Luận văn Ứng dụng bộ kít nhuộm hóa học tế bào để phân loại bệnh bạch cầu cấp theo tiêu chuẩn FAB

udan B. Nguyên nhân là các cơ chất dùng cho các kỹ thuật nhuộm esteraza đặc hiệu, không đặc hiệu ức chế và không ức chế, photphataza kiềm, axit rất dễ bị phân hủy đều phải nhập ngoại với giá thành cao (>10 triệu đồng/1g) và điều kiện bảo quản đòi hỏi ở nhiệt độ <-200C. Mặt khác các kỹ thuật này thường không đồng bộ do mỗi kỹ thuật có thời gian nhuộm, dung dịch cố định khác nhau dẫn đến kỹ thuật viên rất khó thực hiện (xem Bảng 1.5). Bảng 1.5. Quy trình kỹ thuật của các bước nhuộm đơn TT Kỹ thuật nhuộm Dung dịch Cố định Oxi hóa glycogen thành andehit Nhuộm các chất cần phát hiện Tẩy Màu Nhuộm nền Số bước nhuộm Tổng thời gian Nhuộm PAS, Kỹ thuật Hotchkiss Hơi formol, 5 phút Periodic 1%, 10 phút Schiff 100%, 30 phút Dung dịch SO2, 3 phút Hematoxylin, 10 phút 5 58 phút Nhuộm peroxidaza, Kỹ thuật Quaglino & Flemans Formalin 10%, trong ethanol 30 giây Benzidin 2,5%, 7 phút Giemsa 7%, 20 phút 3 27,5 phút Nhuộm sudan B, Kỹ thuật Sheehan & Storey Hơi formol, 10 phút Sudan B 0,18%, 60 phút Ethanol 70% Giemsa 7%, 20 phút 4 90 phút Nhuộm esteraza đặc hiệu, Kỹ thuật Wachstein & Wolf Hơi formol, 5 phút Naphtol AS-D Cloaxetat 1%, 30 phút Nuclear Fast Red, 0,1%: 10 phút 3 45 phút Nhuộm esteraza không đặc hiệu, kỹ thuật Wachstein & Wolf Hơi formol, 5 phút Naphtol AS axetat 1%, 60 phút Nuclear Fast Red 0,1%, 10 phút 3 105 phút Nhuộm esteraza không đặc hiệu ức chế bằng NaF, kỹ thuật Wachstein & Wolf Hơi formol, 5 phút Naphtol AS axetat 1% &NaF, 60 phút Nuclear Fast Red 0,1%, 10 phút 3 105 phút Nhuộm photphataza kiềm, kỹ thuật Kaplow Axeton trong đệm xitrat, 30 giây Naphtol AS-BI phosphate 0,009%, 10 phút Hematoxylin, 5 phút 3 15,5 phút Nhuộm photphataza axit, kỹ thuật Li và cs Hơi formol, 4 phút Naphtol AS-BI phosphate 0,017%, 90 phút Hematoxylin, 10 phút 3 104 phút Quy trình chẩn đoán thể bệnh bạch cầu cấp theo tiêu chuẩn FAB dựa trên phương pháp hình thái học-hóa học tế bào được thực hiện qua các bước thể hiện trên hình 1.8. Với quy trình này, quá trình nhuộm thường được tiến hành tuần tự nên thời gian thường kéo dài, các kỹ thuật nhuộm enzym đòi hỏi nhuộm càng sớm càng tốt để không bị giảm hoạt tính. Ngoài ra, kỹ thuật chọc tủy là một thủ thuật khó, cần tiến hành bởi các bác sỹ có chuyên môn cao và gây đau đớn cho người bệnh. Do vậy, mẫu tủy cần phải được xét nghiệm với hiệu quả cao tránh phải chọc tủy nhiều lần, nên việc tiến hành nhuộm đồng bộ một lúc sẽ rút ngắn thời gian chẩn đoán, đảm bảo chất lượng nhuộm. Giá thành bộ kít HICYTEC với 10 kỹ thuật nhuộm tốn khoảng 300.000 đ. Số tiền này bằng giá 1 marker (CD) và bằng 1/10 giá 1 xét nghiệm gen (3.200.000 đ), hơn nữa chỉ sau 1 giờ nhuộm là có thể giúp chẩn đoán nhiều bệnh như: Phân loại thể bệnh bạch cầu cấp theo tiêu chuẩn FAB, giảm điểm của nhuộm photphataza kiềm bạch cầu và ứ sắt. Bộ kít này đã được Hội đồng nghiệm thu đề tài cấp bộ mang mã số: BH-2011-BV198-11 nghiệm thu và cho phép triển khai tại các cơ sở khám chữa bệnh trong cả nước. Bộ kít