Luận văn Tuyển chọn và khảo sát khả năng sinh amylase của một số chủng nấm sợi từ rừng ngập mặn Cần Giờ thành phố Hồ Chí Minh

1600 1800 2000 2200 2400 H oạ t đ ộ a m yl as e 9 9A 9B 9C MT Asp.oryzae 1000 1200 1400 1600 1800 2000 2200 2400 H oạ t đ ộ a m yl as e 11 11A 11B 11C MT Asp.protuberus Biểu đồ 3.7. Ảnh hưởng của tỉ lệ cám-trấu đến hoạt độ glucoamylase của hai chủng NS. 3.3.3. Ảnh hưởng của nguồn N. Tiến hành nghiên cứu với MT9 (đối với chủng Asp.oryzae) và MT11 (đối với chủng Asp.protuberus) có bổ sung các nguồn N khác nhau theo mục 2.2.2.6. Kết quả được trình bày ở bảng 3.10 và minh họa bằng biểu đồ 3.8 cho thấy cả hai chủng đều có khả năng đồng hóa các nguồn N hữu cơ và vô cơ khác nhau. Với các nguồn N khác nhau này, cả hai chủng đều có sự sinh trưởng và phát triển rất mạnh so với mẫu đối chứng. Tuy nhiên, với những nguồn N khác nhau ta thấy màu sắc của KL ở hai chủng cũng có sự khác nhau so với mẫu đối chứng. Chủng Asp.oryzae có sự phát triển mạnh ở MT có bổ sung cao thịt và cao nấm men. Tuy nhiên, ở MT này KL không có màu sắc đặc trưng của chủng, màu sắc rất nhạt. Ở MT bổ sung bột đậu nành và NaNO3, chúng ta thấy KL phát triển tốt và có màu sắc rất đẹp, đặc trưng của chủng Asp.oryzae. Do đó, chúng tôi cho rằng ở MT có bổ sung bột đậu nành hay NaNO3 thì chủng Asp.oryzae phát triển tốt nhất, trong đó bột đậu nành kích thích KL phát triển mạnh hơn NaNO3. Bảng 3.10. Ảnh hưởng của nguồn N đến sinh trưởng của hai chủng NS. Mức độ phát triển (mm) Nguồn N Aspergillus oryzae Asppergillus protuberus Đối chứng 32 4.5 NaNO3 29.5 5.5 NaNO2 30.5 5.5 Cao nấm men 48.5 8 Cao malt 46 7.5 Cao thịt 50.5 8.5 Bột đậu nành 45 7 Pepton 47 9 Trong khi đó, chủng Asp.protuberus lại phát triển mạnh ở MT có bổ sung cao nấm men, cao thịt hay pepton. Với MT có bổ sung pepton, chủng nấm này phát triển mạnh nhất. Đây cũng là điều dễ hiểu vì chủng này có sự phát triển rất yếu so với chủng Asp.oryzae. Các nguồn N từ cao nấm men, cao thịt hay pepton đều là nguồn N dễ tiêu, dễ sử dụng cho sinh trưởng và phát triển hơn là bột đậu nành, nitrat và nitrit. Ngoài ra, chúng ta cũng có thể thấy cả hai chủng đều có thể phát triển được ở MT có bổ sung nitrit (NaNO2), chứng tỏ chúng thích nghi được với MT tự nhiên ở RNM Cần Giờ, nơi có nhiều xác động TV phân hủy và sử dụng được các nguồn đạm này cho sinh trưởng. Đồng thời, khi nghiên cứu ảnh hưởng các nguồn N khác nhau đến khả năng sinh amylase cao của hai chủng nấm này cũng cho kết quả tương ứng. Bột đậu nành Cao malt NaNO3 NaNO2 Pepton Cao nấm men Cao thịt Đối chứng Hình 3.3. Ảnh hưởng của các nguồn N khác nhau đến sinh trưởng của chủng Asp.oryzae Bột đậu nành Cao malt NaNO3 NaNO2 Pepton Cao nấm men Cao thịt Đối chứng Hình 3.4. Ảnh hưởng của các nguồn N khác nhau đến sinh trưởng của chủng Asp.protuberus Bảng 3.11. Ảnh hưỏng của nguồn N đến hoạt độ α - amylase và glucoamylase của hai chủng NS. Hoạt độ amylase (UI/g/phút) Asp.oryzae Asp.protuberus Nguồn N (0,5%) Α - amylase Glucoamylase α - amylase glucoamylase Bột đậu 44,26 2571,82 32,32 