Luận văn Tuyển chọn, nuôi cấy chủng Aspergillus oryzae sinh tổng hợp endo-Β-1,4-glucanase và xác định tính chất lý hóa của nó

n vi sinh vật và Công nghệ sinh học (Đại học Quốc gia Hà Nội) cung cấp đƣợc sử dụng để tuyển chọn chủng sinh tổng hợp endo-β-1,4-glucanase cao nhất. 2.1.2. Thiết bị Các thiết bị sử dụng trong thí nghiệm đƣợc liệt kê trong bảng 2.1. Bảng 2.1. Thiết bị đƣợc sử dụng trong thí nghiệm Tên thiết bị Hãng sản xuất Bể ổn nhiệt Trung Quốc Box cấy LB-1234 Việt Nam Box cấy vi sinh vật clean bench (TTCG công nghệ) Việt Nam Cân phân tích AB 240 Sartorius (Thụy Sỹ) Cân phân tích BL 150S Sartorius (Đức) Hệ thống chụp ảnh gel-doc Pharmacia (Thụy Điển) Hệ thống điện di ngang Mupid α (Nhật Bản) Hệ thống điện di SDS-PAGE Biometra (Đức) Lò vi sóng SamSung (Hàn Quốc) Máy chuẩn pH tự động 718 Stat Titrino Metrohm (Thụy Sỹ) Máy lắc nuôi cấy Certomat HK (Đức) Máy li tâm lạnh Mikro 22R Hettich (Đức) Máy PCR Mastercycler personal Eppendorf (Đức) Máy quang phổ UV-2500 LaboMed Inc (Mỹ) Nồi khử trùng ES-315 Tomy (Nhật Bản) Tủ lạnh 4C, -20C, -80C Toshiba, Sanyo (Nhật bản) 2.1.3. Hóa chất Các hóa chất dùng trong thí nghiệm đều ở dạng tinh khiết (bảng 2.2) Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 23 Bảng 2.2. Các hóa chất đƣợc sử dụng trong thí nghiệm Hóa chất Hãng sản xuất (nƣớc) Cao nấm men Difco (Mỹ) CMC Sigma (Mỹ) Kit tinh sạch plasmide QIA prep Spin Miniprep Qiagen (Mỹ) Peptone Merck (Mỹ) Sephadex G100 Pharmacia Sodium dodecylsulfate Sigma (Mỹ) Triton X-100 Merck (Đức) Tween-20 BioBasic Inc (Mỹ) 2.1.4. Dung dịch và đệm phá tế bào Bảng 2.3. Danh sách các dung dịch và đệm đƣợc sử dụng trong thí nghiệm Dung dịch Thành phần, nồng độ Dung dịch A Đệm 1,5 M Tris-HCl, pH 8,8 Dung dịch Amp gốc 100 mg/ml ampicillin Dung dịch APS 10% ammonium persulfate Dung dịch arsenomolypdate 5% (w/v) ammonium molybdate; 5% (v/v) H2SO4 đặc; 0,6% (w/v) Na2HAsO4.7H2O Dung dịch B Đệm 0,5 M Tris-HCl, pH 6,8 Dung dịch Bradford gốc 100 ml 95% ethanol; 350 mg serva Blue G; 200 ml 88% phosphoric acid Dung dịch Bradford thí nghiệm 425 ml H2O; 15 ml 95% ethanol; 30 ml 88% phosphoric acid; 30 ml dung dịch Bradford gốc Dung dịch C 30% acrylamide; 0,8% bis-acrylamide Dung dịch D 10% SDS; 25mM EDTA Dung dịch muối A 20% (w/v) Na2SO4; 2,5% (w/v) Na2CO3; 2,5% (w/v) muối Seignett; 2% (w/v) NaHCO3 Dung dịch muối B 15% CuSO4.5H2O; thêm vài giọt H2SO4 đặc Dung dịch nhuộm 0,1% (w/v) Coomassie Brilliant Blue; 30% (v/v) Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 24 methanol; 10% (v/v) acetic acid Dung dịch nhuộm gel 0,1 μg/ml ethidium bromide Dung dịch phá tế bào 100 mM Tris, 100 mM EDTA, 2% SDS, pH 8,0 Dung dịch protease K 20 μg/ml protease K Dung dịch RNase 10 μg/ml Rnase Dung dịch rửa PAGE 30% (v/v) methanol; 10% (v/v) acid acetic Dung dịch Sol I 50 mM glucose; 25 mM Tris-HCl; 10 mM EDTA; pH 8,0 Dung dịch Sol II 0,2 N NaOH; 1% SDS Dung dịch Sol III 60% potassium acetate; 11,5% (v/v) acid glacial acetic Đệm điện di protein (biến tính) 25 mM Tris-HCl; 192 mM glycine; 0,1% SDS, pH 8,4 Đệm TBE 10x 