nhuộm hóa học tế bào HICYTEC gồm 10 kỹ thuật đồng bộ gồm: TT Kỹ thuật nhuộm Mục đích phát hiện Giemsa Quan sát hình thái tế bào Periodic-Axit Schiff (PAS) Glycogen Peroxidaza Enzym peroxidaza Sudan B Hạt mỡ Esteraza đặc hiệu Enzym esteraza đặc hiệu Esteraza không đặc hiệu Enzym esteraza không đặc hiệu Esteraza không đặc hiệu-NaF Enzym esteraza không đặc hiệu Photphataza axit Photphataza axit Photphataza kiềm Photphataza kiềm Perls Tình trạng ứ sắt Hinh 1.8. Quy trình thường quy nhuộm hóa học tế bào chẩn đoán thể bệnh bạch cầu cấp theo FAB CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Đối tượng nghiên cứu Đối tượng nghiên cứu là 202 bệnh nhân có chỉ định chọc tủy tại Viện Huyết học-Truyền máu trung ương. 2.1.1. Tiêu chuẩn lựa chọn Bệnh nhân có các triệu chứng nằm trong tiêu chuẩn về mặt lâm sàng bạch cầu cấp; Bệnh nhân chọc tủy lần đầu, được chẩn đoán xác định bạch cầu cấp và chưa điều trị. 2.1.2. Tiêu chuẩn loại trừ Bệnh nhân hoặc thân nhân không đồng ý chọc tủy; Bệnh nhân cũ đã và đang điều trị; Bệnh nhân không bị bệnh bạch cầu sau khi có kết quả xét nghiệm marker và di truyền trong chẩn đoán phân loại dòng tế bào theo tiêu chuẩn FAB. 2.2. Phương pháp nghiên cứu 2.2.1. Thiết kế nghiên cứu Nghiên cứu mô tả cắt ngang. 2.2.2. Phương pháp thu thập mẫu và số liệu Hồi cứu: Sử dụng kết quả nghiên cứu của đề tài cấp bộ "Nghiên cứu chế tạo bộ kít nhuộm hóa học tế bào để chẩn đoán các dòng tế bào trong bệnh ung thư máu", mã số: BH-2011-BV198-11 của Trần Văn Tính và cộng sự. Phương pháp thu thập mẫu của đề tài cụ thể như sau: Thu thập các mẫu tủy của bệnh nhân chọc tủy lần đầu chưa điều trị có các triệu chứng nằm trong tiêu chuẩn về mặt lâm sàng hoặc được chẩn đoán là bệnh bạch cầu cấp từ tuyến khác chuyển đến Viện Huyết học-Truyền máu trung ương từ 27/08/2014-15/06/2015. Mỗi mẫu kéo 10 tiêu bản, chuyển về Trung tâm Huyết học-Truyền máu, Bệnh viện 19-8, Bộ Công an tiến hành nhuộm bằng bộ nhuộm HICYTEC gồm 10 kỹ thuật nhuộm hóa học tế bào. Tiến hành đọc kết quả và phân loại thể bệnh theo tiêu chuẩn FAB dựa trên kỹ thuật hình thái học-hóa học tế bào. Qua 100 mẫu nghiên cứu của đề tài cấp bộ đã có 10 mẫu được xác định thể bệnh bạch cầu cấp dòng lympho và 8 mẫu được xác định thể bệnh bạch cầu cấp dòng tủy. Để thực hiện đề tài, đã tiếp tục thu thập mẫu như phương pháp thu thập mẫu và nhuộm bằng bộ kít HICYTEC đồng bộ của đề tài ở trên. Thu thập dữ liệu kết quả chẩn đoán xác định thể bệnh do Viện Huyết học-Truyền máu trung ương kết luận. Các kết luận về thể bệnh của viện Huyết học-Truyền máu dựa trên kết quả của ba phương pháp: hình thái học - hóa học tế bào (3 kỹ thuật: PAS, Peroxidaza và Sudan B), miễn dịch và di truyền. Thời gian nhận được kết luận thể bệnh khoảng 7 ngày kể từ ngày chọc tủy. Cỡ mẫu nghiên cứu dự kiến là 30 (10 hồi cứu và 20 mẫu thu thập tại thời điểm nghiên cứu). Kết quả lấy đến mẫu thứ 102 thì thu được 20 mẫu có kết luận bệnh bạch cầu cấp dòng lympho, 22 mẫu có kết luận bệnh bạch cầu cấp dòng tủy và dừng thu thập mẫu tủy. Tiến hành so sánh phân loại thể bệnh bạch cầu