Luận văn Về nghiên cứu đa dạng di truyền nguồn gen bông cỏ (Gossypium arboreum L.) phục vụ lập bản đồ gen kháng bệnh xanh lùn

uyền (có hệ số tương đồng 0,48) chủ yếu là những cặp bông luồi-bông hải đảo. Đa dạng di truyền quan sát được trong nhóm các giống bông luồi cao hơn so với hai nhóm bông hải đảo và bông cỏ. Cũng trong nghiên cứu này, 49 giống bông nghiên cứu đã chia làm 3 nhóm: nhóm 1 gồm 16 giống bông hải đảo, nhóm 2 gồm 21 giống bông luồi, nhóm 3 gồm 12 giống bông cỏ. Hệ số tương đồng di truyền của nhóm 1 với 2 nhóm bông còn lại thấp, chỉ khoảng 0,59. Nhóm bông luồi và bông cỏ gần nhau về mặt di truyền hơn, với độ tương đồng di truyền khoảng 0,67. Hệ số tương đồng di truyền giữa các giống bông trong cùng nhóm phân loại khá cao, trên 0,84. 23 1.5. NGHIÊN CỨU DI TRUYỀN TÍNH KHÁNG BỆNH XANH LÙN Hiện nay, cơ chế kháng bệnh xanh lùn ở bông vẫn chưa được làm sáng tỏ. Có nhiều giống tỏ ra kháng bệnh được cho là do có nhiều đặc điểm không được rệp ưa thích (Stephen J. Allen, 2006). Đó là các đặc điểm hình thái liên quan đến màu sắc cây, có lông tơ, có thân cứng hoặc các đặc điểm hóa sinh như có thành phần gossypol, có lớp hóa chất bao phủ (Krisnamoorthy, 2005). Cây có màu đỏ được nhận thấy có liên quan đến tính kháng rệp (El zik & Thaxton, 1989). Những kiểu gen có biểu hiện tính kháng rệp thường có hàm lượng protein, phenol và axit nucleic cao, lượng dầu và lưu huỳnh thấp (Alimukhamedov, Shvetsova, 1988). Những hiểu biết về kiểu di truyền tính kháng bệnh xanh lùn đóng vai trò quan trọng trong công tác lập bản đồ di truyền và sử dụng chỉ thị phân tử trong chọn giống kháng bệnh xanh lùn ở cây bông vải. Nghiên cứu đầu tiên về di truyền tính kháng bệnh xanh lùn được tiến hành trên giống bông G155-7 có nguồn gốc lai 3 dòng (HAR) (Gossypium hirsutum/ G. arboreum/ G. raimondii) và đã xác định được một gen trội kiểm soát tính kháng ở giống này. Nghiên cứu không xác định được nguồn gen kháng có từ bông cỏ châu Á G. arboreum hay từ bông dại D. raimondii. Cho đến gần đây, công trình của các tác giả Brazil (Junior & cs., 2008) đã xác định được tính kháng bệnh xanh lùn ở hai giống bông luồi tứ bội G. hirsutum L. CD401 và Delta Opal là tính trạng đơn gen di truyền trội khi phân tích sự phân ly di truyền các cá thể của quần thể F2, BC1F1, BC1F1, F2:3 với phương pháp đánh giá bệnh nhờ lây nhiễm bằng truyền bệnh qua rệp mang mầm bệnh xanh lùn. Theo như công bố, đây là công trình đầu tiên báo cáo về di truyền tính kháng bệnh xanh lùn ở cây bông vải. Nhóm tác giả đặt tên cho gen kháng bệnh xanh lùn này là Rghv1. Tuy nhiên, nghiên cứu chưa xác định được di truyền tính kháng bệnh xanh lùn ở hai giống bông này là do cùng một gen trội quy định hay là hai gen khác biệt. Những nghiên cứu tiếp theo để xác định các gen kháng này đang được tiến hành. Gần đây nhất, báo cáo đầu tiên về lập bản đồ gen kháng bệnh xanh lùn ở giống bông luồi tứ bội Delta Opal của Fang và cộng sự (2009) đã được tiến hành 24 dựa trên 364 cá thể thuộc họ F2.3 của ba quần thể được phát triển từ giống Delta Opal mà mang