108 g Tris base; 55 g boric acid; 40 ml 0,5 M EDTA pH 8,0 Đệm TE 100 mM Tris-HCl; 1 mM EDTA; pH 8,0 Đệm tra mẫu protein 5X (biến tính) 0,05% Brommophenol blue; 50% glycerol 100%; 10% SDS; 10% 2 mecaptho ethanol pha trong đệm 0,312 M Tris-HCl, pH 6,8 Đệm tra mẫu DNA 5x 0,09% (w/v) brommophenol blue; 0,09% (w/v) xylene xyanol (FF); 60% (v/v) glycerol Hỗn hợp muối AB Dung dịch muối A: dung dịch muối B = 25:1 2.1.5. Môi trƣờng Các chủng A. oryzae đƣợc nuôi cấy trong 3 ml môi trƣờng khoáng (MTK): 0,1% (w/v) peptone; 0,2% (w/v) KH2PO4; 0,03% (w/v) CaCl2.2H2O; 0,14% (w/v) (NH4)2SO4; 0,03% MgSO4.7H2O; 0,1% (w/v) cao nấm men; 1 ml dung dịch muối (18 mM FeSO4; 6,6 mM MnSO4; 4,8 mM ZnSO4.7H2O; 15 mM CoCl2); pH 6,5 khử trùng (Hong et al., 2001). Cazpek: 0,1% (w/v) NaNO3; 0,1% (w/v) K2HPO4; 0,05% (w/v) MgSO4; 0,05% (w/v) KCl; 2% sucrose; pH 6,5 khử trùng. Môi trƣờng đặc bổ sung 2% (w/v) agar. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 25 Chủng E. coli DH5α đƣợc nuôi cấy trong môi trƣờng LB (Luria-Bertani): 1% (w/v) peptone; 0,5% (w/v) cao nấm men; 1% (w/v) NaCl; pH 6,5 khử trùng, với môi trƣờng đặc bổ sung 2% (w/v) agar. Đối với việc chọn chủng mang plasmid tái tổ hợp, môi trƣờng đƣợc bổ sung 100 μg/ml ampicillin. 2.2. PHƢƠNG PHÁP 2.2.1. Nuôi cấy sinh tổng hợp enzyme Chủng nấm A. oryzae sinh tổng hợp endo-β-1,4-glucanase đƣợc nuôi cấy trong môi trƣờng khoáng MTK chứa 0,5% CMC làm nguồn cơ chất cảm ứng ở nhiệt độ 30C, lắc 200 vòng/phút, sau 72 giờ. 2.2.2. Định tính endo-β-1,4-glucanase Hoạt tính enzyme đƣợc định tính theo phƣơng pháp khuếch tán trên đĩa thạch. Đĩa thạch chứa 0,5% cơ chất CMC trong nƣớc cất dày khoảng 0,5 cm, đƣợc đục lỗ đƣờng kính 0,5 cm. Năm mƣơi μl dịch enzyme đƣợc cho vào lỗ rồi ủ 12 giờ trong 4C cho enzyme khuếch tán. Sau đó, đĩa thạch đƣợc ủ 4-6 giờ ở 37C lấy ra và nhuộm bằng lugol 1%. Bán kính vòng thủy phân Rhalo = R-r (với R là bán kính vòng ngoài tính từ tâm lỗ đến mép ngoài cùng vòng thủy phân và r là bán kính lỗ), biểu thị hoạt tính tƣơng đối của enzyme. 2.2.3. Xác định hoạt tính endo-β-1,4-glucanase Hoạt tính enzyme đƣợc xác định theo phƣơng pháp định lƣợng đƣờng khử của Nelson/Samogi (Nelson N, 1944). Đơn vị hoạt độ là lƣợng enzyme phân giải cơ chất CMC thành đƣờng khử tƣơng đƣơng 1 l glucose trong một phút ở điều kiện thí nghiệm. Xây dựng đường chuẩn: Glucose đƣợc pha trong 100 mM đệm natri acetate pH 5,0 với các nồng độ chuẩn khác nhau từ 20-100 µg/ml. Một ml dung dịch glucose chuẩn đƣợc đo ở bƣớc sóng 660 nm. Độ hấp phụ và nồng độ Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 26 glucose đƣợc vẽ theo chƣơng trình Excel. Kết quả cho thấy, đƣờng nồng độ chuẩn tuyến tính trong dải nồng độ từ 20-90 µg/ml. Đƣờng chuẩn có phƣơng trình y = 0,0064x - 0,0024. Trong đó, y là độ hấp phụ (OD) ở bƣớc sóng 660 nm, x là nồng độ glucose (µg/ml) (Hình 2.1). Hình 2.1. Đƣờng chuẩn glucose Ống thí nghiệm (lặp lại 3 lần): 0,5 ml dung dịch 0,5% CMC pha trong 100 mM đệm natri acetate pH 5,0 đƣợc cho vào ống nghiệm, thêm 0,5 ml dịch enzyme. Hỗn hợp đƣợc