Luận văn Ứng dụng phương pháp PCR (polymerase chain reaction) và phương pháp nuôi cấy để khảo sát sự nhiễm vi sinh vật gây bệnh trong thực phẩm đường phố

gen đặc trưng của vi sinh vật qua quá trình lai. Cơ sở của sự lai phân tử là sự tách rời hai mạch đơn của chuỗi xoắn kép DNA khi nhiệt độ môi trường vượt quá nhiệt độ nóng chảy (Tm ) và sự tái bắt cặp trở lại giữa hai mạch khi nhiệt độ được giảm từ từ. Một trong hai mạch DNA bổ sung (thường là DNA mục tiêu) được cố định trên một giá thể rắn hoặc nằm ngay trên tế bào hay mô. Sự tái bắt cặp chỉ xảy ra giữa hai trình tự hoàn toàn bổ sung. Các trình tự bổ sung có thể là DNA hay RNA, dẫn đến sự hình thành các phân tử lai DNA-DNA hay DNA-RNA [10]. Quá trình lai phân tử chịu ảnh hưởng rất nhiều bởi các yếu tố: nồng độ DNA trong môi trường, nhiệt độ và thời gian phản ứng, kích thước các trình tự lai và lực ion của môi trường. 1.3.2.4. Phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction) Phương pháp PCR là một phương pháp in vitro để tổng hợp DNA dựa trên khuôn là một trình tự đích DNA ban đầu, khuếch đại, nhân số lượng bản sao của khuôn này thành hàng triệu bản sao nhờ hoạt động của enzyme DNA polymerase và một cặp mồi (primer) đặc hiệu cho đoạn DNA đó [8], [11]. Kỹ thuật này do Karl Mullis và cộng sự (Mỹ) phát minh vào năm 1985. Hiện nay, kỹ thuật PCR được sử dụng rộng rãi để phát hiện, chuẩn đoán bệnh, phát hiện các vi sinh vật có trong thực phẩm. Phương pháp này dựa trên nguyên tắc là: tất cả các DNA polymerase đều cần những mồi chuyên biệt để tổng hợp một mạch DNA mới từ khuôn. Mạch khuôn thường là một trình tự DNA của gen (gọi là trình tự DNA mục tiêu) đặc trưng cho loài vi sinh vật mục tiêu hoặc là gen quy định việc tổng hợp một loại độc tố chuyên biệt của vi sinh vật này. Mồi là những đoạn DNA ngắn, có khả năng bắt cặp bổ sung với một đầu của mạch khuôn. Nhờ hoạt động của DNA polymerase đoạn mồi này được nối dài để hình thành mạch mới có trình tự bổ sung ngược chiều với mạch khuôn. Nếu có hai mồi chuyên biệt bắt cặp bổ sung ở hai đầu của một trình tự DNA, ở điều kiện đảm bảo hoạt động của DNA polymerase trong phản ứng PCR, số lượng bản sao của đoạn DNA nằm giữa hai mồi sẽ được nhân lên (khuếch đại) đến mức có thể thấy được vạch của DNA sau khi nhuộm bằng Ethidium bromide [3], [7], [8]. Để khuếch đại một trình tự DNA xác định, cần phải có những thông tin tối thiểu về trình tự của DNA, đặc biệt là trình tự base ở hai đầu đoạn DNA đủ để tạo được cặp mồi chuyên biệt. Cặp mồi này gồm một mồi xuôi (sense primer) và một mồi ngược (antisense primer) so với chiều phiên mã của gen. Ngoài các phương pháp không truyền thống trên, hiện nay còn sử dụng một số phương pháp thử nhanh khác như: + Kỹ thuật phân tách và tăng mật độ: nhằm tách các tế bào vi sinh vật mục tiêu với các tế bào vi sinh vật khác, bằng cách sử dụng những hạt có từ tính cao được bao bọc bên ngoài bởi những kháng thể của vi sinh vật mục tiêu [8], [17]. Các hạt này giúp hấp phụ chọn lọc các vi sinh vật mục tiêu và giữ chúng lại trênbờ mặt các hạt từ và tách chúng ra khỏi các