2322,96 NaNO3 44,15 2520,00 42,47 2302,22 (NH4)2SO4 42,50 2322,96 35,93 1389,63 Cao nấm men 43,11 2602,96 43,11 2177,78 Pepton 43,82 2405,93 43,58 2260,74 Cao thịt 42,50 2136,30 43,53 2240,00 Từ bảng 3.11, chúng ta có thể thấy khi được bổ sung N, cả hai chủng NS đều sinh amylase mạnh hơn hẳn, đặc biệt với MT có bổ sung nguồn N là bột đậu nành của chủng Asp.oryzae. Đây là một ưu điểm vì bột đậu nành là nguồn N tự nhiên dễ kiếm và rẻ tiền, thích hợp cho việc nuôi cấy NS sinh enzym với số lượng lớn. Kết quả này cho thấy có sự phù hợp giữa sinh trưởng và khả năng sinh amylase cao khi MT nuôi cấy được bổ sung bột đậu nành. Đây chính là một điểm thuận lợi khi đưa chủng NS này vào sản xuất với số lượng lớn. Trong khi đó, pepton chính là nguồn đạm bổ sung hợp lý cho sinh trưởng sinh tổng hợp α - amylase của chủng Asp.protuberus, nhưng hoạt độ glucoamylase của chủng này thì cao nhất với bột đậu nành. Vì pepton là nguồn đạm có giá thành khá cao, nên chúng tôi quyết định tiến hành nghiên cứu tiếp về nguồn N bột đậu nành với các nồng độ khác nhau để thu được kết quả khả quan hơn về khả năng sinh amylase cao của chủng nấm này. Ngược lại, chúng ta cũng thấy việc bổ sung (NH4)2SO4 vào MT đều gây ức chế khả năng sinh cả hai loại enzym ở cả hai chủng. Kết quả khảo sát ở bảng 3.12 cho thấy, tỉ lệ bột đậu bổ sung vào MT ảnh hưởng khá mạnh đến khả năng sinh amylase của hai chủng nấm. Tuy có sự khác nhau về tỉ lệ, nhưng nhìn chung, sự sinh tổng hợp cả hai loại amylase của hai chủng đều tăng rõ rệt, đặc biệt là chủng Asp.protuberus, khi được bổ sung tỉ lệ bột đậu nành phù hợp. Vì MT tinh bột có sự khác nhau, do đó nhu cầu bổ sung thêm tỉ lệ N của hai chủng cũng có khác nhau. Bột bắp ở MT11 đã có sẵn một lượng N tương đối, do đó nhu cầu bổ sung thêm bột đậu nành của chủng Asp.protuberus thấp hơn so với chủng Asp.oryzae. 0 10 20 30 40 50 60 M ức độ p há t t riể n (m m ) Đối chứng NaNO3 NaNO2 Cao nấm men Cao malt Cao thịt Bột đậu Pepton Nguồn nitơ Asp.oryzae Asp.protuberus NaNO3 NaNO2 Biểu đồ 3.8. Ảnh hưởng của nguồn N đến sinh trưởng của hai chủng NS. 0 10 20 30 40 50 60 M ức độ p há t t riể n (m m ) Đối chứng NaNO3 NaNO2 Cao nmen Cao malt Cao thịt Bột đậu Pepton Nguồn nitơ Asp.oryzae Asp.protuberus 3 NaNO2 Biểu đồ 3.9. Ảnh hưởng của nguồn N đến hoạt độ α – amylase của hai chủng NS. 0 500 1000 1500 2000 2500 3000 H oạ t đ ộ e nz ym a m yl as e Đậu NaNO3 (NH4)2SO4 Cao nấm men Pepton Cao thịt Nguồn nitơ Asp.oryzae Asp.protuberus NaNO3 ( 4)2SO4 Biểu đồ 3.10. Ảnh hưởng của nguồn N đến hoạt độ glucoamylase của hai chủng NS. Bảng 3.12. Ảnh hưởng tỉ lệ bột đậu nành đến hoạt độ amylase của hai chủng NS. Hoạt độ amylase (UI/g/phút) Asp.oryzae Asp.protuberus Tỉ lệ bột đậu nành Α - amylase Glucoamylase α - amylase Glucoamylase 0,5% 44,26 2571,85 32,32 2322,96 1% 44,29 2706,67 43,60 2520,00 2% 45,97 2768,89 42,90 2623,70 3% 44,55 2862,22 41,79 2561,48 5% 43,79 2852,22 37,13 2395,56 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 H oạ t đ ộ e nz ym a m yl as e 0.50% 1% 2% 3% 5% Tỉ lệ bột đậu (%) Asp.oryzae Asp.protuberus Biểu đồ 3.11. Ảnh hưởng của các tỉ lệ bột đậu khác nhau đến hoạt độ α – amylase của hai chủng NS. 0 500 1000 1500 2000 2500 3000 H oạ t đ ộ e nz ym a m yl as e 0.50% 1% 2% 3% 5% Tỉ lệ bột đậu (%) Asp.oryzae Asp.protuberus Biểu đồ 3.12. Ảnh hưởng của các tỉ lệ bột đậu khác nhau đến hoạt độ glucoamylase của hai chủng NS. Qua kết quả trên, chúng ta thấy, tỉ lệ bột đậu nành bổ sung có ảnh hưởng rất lớn đến hoạt độ cả hai loại amylase của hai chủng nấm. Khi tỉ lệ bột đậu dần tăng lên thì hoạt độ cả hai loại enzym đều tăng mạnh. Hoạt độ glucoamylase tăng lên nhiều so với α – amylase. Đồng thời, tỉ lệ bột đậu bổ sung thích hợp cho sự sinh tổng hợp glucoamylase cũng cao hơn cho α – amylase. Tuy vậy, khi lượng bột đậu nành bổ sung quá cao sẽ làm mất cân bằng tỉ lệ C:N nên hoạt độ của các amylase giảm dần sau tỉ lệ bột đậu tối ưu trên. Vậy tỉ lệ bột đậu nành tối ưu cho sinh tổng hợp α – amylase là 2% (đối với chủng Asp.oryzae) và 1% (đối với chủng Asp.protuberus); glucoamylase là 3% (đối với chủng Asp.oryzae) và 2% (đối với chủng Asp.protuberus). Kết quả này cũng phù hợp với nhận định của Đoàn Văn Thược khi cho là nguồn N thích hợp nhất cho hoạt độ amylase mạnh của Asp.oryzae là bột đậu nành [36]. 3.3.4. Ảnh hưởng của nhiệt độ. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ được trình bày ở bảng 3.13 và 3.14. Bảng 3.13. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sinh trưởng của hai chủng NS. Mức độ phát triển (mm) Nhiệt độ (0C) Aspergillus oryzae Asppergillus protuberus 25 12 1.5 30 32,5 5 35 35 3 40 34 0,5 45 15 0 50 0 0 Từ kết quả này, chúng ta thấy hai chủng nấm nghiên cứu sinh trưởng mạnh và có khả năng sinh amylase cao ở nhiệt độ dao động trong khoảng 30 – 40oC. Nhiệt độ cao quá, ở 50oC, cả hai chủng nấm đều không sống được và cũng không sinh enzym. Điều này cho thấy hai chủng nấm này không thuộc loại nấm ưa nhiệt và thích hợp với điều kiện sống ở RNM Cần Giờ Bảng 3.14. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt độ hai loại amylase của hai chủng NS. Hoạt độ amylase (UI/g/phút) Asp.oryzae Asp.protuberus Nhiệt độ (oC) α - amylase glucoamylase α - amylase glucoamylase 25 40,75 2416,30 34,54 2312,59 30 44,92 2779,26 43,56 2592,59 35 44,59 2665,19 33,12 2333,33 40 41,15 2084,44 14,30 311,11 45 25,32 902,22 0,09 73,59 50 0,35 165,93 0,00 0,00 0 5 10 15 20 25 30 35 40 20 25 30 35 40 45 50 55 Nhiệt độ (oC) M ức độ p há t t riể n (m m ) Asp.oryzae Asp.protuberus Đồ thị 3.1. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sinh trưởng của hai chủng NS. 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 20 25 30 35 40 45 50 55 Nhiệt độ nuôi cấy (oC) H oạ t đ ộ e nz ym a m yl as e Asp.oryzae Asp.protuberus Đồ thị 3.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt độ α – amylase của hai chủng NS. 0 500 1000 1500 2000 2500 3000 25 30 35 40 45 50 Nhiệt độ (oC) H oạ t đ ộ e nz ym a m yl as e Asp.oryzae Asp.protuberus Đồ thị 3.3. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt độ glucoamylase của hai chủng NS. Riêng chủng Asp.protuberus có giới hạn chịu nhiệt rất hẹp. Chủng này chỉ sinh trưởng mạnh nhất ở 30oC, còn đến 40oC thì mức độ sinh trưởng đã giảm rất đáng kể. Song song đó, hoạt độ cả hai loại amylase của chủng này cũng giảm rất mạnh ở 40oC. Chủng Asp.oryzae sinh trưởng mạnh nhất và cho hoạt độ hai loại amylase cao ở khoảng nhiệt độ 30 – 40oC, trong đó nhiệt độ tối ưu là 30oC. Đồng thời, với kết quả này chúng ta thấy cả hai chủng nấm đều sinh trưởng và sinh tổng hợp amylase ở mức tốt nhất thích hợp với điều kiện nhiệt độ của RNM Cần Giờ (25 – 30oC). Kết quả được minh họa ở đồ thị 3.1, 3.2 và 3.3. Kết quả thu được này cũng phù hợp với nhiều kết quả nghiên cứu khác về NS sinh amylase, như nhiệt độ lên men sinh amylase tốt nhất của chủng Asp.niger là 32,4oC và Asp.oryzae là 33,6oC của Đoàn Văn Thược [36] và 28 – 30oC của Đồng Thị Thanh Thu [35] cũng như của Nguyễn Đức Lượng [25]. 3.3.5. Ảnh hưởng của độ mặn. Tiến hành nuôi cấy hai chủng NS theo phương pháp ở phần 2.2.2.5. Sau khi ủ các chủng nấm 3 ngày trên các MT có độ mặn khác nhau và mẫu đối chứng là MT1 không có muối, pH 6.5. Chúng tôi thu được kết quả theo bảng 3.15 và minh họa bằng đồ thị 3.4. Khảo sát ảnh hưởng độ mặn đến khả năng sinh amylase cao, chúng tôi tiến hành thí nghiệm như mục 2.2.2.6. Kết quả thu được ở bảng 3.16 và minh họa bằng đồ thị 3.5 và 3.6. Khả năng chịu mặn chính là một đặc trưng của NS RNM Cần Giờ. Kết quả bảng 3.15 và 3.16 cho thấy cả hai chủng đều có thể sinh trưởng tốt và cho hoạt độ amylase cao trên MT cả nước ngọt lẫn nước mặn. Điều này chứng tỏ chúng có nguồn gốc từ đất liền du nhập vào RNM Cần Giờ và thích nghi với điều kiện sống tại đây. Chúng là các NS có khả năng chịu mặn cao. Cả hai chủng này đều sinh trưởng mạnh nhất ở nồng độ muối 3% (riêng chủng Asp.protuberus vẫn sinh trưởng mạnh ở độ mặn 5%), đây chính là độ mặn của RNM Cần Giờ. Ở độ mặn này, chúng sinh trưởng và cho hoạt độ amylase mạnh hơn ở MT không có muối và các nồng độ muối khác. Do đó, tuy là những chủng du nhập nhưng chúng thích nghi với MT nước lợ của RNM Cần Giờ. Bảng 3.15. Ảnh hưởng của độ mặn đến sinh trưởng của hai chủng NS. Mức độ phát triển (mm) Nồng độ muối (%) Aspergillus oryzae Asppergillus protuberus Đối chứng 36,0 3,5 2 42,5 8,0 3 44,0 10,0 5 41,0 10,0 7 33,0 8,5 10 19,5 4,5 20 0,5 0,0 Bảng 3.16. Ảnh hưởng của độ mặn đến hoạt độ α- amylase và glucoamylase của hai chủng NS. Hoạt độ amylase (UI/g/phút) Độ mặn (%) Asp.oryzae Asp.protuberus 0 43,82 1669,63 35,85 1783,70 2 44,41 2717,04 42,31 2229,63 3 44,90 2893,33 43,46 2634,07 5 44,08 2654,82 43,35 2602,96 7 41,46 1866,67 42,33 1877,04 10 36,18 829,63 35,45 311,11 Ở đây chúng ta vẫn thấy có sự tương ứng giữa sinh trưởng và hoạt độ amylase của hai chủng. Với độ mặn tối ưu 3% thì hoạt độ cả hai loại amylase cũng đạt giá trị cao nhất. Điều này chứng tỏ chẳng những hai chủng nấm này thích nghi tốt với điều kiện nước lợ của RNM Cần Giờ (độ mặn 18 - 30‰), mà còn sinh ra hệ amylase phân giải tinh bột mạnh tại đây, giúp giải quyết một phần vấn nạn ô nhiễm MT. Đây cũng là một thuận lợi trong việc nuôi cấy để vừa thu được sinh khối cao nhất vừa có được hoạt độ amylase cao nhất. 