Luận văn Xác định đồng thời một số kháng sinh nhóm carbapenem bằng phương pháp điện di mao quản sử dụng detector đo độ dẫn không tiếp xúc (Ce - C4d)

H=7,5 (w/w 150:100:750). Cột C18, kích thước 4,6mm x 25cm x 5µm HPLC-UV tại 300nm Khoảng được chấp nhận 90- 120% 19 USP 40 [25] Xác định imipenem trong thuốc tiêm Pha động: natri 1-hexansulfonat pH=6,8, kích thước cột: 4,6mm x 30 cm cột C18 HPLC-UV tại 254nm Khoảng được chấp nhận 90- 115% 1.3. Phương pháp điện di mao quản 1.3.1. Nguyên tắc phân tách các chất trong điện di mao quản Điện di mao quản (Capillary Electrophoresis - CE) là một phương pháp tách và phân tích các chất dựa trên cơ sở sựu di chuyển khác nhau của các ion mang điện tích trong dung dịch chất điện ly dưới tác dụng của điện trường sinh ra từ nguồn thế cao áp vào hai đầu mao quản. Thời gian di chuyển các ion được dung để định tính, định lượng sẽ dựa vào diện tích pic thu được sau quá trình phân tích. Phương pháp CE được sử dụng rộng rãi do tính chất ưu việt về hiệu quả tách cao, thời gian phân tích ngắn, lượng mẫu tiêu tốn ít. Hiện nay, phương pháp ứng dụng trong nhiều lĩnh vực như: y dược, sinh học,.... 1.3.2. Phân loại Điện di mao quản gồm nhiều các kỹ thuật tách khác nhau, mỗi kỹ thuật có một cơ chế riêng [26, 27]: - Điện di mao quản vùng (CZE) - Sắc ký mao quản Gel (CGE) - Sắc ký mao quản điện động học mixen (MECC) - Điện di mao quản điểm đẳng điện (IEF) - Điện di mao quản đẳng tốc độ (ITP) - Sắc kí điện di mao quản (CEC) 20 Trong đó kỹ thuật điện di mao quản vùng (CZE) được sửu dụng nhiều bởi đặc tính đơn giản và hiệu quả 1.3.3. Cơ sở lý thuyết Độ điện di (µ) là hằng số đặc trưng cho hạt tích điện trong một điều kiện điện di xác định: µ = q/(6...r.) Từ công thức trên có thể thấy [26, 27]:, độ điện di tỷ lệ thuận với điện tích của hạt mang điện (q) và tỷ lệ nghịch với độ nhớt của dung dịch đệm điện di (), bán kính hyddrat của hạt mang điện (r). Nghĩa là, trong một điện trường E nhất định, chất nào có điện tích lớn và kích thước nhỏ sẽ di chuyển nhanh; với các chất mang điện có cùng điện tích, chất nào có kích thước nhỏ sẽ di chuyển nhanh hơn; với các chất mang điện có cùng bán kính, chất nào có điện tích lớn sẽ di chuyển nhanh hơn. 1.3.4. Cấu tạo hệ CE cơ bản Sau đây là cấu tạo của hệ điện di cơ bản: - Dung dịch đệm điện ly: dùng để tạo môi trường cho quá trình điện di khi áp thế cao vào đầu hai mao quản. Trong quá trình điện di, hai đầu mao quản được đặt trong hai bình chứ dung dịch đệm. - Nguồn thế cao: thường dao động từ 5-30kV, dùng để áp vào đầu hai mao quản nhằm sinh ra điện trường lớn cho quá trình điện di xảy ra. - Detector: bộ phận phát hiện và ghi nhận tín hiệu của chất phân tích sau quá trình tách điện di. Các loại detector thông dụng: hấp thụ phân tử (UV-VIS), huỳnh quang phân tử, phát xạ hoặc hấp thụ nguyên tử, khối phổ, đo dòng, đo thế, đo độ dẫn. - Bộ phận điều khiển: thường là máy tính sử