gen kháng trước đó, sử dụng phương pháp phân ly nhóm. Locus đơn gen kháng trội được định vị tại vùng telomere trên nhiễm sắc thể số 10, với 3 chỉ thị SNP được thiết kế liên kết với gen kháng ở khoảng cách từ 0.05 đến 5.4 cM. Nhóm nghiên cứu đã đặt lại tên cho locus gen kháng trội này là Cbd. Nhóm tác giả đã sử dụng các chỉ thị liên kết với gen kháng này để khảo sát nguồn gen bông từ 25 nước khác nhau. Kết quả khảo sát alen tại locus này cho thấy phần lớn các nguồn gen có nguồn gốc từ các nước châu Phi, Nam Mỹ và Nam Á đều có alen kháng tại locus Cbd. Đa phần các nguồn gen bông có nguồn gốc từ Nam Mỹ, châu Âu, Úc và Trung Quốc đều mang alen nhiễm tại locus Cbd này. Ở nước ta, những nghiên cứu đánh giá của Viện nghiên cứu Bông và PTNN Nha Hố cho thấy, hiện nay các giống bông luồi đang trồng phổ biến ở Việt Nam đều nhiễm bệnh xanh lùn, các giống kháng của Châu Phi, Nam Mỹ và Thái Lan khi được khảo sát ở Nha Hố cũng đều nhiễm bệnh. Năm 2000, lần đầu tiên, trong quỹ gen cây bông hiện có của loài bông cỏ Châu Á (Gossypium arboreum L.), Viện nghiên cứu Bông và PTNN Nha Hố đã xác định được một số đầu dòng bông cỏ Nghệ An có khả năng kháng hoàn toàn đối với bệnh xanh lùn. Nghiên cứu đặc điểm di truyền tính kháng bệnh xanh lùn của các dòng bông cỏ Nghệ An bước đầu cho thấy tính kháng bệnh xanh lùn được quy định bởi đơn gen trội (Đặng Minh Tâm, 2006). Đây là nguồn gen kháng bệnh quý cần được đánh giá để khai thác sử dụng. Di truyền đơn gen trội cũng đã được xác định là kiểu di truyền đối với nhiều tính trạng khác ở cây bông vải: tính kháng bệnh nấm Colletotrichum gossypii var. cephalosporioides (Zandona & cs., 2006); tính kháng bệnh đốm góc lá do Xanthomonas axonopodis pv. malvacearum (Zandona & cs., 2005), Metha & Arias (2001) (Zandona & cs., 2005); tính kháng bệnh Stemphylium solani. 25 Chương 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU 2.1.1. Vật liệu thực vật 30 giống bông cỏ nhập nội và địa phương được chọn lọc từ nguồn gen có sẵn của Viện nghiên cứu Bông và PTNN Nha Hố và những giống này được thu thập từ các nước Việt Nam, Ấn Độ, Liên xô cũ (bảng 2.1). Bảng 2.1. Tên và nguồn gốc của 30 giống bông cỏ thu thập được TT MS TĐ Tên giống Nguồn gốc TT MS TĐ Tên Giống Nguồn gốc 1 2 Cỏ Thanh Hóa Việt Nam 16 77 91-B-16 Ấn độ 2 3 Hà Sơn Bình Việt Nam 17 78 91-B-36 Ấn độ 3 5 Cỏ Phú Khánh Việt Nam 18 79 BAA (bar x arb) Ấn độ 4 6 Cỏ Nghệ An Việt Nam 19 80 BAA (bar x arb) Ấn độ 5 7 Cỏ Bắc Ái Việt Nam 20 81 BAA (bar x arb) Ấn độ 6 15 AK-235 Ấn Độ 21 82 BAA (bar x arb) Ấn độ 7 18 Lục Ngạn Việt Nam 22 83 BAA (bar x arb) Ấn độ 8 34 B2III4 Ấn Độ 23 85 BAA (bar x arb) Ấn độ 9 35 B2IV10 Ấn Độ 24 86 BAA (bar x arb) Ấn độ 10 42 Akola Ấn Độ 25 87 BAA (bar x arb) Ấn độ 11 43 Tka 283 Ấn Độ 26 92 BAA (bar x arb) Ấn độ 12 44 Tka 188 Ấn Độ 27 93 BAA (bar x arb) Ấn độ 13 46 Ava Liên Xô 28 94 BAA (bar x arb) Ấn độ 14 75 B10 Ấn Độ 29 100 Không tên Ấn độ 15 76 91-L1-2 Ấn Độ 30 101 Không tên Ấn độ * Chú thích: MSTĐ – Mã số tập đoàn 26 2.1.2. Các cặp mồi SSR 50 cặp mồi SSR cho cây bông, bao