Luận văn Tuyển chọn một số chủng nấm sợi từ rừng ngập mặn Cần Giờ có khả năng sinh tổng hợp enzyme chitinase cao

6]. Dahiya và cs (2005) đã ứng dụng chitinase từ Enterobacter sp. NRG4 nuôi trên MT bán rắn để phân lập tế bào trần từ nấm và nấm men [27]. Dahiya và cs (2006) Nghiên cứu enzyme chitinase từ Baccilus circulans và ứng dụng để phân giải thành tế bào nấm men (Rhaffia Rhodozyme) [26] . Lee (2007) đã nuôi cấy, tinh sạch và khảo sát một số đặc điểm của chitinase từ vi khuẩn Bacillus sp. [44]. De-hui Dai (2011) phát hiện được nhóm vi khuẩn chịu nhiệt Bacillus sp. HU1 từ đất ở suối nước nóng Trung Quốc cho nguồn enzyme chitinase mới có khả năng chịu nhiệt, khi ủ ở pH tối ưu 6,5 vẫn giữ được họat tính khi gia nhiệt ở 60PoPC trong thời gian 100 phút * Nghiên cứu về chitinase được sinh tổng hợp từ nấm sợi Nấm sợi được xem là nguồn cung cấp enzyme cho HT cao và ổn định, là đối tượng được chú ý để nghiên cứu nhiều trong lĩnh vực enzyme. Pedraza-Reyes và Lopez-Romero (1989) đã nghiên cứu về các đặc tính của hai loại enzyme ngoại bào chitinase ở nấm mốc Mucor rouxii [58]. Abdel-Naby và cs (1992) đã tinh sạch và khảo sát tính chất của enzyme chitinase từ Aspergillus carneus [18] Kumari và Panda (1994) đã nghiên cứu về ảnh hưởng của một số nhân tố đến sự tạo tế bào trần từ nấm sợi Trichoderma reesi và cho thấy vai trò của chitinase trong việc tạo tế bào trần [42]. Chitinase từ thể tự tiêu Penicillium oxalicum đã được Rodriguez, Copa Patiño, Pérez Leblic (1995) tinh sạch bằng phương pháp tủa muối amoni sunfat và tính chất của nó cũng đã được khảo sát với pH và nhiệt độ tối ưu là 5,0 và 35°C, enzyme này bền vững ở nhiệt độ tối đa 45°C và pH dao động từ 4,0 đến 6,0 [61] Escott, Hearn và Adams (1998) đã tủa và tinh sạch enzyme chitinase từ chủng Aspergillus fumigatus, phát hiện enzyme chitinase có khối lượng phân tử 45kDa khác biệt rõ nét với enzyme từ chủng Aspergillus carneus có khối lượng khoảng 25kDa. Bên cạnh đó, qua phân tích thành phần acid amin trong chủng Aspergillus carneus đã cho thấy enzyme chứa nhiều acid amin asparagine, serine, threonine hoạt đông trong điều kiện tối ưu pH 5,2 ở 50P0PC [29] Kawachi (2001) nghiên cứu phương pháp tinh sạch và các đặc tính của enzyme chitinase ngoại bào từ chủng nấm kí sinh Isaria japonica và chiết tách được 2 loại enzyme chitinase với khối lượng tương ứng 43,2kDa và 31,1kDa hoạt động tốt trong khoảng pH khá thấp từ 3,5 đến 4,5 ở nhiệt độ từ 40-50P0PC [39]. Những đặc điểm của chitinase và endo-ß-1,3-glucanase từ Trichoderma harzianum Rifai T24 có liên quan đến phòng trừ nấm bệnh Sclerotium rolfsii và Rhizoctonia solani đã được El-Katatny và cs nghiên cứu (2001) [28] Những nghiên cứu về chitinase được phát triển mạnh bởi nhiều chủng nấm Aspergillus sp. cho HT enzyme tốt. Nghiên cứu đường hóa chitin sử dùng MT nuôi cấy bán rắn với chủng nấm Aspergillus sp. S1-13 với cơ chất lấy từ chất thải trong thủy sản nhằm tận dụng nguồn phế thải để tạo ra nguồn enzyme có giá trị kinh tế cao. Với phương pháp tủa muối ammonisulfate và sắc kí đã tách được một exochitinase có khối lượng phân tử khoảng 