lắc đều và ủ 5 phút ở 50C sau đó bổ sung ngay các hóa chất định lƣợng đƣờng khử tạo thành. Ống kiểm tra: Hút 0,5 ml cơ chất CMC, thêm các hóa chất định lƣợng đƣờng khử, sau đó bổ sung 0,5 ml dịch enzyme và tiến hành định lƣợng đƣờng khử ngay. Một ml dung dịch cần định lƣợng đƣờng khử đƣợc cho vào ống nghiệm, thêm 1 ml hỗn hợp muối AB. Hỗn hợp đƣợc đun sôi cách thủy đúng 20 phút, làm lạnh đến nhiệt độ phòng, thêm 1 ml dung dịch asenomolybdate lắc đều đến khi hết bọt khí. Sau đó hỗn hợp đƣợc ly tâm 8000 vòng/phút loại bỏ tủa y = 0.0064x - 0.0024 R 2 = 0.9943 0 0.2 0.4 0.6 0 20 40 60 80 100 Nồng độ glucose (µg/ml) O D (6 60 nm ) Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 27 cơ chất còn dƣ và so màu ở bƣớc sóng 660 nm. Mẫu đối chứng thay dung dịch cần định lƣợng đƣờng khử bằng nƣớc cất. Đối chiếu với đồ thị chuẩn suy ra hàm lƣợng đƣờng khử. 2.2.4. Nghiên cứu ảnh hƣởng của một số yếu tố môi trƣờng lên khả năng sinh tổng hợp endo-β-1,4-glucanase 2.2.4.1. Khảo sát thời gian sinh tổng hợp endo-β-1,4-glucanase Chủng A. oryzae VTCC-F-045 đƣợc nuôi cấy trong môi trƣờng MTK pH 6,5 ở 30C, có 0,5% CMC làm nguồn cơ chất cảm ứng. Dịch enzyme đƣợc thu ở những khoảng thời gian khác nhau từ 24-56 giờ (cách nhau 12 giờ) để xác định hoạt tính endo-β-1,4-glucanase. 2.2.4.2. Tối ƣu nồng độ cơ chất cảm ứng Chủng A. oryzae VTCC-F-045 đƣợc nuôi cấy trong môi trƣờng MTK pH 6,5 ở 30C và bổ sung cơ chất CMC ở các nồng độ khác nhau 0,5; 0,7; 1,0; 1,5; 2,0; 2,5 và 2,7. Dịch enzyme đƣợc thu ở 120 giờ để xác định hoạt tính. 2.2.4.3. Tối ƣu nguồn carbon Chủng A. oryzae VTCC-F-045 đƣợc nuôi trong môi trƣờng MTK pH 6,5 ở 30C và bổ sung 1% CMC làm nguồn cơ chất cảm ứng. Trong đó, nguồn cao nấm men đƣợc thay bằng các nguồn carbon khác là lactose, glucose, lõi ngô, bã mía, vỏ lạc, vỏ cà phê, trấu cám, CMC, vỏ quýt ở cùng nồng độ ban đầu (0,1%). Dịch enzyme đƣợc thu ở 120 giờ để xác định hoạt tính. Sau khi xác định đƣợc nguồn carbon tốt nhất, để tối ƣu nồng độ carbon, chủng A. oryzae VTCC-F-045 đƣợc nuôi trong môi trƣờng MTK Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 28 pH 6,5 ở 30C có nồng độ carbon khác nhau: 0,1% và 0,2-2,2% (cách nhau 0,2%). Sau 120 giờ nuôi cấy, hoạt tính enzyme đƣợc xác định. 2.2.4.4. Tối ƣu nguồn nitrogen Trong môi trƣờng MTK nuôi cấy chủng nấm A. oryzae VTCC-F-045 ban đầu, nguồn nitrogen sử dụng là peptone nhƣng không phù hợp để sản xuất chế phẩm enzyme do giá thành chi phí sản xuất rất cao. Với mục tiêu là sử dụng nguyên liệu sẵn có, peptone đƣợc thay thế bằng các nguồn nitrogen khác nhƣ NaNO3, (NH4)2SO4, bột cá, bột đậu tƣơng, urea với cùng nồng độ ban đầu (0,1%), bổ sung 1% CMC làm nguồn cơ chất cảm ứng và nguồn carbon đã đƣợc tối ƣu ở 30C, pH 6,5. Dịch enzyme đƣợc thu ở 120 giờ để xác định hoạt tính. Sau khi xác định đƣợc nguồn nitrogen tốt nhất, để tối ƣu nồng độ nitrogen chủng A. oryzae VTCC-F-045 đƣợc nuôi trong môi trƣờng có nồng độ nitrogen khác nhau: 0,1; 0,5; 1; 1,5; 1,8 và 2%. Sau 120 giờ nuôi cấy, hoạt tính enzyme đƣợc xác định. 2.2.4.5. Ảnh hƣởng của