cấp bằng bộ kít HICYTEC của 20 bệnh nhân mới và 10 bệnh nhân hồi cứu với kết luận thể bệnh của Viện Huyết học-Truyền máu trung ương đối với bạch cầu cấp dòng lympho. Đối với bạch cầu cấp dòng tủy thì so sánh phân loại thể bệnh bạch cầu cấp bằng bộ kit HICYTEC của 22 bệnh nhân mới và 8 bệnh nhân hồi cứu với kết luận thể bệnh của Viện Huyết học-Truyền máu trung ương. 2.2.3. Kỹ thuật nghiên cứu Nhuộm 10 kỹ thuật theo hướng dẫn của bộ kít nhuộm hóa học tế bào đồng bộ HICYTEC sản phẩm của đề tài cấp bộ mang mã số: BH - 2011 - BV198 - 11 Kỹ thuật nhuộm hình thái tế bào bằng thuốc nhuộm giemsa; Kỹ thuật nhuộm glycogen bạch cầu bằng thuốc thử Schiff; Kỹ thuật nhuộm lipit bạch cầu bằng thuốc thử Sudan B; Kỹ thuật nhuộm peroxidaza bạch cầu bằng cơ chất là benzidin; Kỹ thuật nhuộm esteraza đặc hiệu bạch cầu bằng cơ chất là naphtol AS-D 2-cloaxetat; Kỹ thuật nhuộm esteraza không đặc hiệu bạch cầu bằng cơ chất là naphtol AS axetat; Kỹ thuật nhuộm esteraza đặc hiệu bạch cầu bằng cơ chất là naphtol AS axetat với chất ức chế NaF; Kỹ thuật nhuộm photphataza axit bạch cầu bằng cơ chất là naphtol AS-BI photphat ở pH axit; Kỹ thuật nhuộm photphataza kiềm bạch cầu bằng cơ chất là naphtol AS-BI photphat ở pH kiềm; Kỹ thuật nhuộm nguyên hồng cầu hoặc các tế bào lưới nội mô ứ sắt bằng Kali Feroxyanua. 2.2.4. Xử lý số liệu Kết quả được xử lý bằng phần mềm SPSS 18.0. 2.2.5. Biện pháp hạn chế sai số Người thu thập số liệu am hiểu về vấn đề nghiên cứu; Có người giám sát khi thu thập số liệu; Loại bỏ những yếu tố gây nhiễu; Người làm xét nghiệm tuân thủ quy trình xét nghiệm và có trách nhiệm với xét nghiệm đang làm. 2.2.6. Thời gian và địa điểm nghiên cứu Thời gian: Từ ngày 27/08/2014-15/06/2015. Địa điểm: Viện Huyết học-Truyền máu trung ương và Trung tâm Huyết học-Truyền máu, Bệnh viện 19-8, Bộ Công an. 2.3. Thực nghiệm 2.3.1. Bệnh phẩm, dụng cụ, máy móc và hóa chất nghiên cứu Bệnh phẩm: 202 mẫu tủy sinh máu chọc lần đầu tại Viện Huyết học-Truyền máu trung ương Cố định tiêu bản trong dung dịch cố định tiêu bản với thời gian 1 phút; Với các nghiên cứu dài ngày, tiêu bản được bảo quản trong hộp bảo quản từng tiêu bản có chất chống ẩm ở nhiệt độ -370C. Khi đưa vào nhuộm nghiên cứu thì tiến hành nâng nhiệt độ lên nhiệt độ phòng thí nghiệm. b) Dụng cụ và máy móc: Máy ủ nhiệt CW-20G từ 0-500C, độ chính xác ±0,10C; Máy đo pH inoLab 730 với độ chính xác đến 10-3; Cân phân tích Sartorius TE214S có độ chính xác 10-4; Kính hiển vi Nikon với độ phóng đại 1.000 lần có gắn máy chụp ảnh; Pipet tự động của hãng Thermo kèm đầu côn 0,2 mL, 1,0 mL và 10 ml của hãng Gilson; Hộp nhuộm của hãng HICYTEC. c) Hóa chất: Bộ kít nhuộm hóa học tế bào HICYTEC tại trung tâm Huyết học-Truyền máu bệnh viện 19-8, Bộ Công an. Bảng 2.1. Thành phần bộ kít nhuộm hóa học tế bào Thuốc thử Tên thuốc thử Thể tích Bảo quản R1 Xitrat-fomol-axeton 10ml 25ºC R2 Giemsa 2,5ml 25ºC R3 Kali feroxyanua 2,5ml 25ºC R4 Naphthol AS-D chloroacetate 2,5ml <-20ºC R5 Naphthol AS acetat 5,0ml <-20ºC R6 Naphthol AS-BI phosphate 5,0ml <-20ºC R7 Sudan B 2,5ml 25ºC R8 