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 0 1 2 3 4 5 6 7 8 Độ mặn (%) M ức độ p há t t riể n (m m ) Asp.oryzae Asp.protuberus 52 3 107 20Đối chứng Đồ thị 3.4. Ảnh hưởng của độ mặn đến sinh trưởng của hai chủng NS. 20 25 30 35 40 45 50 0 2 3 5 7 10 Độ mặn (%) H oạ t đ ộ e nz ym a m yl as e Asp.oryzae Asp.protuberus Đồ thị 3.5. Ảnh hưởng của độ mặn đến hoạt độ α – amylase của hai chủng NS. 0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500 0 2 3 5 7 10 Độ mặn (%) H oạ t đ ộ e nz ym a m yl as e Asp.oryzae Asp.protuberus Đồ thị 3.6. Ảnh hưởng của độ mặn đến hoạt độ glucoamylase của hai chủng NS. Riêng chủng Asp.protuberus có khả năng chịu mặn cao hơn chủng Asp.oryzae vì vẫn có thể sinh trưởng mạnh và cho hoạt độ enzym cao ở độ mặn 5%. Trong khi đó, khả năng sinh trưởng cũng như hoạt độ enzym của chủng Asp.oryzae bắt đầu giảm nhanh từ độ mặn này. Vậy độ mặn thích hợp nhất cho sinh trưởng và hoạt độ amylase cao hai chủng là 3%. 3.3.6. Ảnh hưởng của độ ẩm. Tiến hành nuôi hai chủng NS trên các MT thích hợp như mục 2.2.2.5 và mục 2.2.2.6 để nghiên cứu ảnh hưởng của độ ẩm đến sinh trưởng. Nghiên cứu ảnh hưởng của độ mặn đến khả năng sinh amylase của hai chủng NS được thực hiện với MT: -Chủng Asp.oryzae ở MT9, bổ sung 2% bột đậu nành (với α-amylase) và 3% (với glucoamylase). -Chủng Asp.protuberus ở MT11, bổ sung 1% bột đậu nành (với α-amylase) và 2% (với glucoamylase). Pha nước muối có độ mặn 3%, rồi bổ sung vào MT nuôi của hai chủng với các độ ẩm: 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%. Nuôi cấy hai chủng ở 30oC trong 3 ngày. Đo hoạt độ hai loại amylase. Kết quả thu được ở bảng 3.17. Bảng 3.17. Ảnh hưởng của độ ẩm đến hoạt độ amylase của hai chủng NS.. Hoạt độ amylase (UI/g/phút) Asp.oryzae Asp.protuberus Độ ẩm (%) α – amylase glucoamylase α – amylase Glucoamylase 50 37,31 2395,56 35,01 2177,78 55 44,55 2986,67 44,05 2779,26 60 45,25 2872,59 43,70 2613,33 65 43,86 2696,30 39,98 2167,41 70 36,35 2271,11 34,51 1576,30 75 19,46 1306,67 6,15 694,82 Kết quả cho thấy chủng Asp.oryzae cho hoạt độ α – amylase mạnh nhất ở độ ẩm 60% và glucoamylase mạnh nhất ở độ ẩm 55%. Trong khi đó, chủng Asp.protuberus cho cả hai loại enzym mạnh nhất ở độ ẩm 55%. Chúng ta cũng biết, độ ẩm là yếu tố rất quan trọng đối với sự lên men bề mặt. Ở độ ẩm 50%, MT nuôi cấy NS quá khô nên kìm hãm sự sinh trưởng của NS đồng thời cũng kìm hãm sự sinh tổng hợp enzym. Trong khi đó, độ ẩm quá cao, trên 60% (đối với chủng Asp.oryzae) và trên 55% (đối với chủng Asp.protuberus) cũng gây ức chế sinh trưởng NS vì làm giảm độ thoáng khí của MT. Do đó ở những độ ẩm này, hoạt độ amylase giảm mạnh. Đặc biệt ở độ ẩm 75%, MT bị bết lại vì quá nhiều nước làm NS sinh trưởng rất yếu nên hoạt độ enzym giảm rất mạnh. 