quần thể vi sinh vật khác [8], [12]. + Kỹ thuật màng Petri (Petrifilm): kỹ thuật này đã được dùng trong các ứng dụng kiểm tra tổng vi khuẩn hiếu khí, số coliform, nấm mốc, nấm men. Ưu điểm của kỹ thuật này là dễ thao tác, tiết kiệm không gian ủ và bảo quản, thời hạn sử dụng lâu và không cần hấp khử trùng môi trường [8]. + Kỹ thuật độ dẫn điện, trở kháng (Conductance/ impedance): kỹ thuật này nhằm phát hiện và định lượng nhanh vi sinh vật dựa trên sự tăng độ dẫn điện của môi trường do sản phẩm trao đổi chất có tính ion được tiết vào môi trường bởi vi sinh vật. Môi trường nuôi cấy chọn lọc có tác dụng như dung dịch điện phân. Sự thay đổi về độ dẫn điện được ghi nhận bởi các thiết bị đo, nhờ vậy giúp phát hiện các vi sinh vật trong môi trường nuôi cấy [8], [24]. 1.3.3. Ưu điểm và nhược điểm của các phương pháp - Phương pháp truyền thống để phát hiện vi sinh vật gây bệnh được xem là phương pháp chuẩn và đang được sử dụng phổ biến trong các phòng thí nghiệm và các trung tâm phân tích. Tuy nhiên, việc phát hiện bằng phương pháp này tốn nhiều thời gian (5 - 7 ngày), tốn kém và mất nhiều công sức [8]. - Phương pháp ELISA có ưu điểm và độ nhạy cao, nhưng độ đặc hiệu lại thấp, do có thể hình thành các phản ứng chéo không đặc hiệu giữa các chủng khác nhau, phương pháp này đòi hỏi độ tinh sạch của mẫu cao nhằm tránh sự ức chế bởi các protein trong thực phẩm. Mặt khác, mẫu cần nguyên vẹn, không bị biến tính để tránh trường hợp cho kết quả âm tính giả [58]. - Phương pháp lai phân tử và phương pháp PCR đang được ứng dụng nhiều nhất hiện nay. Phương pháp lai dùng mẫu dò không đánh dấu bằng phóng xạ (được khuyến cáo sử dụng) chỉ phát hiện được vi sinh vật ở mức 106 - 108 tế bào/g mẫu. Trong khi đó, thông thường độ nhạy của phản ứng PCR có thể là 1 - 10 tế bào/g mẫu [23], [68]. Nhìn chung, so với các phương pháp hiện đại đã đề cập trên, phương pháp PCR có một số ưu điểm sau: + Thời gian cho kết quả nhanh: phương pháp PCR có thể phát hiện vi sinh vật trong mẫu thực phẩm trong khoảng 1 - 2 ngày, trong khi đó, phương pháp nuôi cấy truyền thống là 5 - 7 ngày [8]. + Thao tác đơn giản, có thể phân tích những vi sinh vật khó nuôi cấy, việc nuôi cấy tăng sinh đơn giản không cần qua giai đoạn tăng sinh chọn lọc. + Hoá chất cần cho phản ứng PCR dễ tìm, dễ bảo quản. Không sử dụng nhiều môi trường nuôi cấy phức tạp như phương pháp nuôi cấy [4]. + Độ nhạy và độ đặc hiệu của phương pháp PCR cao do nguyên tắc phát hiện dựa trên kiểu gen chuyên biệt của từng vi sinh vật đích [7]. Hiện nay, phòng thí nghiệm sinh học phân tử Trường Đại học Khoa học tự nhiên ĐHQG TP. HCM đã chuyển giao các quy trình và bộ kit PCR xét nghiệm các vi sinh vật gây bệnh trong thực phẩm với giá 30.000 VND, với giá thành này có thể cạnh tranh với các phương pháp khác [57]. Chính vì những ưu điểm trên mà phương pháp PCR đang ngày càng được sử dụng rộng rãi trong các xét nghiệm vi sinh. 1.4. Tình hình ứng dụng kỹ thuật PCR vào việc kiểm tra các vi sinh vật gây bệnh trong thực phẩm trên thế giới và tại Việt Nam 1.4.1. Lịch sử ra đời kỹ thuật PCR Phương