Fastred violet LB salt 12,5ml <-20ºC R9 Đệm giemsa 50ml 25ºC R10 HCl 50ml 25ºC R11 Đệm esteraza đặc hiệu 50ml 25ºC R12 Đệm esteraza không đặc hiệu 50ml 25ºC R13 Đệm esteraza không đặc hiệu có chất ức chế NaF 50ml 25ºC R14 Đệm photphataza axit 50ml 25ºC R15 Đệm photphataza kiềm 50ml 25ºC R16 Đệm Sudan B 50ml 25ºC R17 Benzidin 50ml 25ºC R18 Periodic 50ml 25ºC R19 Dung dịch cố định màu 100ml 25ºC R20 Dung dịch schiff 20ml 25ºC R21 Nuclear Fast red 50ml 25ºC R22 Hematoxylin 100ml 25ºC R23 Dung dịch tăng màu 100ml 25ºC Bộ thuốc thử đủ cho 20 lần nhuộm, mỗi lần 2 bộ tiêu bản. Hạn sử dụng 1 năm kể từ ngày sản xuất. Bộ kít gồm 2 phần bảo quản lạnh dưới -20ºC và ở nhiệt độ phòng thí nghiệm. 2.3.2. Quy trình nhuộm hóa học tế bào Chuẩn bị tiêu bản: Ghi mã số, ký hiệu Tiến hành nhuộm Bước 1: Cố định tiêu bản Bước 2: Nhuộm các chất cần phát hiện Bảng 2.2. Pha chế dung dịch nhuộm STT Vị trí nhuộm Kỹ thuật nhuộm Bước 1 Bước 2 Bước 3 Thời gian 1 1 GS R2: 0,1ml R9: 1,9ml 30 phút 2 2 Perls R3: 0,1ml R10: 1,9ml 30 phút 3 3 CE R4: 0,1ml R8: 0,1ml R11: 1,8ml 30 phút 4 4 NE R5: 0,1ml R8: 0,1ml R12: 1,8ml 30 phút 5 5 NF-NaF R5: 0,1ml R8: 0,1ml R13: 1,8ml 30 phút 6 6 PA R6: 0,1ml R8: 0,1ml R14: 1,8ml 30 phút 7 7 PAL R6: 0,1ml R8: 0,1ml R15: 1,8ml 30 phút 8 8 SD R7: 0,1ml R16: 1,9ml 30 phút 9 9 PER R17: 2ml 30 phút 10 10 PAS R18: 2ml 30 phút Bước 3: Nhuộm glycogen, nhân và nền Bảng 2.3. Nhuộm glycogen và biệt hóa STT Vị trí nhuộm Kỹ thuật nhuộm Bước 1 Thời gian 1 1 GS 2 2 Perls 3 3 CE R19: 2ml 15 phút 4 4 NE R19: 2ml 15 phút 5 5 NF-NaF R19: 2ml 15 phút 6 6 PA R19: 2ml 15 phút 7 7 PAL R19: 2ml 15 phút 8 8 SD R19: 2ml 15 Phút 9 9 PER R19: 2ml 15 Phút 10 10 PAS R20: 2ml 15 Phút Rửa kỹ dưới vòi nước chảy 5 phút Bước 4: Lấy hộp nhuộm mới, lắc các thuốc thử và nhỏ lần lượt vào các ô. Bảng 2.4. Nhuộm nhân và nền STT Vị trí nhuộm Kỹ thuật nhuộm Bước 1 Thời gian 1 1 GS 2 2 Perls R21: 2ml 10 phút 3 3 CE R22: 2ml 10 phút 4 4 NE R22: 2ml 10 phút 5 5 NF-NaF R22: 2ml 10 phút 6 6 PA R22: 2ml 10 phút 7 7 PAL R22: 2ml 10 phút 8 8 SD R22: 2ml 10 phút 9 9 PER R22: 2ml 10 phút 10 10 PAS R22: 2ml 10 phút Rửa kỹ dưới vòi nước chảy 5 phút Bước 5: Lấy hộp nhuộm mới, lắc các thuốc thử và nhỏ lần lượt vào các ô. Bảng 2.5. Nhuộm tăng màu STT Vị trí nhuộm Kỹ thuật nhuộm Bước 1 Thời gian 1 1 GS 2 2 Perls 3 3 CE R23: 2ml 5 phút 4 4 NE R23: 2ml 5 phút 5 5 NF-NaF R23: 2ml 5 phút 6 6 PA R23: 2ml 5 phút 7 7 PAL R23: 2ml 5 phút 8 8 SD R23: 2ml 5 phút 9 9 PER R23: 2ml 5 phút 10 10 PAS R23: 2ml 5 phút Rửa dưới vòi nước, để khô, soi kính hiển vi với vật kính dầu có độ phóng đại 1.000 lần. 2.3.3. Đánh giá kết quả Đánh giá định tính: Dựa vào màu xuất hiện trên nguyên sinh chất của tế bào. Bảng 2.6. Đánh giá kết quả định tính TB Nhuộm Dương tính Âm tính 1 GS Nhuộm quan sát hình thái học tế bào 2 Perls Màu xanh dương Không có màu xanh dương 3 PAS Màu đỏ Không có màu đỏ 4 PER Màu vàng nâu Không có màu vàng nâu 5 SD Màu đen Không có màu đen 6 CE Màu đỏ Không có màu đỏ 7 NE Màu đỏ Không có màu đỏ 8 NE-NaF Bị ức chế: mất màu đỏ Không bị ức chế: có màu đỏ 