nhiệt độ nuôi cấy Chủng A. oryzae VTCC-F-045 đƣợc nuôi cấy trong môi trƣờng MTK bổ sung 1% CMC làm nguồn cơ chất cảm ứng cùng nguồn carbon và nitrogen đã đƣợc tối ƣu, nuôi lắc 200 vòng/phút ở pH 6,5 và các nhiệt độ khác nhau: 28, 30 và 37C. Dịch enzyme đƣợc thu ở 120 giờ để xác định hoạt tính. 2.2.4.6. Ảnh hƣởng của pH môi trƣờng Chủng nấm A. oryzae VTCC-F-045 đƣợc nuôi cấy 120 giờ trong môi trƣờng MTK có pH thay đổi từ 3,5-8,5 ở 28C, lắc 200 vòng/phút để xác định pH môi trƣờng tối ƣu. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 29 2.2.5. Tinh sạch sơ bộ endo-β-1,4-glucanase Dịch enzyme thô ↓ Ly tâm 10 phút ở12500 vòng/phút ↓ Dịch trong ↓ Tủa muối ammonium sulfate 65% ↓ Thẩm tích loại muối ↓ Qua cột Sephadex G100 ↓ Enzyme tinh sạch Hình 2.2. Quy trình tinh sạch endo-β-1,4-glucanase từ chủng A. oryzae VTCC-F-045 Bốn mƣơi ml dịch enzyme sau khi ly tâm 10 phút ở 12500 vòng/phút đƣợc tủa với ammonium sulfate ở nồng độ 65% và để ở 4C qua đêm. Sau khi ly tâm thu tủa ở 12500 vòng/phút, tủa đƣợc hòa vào đệm 100 mM acetate pH 5,5 và thẩm tích loại muối (Hong et al., 2001). Để thấm tích loại muối, 15 ml mẫu đƣợc hút vào trong túi thẩm tích đã hoạt hóa và kẹp chặt hai đầu. Cho túi vào cốc chứa 200 ml nƣớc cất có khuấy từ liên tục và đặt cốc vào trong đá. Sau 3 giờ mẫu đƣợc thay nƣớc một lần để loại muối. Dịch tủa sau khi loại muối đƣa qua cột sắc ký lọc gel Sephadex G100. Cột có kích thƣớc 2,6 x 60 cm. Cột đƣợc cân bằng với đệm phosphate 50 mM, pH 7,5. Tốc độ chảy là 25 ml/h. Thể tích mỗi phân đoạn đƣợc thu 2 ml (thu 20 phân đoạn). Hàm lƣợng protein và số đơn vị hoạt tính enzyme đƣợc xác định trong mỗi phân đoạn. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 30 2.2.6. Điện di SDS-PAGE Khối lƣợng tƣơng đối của enzyme tách chiết và độ tinh sạch của enzyme đƣợc đánh giá bằng phƣơng pháp điện di trên gel polyacrylamide theo Laemmli (1970). Thành phần Gel tách (l) Gel co (l) H2O 1940 1180 Dung dịch A 1500 0 Dung dịch B 0 500 Dung dịch C 2500 300 Dung dịch D 60 20 APS 10% 24 10 TEMED 7 5 Tổng 6031 2015 Bản điện di đƣợc chạy với cƣờng độ dòng điện 18-20 mA cho gel co và 25-30 mA cho gel tách. 2.2.7. Xác định tính chất lý hóa của endo-β-1,4-glucanase 2.2.7.1. Xác định nhiệt độ tối ƣu và pH tối ƣu Để tìm nhiệt độ phản ứng tối ƣu, dịch enzyme đã tinh sạch (0,028 mg/ml protein) đƣợc ủ với cơ chất 0,5% CMC trong đệm 0,1 M natri acetate pH 5,0 ở các nhiệt độ khác nhau từ 30-80C trong 5 phút. Để tìm pH tối ƣu, dịch enzyme đã tinh sạch đƣợc ủ với cơ chất 0,5% CMC trong đệm ở các pH khác nhau từ 3,5-7,5 ở nhiệt độ tối ƣu là 55C trong 5 phút. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 31 2.2.7.2. Xác định độ bền nhiệt và độ bền pH Để xác định độ bền nhiệt của endo-β-1,4-glucanase ở chủng A. oryzae VTCC-F-045, dịch enzyme đã tinh sạch (0,028 mg/ml protein) đƣợc ủ ở các nhiệt độ khác nhau từ 30-60C trong các khoảng thời gian là 1; 2; 4; 6 và 8 giờ. Dịch enzyme sau khi ủ đƣợc xác định hoạt tính endo-β-1,4-glucanase với thời gian phản ứng là 5 phút và nhiệt độ tối ƣu là 55C. Để xác định độ bền pH, dịch enzyme đƣợc ủ ở các đệm có nồng độ 0,1 M ở các pH khác nhau từ 4,5-7,5 (đệm natri acetate pH từ 4,5-5,5; đệm phosphate pH từ 6,0-7,5). Sau khi ủ 1; 2; 4 và 6 giờ ở nhiệt độ phòng, hoạt tính enzyme còn lại đƣợc xác định trong thời gian phản ứng là 5 phút. 2.2.7.3. Ảnh hƣởng của dung môi hữu cơ Để đánh giá ảnh hƣởng của dung môi hữu cơ lên hoạt tính của endo-β- 1,4-glucanase, dịch enzyme tinh sạch (0,028 mg/ml protein) đƣợc ủ với các dung môi hữu cơ methanol, ethanol, isopropanol, acetone và n-butanol nồng độ 80% ở nhiệt độ phòng. Sau 4 giờ ủ, hoạt tính còn lại đƣợc xác định ở 55C trong thời gian phản ứng là 5 phút. 2.2.7.4. Ảnh hƣởng của chất tẩy rửa Để đánh giá ảnh hƣởng của chất tẩy rửa lên hoạt tính của endo-β-1,4- glucanase, dịch enzyme tinh sạch (0,028 mg/ml protein) đƣợc ủ với các chất tẩy rửa Tween 20, Tween 80, Triton X-100 và SDS với các nồng độ 0,4-2,0% ở nhiệt độ phòng. Sau 4 giờ ủ, hoạt tính còn lại đƣợc xác định ở 55C trong thời gian 5 phút để đánh giá ảnh hƣởng của chúng lên hoạt tính endo-β-1,4- glucanase. 2.2.7.5. Ảnh hƣởng của ion kim loại Để đánh giá mức độ ảnh hƣởng của ion kim loại lên hoạt tính của endo-β-1,4-glucanase, dịch enzyme tinh sạch (0,028 mgml protein) đƣợc ủ Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 32 với các ion kim loại Ag+, Ca2+, Co2+, Cu2+, Fe2+, Zn2+, Ni+, Mn2+, K+ và EDTA với các nồng độ 4 mM, 8 mM và 12 mM ở nhiệt độ phòng. Hoạt tính còn lại đƣợc xác định sau 4 giờ ủ, thời gian phản ứng 5 phút ở nhiệt độ phản ứng là 55C. 2.2.8. Các phƣơng pháp sinh học phân tử 2.2.8.1. Tách chiết DNA tổng số Tế bào nấm sợi đƣợc nuôi cấy trong môi trƣờng Czapek ở 30C, lắc 200 vòng/phút, sau 96 giờ dịch nuôi đƣợc ly tâm 10 phút với 10000 vòng/phút. Tủa tế bào đƣợc nghiền nhẹ trong nitơ lỏng, sau đó bổ sung 600 µl đệm phá tế bào lắc nhẹ và 65 µl lysozyme, ủ 45 phút ở 37°C. Sau đó hỗn hợp đƣợc bổ sung 5 µl protease K ủ 2-3 giờ ở 56°C. Bổ sung chloroform : isoamyl alcohol (24:1) với tỷ lệ 1:1 và ly tâm 12000 vòng/phút trong 15 phút ở 4°C. 500 µl dịch nổi phía trên đƣợc thu sang ống eppendorf mới và bổ sung isopropanol tỷ lệ 1:1 để ở -20°C trong 2 giờ. Tủa sau khi ly tâm 15 phút ở 4°C với 12000 vòng/phút đƣợc làm khô dƣới ánh sáng đèn và bổ sung 500 µl ethanol 70% để rửa DNA, loại muối và isopropanol. Sau khi ly tâm 12000 vòng/phút trong 10 phút, tủa đƣợc làm khô và hòa trong 40 µl đệm TE và bảo quản ở -20°C (Sandgren et al., 2003). 2.2.8.2. Khuếch đại gene bằng PCR Để khuếch đại đoạn gene 28S rRNA từ chủng nấm A. oryzae VTCC-F- 045 cặp mồi NL1 (5'-GCA TAT CAA TAA GCG GAG GAA AAG-3') và NL4 (5'-GGT CCG TGT TTC AAG ACG G-3') đƣợc sử dụng. Nhiệt độ gắn mồi của cặp NL1 và NL4 là 50°C. Hỗn hợp phản ứng PCR gồm: 1 µl mồi mỗi loại; 2 µl dNTP; 2,5 µl MgCl2 25 mM; 2,5 µl đệm PCR 10x; 0,35 µl Taq; 1 µl khuôn DNA và bổ sung H2O cất tiêm lên tổng thể tích 25 µl. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 33 Phản ứng đƣợc thực hiện ở điều kiện: 95°C/5 phút, 35 chu kỳ (95°C/1 phút; 52°C/1 phút; 72°C/1 phút); 72°C/10 phút. 2.2.8.3. Gắn dính sản phẩm PCR vào pJET1.2 Phản ứng gắn dính sản phẩm PCR vào vector tách dòng pJET1.2 đƣợc thực hiện theo bài thí nghiệm (Fermentas). Hỗn hợp gồm 5 µl đệm 2x; 1,5 µl sản phẩm PCR; 0,5 µl enzyme blunting; 2,5 µl H2O và hỗn hợp đƣợc ủ ở 70°C trong 15 phút. Bổ sung 0,5 µl pJET1.2 và 0,5 µl T4 DNA ligase rồi ủ qua đêm ở nhiệt độ 22°C tạo plasmid tái tổ hợp. 2.2.8.4. Biến nạp plasmid hóa học Plasmid đƣợc biến nạp vào tế bào khả biến E. coli DH5α theo phƣơng pháp sốc nhiệt và hóa học. Một khuẩn lạc E. coli đƣợc cấy chuyển vào 3 ml môi trƣờng LB, lắc 200 vòng/phút ở 37°C qua đêm. Một trăm ml môi trƣờng LB đƣợc tiếp giống với 1 ml dịch tế bào qua đêm, nuôi lắc ở 37°C với 200 vòng/phút. Khi OD600nm đạt 0,4-0,6 (khoảng 2-3 giờ nuôi cấy), dịch nuôi cấy đƣợc đặt vào đá lạnh 1 giờ, rồi ly tâm 10 phút ở 4°C với 6000 vòng/phút. Tủa tế bào đƣợc hòa đều trong 100 ml dung dịch 100 mM CaCl2 lạnh và vô trùng, ủ đá 15 phút và ly tâm nhƣ trên. Tủa tế bào lại đƣợc hòa đều trong 40 ml CaCl2 100 mM lạnh vô trùng, ủ đá khoảng 1 giờ và ly tâm 10 phút với 4000 vòng/phút. Tủa tế bào lại đƣợc hòa vào 500 μl dung dịch 100 mM CaCl2 lạnh, vô trùng chứa 15% glycerol. Dịch hỗn hợp tế bào và glycerol đƣợc chia nhỏ vào các ống eppendorf, dùng để biến nạp ngay hoặc bảo quản ở -84°C. Năm μl plasmid tái tổ hợp đƣợc trộn với 40 μl dịch tế bào làm khả biến, ủ 20-30 phút ở 4°C. Hỗn hợp đƣợc sốc nhiệt 45 giây ở 42°C. Sau đó đặt ngay vào đá lạnh 5 phút rồi bổ sung 250 μl môi trƣờng LB đã khử trùng. Sau khi nuôi lắc hỗn hợp khoảng 60 phút ở 37°C với 200 vòng/phút, 50-200 μl dịch tế Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 34 bào đã biến nạp đƣợc cấy trải trên môi trƣờng LB đặc chứa kháng sinh ampinillin ủ qua đêm ở 37°C. 2.2.8.5. Tách chiết DNA plasmid Một khuẩn lạc đã đƣợc biến nạp trên đĩa thạch đƣợc cấy vào 3 ml môi trƣờng LB chứa ampicillin, nuôi lắc qua đêm ở 37°C, 200 vòng/phút. Dịch tủa tế bào thu đƣợc sau khi ly tâm 5 phút với 6000 vòng/phút đƣợc lắc rung 30 giây trong 150 µl Sol I thành dịch đồng nhất, ủ 15-20 phút ở nhiệt độ phòng. Sau đó 150 µl Sol II đƣợc bổ sung vào hỗn hợp và đảo nhẹ, tiếp tục bổ sung 150 µl Sol III vào hỗn hợp đảo nhẹ. Hỗn hợp đƣợc bổ sung 450 µl chloroform/isoamyl alcohol 24:1, lắc nhẹ và ly tâm 10 phút với 12500 vòng/phút trong. 450 µl pha trên đƣợc hút sang ống mới, bổ sung 320 µl isopropanol, lắc nhẹ và ủ 5 phút ở -80°C để tủa DNA plasmid. Tủa DNA plasmid sau khi ly tâm 12500 vòng/phút trong 5 phút đƣợc rửa với 500 µl 70% ethanol ở 4°C để loại muối và isopropanol, làm khô trong không khí ở nhiệt độ phòng. Tủa plasmid đƣợc hòa trong đệm TE pH 8,0 hoặc nƣớc khử ion vô trùng và điện di kiểm tra sản phẩm tách plasmid rồi bảo quản ở -20°C. 2.2.8.6. Cắt DNA tái tổ hợp bằng enzyme giới hạn DNA plasmid tái tổ hợp đƣợc cắt kiểm tra bằng enzyme giới hạn XhoI và XbaI qua đêm ở 37C để kiểm tra phân đoạn chèn. Hỗn hợp phản ứng gồm 3,5 µl DNA plasmid tái tổ hợp; 0,25 µl enzyme giới hạn mỗi loại; 2 µl đệm Tango Y + và bổ sung H2O cất tiêm đến 10 µl. Sau