pháp PCR được Kary Mullis người Mỹ phát minh vào năm 1985 và được thừa nhận chính thức từ năm 1993, ông đã đoạt giải Nobel về Hóa học vào tháng 10 năm 1993 cho thành tựu này, chỉ sau 7 năm khi ông đưa ra ý tưởng. Ý kiến của Mullis phát triển và đã được sử dụng tại nhiều nước trên toàn thế giới, trong nhiều lĩnh vực [57], chẳng hạn: + Vân tay di truyền [54] + Kiểm tra huyết thống [55] + Chẩn đoán bệnh di truyền [57] + Tách dòng gene [60] + Gây đột biến điểm [54] + Phân tích mẫu DNA cổ [67] + Xác định kiểu gene của các đột biến [62] + Kiểm tra sự hiện diện của các vi sinh vật [70] + So sánh mức độ biểu hiện của gene [65],… 1.4.2. Tình hình ứng dụng kỹ thuật PCR trên thế giới Từ khi ra đời vào năm 1985, trên thế giới đã có rất nhiều ứng dụng kỹ thuật PCR trong phân tích sinh học và ngày càng được sử dụng trong nhiều lĩnh vực và đã đạt được một số thành tựu nổi bật: Một trong những nghiên cứu thành công đầu tiên là do Eisenach, Sifford , Cave và cộng sự, 1991 sử dụng kỹ thuật PCR trong chẩn đoán bệnh lao trực tiếp từ dịch đờm của bệnh nhân lao phổi, đã phân biệt được trực khuẩn lao với các Mycobacterium không lao khác bằng cách sử dụng đoạn trình tự IS 6110 [63]. Ứng dụng nổi bật khác là do Berenguer, Moreno và cộng sự đã sử dụng kỹ thuật PCR trong chẩn đoán lao màng não [66]. Kỹ thuật PCR còn được sử dụng trong chẩn đoán trực khuẩn lao kháng thuốc INH do thiếu gen catalase (gen Kat G) do Zhang và cộng sự, 1993 [73]. Một thành tựu khác là ứng dụng kỹ thuật PCR trong chẩn đoán sự hiện diện của vi khuẩn Whipple (TW) gây ra bệnh đường ruột và có thể làm tổn thương hệ thần kinh trung ương. Vi khuẩn TW không nuôi cấy được, cũng không chẩn đoán huyết thanh được. Nhờ kỹ thuật PCR đã giúp chẩn đoán dễ dàng vi khuẩn Tropheryma whippelii. Qua các nghiên cứu cho thấy kỹ thuật PCR có độ nhạy là 83,5%, độ đặc hiệu là 99% [71]. Trên đây chỉ là một vài thành tựu điển hình, hiện nay kỹ thuật PCR đã và đang phát triển mạnh mẽ trong nhiều lĩnh vực, đặc biệt là trong lĩnh vực y học. 1.4.3. Tình hình ứng dụng kỹ thuật PCR ở Việt Nam Năm 1988, GS. Lê Đình Lương (Trung tâm Công nghệ Sinh học - ĐH Quốc gia Hà Nội) là người đầu tiên của Việt Nam mua một chiếc máy PCR. Đến nay, kỹ thuật PCR đã trở thành một công cụ hữu hiệu trong chẩn đoán bệnh, trong việc xác định di truyền, xét nghiệm để phát hiện các vi sinh vật có hại trong thực phẩm, thủy sản,… [56], với chi phí thấp hơn hẳn so với việc sử dụng các phương pháp khác. Hiện nay, việc ứng dụng kỹ thuật PCR ở nước ta đã đem lại nhiều hiệu quả cao [72]. Sau đây là một số ứng dụng kỹ thuật PCR tiêu biểu, ứng dụng kỹ thuật PCR trong: - Chẩn đoán viêm gan siêu vi B và viêm gan siêu vi C của ĐH Y Dược TP. HCM, với giá mỗi lần xét nghiệm chỉ từ 150.000 - 300.000 đồng và chỉ mất 4 giờ; trước kia phải tốn 100 USD, với thời gian là 1 tháng [57]. - Phát hiện nhanh nhóm vi khuẩn gây bệnh trong dịch não tủy của người, trước kia việc xét nghiệm (theo phương pháp nuôi cấy) phải mất từ 12 đến 24 giờ, thì nay, chỉ cần chạy PCR với một lượng nhỏ mẫu dịch não, trong vòng 6 giờ đã có kết