9 PA Màu đỏ Không có màu đỏ 10 PAL Màu đỏ Không có màu đỏ Đánh giá bán định lượng: bằng phương pháp tính điểm phân độ dương tính Tổng điểm tính theo công thức: Y = 0 x N0 + 1 x N1 + 2 x N2 + 3 x N3 + 4 x N4 Trong đó: - N là tỷ lệ phần trăm các tế bào đếm được ở các độ dương tính; - 0, 1,2, 3, 4 là độ dương tính của tế bào. Bảng 2.7. Đánh giá kết quả bán định lượng Độ Đặc điểm hạt Cường độ Màu bào tương 0 Không có hạt Không màu Màu nhuộm nền 1 Hạt nhỏ hoặc màu lan tỏa Nhạt tới trung bình Hạt hoặc màu chiếm 1/3 bào tương che một phần nhân 2 Hạt nhỏ hoặc màu lan tỏa Trung bình tới đậm Hạt hoặc màu chiếm 1/2 bào tương che một phần nhân 3 Hạt trung bình hoặc màu lan tỏa Đậm Hạt hoặc màu chiếm 1/3 bào tương che một phần nhân 4 Hạt lớn hoặc màu lan tỏa Rất đậm Che phủ toàn bộ NSC và nhân CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1. Đặc điểm chung của nhóm bệnh nhân được nghiên cứu Bệnh bạch cầu cấp là bệnh lý ác tính của hệ tạo máu được đặc trưng bởi sự tăng sinh và tích tụ tế bào non trong máu và tủy xương. Trong tổng số 202 mẫu chọc tủy lần đầu tại viện Huyết học - Truyền máu Trung ương có 142 trường hợp được chẩn đoán ban đầu mắc bạch cầu cấp trong đó có 60 trường hợp kết luận đúng thể bệnh, như vậy chỉ dựa vào lâm sàng mức độ chẩn đoán đúng thể bệnh đạt tỷ lệ rất thấp (42,3%). Do đó cần kết hợp nhiều phương pháp chẩn đoán khác nhau. Tiêu chuẩn FAB (1986) sử dụng kết quả hình thái học-nhuộm hoá học tế bào, marker và di truyền làm cơ sở để phân loại thể bệnh và dòng tế bào trong bệnh bạch cầu cấp nhằm chẩn đoán và lựa chọn phác đồ điều trị cho bệnh nhân đạt hiệu quả cao nhất [33, 36, 37, 39, 40]. Trong tổng số 202 trường hợp chọc tủy lần đầu tại viện Huyết học Truyền máu Trung ương có 142 trường hợp được chẩn đoán ban đầu mắc bệnh bạch cầu cấp (trong đó có 60 trường hợp có kết luận đúng thể bệnh) và 60 trường hợp thiếu máu, giảm 3 dòng tế bào, hay mắc các bệnh máu và cơ quan tạo máu khác chưa rõ nguyên nhân. Bảng 3.1. Tỷ lệ mắc bệnh bạch cầu cấp Kết luận Số lượng Tỷ lệ (%) Bạch cầu cấp 60 29,7 Bệnh khác 142 70,3 Tổng 202 100 Qua bảng 3.1 cho thấy tỷ lệ phát hiện bệnh bạch cầu cấp trên các bệnh nhân chọc tủy lần đầu chưa điều trị có triệu chứng lâm sàng hoặc đã được chẩn đoán tại các bệnh viện khác chuyển đến Viện Huyết học -Truyền máu trung ương là 29,7%. Tỷ lệ này tương đương với công bố của Trần Thị Minh Hương và cộng sự (32.1%) tại Bệnh viện Bạch Mai [1]. Bảng 3.2. Phân loại bạch cầu cấp theo giới tính Giới tính Số lượng Tỷ lệ (%) Nam 28 46,7 Nữ 32 53,3 Tổng 60 100 Về giới: Tỷ lệ mắc bệnh của nữ giới cao hơn nam giới (xem bảng 3.2) và cao hơn so với công bố của Siegel M. P. H. R., và cộng sự ghi nhận tại Mỹ năm 2014 là 0,756 (23.370 nữ/30.900 nam) [52]. Sự khác nhau có thể là do ảnh hưởng của môi trường sống cũng như thói quen sinh hoạt của người Mỹ và Việt Nam cũng như số lượng mẫu thu thập có thể còn thấp chưa mang tính đại diện. Hình 3.1. Biểu đồ phân loại bạch cầu cấp theo độ tuổi và giới tính Về độ tuổi: Qua hình 3.1 cho thấy bệnh gặp ở mọi lứa tuổi, tuy vậy đối với