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 40 45 50 55 60 65 70 75 80 Độ ẩm (%) H oạ t đ ộ e nz ym a m yl as e Asp.oryzae Asp.protuberus . Đồ thị 3.7. Ảnh hưởng của độ ẩm đến hoạt độ α – amylase của hai chủng NS. 0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500 50 55 60 65 70 75 Độ ẩm (%) H oạ t đ ộ e nz ym a m yl as e Asp.oryzae Asp.protuberus Đồ thị 3.8. Ảnh hưởng độ ẩm đến hoạt độ glucoamylase của hai chủng NS. Tuy RNM Cần Giờ có độ ẩm khá cao, nhưng các mẫu NS đều được thu ở những vùng đất khô ráo có độ ẩm thấp hơn so với độ ẩm trung bình của RNM. Do đó, ta có thể nói cả hai chủng nấm này đều thích nghi với MT sống ở RNM Cần Giờ. Kết quả này cũng phù hợp với công bố của tác giả Nguyễn Đức Lượng [25] là độ ẩm ban đầu của MT để NS sinh amylase phải đạt khoảng 58 – 60%. 3.3.7.Ảnh hưởng của pH. Tiến hành thí nghiệm theo mục 2.2.2.5 và 2.2.2.6 để nghiên cứu ảnh hưởng của pH. Kết quả thu được ở bảng 3.18 và 3.19, minh họa bằng đồ thị 3.9, 3.10 và 3.11. Về sinh trưởng, cả hai chủng nấm đều có thể phát triển được ở các pH từ 3 đến 8, nhưng phát triển tốt nhất ở khoảng pH 6 -7. Đây chính là pH của RNM Cần Giờ (pH thời điểm thu mẫu là 7,02). Từ kết quả này và kết quả về độ ẩm ở trên, chúng ta thấy cả hai chủng nấm này thích nghi rất tốt với điều kiện RNM. Bảng 3.18. Ảnh hưỏng của pH đến sự sinh trưởng của hai chủng NS Mức độ phát triển (mm) pH Asp.oryzae Asp.protuberus Đối chứng 32 5 3 25 1.5 4 31 3 5 33 4 6 35 7 7 33 5 8 28 2 Bảng 3.19. Ảnh hưởng của pH đến hoạt độ α – amylase và glucoamylase của hai chủng NS. Hoạt độ amylase (UI/g/phút) Asp.oryzae Asp.protuberus pH α – amylase glucoamylase α – amylase Glucoamylase 4 27,52 2727,41 16,35 2198,52 4.5 41,86 3245,93 39,06 2717,04 5 44,83 3069,63 44,12 2665,19 5.5 45,37 2934,82 43,70 2634,07 6 41,93 2665,19 42,47 2613,33 6.5 37,53 2094,82 40,50 2395,56 7 29,82 933,33 36,96 2240,00 7.5 21,91 290,37 32,37 1545,19 8 8,25 82,96 22,64 850,37 Qua kết quả này chúng ta thấy có sự khác nhau về pH tối ưu để sinh trưởng và sinh amylase ở cả hai chủng NS. Trong khi đó, để thu được amylase có hoạt độ cao thì MT lên men của cả hai chủng đều đều nghiêng về axit. Chủng Asp.oryzae sinh α – amylase mạnh trong khoảng pH 4,5 – 6 (tối ưu là pH 5,5) còn sinh glucoamylase mạnh trong khoảng pH 4 – 5,5 (tối ưu là pH 4,5). Chủng Asp.protuberus cũng sinh glucoamylase mạnh ở pH 4,5 -6 (mạnh nhất ở pH 4,5) và α – amylase mạnh ở pH 5 – 6,5 (mạnh nhất ở pH 5). Kết quả này phù hợp với nghiên cứu của Forgaty W. M và Kelly C.T. [39] là pH thích hợp để sinh α – amylase thì cao hơn để sinh glucoamylse và nhận định của Ngưyễn Đức Lượng khi cho rằng pH thích hợp của NS để tạo hệ amylase là 4,5 – 5 [53]. 0 10 20 30 40 2 3 4 5 6 7 8 9 pH M ức độ p há t t riể n (m m ) Asp.oryzae Asp.protuberus Đồ thị 3.9. Ảnh hưởng của pH đến sinh trưởngcủa hai chủng NS 0 10 20 30 40 50 3 3.5 4 4.5 5 5.5 6 6.5 7 7.5 8 8.5 pH H oạ t đ ộ e nz ym a m yl as e Asp.oryzae Asp.protuberus Đồ thị 3.10. Ảnh hưởng của pH đến hoạt độ α – amylase của hai chủng NS 0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500 3 3.5 4 4.5 5 5.5 6 6.5 7 7.5 8 8.5 pH H oạ t đ ộ e nz ym a m yl as e Asp.oryzae