quả [57]. - Trong xét nghiệm quan hệ huyết thống tại Trung tâm Công nghệ Sinh học ĐHQG Hà Nội, chi phí cho một lần xét nghiệm, giá khoảng 1 - 1,5 triệu đồng. So với việc xét nghiệm quan hệ huyết thống ở nước ngoài, giá thành cho một lần xét nghiệm giảm hơn 30% (giá một xét nghiệm huyết thống tại Mỹ là 250 - 500 USD) [57]. - Không những thế, kỹ thuật PCR còn là một công cụ xét nghiệm hữu hiệu và quen thuộc của nhiều nông dân nuôi tôm ở Sóc Trăng [57]. - Trong đề tài “Nghiên cứu khoa học và phát triển công nghệ sinh học”, Mã số KC.04. và ELISA, GS.TS. Nguyễn Thị Kê (Viện vệ sinh y tế công cộng TP. HCM) đã ứng dụng kỹ thuật PCR trong xác định nhanh nguyên nhân gây ngộ độc thực phẩm do vi sinh vật (Salmonella, E. coli, Staphylococ- -cus aureus,...) chỉ trong vài giờ [31]. - Tại phòng thí nghiệm sinh học phân tử Trường Đại học Khoa học Tự Nhiên, ĐHQG TP.HCM, đã tiến hành nghiên cứu và xây dựng quy trình (bộ kit) phát hiện vi sinh vật gây bệnh trong thực phẩm bằng kỹ thuật PCR nhằm phục vụ cho nhu cầu cấp bách hiện nay. Và đã ứng dụng bộ kit để kiểm tra sự hiện diện của vi sinh vật gây bệnh trong thực phẩm. Qua đó phần nào khẳng định sử dụng phương pháp PCR để khảo sát sự nhiễm vi sinh vật trong thực phẩm là khoa học và đáng tin cậy. Trong lĩnh vực thực phẩm đường phố cũng đã có ứng dụng, khảo sát, tuy nhiên chưa nhiều và đầy đủ. Trong đề tài Luận văn thạc sỹ Y tế công cộng, Đại học Y tế Công Cộng. Kiều Mai Phương, 1998, đã “Khảo sát thực trạng ô nhiễm vi khuẩn trong thức ăn đường phố tại các cửa hàng ăn dọc quốc lộ 1a thuộc huyện Tiên sơn, Bắc Ninh”. Với tình hình ngộ độc thực phẩm do thức ăn đường phố ở nước ta hiện nay thì cần khảo sát và đưa ra những kết luận về tình hình vệ sinh an toàn thực phẩm đường phố là vấn đề rất cần thiết và đang được sự quan tâm của toàn xã hội. Trong luận văn này, chúng tôi ứng dụng những quy trình, bộ kit PCR dựa trên kết quả các công trình xây dựng quy trình PCR đã công bố trên thế giới, trong nước và phương pháp nuôi cấy để khảo sát sự hiện diện của các vi sinh vật gây bệnh trong nhóm thực phẩm đường phố bao gồm các nhóm: kem, sữa và nước giải khát trên địa bàn TP. HCM. Từ đó đưa ra kết luận về tình hình vệ sinh an toàn thực phẩm đường phố trên địa bàn TP. HCM hiện nay so với tiêu chuẩn của Bộ Y tế (QĐ-BYT, 04/1998) đối với nhóm thực phẩm đường phố ở nước ta hiện nay. Chương 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Vật liệu 2.1.1. Dụng cụ và thiết bị - Máy dập mẫu Stomacher 400 Circulator (Seward, Anh). - Máy ly tâm lạnh Mikro (Hetlich Zentrifugen). - Tủ ấm. - Máy vortex. - Máy luân nhiệt Mastercycler Personal (Eppendorf, Đức). - Bộ điện di ngang Horizon 58 (Life technology). - Hộp soi đèn tử ngoại Hoefer (model no UVTM-19-23V). - Máy đo quang phổ UV-VIS UItrospec 2000. - Ống nghiệm. - Máy chụp hình gel IMAGEMATERS VDS (Amersham Pharmacia Biotech). 