nam tần suất mắc bệnh tỷ lệ nghịch với độ tuổi, dưới tuổi lao động chiếm tỷ lệ cao nhất (21,5%). Ngược lại, ở nữ giới thì độ tỷ lệ mắc bệnh cao nhất là ở ngoài độ tuổi lao động (20,0%). Về phân loại thể bệnh, theo FAB (1986): bệnh bạch cầu cấp được chia thành 2 nhóm chính là bạch cầu cấp dòng tủy và bạch cầu cấp dòng lympho. Bạch cầu cấp dòng tủy gồm 8 thể bệnh từ M0 đến M7. Bạch cầu cấp dòng lympho gồm 3 thể bệnh từ L1 đến L3. Trong nghiên cứu này, bạch cầu cấp chia làm 3 nhóm, gồm bạch cầu cấp dòng tủy chiếm tỷ lệ cao nhất (50,0%), tiếp theo là thể bệnh bạch cầu cấp dòng lympho chiếm 41,7% và nhóm thứ ba chiếm tỷ lệ thấp nhất là thể lai giữa lympho và tủy chiếm 8.3% (xem hình 3.2). Tỷ lệ này cũng phù hợp với các nghiên cứu trong và ngoài nước về tình hình chung mắc bạch cầu cấp. Kết quả nghiên cứu của Trần Ngọc Vũ và cộng sự tại khoa Nhi bệnh viện Trung ương Huế cũng cho thấy nhóm bạch cầu cấp dòng tủy (55,45%) chiếm tỷ lệ cao hơn nhóm bạch cầu cấp dòng lympho (44,55%). Nghiên cứu cũng chỉ ra ở người lớn tỷ lệ mắc bạch cầu cấp dòng tủy là 70,77%, dòng lympho là 29,23%. Còn ở trẻ em thì ngược lại tỷ lệ mắc bạch cầu cấp dòng lympho (77,22%) cao hơn nhiều so với tỷ lệ mắc bạch cầu cấp dòng tủy (27,78%) [25]. Hình 3.2. Biểu đồ phân loại bệnh bạch cầu cấp. 3.2. Nhóm bạch cầu cấp dòng lympho 3.2.1. Đặc điểm chung về nhóm bệnh bạch cầu cấp dòng Lympho Bảng 3.3. Bảng phân loại bạch cầu cấp dòng lympho theo giới tính Giới tính Số lượng Tỷ lệ (%) Nam 14 56,0 Nữ 11 44,0 Tổng 25 100 Về giới tính: bệnh gặp ở cả 2 giới. Tuy nhiên, tỷ lệ mắc bệnh bạch cầu cấp dòng lympho ở nam cao hơn nữ, nam chiếm 56,0%, nữ chiếm 44,0 % (nam/nữ =1,3). Về độ tuổi: Mẫu nghiên cứu có tuổi thấp nhất là 1 tháng tuổi và cao nhất là 93 tuổi, bệnh gặp ở mọi lứa tuổi. Theo tiêu chuẩn quy định độ tuổi lao động của người Việt Nam: độ tuổi lao động của nam giới từ 18-60 tuổi, độ tuổi lao động của nữ giới từ 18 - 55 tuổi. Qua hình 3.3 cho thấy tỷ lệ mắc bệnh bạch cầu cấp dòng lympho < 18 tuổi chiếm tỷ lệ cao nhất (60%). Điều này ảnh hưởng rất lớn đến sự phát triển kinh tế-xã hội. Số trường hợp mắc bệnh bạch cầu cấp dòng lympho tập trung chủ yếu ở nhóm tuổi vị thành niên - nguồn lực phát triển trong tương lai của đất nước, cần được gia đình và xã hội quan tâm chăm sóc nhiều hơn. Kết quả này phù hợp với các công bố của các tác giả trong và ngoài nước. Theo Trần Thị Hồng Hà (2004), độ tuổi mắc bệnh bạch cầu cấp dòng lympho hay gặp nhất từ 4-5 tuổi [5]. Nguyễn Công Khanh (1987) thấy rằng gần 50% trẻ mắc bệnh dưới 5 tuổi và tỷ lệ này cũng giảm dần ở trẻ lớn [8]. Theo Bùi Ngọc Lan (2007), độ tuổi mắc bệnh trung bình là 6,0 ± 3,8 [9]. Đối với người trên 16 tuổi, nhiều nghiên cứu cho thấy ở Việt Nam, tỷ lệ người mắc bệnh trẻ tuổi chiếm tỷ lệ khá cao. Nghiên cứu của Phạm Quang Vinh (2003), có trên 256 bệnh nhân có 40,0% số bệnh nhân dưới 30 tuổi [24]. Hình 3.3. Biểu đồ phân loại bệnh bạch cầu cấp dòng lympho theo độ tuổi 3.2.2. Phân loại thể bệnh bạch cầu cấp dòng lympho sử dụng bộ kit nhuộm HICYTEC Như đã đề cập ở phần tổng