dụng phần mềm chuyên dụng phù hợp, để ghi nhận, hiển thị và xử lý kết quả. 21 Hình 1.6: Cấu tạo hệ CE cơ bản 1.3.5. Dòng điện di thẩm thấu EOF Dòng điện di thẩm thấu (ElectroOsmotic Flow - EOF) là một đặc trưng riêng có của phương pháp điện di mao quản sử dụng mao quản silica. Đây là dòng chuyển động của khối dung dịch di chuyển trong mao quản từ cực dương sang âm (với mao quản silica có bề mặt trong tích điện âm SiO-) xuất hiện khi áp một điện thế cao vào hai đầu mao quản chứa đầy dung dịch đệm. Tốc độ của dòng EOF bằng đúng tốc độ của các ion không mang điện trong quá trình điện di. Hình 1.7: Mô hình dòng EOF trong phương pháp điện di mao quản 22 Trong quá trình di chuyển của mình, EOF sẽ cuốn theo các ion có mặt trong mao quản. Với cột mao quản silica, cations dịch chuyển cùng chiều EOF, còn anions dịch chuyển ngược chiều EOF. 1.3.6. Các detector thông dụng Trong phương pháp điện di mao quản, sự phát hiện các chất trong quá trình có thể được thực hiện trực tiếp hoặc gián tiếp tùy vào bản chất các chất phân tích. Còn việc định lượng dựa trên mối quan hệ giữa tín hiệu đo và nồng độ các chất phân tích. Việc phát hiện và đo định lượng được thực hiện nhờ các detector. Các detector được đặt ở gần cuối của mao quản. Tùy thuộc vào mục đích phát hiện cũng như định lượng và đặc tính của các chất mà sử dụng các detector tương ứng như: detector quang học, detector khối phổ, detector điện hoa, detector độ dẫn [26].,.... 1.3.6.1. Detector quang học Detector quang phổ hấp thụ phân tử (UV-VIS) hoặc huỳnh quang được sử dụng trong hầu hết các thiết bị CE thương phẩm. Detector quang phổ hấp thụ phân tử (UV-VIS) là detector phổ biến nhất, đáp ứng được những chất phân tích có khả năng hấp thụ ánh sáng trong vùng UV-VIS. Đối với các chất không hấp thụ ánh sáng UV-VIS như ion vô cơ, các amino acid... cần có thêm thuốc thử để tạo các hợp chất màu trung gian. Detector huỳnh quang dùng để phát hiện và định lượng các chất và dẫn xuất có khả năng phát ra ánh sáng huỳnh quang. Chất phân tích hấp thụ ánh sáng ở một bước sóng nhất định ngay sau đó suy biến và phát ra huỳnh quang ở bước sóng dài hơn. Detector huỳnh quang có độ nhạy cao nhất, với LOD gấp 3 lần detector UV-VIS. Tuy nhiên detector này có gái thành cao, cần được kích hoạt băng bức xa laser và có thể gây ra hiện tượng giảm tín hiệu đo do cường độ ánh sáng kích thích lớn [26, 27]. 23 1.3.6.2. Detector khối phổ Detector khối phổ là detector vạn năng cho phân tích và định lượng, có độ nhạy cao vì thế ưu việt hơn detector quang học, điện hóa. Trong phương pháp khối phổ, các phân tử bị ion hóa được tăng tốc trong một trường điện từ và tách theo khối lượng của nó. Quá tình ion hóa thường cung cấp đủ năng lượng để phân tử bị phá võ thành các mảnh khác nhau. Ngoài định tính và định lượng, detector khối phổ còn cho biết cấu trúc của các chất phân tích, do đó nó trở thành công cụ quan trọng để phân tích đặc tính của các phân tử sinh học như peptit, protein, [27]..... 