2.1.2. Hoá chất và môi trường 2.1.2.1. Hoá chất dùng cho phản ứng PCR + Đệm TE (10mM, Tris-HCl, 1mM EDTA): dùng cho quá trình tách chiết DNA khuôn cho phản ứng PCR. + PCR mix cho các chỉ tiêu: B. cereus, C. perfringens, E. coli, Salmonella, S. aureus và Taq polymerase được giữ trong đệm 50mM Tris-HCl (pH: 7,5); 0,1mM EDTA; 5mM DTT; 50% glycerol bảo quản ở -200C. 2.1.2.2. Hóa chất dùng cho điện di và xem kết quả + Agarose. + Đệm tải mẫu điện di (loading dye): 0,15% bromophenolblue, 30% glycerol, 200mM Tris, 20mM EDTA. + Đệm TAE 1X: 4,48g Tris; 2ml Na2EDTA 0,5M, pH: 8; 1,14ml glacial acid acetic; thêm nước cất để đủ 1000ml. + Ethidium Bromide (BET): 1mg/ml. + Thang DNA: được sử dụng để ước lượng kích thước của sản phẩm DNA được khuyếch đại bằng phản ứng PCR, do hãng Fermentas cung cấp, có số vạch và kích thước được minh họa ở hình 2.1. Hình 2.1. Thang DNA 100bp 2.1.2.3. Môi trường - Môi trường TSB (Tryptone Soya Broth): dùng để tăng sinh E. coli, S. aureus, Salmonella và B. cereus. - Môi trường Fluid Thioglycolate: dùng để tăng sinh C. perfringens. - Các môi trường nuôi cấy và thử nghiệm sinh hóa cho quá trình phân tích mẫu bằng phương pháp truyền thống được cung cấp bỡi Merck, chẳng hạn một số môi trường: Tryptic Soy Agar (TSA), Brilliant Green Bile Lactose (BGBL), EMB Agar, Baird Parker Agar (BPA), Rappaport Vassiliadis (RV), Xylose Lysine Desoxycholate (XLD), Simmon Citrate Agar, Brain Heart Infusion (BHI), Kligler Iron Agar (KIA), Urea Broth, Mannitoll phenol red broth, Lysine decarboxylase broth (LDC), EC Broth, MR-VP Broth, Triple Sugar Iron Agar (TSI). 2.1.3. Nguyên vật liệu 2.1.3.1. Các chủng vi sinh vật Các chủng Salmonella, E. coli, C. perfringens, S. aureus và B. cereus đã sử dụng được cung cấp bởi: Viện Vệ sinh Y tế công cộng, Viện Pasteur TP.HCM và Viện Công nghệ Hoàng gia Melbourne RMIT-Úc. 2.1.3.2. Mẫu thực phẩm Các mẫu thực phẩm thuộc nhóm: sữa, kem, nước giải khát được mua tại các quán ăn trên lề đường, trước các trường học; công viên; tại các Quận: 3, 5, 8, 10 và quận Tân Bình trên địa bàn TP. HCM. 2.2. Phương pháp nghiên cứu 2.2.1. Nguyên tắc phát hiện các vi sinh vật gây bệnh trong thực phẩm bằng kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction) PCR là một phản ứng tổng hợp dây chuyền được dùng để khuyếch đại một trình tự DNA đích dựa trên sự bắt cặp đặc hiệu giữa mồi với DNA mạch khuôn và hoạt tính kéo dài cuả enzyme polymerase. Phản ứng PCR gồm nhiều chu kỳ, mỗi chu kỳ gồm 3 bước tương ứng với sự thay đổi nhiệt độ trong phản ứng, theo đó, số lượng bản sao DNA ngày càng tăng. Quá trình này được minh họa ở Hình 2.2 và Hình 2. 3 [57]. Hình 2.2. Các bước của phản ứng PCR Hình 2.3. Số bản sao DNA tăng theo từng chu kỳ trong phản ứng PCR - Bước 1: (biến tính, denaturation): tách rời 2 mạch đơn của phân tử DNA được thực hiện ở nhiệt độ cao (cao hơn Tm của DNA) để hai mạch DNA bị biến tính và tách thành hai mạch đơn. Nhiệt độ phản ứng khoảng 94oC - 95oC, trong vòng 30 - 60 giây [8, 10]. - Bước 2: (bắt cặp, annealing): các cặp mồi bắt cặp với DNA mạch khuôn tại những vị trí chuyên biệt, trong bước này, nhiệt độ hạ thấp hơn Tm của các mồi, cho phép các mồi bắt cặp với mạch khuôn. Nhiệt độ phản ứng dao động khoảng 40oC - 70oC, tùy thuộc vào Tm của các mồi sử dụng và kéo