quan, nhuộm hóa học tế bào là dùng các phản ứng hóa màu để phát hiện các chất hóa học có trong tế bào. Mỗi kỹ thuật nhằm phát hiện một thành phần hóa học của tế bào ung thư giúp chẩn đoán, phân loại các thể bệnh và theo dõi điều trị bệnh bạch cầu cấp. Phân loại thể bệnh bạch cầu cấp dòng lympho theo tiêu chuẩn FAB Việc phân loại thể bệnh dựa vào hình thái học và hóa học tế bào theo tiêu chuẩn FAB đối với bệnh bạch cầu cấp dòng lympho được chia thành 3 thể L1, L2, L3. Kết quả phân loại thể bệnh bạch cầu cấp dòng lympho bằng bộ kít HICYTEC được thể hiện trên bảng 3.4: Bảng 3.4. Kết quả phân loại thể bệnh bạch cầu cấp dòng lympho Thể bệnh Kết quả bộ kít HICYTEC Số lượng Tỷ lệ (%) L1 2 8 L2 23 92 L3 0 0 Tổng cộng 25 100 Kết quả bảng 3.4 cho thấy tỷ lệ mắc bệnh bạch cầu cấp thể L2 gặp nhiều nhất (chiếm 92%), tiếp đến là thể L1 (chiếm 8%) và không gặp trường hợp nào thể L3. Kết quả này phù hợp với các nghiên cứu của Nguyễn Thị Minh An (1995) [1], Lâm Thị Mỹ và cộng sự (2004) đều thấy thể L2 chiếm tỷ lệ cao trong bạch cầu cấp dòng lympho [10]. Tuy vậy, khác với nghiên cứu của tác giả C. H. Pui (2001) tỷ lệ mắc bệnh bạch cầu cấp dòng lympho hầu hết có phân loại theo FAB thuộc thể L1 chiếm tới 70% [48]. Tiêu chuẩn FAB dựa trên kết quả nhuộm giemsa để xác định hình thái học và hóa học tế bào [27]: Thể L1: Dưới 50% số lượng tế bào tủy là nguyên hồng cầu; Lớn hơn 30% tế bào blast tủy có kích thước nhỏ, nhân mịn đồng nhất, hình thoi dẹt, có thể có 1 vài hạt nhân nhỏ hoặc không rõ, bào tương rộng và ưa bazơ; Nhuộm hóa học tế bào cho phản ứng PAS dương tính hạt to trong 80% trường hợp, phản ứng peroxidaza âm tính, sudan đen âm tính, esteraza đặc hiệu và không đặc hiệu âm tính trừ lympho T có thể dương tính hạt. Thể L2: Dưới 50% số lượng tế bào tủy là nguyên hồng cầu; Lớn hơn 30% tế bào blast tủy có kích thước to nhỏ không đều, nhân không đồng nhất, có thể có một vài hạt nhân kích thước lớn, nguyên sinh chất rộng và ưa bazơ; Nhuộm hóa học tế bào cho phản ứng PAS dương tính hạt to trong 80% trường hợp, phản ứng peroxidaza âm tính, sudan đen âm tính, esteraza đặc hiệu và không đặc hiệu âm tính trừ lympho T có thể dương tính hạt. Dưới đây là hình ảnh nhuộm giemsa hình thái học tế bào của bệnh nhân thể L1 và L2 (Hình 3.4 và Hình 3.5): Hình 3.4. Ảnh nhuộm giemsa mẫu tủy của bệnh nhân Doãn Hữu T- thể L1 Hình 3.5. Ảnh nhuộm giemsa mẫu tủy của bệnh nhân Nguyễn Hữu T - thể L2 Hình 3.4 là ảnh nhuộm giemsa hình thái học tế bào của bệnh nhân Doãn Hữu T mắc bạch cầu cấp dòng lympho thể L1 cho thấy trên tiêu bản chủ yếu là các tế bào blast dòng lympho có kích thước nhỏ, nhân mịn và đồng nhất, hạt nhân nhỏ và không rõ, bào tương ưa bazơ đậm, ngoài ra, còn có 1 vài tế bào non dòng tủy. Hình 3.5 là ảnh nhuộm giemsa hình thái học tế bào của bệnh nhân Nguyễn Hữu T mắc bệnh bạch cầu cấp dòng lympho thể L2 cho thấy trên tiêu bản có nhiều tế bào blast dòng lympho có kích thước tế bào lớn, to nhỏ không đều, nhân không đồng nhất, 1 vài tế bào blast có hạt nhân to, rõ, bào tương ưa bazơ vừa. Ngoài ra trên tiêu bản còn gặp