1.3.6.3. Detector điện hóa Detector đo thế là một detector đơn giản và tiện lợi nhất trong các detector điện hóa. Trong detector đo thế, nồng độ chất phân tích được xác định dựa vào sự thay đổi của thế điện cực của điện cực làm việc khi nhúng trong dung dịch phân tích cùng điện cực so sánh. Detector chỉ đáp ứng chọn lọc với một số ion nhất định nên là detector có độ chọn lọc cao nhất trong các detector điện hóa [26, 27]. Detector đo dòng là một hệ 3 điện cực gồm: điện cực làm việc, điện cực so sánh và điện cực phụ trợ, lập thành một mạch điện đặc biệt. Dòng điện sinh ra do quá trình oxi hóa hoặc khử các chất phân tích hay chính là do sự chuyển electron giữa điện cực làm việc và điện cực phụ trợ, dòng điện này tỉ lệ với chất phân tích. Tuy nhiên detector này chỉ phù hợp với các chất phân tích có tính oxi hóa hoặc khử như amin thơm, phenol,... Detector đo độ dẫn là detector phù hợp với tất các chất phân tích mang điện. Chất phân tích được phát hiện bởi detector trong một nền dung dịch điện ly. Detector đo độ dẫn trực tiếp đo độ dẫn của dung dịch phân tích được đặt giữa hai điện cực. Detector đo độ dẫn có thể đo theo kiểu tiếp xúc hoặc không tiếp xúc, vị trí đặt detector có thể tiếp xúc hoặc không tiếp xúc với điện cực và dung dịch điện ly tương ứng. 24 Một nhược điểm chung của detector điện hóa khi dùng để định lượng trực tiếp là độ chọn lọc kém. Giải pháp để hạn chế nhược điểm này là kết hợp giữa định lượng bằng detector điện hóa với kỹ thuật tách, trong đó tách bằng điện di được coi là kỹ thuật đơn giản và phù hợp nhất. 1.3.6.4. Detector đo độ dẫn không tiếp xúc Nguyên lí hoạt động Hình 1.8: Nguyên lý hoạt động của cảm biến đo độ dẫn không tiếp xúc. Hình 1.9: A) Sơ đồ biểu diễn cấu trúc của detector C4D B)Mạch điện tương đương Hai điện cực hình ống được đặt nôi tiếp đồng trục bên ngoài mao quản có chứa dung dịch cần đo. Hai điện cực hình ống tạo với dung dịch bên trong 25 mao quản thành hai tụ điện C. Khoảng dung dịch nằm giữa hai điện cực đóng vai trò như điện trở R. Việc xác định điện trở này sẽ cho ta thông tin về độ dẫn của các ion trong dung dịch đó [27]. Nguồn điện xoay chiều (V) với tần số (f) được áp vào điện cực thứ nhất. Tại điện cực thứ hai, tín hiệu đo được ở dạng cường độ dòng điện (I). Theo đó, dòng điện thu được tại điện cực thứ 2 sẽ phụ thuộc vào độ lớn của điện thế V và tần số f Nguồn kích thích V có giá trị càng cao thì tín hiệu I đo được cũng càng lớn. Hình 1.10: Biểu diễn mối liên hệ giữa tín hiệu đầu ra và độ lớn (điện thế và tần số) của nguồn kích thích xoay chiều Tần số hoạt động f của nguồn kích thích phải cao (tối thiểu vài trăm kHz), để triệt tiêu giá trị dung kháng Z=(1/2πC)2. Ở tần số cao, V=I/R với R là điện trở của dung dịch cần đo. Tín hiệu đầu ra thu được ở dạng cường độ dòng điện (xoay chiều), sau đó sẽ được chuyển đổi