gồm 6 nhóm mồi khác nhau: BNL (Brookhaven National Laboratory, 2007), MUCS (Mauricio Ulloa, 2005), MUSS (Mauricio Ulloa, 2005), NAU (Nanjing Agricultural University, 2007), STV (Taliercio E, Scheffler J. 2006), TM (John Yu, 2002) (Bảng 2.2, phụ lục 1). Bảng 2.2. Các nhóm mồi SSR sử dụng trong nghiên cứu TT Nhóm mồi Nguồn gốc Số cặp mồi sử dụng 1 BNL Brookhaven National Laboratory, 2007 20 2 MUCS Mauricio Ulloa, 2005 6 3 MUSS Mauricio Ulloa, 2005 4 4 NAU Nanjing Agricultural University, 2007 10 5 STV Taliercio E, Scheffler J. 2006 4 6 TM John Yu, 2002 6 Tổng số 50 2.2. CÁC PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU, KỸ THUẬT SỬ DỤNG 2.2.1. Phương pháp đánh giá tính kháng bệnh xanh lùn của các giống bông cỏ 2.2.1.1. Phương pháp chuẩn bị nguồn rệp mang bệnh Cách 1: Rệp được thu thập ở các lá cây bị bệnh xanh lùn (có triệu chứng điển hình) sau đó được truyền trực tiếp lên cây bông thí nghiệm. Cách 2: Thu rệp trên đồng ruộng (cây bông và các cây ký chủ) rồi truyền cho cây bông D16-2. Sau đó lấy rệp từ cây bị bệnh truyền sang cây bông thí nghiệm. Quá trình chuẩn bị nguồn rệp mang bệnh được thực hiện tại Viện Nghiên cứu bông và PTNN Nha Hố. 27 2.2.1.2. Phương pháp lây nhiễm và đánh giá tính kháng bệnh xanh lùn Các giống bông cỏ được gieo trồng với ba lần nhắc lại và được bố trí theo phương pháp ngẫu nhiên. Tính kháng/nhiễm của các giống bông được đánh giá bằng 2 phương pháp lây nhiễm nhân tạo: (1) truyền rệp ở giai đoạn cây bông được 3 – 5 ngày tuổi, truyền rệp mang nguồn bệnh xanh lùn (15 con/cây), cho chích hút trên cây bông 48h sau đó phun thuốc diệt rệp; (2) ghép cây, ở giai đoạn 25 – 30 ngày tuổi, nếu cây chưa bị bệnh thì ghép với cây bị bệnh xanh lùn theo phương pháp ghép áp. Phương pháp đánh giá bệnh được tiến hành dựa trên mức độ biểu hiện bệnh xanh lùn theo 4 cấp của Junior và cs. (2008), thang điểm được ghi nhận như sau: + Cấp 0: Không nhiễm bệnh + Cấp 1: Màu lá bình thường nhưng lá bị biến dạng nhẹ + Cấp 2: Lá có màu đậm và bị biến dạng dễ nhận thấy + Cấp 3: Lá có màu xanh nhạt, bị biến dạng nhiều và gân lá vàng - Cách tính điểm kháng/nhiễm: Cây có bệnh cấp 0: được đánh giá kháng. Cây có có bệnh 1-3 được đánh giá nhiễm. Sau khi lây bệnh nhân tạo tiến hành theo dõi các chỉ tiêu tỷ lệ bệnh và thời gian ủ bệnh. Căn cứ vào kết quả này, những cây không bị bệnh tiếp tục chăm sóc và chọn lọc theo đặc điểm hình thái, chất lượng và năng suất xơ. Hình 2.1. Các cấp bệnh xanh lùn đánh giá trong phòng thí nghiệm 28 2.2.2. Phương pháp đánh giá đặc tính nông sinh học, tiềm năng năng suất của các giống bông Các giống bông được gieo trồng và theo dõi theo các chỉ tiêu, quy trình chung của ngành bông: - Diện tích ô thí nghiệm: 6m2/1 giống. - Diện tích bảo vệ: 100m2 - Tổng diện tích thí nghiệm: 400m2. Phương pháp đánh giá đặc tính nông sinh học, các chỉ tiêu cấu thành năng suất và chất lượng xơ của các giống bông trong nghiên cứu được thực hiện theo đúng Quy phạm khảo nghiệm giá trị canh tác và giá trị sử dụng của cây bông (10TCN 911: 2006). 