73kDa và hai enzyme endochitinase có khối lượng lần lượt là 45kDa và 52kDa (Rattanakit, Plikomol, Yano, Wakayama, & Tachiki, 2002) [59] Đặc điểm của chitinase từ Trichoderma và ứng dụng để trừ nấm Crinipellis perniciosa gây bệnh trên cây ca cao (Marco, Valadares-Inglis, & Felix, 2003) [47] Gkargkas (2004) 15Tnghiên cứu về N-acetyl-[beta]-d-glucosaminidase được sinh ra bởi Fusarium oxysporum F3 phát triển trên m15Tôi trường bán rắn và ứng dụng trong trừ muỗi, nấm và côn trùng gây bệnh [34] Những nghiên cứu gần đây về điều kiện tối ưu trong nuôi cấy nhằm tạo nguồn enzyme HT cao và có sản lượng lớn từ những vật liệu giá trị thấp cũng được quan tâm rất nhiều (Abdel-Fattah et al., 2005). 14 chủng Penicillium sp. có HT chitinase được phân lập và khảo sát trên MT lên men bán rắn (Binod et al., 2005) [23] Rattanakit (2007) sử dụng enzyme chitinase phân lập từ Aspergillus sp. để xử lý MT nhiễm chitin [60]. Swiontek-Brzezinska và cs (2007) dựa vào cơ chế hoạt động của enzyme thủy phân chitin từ các chủng nấm phân lập từ vỏ tôm cho thấy chitinase từ vi khuẩn cho HT mạnh nhất ở pH=8 khi được ủ ở 40P0PC khác biệt so với chitinase từ nấm cho HT mạnh trong MT acid pH=5 ở nhiệt độ 50P0PC. Sự khác nhau về đặc điểm enzyme giữa các dòng vi sinh vật khá rõ [64] Chủng nấm như Penicilium sp. LYG 07 được Lee và cs (2009) phân lập từ đất cho HT enzyme chitinase từ ngày đầu tiên và tiếp tục tăng dần cho đến khi đạt được HT tối ưu sau 3 ngày nuôi cấy. Chitinase được tủa với isopropanol và sắc kí cột MonoQ và Butyl-Sepharose. Khối lượng phân tử chitinase sau khi điện đi SDS-PAGE cho kết quả là 46kDa. Enzyme có HT tối ưu ở pH là 5,0 và nhiệt độ là 40P0PC [43] Gần đây, Ghanem và cs (2010) đã nghiên cứu cải thiện điều kiện nuôi cấy nấm Aspergillus terreus trên cơ chất vảy cá nhằm tăng sản lượng chitinase sinh ra [33]. Năm 2011 ông đã tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy cho enzyme chitinase cao từ Alternaria alternata và ứng dụng sản xuất Chitooligosaccharides và Nacetyl-D-Glucosamine [32] * Nghiên cứu về chitinase được sinh tổng hợp từ vi sinh vật phân lập ở RNM Hơn 300 chủng Actinomyces có khả năng sinh tổng hợp chitinase được phân lập từ bùn biển ở RNM ở phía Nam Fujian, Trung Quốc. Ảnh hưởng của các chất cảm ứng, nguồn C, N và điều kiện nuôi cấy cho sinh tổng hợp chitinase của chủng Streptomyces S-128 đã được nghiên cứu bởi Bingxin (1992) [22] Maria, G.L., Sridhar, K.R. and Raviraja, N.S. (2005) đã phân lập được 14 chủng nấm ký sinh trên thực vật Acanthus ilicifolius và Acrostichum aureum ở RNM bờ biển phía tây nam của Ấn Độ có khả năng kháng các loại vi khuẩn Bacillus subtilis, Enterococcus sp., Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aerugionsa, Salmonella typhi and taphylococcus aureus và nấm Candida albicans và Trichophyton metagrophytes. HT enzyme cellulase, xylanase, pectinase, chitinase và protease của những chủng nấm này cũng đã được nghiên cứu [48] Mtui và Masalu (2008) đã nghiên cứu về enzyme ngoại bào trong đó có chitinase của nấm Laetiporus sulphureus được phân lập từ RNM ở Tanzania, những tính chất