và khuếch đại thành tín hiệu dạng vôn thế (xoay chiều), thông qua việc sử dụng một điện trở khuếch đại. Vôn thế xoay chiều sau đó được chuyển đổi thành vôn thế 1 chiều, lọc nhiễu và khuếch đại, sau 26 cùng chuyển đổi thành tín hiệu số hóa (xem hình 4) trước khi được hiển thị và lưu trữ trên máy tính [27]. Hình 1.11: Sơ đồ thiết kế của C4D Để tăng độ nhạy cần sử dụng giải pháp nâng cao nguồn điện thế kích thích xoay chiều thay vì dùng điện trở khuếch đại quá lớn. Lý do là khi dùng điện trở khuếch đại lớn thì cả tín hiệu cần đo và nhiễu nền cùng được khuếch đại gây cản trở cho định tính và định lượng [27]. Thông thường điện trở khuếch đại có giá trị 330kΩ đến 1,5MΩ. 1.3.7. Các kỹ thuật bơm mẫu Quá trình bơm mẫu vào cột tách của phương pháp có thể thực hiện theo hai phương pháp như hình 1.12: 27 Hình 1.12: Các kĩ thuật bơm mẫu trong phương pháp CE - Kĩ thuật bơm mẫu kiểu thủy động học: trong kĩ thuật này, mẫu được bơm vào mao quản nhờ áp lực (hình a,b,d). Khi đó, lượng mẫu bơm vào phụ thuộc vào áp lực sử dụng (áp suất, lực hút chân không hoặc chiều cao bơm mẫu và thời gian bơm mẫu). - Kĩ thuật bơm mẫu kiểu điện động học: kĩ thuật sử dụng lực điện khi áp thế cao (5-10kV trong vài giây) để bơm mẫu vào mao quản. Phương pháp này cho kết quả các pic phân tách có độ sắc nét cao. Tuy nhiên, diện tích pic dùng để định lượng có độ lặp lại thấp với các nền mẫu khac nhau, do đó thường dùng để định tính [27]. Điện di mao quản (Capillary Electrophoresis - CE) là một phương pháp tách và phân tích các chất dựa trên cơ sở sựu di chuyển khác nhau của các ion mang điện tích trong dung dịch chất điện ly dưới tác dụng của điện trường sinh ra từ nguồn thế cao áp vào hai đầu mao quản. Thời gian di chuyển các ion được dung để định tính, định lượng sẽ dựa vào diện tích pic thu được sau quá trình phân tích [27]. Phương pháp CE được sử dụng rộng rãi do tính chất ưu việt về hiệu quả tách cao, thời gian phân tích ngắn, lượng mẫu tiêu tốn ít. Hiện nay, phương pháp ứng dụng trong nhiều lĩnh vực như: y dược, sinh học [28, 29, 30, 31],.... 28 Gần đây, phương pháp điện di mao quản cho thấy được tiềm năng phát triển do tính chất ưu việt về hiệu quả tách cao, thời gian tách ngắn, lượng mẫu tiêu tốn ít. Phương pháp đã được ứng dụng để xác định kháng sinh trong nhiều đối tượng mẫu khác nhau. Dựa vào các đặc điểm đó có rất nhiều nghiên cứu đã sử dụng và đã thu được một kết quả nhất định như Shoko Taniguchi và các cộng sự [32] theo dõi quá trình phân hủy của kháng sinh meropenem, biapenem và imipenem trong một vài điều kiện khác nhau với điều kiện điện di dung dịch đệm điện di 100mM photphat, pH=8,0, cột 25 µm và thế tách 30kV, nhận thấy rằng các carbapenem đều phân hủy khoảng 30% sau 24 tiếng khi có thêm các tác nhân gây ức chế như fosmicin; ở nghiên cứu khác nhóm tác giả Toshihiro Kitahashi [33] và Yahya Mrestani [34] đều sử dụng detector UV để định lượng hàm