2.2.2.1. Nhóm chỉ tiêu về sinh trưởng a. Chiều cao cây: Theo dõi 10 cây trong số 20 cây đã chọn theo nguyên tắc cách 1 cây đo 1 cây (trừ cây dị dạng, mất đỉnh sinh trưởng và 2 cây đầu hàng), đo từ vết hai lá sò đến đỉnh sinh trưởng ngọn. Bảng 2.3. Bảng số liệu đánh giá chiều cao cây Chiều cao cây thứ ...(cm) Giống Số lần nhắc 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 TB (cm) I A II b. Số đốt trên thân chính: Được tính từ vết hai lá sò, cứ một mắt là một đốt. c. Chiều dài đốt thân trung bình: Chiều cao cây chia cho số đốt trên thân chính ở giai đoạn tương ứng. d. Vị trí cành quả đầu tiên: Lá thật đầu tiên được gọi là vị trí 1, lá thật thứ 2 được gọi là vị trí 2 ...vị trí cành quả đầu tiên tương ứng với vị trí lá thật. Cành quả đầu tiên thường đâm từ nách lá thật thứ 5, 6 trở lên. 29 e. Số cành quả: Cành quả sinh trưởng theo phương thức mầm nách, do đó cành có dạng gãy khúc chữ chi. Cành quả thường đâm thẳng từ thân chính ra thành một góc thẳng, là loại cành trực tiếp mang nụ, hoa và quả. Cành quả được tính khi đã có nụ. f. Số cành đực: Cành đực là mầm chính phát triển từ thân chính, là loại cành không trực tiếp mang nụ, hoa và quả. Cành đực thường phát triển ở phần gốc. g. Chiều dài cành quả: Đo từ thân chính đến đỉnh sinh trưởng của cành. h. Số đốt trên cành quả: Được tính từ thân chính, cứ một lá là một đốt. 2.2.2.2. Nhóm chỉ tiêu về năng suất và các yếu tố cấu thành năng suất a. Số quả/cây: Đếm số quả cây (quy định quả to bằng ngón tay cái trở lên) vào thời kỳ 50% số cây có quả đầu tiên nở. b. Khối lượng quả: Trước mỗi đợt thu hoạch thu 20-25 quả/điểm (thí nghiệm ô lớn) hoặc 20-25 quả/ô (thí nghiệm ô nhỏ) để cân khối lượng quả sau đó tính trung bình. c. Năng suất lý thuyết: Sau khi có khối lượng quả, dựa trên mật độ cây cuối vụ để tính năng suất lý thuyết. NSLT = Số quả/cây x mật độ cây/m2 x khối lượng quả(g) x 10000m2 x 10-5 (tạ/ha). 2.2.2.3. Nhóm chỉ tiêu về hạt, tỉ lệ xơ và chất lượng xơ. Thu toàn bộ lượng bông hạt có trên cây của mỗi điểm qua các lần thu hoạch (trừ bông múi cau), trộn đều và lấy mẫu đại diện theo cách phân tư cho đến lúc đủ lượng bông cần thiết dùng cho phân tích xơ (khoảng 100-150g). a. Khối lượng 100 hạt: Đếm 100 hạt đem cân để biết khối lượng. b. Tỷ lệ xơ Tỷ lệ xơ (%) = Khối lượng xơ bông / Khối lượng bông hạt c. Các chỉ tiêu về chất lượng xơ: Độ bền, độ mịn, độ chín, chiều dài xơ, độ đều xơ được thực hiện trên máy. - Chiều dài trung bình nửa trên (Upper Half Mean length: UHML): Chiều dài trung bình nửa trên là chiều dài trung bình của một nửa số xơ có chiều dài dài hơn nửa còn lại, được biểu thị bằng tiếp tuyến từ điểm 50% trên biểu đồ phân bố xơ của chùm xơ thử (hình 2.1b) 30 - Chiều dài trung bình (Mean Length, ML): Chiều dài trung bình là chiều dài xơ trung bình của tất cả các xơ có trong mẫu bông, được biểu thị bằng tiếp tuyến từ điểm 100% trên biểu đồ phân bố xơ của chùm xơ thử (hình 2.2a). (a) (b) Hình 2.2. Chiều dài xơ đo bằng thiết bị HVI (a) Chiều dài trung bình (b) Chiều dài trung bình nửa trên - Chỉ số độ đồng đều (Uniformity Index): Chỉ số độ đồng đều là tỷ số giữa chiều dài trung bình và chiều dài trung bình nửa trên được tính bằng đơn vị phần trăm. - Độ bền (Strength): Độ bền xơ biểu thị sức bền của một chùm xơ đối với một lực kéo đứt được tính bằng đơn vị gam lực/tex (G/tex). Trong đó, đơn vị tex là khối lượng được tính bằng gam của 1.000 mét xơ. Độ bền ở đây chính là độ bền tương đối tính trên đơn vị tex thay cho việc xác định ứng suất kéo của xơ. - Chỉ số độ chín (Maturity Index): Chỉ số độ chín là tỷ lệ giữa bề dày thành xơ và bề ngang xơ. - Độ ẩm xơ (Moisture content): Độ ẩm xơ là tỷ số giữa khối lượng nước có trong mẫu xơ và khối lượng khô tuyệt đối của mẫu xơ được tính bằng phần trăm. Độ ẩm thực tế là độ ẩm của mẫu xơ trong điều kiện thực tế mà mẫu xơ được lưu giữ. 2.2.3. Phương pháp phân tích đa hình di truyền bằng chỉ thị phân tử SSR 2.2.3.1. Phương pháp tách chiết DNA tổng số DNA lá bông được tách chiết và tinh sạch theo phương pháp CTAB của Doyle, J.J. và cs. (1987). 31 Bảng 2.4. Thành phần đệm chiết Hóa chất Nồng độ Thể tích 1M Tris-HCl pH8.0 100mM 100ml 5M NaCl 1.4M 280ml 0.5M Na2- EDTA pH8.0 20mM 40ml CTAB 2%(w/v) 20g PVP40 2%(w/v) 20g DIECA 0.1% 1g -mercaptoethanol 0.2%(v/v) 2ml Ascorbic acid 0.1%(w/v) 1g H2O Tổng 1000ml Bảng 2.5. Thành phần đệm rửa I (wash buffer I) Hóa chất Nồng độ Thể tích Etanol 100% 76% 380ml 1M NaOAc (Sodium acetat) 0.2M 100ml H2O 20ml Tổng 500ml Bảng 2.6. Thành phần đệm rửa II (Wash buffer II) Hóa chất Nồng độ Thể tích Etanol 100% 76% 380ml 100mM NH4OAc (Amonium acetat) 10mM 50ml H2O 20ml Tổng 500ml 32 Quy trình tách chiết ADN tổng số: - Mẫu lá non được nghiền mịn trong nitơ lỏng trong ống eppendorf 2ml - Thêm 1ml dung dịch đệm chiết - Ủ 650C trong 90 phút, cứ 15 phút lắc đều một lần. - Cho 500µl chloroform:isoamyl alcohol (24:1), lắc nhẹ trong 5 phút. Sau đó ly tâm 12.000 vòng/phút trong 15 phút. - Chuyển phần dịch phía trên sang ống eppendorf mới, cho 500µl Isopropanol để tủa ADN. Ly tâm 12.000vòng/phút để thu kết tủa. - Rửa kết tủa bằng 500µl Wash buffer I. Sau đó ly tâm 12.000vòng/phút trong 5 phút để thu tủa. - Tiếp tục rửa bằng 500µl Wash buffer II. Sau đó ly tâm 12.000vòng/phút trong 5 phút để thu tủa. - Để khô ADN sau đó cho 50µl TE - Khử ARN bằng cách thêm 4µl RNAse/eppendorf trong tủ ấm 370C trong 3h. Kiểm tra ADN tổng số: Chất lượng và nồng độ ADN tổng số được kiểm tra trên gel agarose 0.8%. Nồng độ chính xác được đo trên máy quang phổ Nanodrop. 2.2.3.2. Kỹ thuật PCR Phản ứng PCR được tiến hành trên máy chu kỳ nhiệt Veriti 96well Thermal cycler. Tổng dung dịch phản ứng là 15 µl bao gồm 50ng ADN tổng số, 0.15µM mồi, 0.2 mM dNTPs, 1X dịch đệm PCR, 2.5mM MgCl2 và 0.5 đơn vị Taq TaKaRa. Điều kiện phản ứng PCR (bảng 2.7). Bảng 2.7. Chương trình chạy phản ứng PCR Các bước Nhiệt độ (0C) Thời gian Số chu kỳ Tác dụng 1 95 7 phút 1 Biến tính 2 94 55 72 15 giây 30 giây 2 phút 40 Biến tính Gắn mồi Tổng hợp 3 72 7 phút 1 Tổng hợp 4 4 Bảo quản 33 2.2.3.3. Phương pháp điện di trên gel agarose Theo phương pháp của Khoa Genome thực vật, Trường Đại học công nghệ Texas, Mỹ (2002). Chuẩn bị gel agarose: - Bột Agarose được hòa tan trong dung dịch đệm theo đúng tỷ lệ (đối với kiểm tra ADN tổng số, agarose được chuẩn bị với nồng độ 0,8%; đối với kiểm tra sản phẩm PCR, gel agarose được chuẩn bị với nồng độ 3,5%). - Đun sôi dung dịch agarose bằng lò vi sóng. - Hạ nhiệt độ của gel agarose xuống khoảng 500C. - Bổ sung Ethidium bromide (EtBr) có nồng độ là 0.5µg/ml. - Chuẩn bị khay gel và lược. - Rót hỗn hợp gel agarose EtBr vào khay gel và cắm lược. Thời gian chờ gel đông là 45 - 60 phút. - Tra mẫu ADN. - Chuẩn bị dung dịch đệm TBE 0,5% cho vào bể chạy điện di. - Chạy điện di tại 100mA trong 4 giờ. - Rửa gel trong H2O, đặt gel vào máy soi UV và chụp ảnh. 2.2.3.4. Phân tích số liệu đa hình di truyền Những số liệu thống kê bao gồm số allen trên locus, tần số allen phổ biến nhất, số allen độc nhất, chỉ số PIC (Polymorphism Information Content) được tính toán sử dụng phần mềm Excel, trong đó: - Chỉ số Tần số allen phổ biến nhất được tính bằng tỷ lệ % của số cá thể xuất hiện allen phổ biến nhất trên tổng số allen xuất hiện ở từng locus nghiên cứu - Allen cá biệt của từng chỉ thị SSR được xác định là allen xuất hiện duy nhất ở 1 giống trong toàn bộ các giống bông nghiên cứu. - Đa dạng di truyền allen của các chỉ thị SSR được đánh giá thông qua hệ số PIC (Botstein,1980) và được tính theo phương trình: 34 Trong đó: Pij là tần số xuất hiện của alen thứ j tương ứng với mồi i. Giá trị PIC càng lớn tức là mức độ đa hình của locus do mồi i khuếch đại càng lớn, tức là càng nhiều allen được sinh ra. - Hệ số tương đồng di truyền S: phản ánh mức độ giống nhau và khác nhau giữa các giống. Cơ sở để tính toán hệ số này là mô hình toán Nei và Li (1979) như sau: 2 xy x y N S N N   Trong đó: S là hệ số tương đồng Nxy: là số băng cùng vị trí của mẫu x và y Nx, Ny: là số băng ADN của mẫu x và y - Khoảng cách di truyền d: d = 1 - S Sự có mặt hay vắng mặt của các allen của từng chỉ thị SSR được ghi nhận cho tất cả các giống bông nghiên cứu, trong đó 0 là không có băng ADN và 1 là có băng ADN ở cùng một vị trí. Số liệu được nhập vào chương trình NTSYS-pc v. 2.1 (Rohlf, 1997) để xây dựng ma trận tương đồng di truyền. Tiếp theo, sơ đồ hình cây biểu diễn mối quan hệ di truyền giữa các giống bông nghiên cứu được xây dựng bằng phương pháp phân nhóm UPGMA (Unweighted Pair-Group Method with Arithmetical averages). 2.2.4. Các phương pháp xử lý số liệu chính trong nghiên cứu - Phương pháp phân tích đa dạng di truyền bằng phần mềm NTSYS pc 2.1 (Rohlf, 1997). - Phương pháp xử lý thống kê theo chương trình MSTATC (Michigan State University, 1994) - Phương pháp xử lý thống kê bằng phần mềm IRRISTAT v.4.0 (IRRI, 1998) 35 Chương 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. THU THẬP CÁC DÒNG, GIỐNG BÔNG CỎ (G.arboreum. L) CÓ TIỀM NĂNG NĂNG SUẤT CAO, CHẤT LƯỢNG XƠ TỐT VÀ GIỐNG BÔNG KHÁNG BỆNH XANH LÙN Kết quả đề tài đã triển khai thu thập và chọn lọc được 30 giống bông cỏ nhập nội và địa phương làm vật liệu nghiên cứu đa dạng di truyền phân tử (bảng 2.1). Một số giống bông được chọn lọc từ nguồn gen sẵn có của viện Nghiên cứu Bông và Phát triển nông nghiệp Nha Hố. Các giống còn lại được thu thập từ hai vùng trồng bông phổ biến của Việt Nam là Bắc Trung bộ và tỉnh Bình Thuận. 