sinh hóa của các enzyme này đã được làm rõ và ứng dụng trong hệ thống xử lý nước thải bằng phương pháp vi sinh [51] Liu (2009) đã phân lập các chủng vi sinh vật ở đất RNM phía Nam Hàn Quốc có khả năng sinh chitinase và tinh sạch 2 loại chitinase chitinases từ Aeromonas schubertii [45] 1.3.2. Trong nước * Nghiên cứu về enzyme chitinase ly trích từ thực vât Đặng Trung Thành (2008) nghiên cứu thu nhận nguồn enzyme chitinase từ khoai lang ở Khánh Hòa đã thu được những kết quả ban đầu khả quan khi tận dụng nguồn phế phẩm từ lá khoai lang để sản xuất nguồn enzyme có giá trị. Nguyễn Đình Nga (2008) khảo sát khả năng tác động lên nấm Candida albicans của enzyme chitinase thu nhận từ thực vật và nấm Trichoderma. Nguyễn Quang Nhân (2009) nghiên cứu thu nhận, tinh sạch và xác định tính chất của chitinase từ mủ cây cao su Hevea Brasiliensis, đề ra qui trình thu nhận chitinase từ mủ cây cao su cũng như các đặc tính hóa lý của enzyme [4], [10] * Nghiên cứu về enzyme chitinase được tổng hợp bởi vi sinh vật Vi sinh vật là một trong những đối tượng chính để trích ly nguồn enzyme chitinase có HT cao. Trần Thị Luyến và cs (2000) đã nghiên cứu hoàn thiện quy trình sản xuất Chitin-Chitosan và chế biến một số sản phẩm công nghiệp từ phế liệu vỏ tôm, cua. Đinh Minh Hiệp (2001) đã nghiên cứu quy trình chiết tách và ứng dụng nguồn enzym chitinase từ nấm mật Coprinus fimentarius. Nguyễn Thị Hồng Thương và cs (2003) đã khảo sát một số yếu tố tác động quá trình sinh tổng hợp hệ enzym chitinase của các chủng nấm mốc Trichoderma spp. Tô Duy Khương (2004) đã khảo sát sự sinh tổng hợp chitinase ở Trichoderma spp. và khả năng đối kháng với một số nấm gây bệnh. Quỳnh Hương (2006) nghiên cứu về chuyển gen kháng nấm chitinase gluconase vào cây sắn thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens và đã thu được một số kết quả ban đầu. Thạch Thành Trung et al., 2009 nghiên cứu sự cảm ứng isozyme endochitinase ở Trichoderma longibrachiatum TĐ16. Lê Thị Huệ (2010) khảo sát khả năng sinh tổng hợp enzyme chitinase của một số chủng NS thuộc giống Aspergillus, Trichoderma và ứng dụng. Đinh Minh Hiệp (2010) nghiên cứu enzyme chitinase và β- glucanase từ vi nấm Trichoderma spp. và khả năng kiểm soát sinh học đối với một số nấm gây bệnh ở thực vật [4], [10] Nhìn chung, những nghiên cứu về chitinase ở vi sinh vật trong nước còn rất ít, chủ yếu nghiên cứu về chitinase do chi Trichoderma sinh ra và ứng dụng phòng trừ nấm bệnh trong nông nghiệp. Chương 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1. Vật liệu 2.1.1. Đối tượng nghiên cứu Các chủng NS được phân lập từ RNM Cần Giờ do phòng thí nghiệm Vi sinh – Sinh hóa, Trường ĐHSP Tp. HCM cung cấp. Các chủng nấm gây bệnh Rhizoctonia solani, Fusarium oxysporum do bộ môn bảo vệ thực vật Khoa Nông nghiệp Trường Đại học Cần Thơ cung cấp 2.1.2. Hóa chất, nguyên liệu, thiết bị, dụng cụ * Hóa chất: Chitin, N-acetyl glucosamine (Merck), HCl, NaOH, ethanol, aceton, ammonium sulfate, acid phosphoric (TQ), Bovine serum albumin (BSA) (Merck), Comassie Brilliant Blue G250, Trizma Base (Merck), DNS (Merck), glucose, pepton, cao nấm men, chitin, agar, cồn, nước biển, khoai tây, trấu, cám; NaNOR3R, KR2RHPOR4R, MgSOR4R.7HR2RO, KCl, FeSOR4R.7HR2RO, (NHR4R)R2RHPOR4R, Urê, CaClR2R, HCl, Lugol và các hóa chất khác * Nguyên vật liệu: Bột chitin, chitin huyền phù, khoai tây, trấu, cám, bột bắp, bột bắp trích béo, bột đậu nành, bột đậu nành trích béo, bột mì ngang. Cách tạo bột chitin: Vỏ tôm rửa sạch, sấy khô. Sau đó xử lí tách protein bằng dung dịch NaOH 4% ở 70-75PoPC trong 4 giờ, rửa sạch bằng nước cất. Tiếp tục tách khoáng bằng dung dịch HCl 8% ở nhiệt độ phòng trong 16 giờ, rửa sạch bằng nước cất. Sấy khô, xay nhuyễn thành dạng bột. Cách tạo chitin huyền phù: Theo phương pháp của Dai et al. (2011) dung dịch chitin huyền phù 1 % được chuẩn bị như sau: 1g bột chitin được cho dần vào 20ml HCl đậm đặc, để ở 4PoPC và khuấy đều qua đêm. Thêm vào hỗn hợp 200ml ethanol lạnh (-20PoPC) khuấy đều thật nhanh và ủ qua đêm. Ly tâm hỗn hợp ở 5000 vòng/ phút, trong 20 phút, thu lấy kết tủa và rửa bằng nước cất cho đến khi pH trung tính. Thêm vào tủa nước cất cho đến thể tích 100ml. [27] * Thiết bị, dụng cụ - Các thiết bị: nồi hấp vô trùng Huxley (Đài Loan),tủ cấy vô trùng Esco (Singapore), tủ sấy Memmert (Đức), tủ ấm Binder (Đức), KHV quang học, máy chụp hình kỹ thuật số Olympus 5.1 (Nhật), tủ lạnh (National - Nhật), máy đo pH Hana (Nhật), máy li tâm Heraeus ( Đức), cân điện tử Scientech ( Mỹ), máy lắc (Gerhardt - Đức), máy ảnh kĩ thuật số Olympus (Nhật Bản), buồng đếm hồng cầu Burk-Turk, cân phân tích Sartorius (Đức), máy khuấy từ (Hoa Kỳ), Micropipette 20, 100, 200, 1000µl (Eppendorf, Germany). - Các dụng cụ thí nghiệm: Thước đo khuẩn lạc, bình tam giác, ống nghiệm, đĩa petri, đèn cồn, diêm quẹt, que gạt, que cấy, giấy lọc, lame, lammel, bông mỡ, bông thấm nước. 2.1.3. Môi trường * MT Malt Extract Agar (MEA) MT nuôi cấy và giữ giống NS ở RNM [14]: Cao malt 20g, pepton 1g, agar 20g, glucose 20g, nước 1000ml, muối 2%, pH = 5,5 – 6,0 * MT bán rắn khảo sát khả năng sinh tổng hợp hệ enzym thủy phân chitinase từ các chủng NS (MT1) [13]: Trấu 50g, cám 40g, cao nấm men 1g, (NHR4R)R2RSOR4R 0,1g, CaClR2R 0,1g, KCl 0,05g, MgSOR4R.HR2RO 0,05g, bột chitin 10g, muối 2% nước 60%. * MT thử hoạt tính chitinase (MT2) [4]: NaNOR3R 3,5g, KR2RHPOR4 R1,5g, MgSOR4R.7HR2RO 0,5g, KCl 0,5g, FeSOR4R.7HR2RO 0,01g, bột chitin 10g, agar 20g, muối 2%, pH = 6,5. * MT CYA (nuôi cấy nấm gây bệnh cây trồng) [4]: NaNOR3R 3g, KR2RHPOR4 R1g, KCl 0,5g, MgSOR4R.7HR2RO 0,5g, FeSOR4R.7HR2RO 0,01g, cao nấm men 5g, sucrose 30g, agar 20g. * MT CYB (nuôi cấy nấm gây bệnh cây trồng) [4]: NaNOR3R 3g, KR2RHPOR4 R1g, KCl 0,5g, MgSOR4R.7HR2RO 0,5g, FeSOR4R.7HR2RO 0,01g, cao nấm men 5g, sucrose 30g. 2.2. Phương pháp nghiên cứu 2.2.1. Phương pháp kích hoạt giống Giống vi nấm được lấy từ phòng thí nghiệm Vi sinh – Sinh hóa Trường ĐHSP TP.Hồ Chí Minh ở dạng bảo quản trong dầu khoáng. Dùng MT Yeast extract agar (YEA) để nuôi cấy NS. Dùng giấy thấm hút hết dầu khoáng, sau đó dùng que cấy vớt lấy BT cho vào dung dịch Tween 80 nồng độ 0,05%, lắc nhẹ. Sau đó dùng pipet hút 50 ml cho vào đĩa petri chứa MT MEA và dùng que cấy trang đều. Sau 3 ngày, cấy chuyền sang ống thạch nghiêng để bảo quản giống 2.2.2. Phương pháp bảo quản nấm sợi * Bảo quản giống trong ống nghiệm : Nguyên tắc: giống phải được bảo quản tốt để không làm thay đổi phẩm chất ban đầu của giống Tiến hành: - Chuẩn bị các ống thạch nghiêng bằng cách cho vào ống nghiệm có nút bông một lượng MT MEA bằng 1/3 thể tích ống, đem hấp khử trùng ở 121P0PC 1 atm trong 30 phút. Để nguội ống nghiệm chứa MT ở tư thế nghiêng một góc sao cho mặt nghiêng và phần thạch sâu đạt yêu cầu. Để yên cho đến khi MT đặc lại. - Thực hiện thao tác cấy chuyền giống vi sinh vật từ ống giống sang các ống thạch nghiêng. Để các ống thạch nghiêng sau khi cấy ở nhiệt độ phòng khoảng 7 – 10 ngày, sau đó bảo quản trong tủ 4- 6P0PC [13], [14] * Bảo quản giống trên MT thạch có lớp dầu khoáng Nguyên tắc: Bảo quản giống trong dầu khoáng giúp cho giống giữ nguyên phẩm chất ban đầu mà MT không mất nước và không bị khô Tiến hành: Cho 0,2 ml dầu khoáng (như paraffin lỏng hay vazơlin) vào ống eppendorf, khử trùng bằng cách hấp ở 121P0PC trong 30 phút, để nguội. Nuôi cấy NS đạt đến độ trưởng thành (7-10 ngày). Dùng que cấy vô trùng lấy một lượng BT cho vào ống eppendofy, đậy nắp và dùng keo parafin quấn quanh miệng ống và bảo quản ở điều kiện lạnh 4- 6 P0PC. [13], [14] 2.2.3. Nghiên cứu đặc điểm sinh học và phân loại NS Nguyên tắc: Các chủng cần định danh phải được nuôi cấy trên các MT, nhiệt độ, thời gian nuôi cấy theo đúng qui định của các khóa phân loại với từng chi NS. Quan sát các đặc điểm hình thái đại thể và vi thể của chủng nấm. Dựa vào đặc điểm quan sát được, phân loại theo khóa phân loại. Dùng chuyên luận các nhóm phân loại (taxon) bậc cao (ngành, ngành phụ, lớp, bộ, họ, chi) để định loại đến chi. Nếu các đặc điểm so sánh phù hợp với đặc điểm của chi mô tả trong khóa, ta xác định được tên chi của chủng NS cần định danh. Tiến hành: Quan sát đại thể: Cấy NS vào ống thạch nghiêng, sau 3 ngày cho 5ml nước cất vô trùng vào ống giống, lăn nhẹ ống giống trong lòng bàn tay để các BT thấm nước tạo thành dịch huyền phù. Sau đó dùng que cấy vô trùng nhúng nhẹ vào dịch huyền phù rồi cấy 1 điểm vào đĩa petri có đổ một lớp mỏng MT MEA. Ủ ở nhiệt độ 25PoPC, quan sát từng ngày KL về các đặc điểm sau: - Tốc độ phát triển của KL. - Màu sắc và sự biến đổi màu sắc của KL. - Hình dáng KL, mép KL và sợi nấm. - Giọt tiết. - Sắc tố tiết vào MT. Quan sát vi thể: Đặt một miếng thạch mỏng (MT5) có kích thước 0,5x 0,5cm lên một miếng lam vô trùng đặt ở giữa đĩa petri có một miếng giấy lọc được làm ẩm bằng nước cất vô trùng. Sau đó cấy NS vào 2 góc đối của miếng thạch, đậy lamen lên, đậy nắp đĩa petri lại và ủ ở nhiệt độ phòng trong 2 ngày. Lấy lam ra, quan sát bằng kính hiển vi ở vật kính x40 và x100 về các đặc điểm sau: - Hình dạng sợi nấm: màu sắc, có hay không có vách ngăn, có phân nhánh hay không. - Đặc điểm cơ quan sinh BT. - Hình dáng BT. Kiểm tra các đặc điểm KL bằng mắt thường và quan sát cơ quan sinh BT dưới kính hiển vi quang học để xác định các chủng NS theo khóa phân loại của Bùi Xuân Đồng và A. Samson (2004). [1], [3], [14], [62] 2.2.4. Phương pháp xác định mật số BT vi sinh vật [5] Nguyên tắc: Dựa trên số lượng bào tử quan sát được trên 4 ô lớn của buồng đếm Burk-Turk để suy ra số lượng bào tử trên một đơn vị thể tích (1ml) dịch huyền phù. Tiến hành: Cấy NS vào ống thạch nghiêng, sau 7 ngày cho 10ml dung dịch Tween 80 nồng độ 0,05% hoặc nước muối sinh lý vào. Dùng que cấy cạo nhẹ phần BT trên bề mặt để tạo dịch huyền phù. Pha loãng dịch huyền phù đến độ loãng thích hợp và đếm trực tiếp trên buồng đếm Burk-Turk. Sau đó tính BT tổng số theo công thức: N = [a/0,016] x 10P3P x n (tế bào/ml). Trong đó, N: số lượng tế bào trong 1 ml, a: tổng số tế bào trong 4 ô lớn, 0,016: thể tích của 4 ô lớn (µl); n: độ pha loãng; 10P3P: số chuyển mmP3P thành ml (1000mmP3P = 1ml) 2.2.5. Phương pháp xác định gián tiếp số lượng tế bào bằng cách đếm số lượng KL Nguyên tắc: Mỗi KL nấm sợi được hình thành từ 1 BT ban đầu. Số lượng KL đếm được từ một thể tích giống gần như tương đương với số lượng tế bào sống trong thể tích giống đó Tiến hành: Tạo dịch huyền phù BT, tiến hành pha loãng để giảm nồng độ tế bào cho đến khi đạt vài nghìn tế bào/ml. Dùng pipet vô khuẩn lấy từ 0,05 – 0,5ml cho vào mỗi đĩa thạch, sử dụng que cấy gạt thủy tinh để dàn đều các tế bào trên bề mặt thạch, sau 1-2 ngày lấy ra đếm số KL rồi suy ra số lượng tế bào có trong thể tích giống đó. Số lượng tế bào = a x n (a: số KL, n: số lần pha loãng) [4], [13] 2.2.6. Phương pháp nuôi cấy NS trên MT bán rắn thu enzyme chitinase Nguyên tắc: NS sử dụng chất dinh dưỡng có sẵn trong MT để sinh trưởng, tổng hợp một lượng lớn enzyme ngoại bào lẫn trong MT, ta thu được sinh khối NS lẫn enzyme thô từ canh trường. Tiến hành: Cân 10g MT 1 vào các bình 250 ml, hấp khử trùng ở 121P0PC trong 30 phút, sau đó để nguội. Cho 10 ml dung dịch Tween 80 nồng độ 0.05% vào 1 ống giống thạch nghiêng, dùng que cấy cà đều bề mặt, lắc mạnh tạo dịch huyền phù BT. Tiến hành đếm bào tử bằng buồng đếm hồng cầu. Chủng huyền phù BT vào mỗi bình tam giác sao cho mật độ BT là 10P6P BT/1g MT. [10] 2.2.7. Phương pháp tách chiết enzym thô từ canh trường nuôi cấy Nguyên tắc: Dựa trên khả năng hòa tan trong nước của các enzyme, dùng nước cất hòa tan tạo dịch enzyme, sau đó dùng các tác nhân kết tủa khác nhau để kết tủa enzyme. Kết tủa enzyme được sấy ở nhiệt độ dưới 40P0PC, tạo sản phẩm enzyme dạng bột khô Tiến hành: Sau khi nuôi cấy NS trên MT bán rắn cho vào mỗi bình tam giác (chứa 10g MT) 80 ml nước cất, lắc các bình tam giác bằng máy lắc trong 1 giờ, tốc độ 200 vòng/phút, sau đó lọc qua vải, thu dịch lọc, li tâm dịch lọc với tốc độ 5000 vòng/phút trong 10 phút, thu dịch nổi là dịch enzyme thô. Sử dụng ethanol, aceton hoặc amoni sunphat để kết tủa enzyme, li tâm thu tủa được chế phẩm enzyme thô. [10], [13] 2.2.8. Phương pháp xác định sơ bộ khả năng tổng hợp enzyme chitinase bằng cách đo đường kính vòng phân giải Nguyên tắc: Khi chitinase có mặt trong MT chứa chitin nó sẽ phân giải chitin ra N- acetyl glucosamine và các cấu trúc mạch ngắn hơn không bắt màu với thuốc thử lugol. Khi nhỏ thuốc thử lugol, độ lớn của phần MT