lượng meropenem trong một số mẫu như huyết tương, huyết thanh và nước tiểu thì thời gian di chuyển của meropenem đều nằm trong khoảng từ 5-7 phút và có độ nhạy rất tốt với giới hạn phát hiện LOD nhỏ hơn 2 mg/l cùng với độ lặp tốt (RSD 90%) qua đó chứng tỏ phương pháp có thể áp dụng cho việc phân tích thực tế. Ngoài điện di mao quản vùng thì điện di điện động học micelle cũng được ứng dụng trong định lượng các carbapenem, điển hình như hai nhóm nghiên cứu Michalska với 2 công trình đã công bố [35, 36] và Yu-Wei Chou [37] với 1 công trình đã công bố. Với nhóm nghiên cứu Katarzyna Michalska cả 2 công trình đều sử dụng natri dodecyl sulfat để tạo môi trường micelle, tất cả các kết quả của hai công trình đều được đối chứng với phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao nhận thấy rằng sai khác đều nhỏ hơn 10%, chứng tỏ phương pháp có độ đúng cao. Còn đối với nhóm nghiên cứu Yu-Wei Chou thì họ đã thành công trong việc xác định hàm lượng meropenem trong huyết tương của các bệnh nhân viêm màng não và qua nghiên cứu các tác giả thấy 29 rằng nồng độ meropenem sẽ giảm từ 45,04mg/l xuống còn 1,2mg/l từ 1 tiếng sau truyền đến 8 tiếng sau truyền. Kết quả các nghiên cứu xác định carbapenem bằng phương pháp điện di mao quản được tổng hợp trong bảng 1.2 dưới đây. Bảng 1.2: Một số nghiên cứu tách và xác định các carbapenem bằng điện di mao quản Tác giả Đối tượng nghiên cứu Kiểu điện di Detector Điều kiện điện di Kết quả Shoko Taniguchi và các cộng sự [32] meropenem CZE UV-Vis tại 210nm Dung dịch đệm: 100mM photphat, pH=8 Cột: 25 µm I.Dx34,7 cm. Thế tách 30kV LOD=0,128ppm Toshihiro Kitahashi và Itaru Furuta [33] meropenem trong huyết thanh MEKC UV-Vis tại 210nm Dung dịch đệm: 25mM Natri tetraborat/ natri hydroxit (pH=10), SDS khoảng tuyến tính 0-200mg/l; LOD 2mg/l, RSD<8.87% 30 90mM. Cột: 50cm, 75µmI.D. Thế tách 25kV Yahya Mrestani, Reinhard Neubert, Frank Nagel [34] meropenem trong huyết tương, nước tiểu CZE PDA từ 200nm đến 500nm Dung dịch đệm: 10mM phosphat (pH=7,2). Sử dụng Z- cell. Thế tách 30kV Khoảng tuyến tính 0,5 - 200ppm, LOD=0,5ppm Katarzyna Michalska và các cộng sự [35] biapenem trong thuốc MEKC UV tại 200nm Dung dịch đệm: 22,5mM HCOOH(p H=4,3) và 150mM natri dodecyl sulfat Cột: 60/50cm; 50µm I.D. Thế tách 22kV LOD = 0,5ppm 31 Katarzyna Michalska và các cộng sự [36] ertapenem trong dược phẩm MEKC UV tại 214nm Dung dịch đệm: 60mM NaH2PO4, 20mM H3BO3 (pH=6), Cột: 60/52; 75 µm I.D. Thế tách 18kV LOD = 0,3ppm Yu-Wei Chou và các cộng sự [37] meropenem trong huyết tương và dịch não tủy MEKC UV tại 300nm Dung dịch đệm: Tris 40mM, pH=8, SDS Cột: 40,2/30cm, 50 µm I.D. Thế tách 15kV Khoảng tuyến tính 0,5-50ppm. LOD = 0,2ppm Như vậy có thể thấy, các nghiên cứu sử dụng phương pháp điện di ở trên chủ yếu sử dụng detector UV. Qua đây cho thấy được tiềm năng lớn của phương pháp điện di mao quản sử dụng detector đo độ dẫn không