30 giống bông cỏ này đã được triển khai gieo trên đồng ruộng tại Viện Nghiên cứu Bông và PTNN Nha Hố (hình 3.1a) và duy trì trong nhà lưới của Viện (hình 3.1b). Mẫu lá non của từng giống bông riêng biệt (hình 3.1c) đã được thu thập và đưa vào phòng thí nghiệm của Bộ môn Sinh học phân tử, Viện Di truyền Nông nghiệp để tách chiết ADN tổng số, phục vụ phân tích chỉ thị phân tử đánh giá đa dạng di truyền. Hình 3.1. Gieo trồng ngoài đồng (a) để duy trì và trong nhà lưới (b,c) để lấy mẫu lá. a b c 36 3.2. ĐÁNH GIÁ TÍNH KHÁNG CỦA CÁC GIỐNG BÔNG CỎ (G.arboreum L.) NHẰM XÁC ĐỊNH NGUỒN GEN KHÁNG BỆNH XANH LÙN LÀM VẬT LIỆU BAN ĐẦU CHO VIỆC LAI TẠO QUẦN THỂ 30 giống bông cỏ chọn lọc và thu thập được gieo trồng với ba lần nhắc lại và được bố trí theo phương pháp ngẫu nhiên để đánh giá tính kháng/nhiễm bệnh xanh lùn. Phương pháp đánh giá bệnh được tiến hành dựa trên mức độ biểu hiện bệnh xanh lùn theo 4 cấp của Junior và cs. (2008). Kết quả đánh giá tính kháng rệp truyền virus xanh lùn được tổng hợp ở bảng 3.1 và hình 3.2 37 Bảng 3.1. Kết quả đánh giá khả năng kháng bệnh xanh lùn của các giống bông. STT MS TĐ Tên giống Nguồn gốc Khả năng kháng bệnh xanh lùn 1 2 Cỏ Thanh Hóa Việt Nam Nhiễm 2 3 Cỏ Hà Sơn Bình Việt Nam Nhiễm 3 5 Cỏ Phú Khánh Việt Nam Nhiễm 4 6 Cỏ Nghệ An Việt Nam Kháng 5 7 Cỏ Bắc Ái Việt Nam Nhiễm 6 15 AK-235 Ấn Độ Nhiễm 7 18 Lục Ngạn Việt Nam Nhiễm 8 34 B2III4 Ấn Độ Nhiễm 9 35 B2IV10 Ấn Độ Nhiễm 10 42 Akola Ấn Độ Nhiễm 11 43 Tka 283 Ấn Độ Nhiễm 12 44 Tka 188 Ấn Độ Nhiễm 13 46 Ava Liên Xô Nhiễm 14 75 B10 Ấn Độ Nhiễm 15 76 91-L1-2 Ấn Độ Nhiễm 16 77 91-B-16 Ấn Độ Nhiễm 17 78 91-B-36 Ấn Độ Nhiễm 18 79 BAA (bar x arb) Ấn Độ Nhiễm 19 80 BAA (bar x arb) Ấn Độ Nhiễm 20 81 BAA (bar x arb) Ấn Độ Nhiễm 21 82 BAA (bar x arb) Ấn Độ Nhiễm 22 83 BAA (bar x arb) Ấn Độ Nhiễm 23 85 BAA (bar x arb) Ấn Độ Nhiễm 24 86 BAA (bar x arb) Ấn Độ Nhiễm 25 87 BAA (bar x arb) Ấn Độ Nhiễm 26 92 BAA (bar x arb) Ấn Độ Nhiễm 27 93 BAA (bar x arb) Ấn Độ Nhiễm 28 94 BAA (bar x arb) Ấn Độ Nhiễm 29 100 Không tên Ấn Độ Nhiễm 30 101 Không tên Ấn Độ Nhiễm *Chú thích: MSTĐ - Mã số tập đoàn 38 (a) (b) Hình 3.2. Cây bông nhiễm và kháng bệnh xanh lùn (a) giống bị bệnh xanh lùn; (b) giống cỏ Nghệ An kháng bệnh Kết quả nghiên cứu cho thấy, trong 30 giống bông cỏ được đưa vào đánh giá bệnh, giống bông cỏ Nghệ An là giống duy nhất có biểu hiện kháng với bệnh xanh lùn, các giống còn lại đều có biểu hiện nhiễm bệnh. Đề tài đã tiến hành chọn dòng đối với tính kháng bệnh xanh lùn trên giống bông cỏ Nghệ An, kết quả đã chọn lọc được 6 dòng biểu hiện tính kháng bệnh, trong đó có 4 dòng kháng hoàn toàn, đó là các dòng KXL-00-02, KXL-00-03, KXL- 00-04, KXL-00-05 (bảng 3.2). Những dòng bông này được lưu giữ làm vật liệu để lai với các dòng giống bông vải khác, tạo quần thể con lai lập bản đồ gen kháng bệnh xanh lùn. Bảng 