đƣợc xác định từ ngoại suy sự giảm độ nhớt ngƣợc với các nồng độ carrageenan từ cao xuống thấp [84]. Trọng lƣợng phân tử trung bình đƣợc tính theo phƣơng trình Mark– Houwink cho carrageenan: K = 8.84 × 10 -3 và α = 0.86 [85]. 2.2.5.4. Xác định mức độ thế nhóm carboxymethyl trong kappa-carrageenan Mức độ thế (DS) của các gốc carboxymethyl trong kappa-carrageenan đƣợc xác định theo phƣơng pháp của Muzzarelli và cộng sự (1984). Các giá trị DS của mỗi mẫu đƣợc xác định bằng phƣơng pháp chuẩn độ axit – bazơ. Hòa tan 0,2 g mẫu trong 50 mL dung dịch HCl 0,1N và chuẩn độ với dung dịch NaOH 0,1 N tới giá trị pH trung tính sử dụng thuốc thử phenolphtalein. Các giá trị pH đƣợc xác định với máy đo pH cũng nhƣ sự gia tăng thể tích của dung dịch NaOH và giá trị DS đƣợc tính toán theo phƣơng trình sau: Trong đó: - mCMP là khối lƣợng của carboxymethyl polysaccharide. - A số lƣợng trung bình của–CH2COOH và –CH2COONa trên gram mẫu. 49 - V2 và V1 là thể tích chuẩn độ của dung dịch NaOH 0,1 N khi xử lý các mẫu polysaccharide trong các điều kiện giống nhau nhƣng có và không có acid monochloroacetic, tƣơng ứng. 2.2.5.5. Điều chế các hạt vi nang carboxymethyl kappa-carrageenan  Hòa tan carboxymethyl kappa-carrageenan trong nƣớc cất ở nhiệt độ phòng cho đến khi tan hoàn toàn.  Dùng syringe (5 mL) với kích thƣớc đƣờng kính trong của đầu kim từ 0.4 - 0.5 mm để hút dung dịch và nhỏ từng giọt vào dung dịch KCl–HCl (pH =1.2) với tốc độ khuấy 50 vòng/phút.  Sau khi kết thúc quá trình tạo hạt, giữ hạt trong dung dịch trong 5 phút, gạn, thu hạt và rửa hạt 3 lần với ethanol 80% để loại bỏ KCl thừa, làm khô và giữ ở 4oC cho đến khi sử dụng [56]. 2.2.5.6. Xác định cấu trúc mẫu carrageenan bằng phổ FT-IR, 13C NMR và 1H NMR.  Phổ Fourier-Transform Infrared (FT-IR) của mẫu carrageenan và dẫn xuất của carboxymethyl -carrageenan đƣợc đo trên máy Bruker mode ALPHA ở Đại học Nha Trang để xác định sự có mặt của các nhóm chức 3,6- anhydro-D-galactose và gốc sulfatetrong phân tử carrageenan.  Phổ 13C NMR và 1H NMR của mẫu carrageenan và dẫn xuất của nó đƣợc đo ở 80oC với dung môi D2O trên máy Bruker AVANCE 500MHz ở Viện Hóa Học, dùng aceton làm nội chuẩn. 50 CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. TÍNH CHẤT HÓA LÝ VÀ ĐẶC TÍNH CẤU TRÚC CỦA KAPPA – CARRAGEENAN Hàm lƣợng carrageenan, 3,6 anhydro-D-galactose, sulfate, nhiệt độ tạo gel, nhiệt độ tan gel, độ bền gel và trọng lƣợng phân tử trung bình của kappa- carrageenan đƣợc trình bày trong bảng 3.1. Bảng 3.1: Thành phần hóa học và tính chất hóa lý của kappa-carrageenan từ rong đỏ K. striatum Hàm lƣợng carrageenan (% rong khô) Hàm lƣợng 3,6-AG (% carrageenan) Hàm lƣợng Sulfate (% carrageenan) Nhiệt độ tạo gel (oC) Nhiệt độ tan gel ( o C) Độ bền gel (g/cm 2 ) M (kDa) 39,2 ± 3,5 32,4 ± 0,5 24,3 ± 0,8 34,4 ± 0,9 55,6 ± 1,6 615 ± 45 267 AG: 3,6-anhydro-D-galactose; MW: trọng lƣợng phân tử trung bình theo độ nhớt. Trung bình ± SEM (n = 3). Các số liệu trong nghiên cứu này nằm trong phạm vi các giá trị đã đƣợc thông báo cho các loài rong đỏ chứa carrageenan với các giá trị đã đƣợc nghiên cứu và công bố cụ thể nhƣ sau: Hàm lƣợng 3,6-anhydro-D-galactose từ 15 đến 40%, so sánh với mẫu - carrageenan từ rong đỏ K. striatum 32,4 % ± 0,5 là thỏa mãn, hàm lƣợng sulfate - carrageenan từ rong đỏ K. striatum là 24,3 % ± 0,8 nằm trong khoảng từ 23,1 đến 34,5% [86], [87], [88]. Nhiệt độ tạo gel - carrageenan từ rong đỏ K. striatum: 34,4 oC ± 0,9 nằm trong khoảng từ 27 đến 34,5oC, nhiệt độ tan gel tƣơng tự 55,6 ± 1,6 oC thỏa mãn nằm trong phạm vi từ 52 đến 56oC [89]. Độ bền gel - carrageenan: 615 ± 45 thuộc từ 503–1004 g/cm2 [68]. Hàm lƣợng carrageenan là 39,2 % ± 3,5 tƣơng ứng từ 32,5 đến 54,3% [89], [90]. Trọng lƣợng phân tử trung bình - carrageenan là 267 kDa trong phạm vi từ 100 đến 700 kDa [44]. Sự khác nhau trong thành phần hóa học và tính chất hóa-lý giữa các mẫu carrageenan có thể do phƣơng pháp chiết khác nhau trong mỗi nghiên cứu cũng nhƣ thời gian thu hoạch mẫu. 51 3.1.1. Phổ hồng ngoại (FT-IR) của kappa carrageenan Hình 3.1: Phổ FT-IR của kappa carrageenan từ rong đỏ K. striatum Phổ hồng ngoại (FT-IR) (hình 3.1) của kappa-carrageenan cho thấy các dải hấp thụ ở số song 1250 cm-1 và 848 cm-1 tƣơng ứng với dao động đối xứng của liên kết O=S=O và dao động hóa trị của C4–O–S, đặc trƣng cho nhóm – SO4 của β-D-galactose của carrageenan [91]. Dải ở 928 cm-1 tƣơng ứng với sự tồn tại của liên kết C–O–C của 3,6- anhydro-D-galactose của carrageenan [91]. Dải hấp thụ ở 1159 cm-1 và và 1070 cm-1 cũng đã đƣợc thông báo cho dao động hóa trị của cầu nối –O- và dao động hóa trị của liên kết C–O của carrageenan [89], [92]. Dịch chiết carrageenan tự nhiên thƣờng chứa chủ yếu là kappa carrageenan và một lƣợng nhỏ iota-carrageenan mà chúng thƣờng cho thấy dải hấp thụ ở 805 cm -1 . Dải hấp thụ ở vùng số sóng 800-840 thuộc về dao động C-O-S, nếu tín hiệu trong vùng từ 800-820 cho thấy nhóm sulfate ở vị trí axial (C2 và/hoặc 52 C3), vùng 825-840 nhóm sulfate ở vị trí equatorial (C4) cho 3,6 anhydro-α-D- galactose-2-sulfate [89]. Tuy nhiên, phổ hồng ngoại trong nghiên cứu này không cho thấy sự xuất hiện của dải hấp thụ ở 805 cm-1, chỉ ra rằng mẫu carrageenan không chứa iota-carrageenan. 3.1.2. Phổ 13C NMR của kappa carrageenan Hình 3.2: Phổ 13C NMR của carrageenan từ rong đỏ K. striatum Phổ 13C NMR (hình 3.2) của kappa-carrageenan cho thấy sự chuyển dịch hóa học của các tín hiệu mạnh của các nguyên tử carbon trong các nhóm disaccharide lập lại, đƣợc thể hiện trong bảng 3.2, mà chúng tƣơng ứng với các giá trị đã đƣợc công bố [89], [92], [93], [94], [95]. Ngoài ra, các tín hiệu ở 102.6 ppm và 95.3 ppm cũng đã đƣợc thông báo cho các carbon anomeric của D-galactose-4-sulfate và 3,6-anhydro-D- galactose [89] cũng đã đƣợc ghi nhận trong phổ 13C NMR, các tín hiệu tƣơng 53 tự cũng đã đƣợc thông báo cho kappa-carrageenan từ rong đỏ K. alvarezii [89], [96]. Một tín hiệu yếu ở 59.2 ppm, mà nó tƣơng ứng với nhóm methoxyl trên C-6 của β-D-galactose-4-sulfate cũng đƣợc thấy trong phổ này. Bảng 3.2: Độ chuyển dịch hóa học (ppm) của nguyên tử carbon trong phổ 13C NMR của kappa-carrageenan từ rong đỏ K. striatum Đơn vị đƣờng Nguyên tử carbon Kappa- carrageenan Tham khảo [89] Tham khảo [92] Tham khảo [97] D-galactose-4- sulfate (G4S) C-1 102.6 102.6 102.7 102.9 C-2 69.7 69.6 69.9 70.1 C-3 78.7 78.9 79.1 79.5 C-4 74.1 74.1 74.3 74.5 C-5 74.7 74.7 75.0 75.2 C-6 61.4 61.2 61.5 61.7 3,6-anhydro-D- galactose (DA) C-1 95.3 95.2 95.4 95.7 C-2 69.9 69.9 70.1 70.4 C-3 78.9 79.1 79.4 79.6