phản ứng, sản phẩm cắt đƣợc điện di trên gel 0,8% agarose để kiểm tra. 2.2.8.7. Giải trình tự nucleotide Sau khi tinh sạch plasmid tái tổ hợp, đoạn DNA chèn vào plasmid đƣợc giải trình tự nucleotide theo nguyên lý của phƣơng pháp Sanger cải tiến dựa trên các dideoxy. DNA polymerase xúc tác gắn các dideoxynucleotide vào Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 35 đầu 3'-OH mạch đơn DNA đang tổng hợp, quá trình tổng hợp sẽ dừng lại khi gặp dideoxynucleotide đánh dấu huỳnh quang không có nhóm 3'-OH. Kết quả là hỗn hợp sản phẩm sau phản ứng bao gồm các polynucleotide có kích thƣớc hơn kém nhau một nucleotide và đƣợc phát hiện bằng mẫu dò huỳnh quang trên máy đọc trình tự tự động ABI PRISM 3100 Avant Genetic Analyzer. Vector pJET1.2 đƣợc gắn hai trình tự mồi xuôi và mồi ngƣợc M13 (-20) để đọc trình tự phân đoạn chèn DNA ngoại lai. Kết quả đọc trình tự đƣợc phân tích, xử lý bằng phần mềm DNAStar để so sánh trình tự nucleotide, tính khoảng cách di truyền và xây dựng cây phân loại. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 36 Chƣơng 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Sàng lọc chủng nấm mốc có khả năng sinh tổng hợp endo-β-1,4- glucanase cao Các chủng A. oryzae đƣợc nuôi ở cùng môi trƣờng MTK bổ sung 0,5% CMC ở 30C, pH 6,5 lắc 200 vòng/phút; sau 72 giờ dịch nổi nuôi cấy đƣợc xác định hoạt tính trên đĩa thạch. Kết quả khảo sát trên 35 chủng A. oryzae cho thấy, trên đĩa thạch đều xuất hiện vòng phân giải cơ chất CMC với đƣờng kính vòng phân giải rất khác nhau. Nhƣ vậy, các chủng A. oryzae đƣợc khảo sát đều sinh ra endo-β-1,4-glucanase ngoại bào. Tuy nhiên, chỉ một số chủng A. oryzae sinh tổng hợp endo-β-1,4-glucanase cao nhƣ VTCC-F-037, 043, 045, 050, 187 và 189 mới đƣợc chọn ra (Hình 3.1). Hình 3.1. Hoạt tính endo-β-1,4-glucanase của một số chủng A. oryzae Song song với định tính, khả năng sinh tổng hợp endo-β-1,4-glucanase từ 35 chủng A. oryzae trên môi trƣờng khoáng MTK cũng đƣợc định lƣợng. Sau 72 giờ nuôi cấy chủng A. oryzae VTCC-F-045 có khả năng sinh endo-β- 1,4-glucanase cao nhất với hoạt tính đạt 0,97 U/ml (Bảng 3.1). Chủng A. oryzae VTCC-F-045 có khả năng sinh tổng hợp endo-β-1,4-glucanase tốt nhất đƣợc chọn để tối ƣu môi trƣờng nuôi cấy và đánh giá tính chất lý hóa của chúng. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 37 Bảng 3.1. Hoạt tính endo-β-1,4-glucanase của 35 chủng A. oryzae Chủng Hoạt tính Chủng Hoạt tính U/ml % U/ml % A. oryzae VTCC-F-022 0,78 81 A. oryzae VTCC-F-174 0,54 56 A. oryzae VTCC-F-037 0,88 91 A. oryzae VTCC-F-176 0,44 45 A. oryzae VTCC-F-040 0,45 46 A. oryzae VTCC-F-178 0,52 53 A. oryzae VTCC-F-041 0,89 92 A. oryzae VTCC-F-183 0,47 48 A. oryzae VTCC-F-042 0,73 76 A. oryzae VTCC-F-185 0,45 46 A. oryzae VTCC-F-043 0,84 87 A. oryzae VTCC-F-187 0,62 64 A. oryzae VTCC-F-044 0,76 79 A. oryzae VTCC-F-189 0,74 76 A. oryzae VTCC-F-045 0,97 100 A. oryzae VTCC-F-201 0,45 47 A. oryzae VTCC-F-046 0,56 58 A. oryzae VTCC-F-206 0,47 49 A. oryzae VTCC-F-047 0,59 61 A. oryzae VTCC-F-210 0,55 57 A. oryzae VTCC-F-049 