3.2. Kết quả chọn lọc các dòng kháng bệnh xanh lùn của bông Nghệ An. TT Dòng Tổng số cây Tỷ lệ bệnh (%) Thời gian ủ bệnh trung bình (ngày) 1 KXL-00-01 23 4,3 25,0 2 KXL-00-02 32 0 0 3 KXL-00-03 29 0 0 4 KXL-00-04 22 0 0 5 KXL-00-05 22 0 0 6 KXL-00-06 27 3,7 30,0 39 3.3. ĐÁNH GIÁ ĐẶC TÍNH NÔNG SINH HỌC CỦA CÁC GIỐNG BÔNG CỎ NGHIÊN CỨU. Tập đoàn vật liệu gồm 30 giống bông cỏ được tiến hành gieo trồng ngoài đồng ruộng và theo dõi các chỉ tiêu nông sinh học tại Viện Nghiên cứu Bông và PTNN Nha Hố, Ninh Thuận (hình 3.3). Hình 3.3. Ruộng đánh giá các đặc tính nông sinh học của các giống bông 3.3.1. Thời gian sinh trưởng và các đặc điểm thực vật học của các giống bông nghiên cứu. Thời gian sinh trưởng của cây bông được tính từ ngày gieo hạt đến ngày thu hoạch; thể hiện tính chín sớm hay muộn, tập trung hay không tập trung. Các giống chín sớm và tập trung thường tránh được sự phá hại của sâu bệnh và thu được năng suất cao. Thời gian sinh trưởng, phát triển của các giống dài ngắn khác nhau tuỳ thuộc vào đặc điểm di truyền của từng giống và tuỳ thuộc vào điều kiện ngoại cảnh. Kết quả nghiên cứu về thời gian sinh trưởng và một số đặc điểm nông sinh học chính của các giống bông nghiên cứu được trình bày ở bảng 3.3. 40 Bảng 3.3. Thời gian sinh trưởng và các đặc điểm thực vật học chính của các giống bông cỏ trong nghiên cứu. TT MS TĐ Tên giống TGST (ngày) Chiều cao cây (cm) Số cành đực/cây Số cành quả/cây Vị trí cành quả 1 (đốt) 1 2 Cỏ Thanh Hoá 102,6 75,3 0,5 23,1 3,7 2 3 Cỏ Hà Sơn Bình 96,0 107,0 1,5 22,2 4,9 3 5 Cỏ Phú Khánh 99,0 85,9 1,3 19,2 4,2 4 6 Cỏ Nghệ An 100,0 97,3 1,2 19,2 4,3 5 7 Cỏ Bắc Ái 97,0 87,9 1,1 23,6 4,5 6 15 AK-235 100,0 139,6 0,4 22,8 4,8 7 18 Cỏ Lục Ngạn 97,0 136,6 1,7 23,2 4,4 8 34 B2III4 99,0 155,4 2 25,4 5,4 9 35 B2IV10 102,0 118,2 1,4 20,6 4,6 10 42 Akola 103,0 125,6 0,4 22,6 4,6 11 43 Tka 283 104,0 134,4 1,6 24,8 4,8 12 44 Tka188 102,0 115,0 0,6 20,0 3,8 13 46 Ava 99,0 133,0 0,6 23,8 4,8 14 75 B10 107,0 168,4 0,6 23,6 5,6 15 76 91-L1-2 110,0 162,0 1,8 28,4 6,2 16 77 91-B-16 107,0 146,0 1 27,6 5,8 17 78 91-B-36 109,0 149,0 0,6 18,2 6,0 18 79 BAA(bar x arb) 107,0 146,2 2 26,6 6,2 19 80 BAA(bar x arb) 106,0 152,4 0,4 22,6 5,8 20 81 BAA(bar x arb) 115,0 141,6 1,8 19,0 5,2 21 82 BAA(bar x arb) 106,0 143,0 0,8 22,6 5,6 22 83 BAA(bar x arb) 108,0 127,4 3,4 18,6 9,0 23 85 BAA(bar x arb) 107,0 170,8 1,8 28,8 6,8 24 86 BAA(bar x arb) 99,0 181,0 2,4 24,6 6,8 25 87 BAA(bar x arb) 108,0 129,2 2,4 20,6 6,8 26 92 BAA(bar x arb) 107,0 126,4 3,6 20,4 8,2 27 93 BAA(bar x arb) 100,0 131,6 2,6 25,2 7,8 28 94 BAA(bar x arb) 100,0 153,4 1,8 25,0 7,2 29 100 Không tên 100,0 142,8 1,2 23,2 6,2 30 101 Không tên 106,0 164,0 1 25,6 5,8 Max 115,0 181,0 3,6 28,8 9,0 Min 96,0 75,3 0,4 18,2 3,7 Trung bình 103,4 134,9 1,5 23,0 5,7 CV (%) 0,890 1,490 6,070 3,890 12,130 LSD.05 1,503 3,291 0,146 1,465 1,122 * Chú thích: MSTĐ - Mã số tập đoàn; TGST - Thời gian sinh trưởng CV - Hệ số biến động; LSD - Sự khác nhau có ý nghĩa thống kê. 41 Kết quả nghiên cứu cho thấy các giống bông nghiê