dài từ 30 - 60 giây [10]. - Bước 3: (kéo dài, elongation): dưới tác động của DNA polymerase, các nucleotide lần lượt gắn vào mồi theo nguyên tắc bổ sung với mạch khuôn. Mạch mới được tạo thành từ mồi được nối dài. Nhiệt độ phản ứng khoảng 72oC (ở nhiệt độ này DNA polymerase tổng hợp tốt nhất), thời gian của bước này tùy thuộc vào độ dài của trình tự DNA cần khuếch đại, thường kéo dài từ 30 giây đến nhiều phút [10]. Trong phản ứng PCR, một chu kỳ gồm ba bước trên sẽ được lặp đi lặp lại nhiều lần. Mỗi chu kỳ làm tăng gấp đôi số lượng bản sao. Đây là sự khuếch đại theo cấp số nhân. Sau 30 - 40 chu kỳ, sự khuếch đại sẽ cho ra khoảng 106 bản sao so với số lượng mẫu ban đầu. Sau phản ứng PCR, người ta phát hiện sự có mặt của các trình tự DNA đặc trưng thông qua sự xuất hiện các sản phẩm khuyếch đại sau phản ứng PCR bằng phương pháp điện di DNA trên gel và ngâm trong dung dịch Ethidium bromide. Vạch DNA mục tiêu được phát hiện bằng cách soi, quan sát dưới tia UV ở bước sóng phù hợp. 2.2.2. Quy trình phân tích mẫu bằng kỹ thuật PCR và phương pháp truyền thống 2.2.2.1. Qui trình phân tích mẫu bằng kỹ thuật PCR a. Kiểm Salmonella - Đồng nhất 25g mẫu trong 225ml môi trường tăng sinh (TSB hoặc BPW), ủ 37oC từ 18 - 22 giờ. - Hút 1ml dịch tăng sinh vào eppendorf, xử lý mẫu và chạy PCR. Kết quả: + Mẫu không đạt tiêu chuẩn khi kết quả PCR dương tính. + Mẫu đạt tiêu chuẩn khi kết quả PCR âm tính. b. Kiểm E. coli - Không pha loãng hoặc pha loãng 25g mẫu. - Hút 0,99ml dịch đồng nhất cho vào 9ml môi trường tăng sinh, ủ 37oC, tăng sinh sau 18 - 22 giờ. - Hút dịch tăng sinh sau 18 - 22 giờ vào 2 eppendorf (1ml/ 1 eppendorf), xử lý mẫu, chạy PCR. Kết quả: + Mẫu không đạt tiêu chuẩn khi PCR cho kết quả dương tính. + Mẫu đạt tiêu chuẩn khi PCR cho kết quả âm tính. c. Kiểm S. aureus, B. cereus - Hút 0,99ml dịch đồng nhất cho vào 9ml môi trường tăng sinh, ủ 37oC, tăng sinh sau 18 - 22 giờ. - Hút dịch tăng sinh sau 18 - 22 giờ vào 2 eppendorf (1ml/ 1 eppendorf), xử lý mẫu, chạy PCR. Kết quả: + Mẫu không đạt tiêu chuẩn khi PCR cho kết quả dương tính. + Mẫu đạt tiêu chuẩn khi PCR cho kết quả âm tính. d. Kiểm C. Perfringens - Hút 0,99ml dịch đồng nhất cho vào 9ml môi trường tăng sinh, ủ 37oC, tăng sinh sau 18 - 22 giờ. - Hút dịch tăng sinh sau 18 - 22 giờ vào 2 eppendorf (1ml/ 1 eppendorf), xử lý mẫu, chạy PCR. Kết quả: + Mẫu không đạt tiêu chuẩn khi PCR cho kết quả dương tính. + Mẫu đạt tiêu chuẩn khi PCR cho kết quả âm tính. 2.2.2.2. Quy trình phân tích mẫu bằng phương pháp truyền thống a. Kiểm Salmonella: theo TCVN 4829:2001 - Đồng nhất 25g mẫu trong 225ml môi trường tăng sinh, ủ 37oC từ 18 - 22 giờ. Chuyển sang môi trường RV, ủ 42oC/24 giờ và Selenite, ủ 37oC/24 giờ. - Ria cấy trên môi trường XLD, ủ 37oC/24 giờ. - Thử tính chất sinh hóa - Thử ngưng kết kháng huyết thanh. - Tính kết quả dựa theo số khuẩn lạc có đúng tính chất sinh hóa. b. Kiểm E. coli: theo TCVN 5155:90 - Pha loãng mẫu (không pha loãng). Hút 0,2ml dung dịch mẫu, cấy láng trên bề mặt thạch môi trường EMB. - Đếm những khuẩn lạc E. coli điển hình. Chọn 