Asp.protuberus Đồ thị 3.11. Ảnh hưởng của pH đến hoạt độ glucoamylase của hai chủng NS Chúng ta thấy hoạt lực amylase của chủng Asp.protuberus chỉ giảm dần khi pH dần đến trung tính và kiềm. Ở pH 7, chủng nấm này vẫn sinh trưởng phát triển và có khả năng sinh hai loại amylase cao. Trong khi đó, hoạt lực enzym chủng Asp.oryzae giảm rất mạnh sau khoảng pH 6. Vì thế, trong hai chủng thì chủng NS Asp.protuberus thích hợp với MT sống ở RNM Cần Giờ hơn. Còn ở MT quá nghiêng về axit thì enzym bị ức chế. pH = 3 pH = 4 pH = 5 pH = 6 pH = 7 Đối chứng Hình 3.5. Ảnh hưởng của pH đến sinh trưởng của chủng Asp.oryzae pH = 3 pH = 4 pH = 5 pH = 6 pH = 7 Đối chứng Hình 3.6. Ảnh hưỏng pH đến sinh trưởng của chủng Asp.protuberus 3.3.8. Ảnh hưởng của thời gian. Tiến hành khảo sát ảnh hưởng của thời gian đến sinh trưởng và khả năng sinh hai loại amylase của hai chủng NS theo mục 2.2.2.5 và 2.2.2.6. Kết quả được trình bày ở bảng 3.20 và 3.21, minh họa bởi đồ thị 3.12, 3.13 và 3.14. Bảng 3.20. Ảnh hưởng của thời gian đến sinh trưởng của hai chủng NS Mức độ phát triển (mm) Thời gian (giờ) Aspergillus oryzae Asppergillus protuberus 24 8,0 0,0 48 18,0 2,0 72 38,0 5,0 96 41,0 8,0 120 42,0 10,0 144 43,0 11,5 168 43,5 12,5 Qua kết quả chúng ta thấy cả hai chủng đều sinh trưởng chậm so với các chủng NS ở đất liền. Tuy nhiên có sự khác nhau trong sinh trưởng theo thời gian của hai chủng nấm này. Từ ngày 1 đến ngày 3, chủng Asp.oryzae sinh trưởng nhanh và tạo nên KL có kích thước lớn. Đến ngày thứ 3, là thời gian bắt đầu sinh bào tử, thì sự sinh trưởng của chủng này chậm hẳn lại. Tuy vậy, KL của chủng này vẫn có kích thước lớn hơn hẳn so với chủng Asp.protuberus. Chủng Asp.protuberus sinh trưởng yếu hơn. Tốc độ sinh trưởng của chủng này chỉ chậm lại bắt đầu từ ngày thứ 5 trở đi, vì đến giai đoạn này, chủng Asp.protuberus mới bắt đầu tạo bào tử. Tốc độ sinh trưởng của hai chủng nấm cũng ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng hợp enzym của chúng. Cả hai chủng đều cho hoạt độ amylase tăng dần theo thời gian đạt đến cực đại và sau đó giảm dần. Chủng Asp.oryzae cho α – amylase và glucoamylase hoạt lực cao nhất ở 36 giờ. Điều này cũng phù hợp với nhiều kết quả nghiên cứu về thời gian sinh amylase của chủng này là khoảng 36 giờ như kết quả nghiên cứu của Đoàn Văn Thược (2005) là chủng Asp.oryzae cho hoạt độ amylase cao nhất ở 36 giờ [36]. Chủng Asp.oryzae có sự sinh trưởng nhanh nên sinh amylase sớm hơn so với chủng Asp.protuberus. Chúng ta thấy từ khoảng 36 giờ trở đi, chủng Asp.oryzae bắt đầu hình thành bào tử nên hoạt độ enzym giảm mạnh bắt đầu từ sau 36 giờ. Và tốc độ giảm của enzym cũng rất nhanh. Do đó, để thu nhận α – amylase và glucoamylase có hoạt lực mạnh nhất ở chủng nấm này, chúng ta nên dừng nuôi cấy ở thời điểm 36 giờ. Bảng 3.21. Ảnh hưởng của thời gian đến hoạt độ α – amylase và glucoamylase của hai chủng NS. Hoạt độ amylase (UI/g/phút) Asp.oryzae Asp.protuberus Thời gian (giờ) α-amylase glucoamylase α-amylase Glucoamylase 24 37,24 2437,04 16,77 331,85 36 