0,76 79 A. oryzae VTCC-F-233 0,35 36 A. oryzae VTCC-F-050 0,64 66 A. oryzae VTCC-F-243 0,27 28 A. oryzae VTCC-F-051 0,70 72 A. oryzae VTCC-F-254 0,30 31 A. oryzae VTCC-F-053 0,52 54 A. oryzae VTCC-F-310 0,39 41 A. oryzae VTCC-F-056 0,50 52 A. oryzae VTCC-F-314 0,31 32 A. oryzae VTCC-F-111 0,50 52 A. oryzae VTCC-F-351 0,32 33 A. oryzae VTCC-F-122 0,62 64 A. oryzae VTCC-F-357 0,37 38 A. oryzae VTCC-F-173 0,47 49 3.2. Phân loại chủng nấm sợi A. oryzae VTCC-F-045 dựa vào đoạn gene 28S rRNA DNA của A. oryzae VTCC-F-045 sau khi tách chiết, đƣợc điện di trên gel agarose 0,8 % cho thấy DNA tinh sạch và đủ để tiến hành nhân dòng và đọc trình tự. Phản ứng PCR đƣợc tiến hành với cặp mồi NL1 và NL4. Sau khi điện di, một vạch có kích thƣớc khoảng 614 bp xuất hiện (Hình 3.2A). Sản phẩm PCR đƣợc gắn trực tiếp vào vector pJET1.2 sau đó đƣợc biến nạp vào tế bào E. coli DH5. Các dòng plasmid tái tổ hợp đƣợc chọn lọc và cắt Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 38 kiểm tra bằng enzyme hạn chế XhoI và XbaI. Sản phẩm cắt kiểm tra trên gel 0,8% agarose (Hình 3.2C) có 2 băng DNA kích thƣớc khoảng 2974 bp tƣơng ứng với vector pJET1.2 và băng còn lại có kích thƣớc khoảng 600 bp tƣơng ứng với đoạn DNA ngoại lai. A B C Hình 3.2. Điện di đồ sản phẩm PCR từ khuôn DNA của chủng A. oryzae (A); Sản phẩm Plasmid (B) và Sản phẩm cắt vector tái tổ hợp bằng XhoI và XbaI (C). P1: plasmid mang gene 28S rRNA; ĐC: plasmid không mang gene 28S rRNA Plasmid tái tổ hợp mang đoạn gene mong muốn đã đƣợc tách và tinh sạch bằng kit QIAGEN để đọc trình tự nucleotide. Đoạn gene 28S rRNA của chủng A. oryzae VTCC-F-045 đƣợc xác định trình tự nucleotide trên máy giải trình tự tự động ABI PRISM 3100 Avant Genetic Analyzer. Sau khi phân tích và xử lý số liệu, nhận đƣợc đoạn gene 28S rRNA của chủng A. oryzae VTCC-F-045 dài 614 bp (Bảng 4.2). Trình tự đoạn gene 28S rRNA của chủng A. oryzae VTCC-F-045 đƣợc so sánh với trình tự gene 28S rRNA của các chủng nấm sợi đã công bố trên GenBank bằng phần mềm DNAstar. Trình tự đoạn gene 28S rRNA của chủng A. oryzae VTCC-F-045 có quan hệ họ hàng gần gũi với một số đại diện thuộc chi Aspergillus. Trong đó, có độ tƣơng đồng 99,7% với các chủng A. oryzae RIB40 (AP007172), A. flavus IFM (AB363745), A. oryzae NRRL 506 ĐC P1 M 1 2 750 500 250 1000 614 bp 1500 3000 750 500 250 1000 1500 3000 614 bp Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 39 (AF459735), A. parasiticus NRRL 6433 (EF661568), A. oryzae MN (GQ38275), A. flavus UWFP 570 (AY216669) và A. parasiticus NRRL 424 (EF661557) (Hình 3.2). Trình tự 28S rRNA của chủng A. oryzae VTCC-F- 045 đã đƣợc đăng kí trong GenBank với mã số là GQ382276. Nucleotide Substitutions (x100) 0 0.2 Ap68 Ap57 Ao35 Af69 Ao75 Ao72 Af45 Ao76 Hình 3.3. Cây phân loại chủng A. oryzae VTCC-F-045 Ao68: A. parasiticus NRRL 6433, Ap57: A. parasiticus NRRL 424, Ao75: A. oryzae MN; Af69: A. flavus UWFP570; Af45: A. flavus IFM 5436; Ao35: A. oryzae NRRL 506; Ao76: A. oryzae VTCC-F-045, Ao72: A. oryzae RIB40 3.3. Tối ƣu các điều kiện sinh tổng