5 khuẩn lạc điển hình thử tính chất sinh hóa. - Tính kết quả dựa theo số khuẩn lạc có đúng tính chất sinh hóa. c. Kiểm S. aureus: theo TCVN 5156:1990 - Pha loãng mẫu hoặc không pha loãng. Hút 0,2ml dung dịch mẫu, cấy láng trên bề mặt thạch Chapman. - Đếm những khuẩn lạc S. aureus điển hình. Chọn 5 khuẩn lạc điển hình thử tính chất sinh hóa. - Tính kết quả dựa theo số khuẩn lạc có đúng tính chất sinh hóa như trên. d. Kiểm B. cereus: theo AOAC 2000 (980.31) - Pha loãng mẫu hoặc không pha loãng. Hút 0,2ml dung dịch mẫu, cấy láng trên bề mặt thạch MYP. - Đếm những khuẩn lạc B. cereus điển hình. Chọn 5 khuẩn lạc điển hình thử tính chất sinh hóa. - Tính kết quả dựa theo số khuẩn lạc có đúng tính chất sinh hóa như trên. e. Kiểm C. perfringens: theo QĐ 3348/QĐ-BYT ngày 31/7/2001 của Bộ Y tế - Pha loãng mẫu hoặc không pha loãng. Hút 1ml dung dịch mẫu, cấy sâu vào 2 ống môi trường TSN. - Đếm những khuẩn lạc C. perfringens điển hình. Chọn vài khuẩn lạc điển hình thử tính chất sinh hóa. - Tính kết quả dựa theo số khuẩn lạc có đúng tính chất sinh hóa như trên. 2.2.3. Ứng dụng phương pháp nuôi cấy và quy trình, bộ kit PCR để khảo sát sự nhiễm vi sinh vật gây bệnh trong thực phẩm đường phố trên địa bàn TP. HCM 2.2.3.1. Mục tiêu Ứng dụng quy trình và bộ kit PCR để phân tích nhanh các nguyên nhân gây ngộ độc trong nhóm thực phẩm đường phố tại địa bàn TP.HCM và so sánh với kết quả theo phương pháp nuôi cấy. Từ đó nhận định khả năng ứng dụng các quy trình, bộ kit PCR để kiểm tra và giám sát an toàn vệ sinh thực phẩm, mặt khác qua đó thấy được tình hình nhiễm vi sinh vật gây bệnh trong các mẫu thực phẩm đường phố trên địa bàn TP. HCM so với tiêu chuẩn của Bộ Y tế. - Đơn vị hợp tác: Viện Vệ sinh y tế công cộng TP. HCM. - Loại mẫu: Nhóm thực phẩm đường phố gồm: nhóm sữa, nước giải khát và kem . - Số lượng mẫu: 77 mẫu. - Địa điểm lấy mẫu: Mẫu được lấy từ các quầy bán thức ăn trên vỉa hè, trước các chợ, công viên, trường học, tại các quận: Q. 3, Q. 5, Q. 8, Q. 10 và quận Tân Bình. 2.2.3.2. Tiêu chuẩn phân tích Các mẫu được phân tích bằng phương pháp PCR và nuôi cấy theo tiêu chuẩn của Bộ Y tế (QĐ867/98) đối với các chỉ tiêu vi sinh phân tích được chọn của đề tài (E. coli, Salmonella, S. aureus, B. cereus và C. perfringens) tương ứng với nhóm thực phẩm (sữa, nước giải khát và kem) được thể hiện ở Bảng 2.1, Bảng 2.2 và Bảng 2.3 [2]. Bảng 2.1. Chỉ tiêu phân tích vi sinh của Bộ Y tế đối với nhóm sữa STT Vi sinh vật kiểm tra Mức độ tối đa cho phép (CFU/g) 1 E. coli/g 3 2 S. aureus/g 0 3 B. cereus/g 0 4 Salmonella/25g 0 Bảng 2.2 Chỉ tiêu phân tích vi sinh của Bộ Y tế đối với các loại nước giải khát STT Vi sinh vật kiểm tra Mức độ tối đa cho phép (CFU/g) 1 E. coli/g 0 2 S. aureus/g 0 3 C. perfringens/g 0 Bảng 2.3. Chỉ tiêu phân tích vi sinh của Bộ Y tế đối với nhóm kem STT Vi sinh vật kiểm tra Mức độ tối đa cho phép (CFU/g) 1 E. coli/g 0 2 S. aureus/g 10 3 C. perfringens/g 10 4 Salmonella/25g 0 2.2.3.3. Địa điểm thực hiện Phân tích các chỉ tiêu vi sinh vật bằng kỹ thuật PCR và bằng phương pháp nuôi cấy được thực hiện tại