trong suốt (vòng phân giải) phản ánh HT chitinase của chủng NS. Đo đường kính vòng phân giải để xác định HT chitinase. [10] Cách tiến hành: Dùng khoan nút chai (d= 0,9cm) vô trùng, khoan các lỗ thạch trên MT nuôi cấy NS ở các đĩa petri. Dùng pipet vô trùng nhỏ 100μl dịch enzyme thô vào các lỗ khoan. Giữ các hộp petri ở nhiệt độ phòng trong 1 đến 2 ngày, cho thuốc thử lugol vào. Xác định HT chitinase bằng thuốc thử lugol rồi đo kích thước vòng phân giải (D – d, cm), với D là đường kính vòng phân giải. D-d ≥ 2,5cm: chủng NS có HT chitinase mạnh D-d ≥ 2,0cm: chủng NS có HT chitinase khá mạnh D-d ≥ 1,5cm: chủng NS có HT chitinase trung bình D-d < 1,5cm: chủng NS có HT chitinase yếu 2.2.9. Phương pháp xác định HT của enzyme chitinase bằng phương pháp so màu HT của chitinase được xác định theo phương pháp so màu với thuốc thử DNS (3,5 – dinitrosalicylic acid) [10], [25], [43] Nguyên tắc: HT chitinase được xác định dựa vào lượng đường khử N-acetyl-β-D-Glucosamine sinh ra ttrong phản ứng thủy phân. Khi cho chitinase tác dụng với cơ chất là chitin huyền phù, N- acetyl-β-D-Glucosamine sinh ra trong phản ứng được định lượng qua phản ứng với thuốc thử DNS (3,5 - dinitrosalisylic acid), cho sản phẩm 3-amino-5 nitrosalicylic acid hấp thụ ánh sáng khả kiến ở bước sóng 535nm. +  + đường oxi hóa Tiến hành Chuẩn bị hóa chất * Dung dịch đệm phosphate 0,2M, pH 6,5 N – Acetylglucosamine - Dung dịch NaHR2RPOR4R 0,2M: cân 31,2g NaHR2RPOR4R.2HR2RO hòa tan và thêm nước cất đến 1000ml - Dung dịch NaR2RHPOR4 R0,2M: cân 71,6g NaR2RHPOR4R.12HR2RO hòa tan và thêm nước cất đến 1000 ml * Thuốc thử DNS - Dung dịch A: hòa tan 300g muối Na-K tartrat kép vào trong 500ml nước cất. - Dung dịch B: hòa tan 10g 3,5-dinitrosalicylic acid vào 200ml dung dịch NaOH 2N - Thuốc thử DNS dùng trong phản ứng: trộn dung dịch A với dung dịch B, thêm nước cất cho đủ 1 lít. Chỉ pha dung dịch DNS dùng cho phản ứng trước khi sử dụng, bảo quản trong chai nâu và tránh không khí Dựng đường chuẩn N-acetyl-β-D-Glucosamine Chuẩn bị dung dịch chuẩn N-acetyl-β-D-Glucosamine (10µmol/ml): cân chính xác 0,1105g N- acetyl- β -D-Glucosamine, cho nước cất vào đủ 50 ml. Bảng 2.1: Bố trí thí nghiệm dựng đường chuẩn Glucosamine. Chuẩn bi dãy dung dịch N-acetyl-β-D-Glucosamine với các nồng độ khác nhau từ0- 7(µmol/ml) Ống nghiệm số 0 1 2 3 4 5 6 7 Nồng độ N-acetyl-β-D-Glucosamine (µmol/ml) 0 0,5 1 1,5 2,0 2,5 3.0 3.5 Thể tích dung dịch chuẩn (10µmol/ml) N-acetyl- β -D-Glucosamine (ml) 0 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 0,3 0,35 Thể tích nước cất (ml) 1 0,95 0,9 0,85 0,8 0,75 0,7 0,65 Tổng thể tích (ml) 1 1 1 1 1 1 1 1 Phản ứng của N-acetyl- β -D-Glucosamine với thuốc thử DNS Dung dịch N-acetyl- β -D-Glucosamine 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 với các nồng độ khác nhau đã chuẩn bị như trên (ml) DNS (ml) 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 Lắc đều, đun sôi 5 phút HR2RO (ml) 1 1 1 1 1 1 1 1 Lắc đều, để yên 5 phút, đo OD ở bước sóng 535 nm Chuẩn bị dung dịch chuẩn N-acetyl-β-D-Glucosamine (10µmol/ml): cân chính xác 0,1105g N- acetyl- β -D-Glucosamine, cho nước cất vào đủ 50 ml. Pha loãng dung dịch dung dịch chuẩn N-acetyl- β -D-Glucosamine (10µmol/ml) để có dãy nồng độ từ 0-4(µmol/ml) Lấy 0,2ml dung dịch N-acetyl- β -D-Glucosamine với các nồng độ khác nhau cho tác dụng với 0,2ml DNS, đun sôi trong 5', thêm vào mỗi ống 1ml nước cất. Lắc đều, đo OD của dung dịch ở bước sóng 535nm. Dựng đường chuẩn biểu diễn sự tương quan giữa nồng độ N-acetyl-β-D-Glucosamine và giá trị OD. Xác định HT enzyme chitinase Nguyên tắc: HT enzyme chitinase được xác định dựa trên phương pháp định lượng glucosamine sinh ra trong quá trình phân giải chitin. Tiến hành * Đối với dịch enzyme làm thí nghiệm - Cho vào các eppendorf hỗn hợp phản ứng gồm: 0,5ml enzyme + 0,5ml chitin huyền phù 1%. Ủ ở 40P0PC trong vòng 60 phút. Ngừng phản ứng bằng 0,5ml NaOH 1N và đun sôi cách thủy trong 5 phút Ly tâm 4000 vòng/phút trong 5 phút, thu dịch bên trên, bỏ cặn. Cho vào eppendoff 0,2ml dung dịch thủy phân enzyme + 0,2ml DNS 1%, lắc đều, đun sôi cách thủy trong 5 phút, làm lạnh nhanh trong bồn làm lạnh. Thêm 1ml nước cất, lắc đều và đo OD ở bước sóng 535nm * Đối với dịch enzyme làm đối chứng - Cho 0,5 ml dịch enzyme vào ống nghiệm, nhỏ 0,5 ml NaOH 1N, đun sôi cách thủy trong 5 phút, sau đó cho thêm 0,5 ml dịch huyền phù chitin 1% vào, tiếp tục làm theo các bước tương tự như trên - Lượng glucosamine sinh ra được xác định dựa theo đường chuẩn N-acetyl-β-D-Glucosamine Đơn vị HT chitinase Một đơn vị HT chitinase (đvht) là lượng enzyme cần thiết để giải phóng 1µmol N-acetyl-β-D- Glucosamine (NAG) từ phản ứng thủy phân cơ chất chitin trong thời gian 1 phút ở nhiệt độ 40P0PC HTR của chitinase: là số đơn vị HT enzyme có trong 1mg protein HT riêng được xác định theo công thức HT chitinase U/ml CPE Lượng protein mg/ml CPE Trong đó: CPE là chế phẩm enzym Đơn vị HTR = U/mg-protein 2.2.10. Phương pháp định lượng protein [8] Nguyên tắc: Phương pháp này dựa trên sự thay đổi màu của thuốc thử Bradford khi kết hợp với protein trong MT acid. Thuốc thử Bradford là hợp chất gồm Coomassie Brilliant Blue (CBB) G250 và phosphoric acid hòa tan trong ethanol:nước cất theo tỷ lệ 1:4. Trong MT mang tính acid, khi chưa gắn với protein thì thuốc nhuộm ở dạng màu đỏ có bước sóng hấp thu cực đại 465 nm và khi kết hợp với protein thì thuốc nhuộm chuyển sang màu xanh dương và hấp thụ cực đại ở bước sóng 595 nm. Vì vậy lượng protein có thể được biết bằng cách xác định thuốc nhuộm ở dạng tích điện màu xanh dương khi đo hấp thụ của dung dịch ở bước sóng 595 nm. Độ hấp thu tỷ lệ thuận với HL protein có trong dung dịch. Các bước tiến hành: = Chuẩn bị dung dịch Bradford: hòa tan 100mg Coomassie Brilliant Blue G250 trong 50ml ethanol 95% → cho thêm 100ml acid phosphoric 85% → khuấy đều → bổ sung thêm nước cất cho đến 1lít → Lọc dung dịch bằng giấy lọc Whatman No.1→ trữ trong chai tối ở nhiệt độ phòng. Xây dựng đường chuẩn : Chuẩn bị dãy protein BSA chuẩn với nồng độ tăng dần từ 0, 5, 10, 20, 30, 50 µg/ml • Thí nghiệm được lặp lại 3 lần. • Chuẩn bị các ống eppendorf và thêm vào các chất theo bảng: Bảng 2.2: Bố trí thí nghiệm dựng đườn