nguyên hồng cầu ưa đa sắc và một vài tế bào dòng tủy. Về nhuộm hóa học tế bào: Chủ yếu dựa vào kết quả của kỹ thuật nhuộm Periodic - axit schiff (PAS). Bản chất của nhuộm PAS là phản ứng hoàn nguyên nhằm bộc lộ glycogen trong nguyên sinh chất của tế bào. Cơ chế của phản ứng gồm 2 giai đoạn: axit periodic oxi hóa glycogen trong tế bào thành diandehit, diandehit tạo thành sẽ tác dụng với thuốc thử Schiff thành phẩm màu Quinoit màu đỏ. PAS dương tính hạt với bạch cầu ung thư dòng lympho, tế bào trưởng thành thì mức độ dương tính càng mạnh. Các tế bào dòng tủy mẫu tiểu cầu, tiểu cầu dương tính lan tỏa, dòng mono dương tính yếu; bạch cầu ưa axit, bazơ, hồng cầu gần như âm tính. Kết quả nhuộm PAS được thể hiện trên hình 3.6 và hình 3.7: Hình 3.6. Ảnh nhuộm PAS bệnh nhân Doãn Hữu T - Thể L1 Hình 3.7. Ảnh nhuộm PAS bệnh nhân Nguyễn Hiền A- Thể L2 Hình 3.6 là ảnh nhuộm PAS với độ phóng đại 1.000 lần của bệnh nhân Doãn Hữu T mắc bạch cầu cấp dòng lympho thể L1 cho thấy kết quả dương tính, hạt màu đỏ trên nguyên sinh chất của các tế bào blast dòng lympho ngoài ra trên tiêu bản còn có một vài tế bào dòng tủy dương tính lan tỏa bào tương có màu đỏ tươi mịn. Hình 3.7 là ảnh nhuộm PAS với độ phóng đại 1.000 lần của bệnh nhân Nguyễn Hiền A mắc bạch cầu cấp thể L2 cho thấy trên tiêu bản các tế bào blast dòng lympho dương tính hạt to, màu đỏ tươi trên nền nhân và hồng cầu màu xanh. Các phương pháp nhuộm hoá học tế bào khác như: Peroxidaza, lipit bằng sudan đen các tế bào blast cho kết quả âm tính. Hình 3.8 - 3.9 là ảnh nhuộm peroxidaza của bệnh nhân Doãn Hữu T và Nguyễn Hiền A mắc bạch cầu cấp thể L1, L2 cho thấy phản ứng peroxidaza âm tính với các tế bào blast dòng lympho không bắt màu vàng nâu và 1 số tế bào dòng tủy dương tính bắt màu vàng nâu trên tiêu bản. Hình 3.8. Ảnh nhuộm PER bệnh nhân Doãn Hữu T - Thể L1 Hình 3.9. Ảnh nhuộm PER bệnh nhân Nguyễn Hữu T- Thể L2 Hình 3.10 và hình 3.11 là ảnh nhuộm Sudan đen hạt mỡ của 2 bệnh nhân bạch cầu cấp thể L1 và L2 cho thấy các tế bào blast dòng lympho không bắt màu đen cho phản ứng Sudan B âm tính, trên tiêu bản còn có 1 vài tế bào dòng tủy dương tính, bắt màu đen. Hình 3.10. Ảnh nhuộm SD bệnh nhân Doãn Hữu T - Thể L1 Hình 3.11. Ảnh nhuộm SD bệnh nhân Nguyễn Hữu T - Thể L2 b) Đánh giá mức độ phù hợp phân loại thể bệnh bạch cầu cấp dòng lympho bằng bộ kít nhuộm đồng bộ HICYTEC so với kết quả chẩn đoán xác định của Viện Huyết học-Truyền máu trung ương Bảng 3.5. Kết quả phân loại thể bệnh bạch cầu cấp dòng tuỷ bằng bộ kít HICYTEC và kết chẩn đoán xác định của Viện Huyết học-Truyền máu trung ương trên từng bệnh nhân TT Mã BN Họ và tên Năm sinh Ngày XN Kết luận của viện HH-TM TW Kết luận thể bệnh sử dụng kit HICYTEC 15010165 Nguyễn Thị L. 1949 30/04/2015 L2 L2 15013692 Dương Ngọc L. 2013 28/05/2015 L2 L2 15013057 Nguyễn Sơn H. 2013 22/05/2015 L2 L2 15012072 Nguyễn Mạnh D. 2007 14/05/2015 L2 L2 14034835 Lưu Kế X. 1954 01/10/2014 L2 L2 15011022 Nguyễn Thị Đ. 1936 11/05/2015 L2 L2 15011378 Vũ Trung T. 2010 11/05/2015 L2 L2 15010693 Vũ Thị Đ. 1947 13/05/2015 L2 L2