phòng Thí nghiệm Công Nghệ Sinh học Phân tử Trường ĐHKHTN, ĐHQG, TP. HCM và phòng Vi sinh Thực phẩm - Viện Vệ sinh y tế Công Cộng, TP. HCM. 2.2.3.4. Quy trình kiểm nghiệm * Quy trình phân tích mẫu bằng kỹ thuật PCR Các quy trình PCR xét nghiệm vi sinh gây ngộ độc dùng trong nghiên cứu này được xây dựng trên cơ sở định tính sự hiện diện của vi sinh gây ngộ độc trong thực phẩm (0CFU/g hay 0CFU/25g). Tuy nhiên, một số chỉ tiêu vi sinh như E. coli, Staphylococcus aureus, Bacillus cereus, Clostridium perfringens ở một số thực phẩm đường phố lại được phép hiện diện ở một mật độ nhất định trong thực phẩm (thường trong khoảng 3 - 10CFU/g). Trong trường hợp này, các quy trình PCR định tính cũng được áp dụng để xét nghiệm mẫu có đạt hay không bằng cách thêm một bước pha loãng mẫu sau khi được đồng nhất thành một độ pha loãng tương ứng với mật độ cho phép trước khi thực hiện bước ủ tăng sinh (ví dụ pha loãng 3 lần nếu mật độ cho phép là 3CFU/g hoặc pha loãng 10 lần nếu mật độ cho phép là 10CFU/g). Quy trình xét nghiệm định tính và xét nghiệm định lượng chỉ khác nhau ở bước đồng nhất mẫu và pha loãng trước khi tăng sinh. Các bước còn lại của hai quy trình xét nghiệm này là như nhau. Quy trình xét nghiệm này bao gồm 5 bước: a. Bước 1: Đồng nhất mẫu, pha loãng và tăng sinh * Chỉ tiêu E. coli (0CFU/g hoặc cho phép 3CFU/g tùy loại thực phẩm) - Đồng nhất 25g mẫu trong 225ml môi trường tăng sinh TSB. - Pha loãng và tăng sinh tùy theo từng chỉ tiêu cụ thể như sau: + Đối với chỉ tiêu 0CFU/g (nhóm nước giải khát và kem) Hút 10ml dịch đồng nhất (tương đương 1g mẫu) để tăng sinh ở 37oC trong 18 - 22 giờ trước khi thực hiện phản ứng PCR. Nếu phản ứng PCR dương tính thì kết luận mẫu chứa E. coli ít nhất 1CFU/g  mẫu không đạt. + Đối với chỉ tiêu 3CFU/g (nhóm sữa) Hút 10ml dịch đồng nhất (tương đương 1g mẫu) pha loãng 3 lần bằng cách trộn với 20ml môi trường TSB. Nếu mẫu chứa 3CFU/g thì 30ml dịch pha loãng này chứa 3CFU hay 1CFU/10ml. Hút 9,9ml dịch pha loãng để tăng sinh ở 37oC trong 18 - 22 giờ trước khi thực hiện phản ứng PCR. Nếu phản ứng PCR dương tính thì kết luận mẫu chứa trên 3CFU/g  mẫu không đạt. * Chỉ tiêu Staphylococcus aureus (không cho phép hoặc cho phép 10 CFU/g tùy loại thực phẩm) - Đồng nhất 25g mẫu trong 225ml môi trường tăng sinh TSB. - Pha loãng và tăng sinh theo từng chỉ tiêu cụ thể như sau: + Đối với chỉ tiêu 0CFU/g (nhóm sữa và nước giải khát) Hút 10ml dịch đồng nhất (tương đương 1g mẫu) để tăng sinh ở 37oC trong 18 - 22 giờ trước khi thực hiện phản ứng PCR. Nếu phản ứng PCR dương tính thì kết luận mẫu chứa S. aureus ít nhất 1CFU/g  mẫu không đạt. + Đối với chỉ tiêu 10CFU/g (nhóm kem) Hút 10ml dịch đồng nhất (tương đương 1g mẫu) pha loãng 10 lần bằng cách trộn với 90ml môi trường TSB. Nếu mẫu chứa 10CFU/g thì 100ml dịch pha loãng này chứa 10CFU hay 1CFU/10ml. Hút 9,9ml dịch pha loãng để tăng sinh ở 37oC trong 18 - 22 giờ trước khi thực hiện phản ứng PCR. Nếu phản ứng PCR dương tính thì kết luận mẫu chứa S. aureus trên 10CFU/g  mẫu không đạt. * Chỉ tiêu Bacillus cereus (không cho phép ở cả 3 n