47,73 3754,07 23,02 674,07 48 44,64 3442,96 32,15 1783,70 60 37,83 3142,22 38,02 2613,33 72 30,55 2405,93 44,31 2520,00 84 24,95 1939,26 40,59 2136,30 96 18,09 1420,74 33,73 1659,26 108 12,74 767,41 29,68 922,96 120 8,25 290,37 22,64 705,19 Trong khi đó, chủng Asp.protuberus sinh trưởng chậm hơn, nên thời điểm cho hoạt độ enzym cao nhất cũng chậm hơn so với chủng Asp.oryzae. Chủng nấm này có khả năng sinh α – amylase mạnh nhất ở thời điểm 72 giờ và glucoamylase mạnh nhất ở 60 giờ. Sau khoảng thời gian này, hoạt độ enzym giảm dần vì sợi nấm bắt đầu sinh bào tử. 0 10 20 30 40 50 0 1 2 3 4 5 6 7 8 Thời gian (ngày) M ức độ p há t t riể n (m m ) Asp.oryzae Asp.protuberus Đồ thị 3.12. Ảnh hưởng của thời gian đến sự sinh trưởng của hai chủng NS. 0 10 20 30 40 50 60 0 12 24 36 48 60 72 84 96 108 120 132 Thời gian nuôi cấy (giờ) H oạ t đ ộ e nz ym a m yl as e Asp.oryzae Asp.protuberus Đồ thị 3.13. Ảnh hưởng của thời gian đến hoạt độ α – amylase của hai chủng NS. 0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500 4000 0 12 24 36 48 60 72 84 96 108 120 132 Thời gian nuôi cấy (giờ) H oạ t đ ộ e nz ym a m yl as e Asp.oryzae Asp.protuberus s Đồ thị 3.14. Ảnh hưởng của thời gian đến hoạt độ glucoamylase của hai chủng NS. 3.4. Động thái quá trình sinh amylase trong điều kiện tối ưu. Tiến hành nuôi cấy hai chủng NS ở những điều kiện tối ưu đã khảo sát cho từng chủng. Thu dịch enzym và đo OD xác định hoạt độ từng enzym cùng sự thay đổi pH và nhiệt độ tại các thời điểm 12 đến 96 giờ (bước nhảy 12). Kết quả được trình bày ở bảng 3.22 và minh họa bằng đồ thị 3.15 v à 3.16. Bảng 3.22. Động thái quá trình sinh amylase trong điều kiện tối ưu Các giá trị Aspergillus oryzae Aspergillus protuberus Thời gian (giờ) α-amylase glucoamylase pH α-amylase glucoamylase pH 12 14,35 896,00 5,78 7,35 236,79 5,19 24 37,35 2437,04 6,01 16,77 331,80 5,23 36 47,75 3755,12 6,95 23,04 675,07 5,41 48 44,66 3443,23 6,97 32,16 1784,00 5,68 60 37,81 3142,63 7,02 38,72 2615,67 6,37 72 30,55 2426,33 7,04 44,37 2552,65 6,89 84 25,00 1939,65 7,05 40,57 2136,97 7,01 96 18,10 1425,17 7,02 33,82 1661,26 7,05 108 12,79 767,41 7,02 30,01 922,99 7,07 120 9,01 292,00 7,01 22,62 710,23 7,08 0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500 4000 0 12 24 36 48 60 72 84 96 108 120 132 Thời gian (giờ) H oạ t đ ộ g lu co am yl as e 0 10 20 30 40 50 60 H oạ t đ ộ a lp ha a m yl as e glucoamylase pH alpha amylase Đồ thị 3.15. Động thái của quá trình sinh tổng hợp hai loại amylase của chủng Asp.oryzae Đồ thị 3.16. Động thái của quá trình sinh tổng hợp hai loại amylase của chủng Asp.protuberus Kết quả bảng 3.22 cho thấy tại thời điểm 36 đến 48 giờ, chủng Asp.oryae cho hoạt độ hai loại amylase có giá trị cao hẳn so với các thời điểm khác. Còn chủng Asp.protuberus thì cho hoạt độ hai loại amylase cao ở thời điểm 60 đến 72 giờ. Đây chính là thời điểm thích hợp để thu enzym. Sau các thời điểm này thì hoạt độ enzym giảm rõ rệt. Tương ứng với sự tăng hoạt độ enzym, pH của MT cũng tăng theo. Tuy nhiên,theo thời gian p