tiếp xúc CE-C4D trong việc kiểm nghiệm, xác định bốn kháng sinh nhóm carbapenem. Dưới đây sẽ chỉ ra thực nghiệm của quá trình xác định đồng thời doripenem, meropenem, imipenem và ertapenem trong mẫu thuốc sử dụng phương pháp điện di mao quản với detector độ dẫn không tiếp xúc. 32 33 NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Nội dung nghiên cứu Để đạt được mục tiêu nghiên cứu, các nội dung chính cần thực hiện là: * Nghiên cứu khảo sát các điều kiện tối ưu cho việc xác định đồng thời Doripenem, Meropenem, Imipenem và Ertapenem: - Điều kiện phân tích trên thiết bị điện di: Cố định một số điều kiện như chiều dài cột, đường kính cột và chiều cao bơm mẫu. - Khảo sát hệ đệm, nồng độ đệm và pH của dung dịch đệm. - Khảo sát thời gian bơm mẫu. - Khảo sát điện thế đặt vào hai đầu mao quản. * Thẩm định phương pháp phân tích - Xác định khoảng tuyến tính, xây dựng đường chuẩn. - Xác định giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ). - Đánh giá độ chụm của phương pháp phân tích. - Đánh giá độ đúng của phương pháp phân tích. * Áp dụng phân tích một số mẫu thuốc trên thị trường. * Thực hiện phân tích đối chứng với phương pháp tiêu chuẩn sắc ký lỏng hiệu năng cao sử dụng detector PDA. 2.2. Phương pháp nghiên cứu 2.3.1. Phương pháp phân tích CE-C4D Phương pháp điện di mao quản sử dụng detector đo độ dẫn không tiếp xúc (CE-C4D) được phát triển mạnh mẽ những năm gần đây. Phương pháp 34 được ứng dụng rộng rãi để phân tích để phân tích các đối tượng mẫu khác nhau đặc biệt hiệu quả trong tách và phân tích các loại mẫu sinh học, dược phẩm. Đây là một trong số ít các phương pháp phân tích vừa có thể triển khai hiệu quả trong phòng thí nghiệm, vừa có thể triển khai hiệu quả tại hiện trường, thậm chí tự động hóa quá trình phân tích khi cần thiết. Do đó, phương pháp điện di mao quản là sự lựa chọn phù hợp cho nghiên cứu phát triển và ứng dụng xác định hàm lượng ba kháng sinh nhóm Carbapenem trong dược phẩm, từ đó góp đảm bảo chất lượng dược phẩm, củng cố niềm tin của người tiêu dùng. 2.3.1.Thiết bị và hóa chất 2.3.1.1. Thiết bị CE-C4D Thiết bị CE-C4D sử dụng trong nghiên cứu được cung cấp bởi Công ty 3Sanalysis ( Thiết bị có nguồn thế cao lên đến 25 kV, sử dụng detector đo độ dẫn không tiếp xúc (C4D). Hình ảnh thiết bị CE- C4D sử dụng trong nghiên cứu được thể hiện trong hình 2.1. Hình 2.1: Ảnh chụp hệ thiết bị CE-C4D sử dụng trong nghiên cứu (1: Hộp thế an toàn, 2: Bộ điều khiển cao thế, 3: Cảm biến độ dẫn không tiếp xúc, 4: Ống dẫn dung dịch đệm, 5: Núm điều chỉnh, 6: Bộ phận điều khiển, 7: Bình khí nén) 35 2.3.1.2. Các thiết bị khác và dụng cụ - Máy ly tâm của hãng LCEN -200. - Máy rung siêu âm có gia nhiệt BRANSON 521. - Máy đo pH của hãng HANNA. - Tủ lạnh Sanaky VH-2899W. - Máy lọc nước Direct Q3-UV hãng Merck Millipore - Cân phân tích với độ chính xác 0,1mg. Các dụng cụ bao gồm: - Dụng cụ thủy tinh: bình định mức 10,00ml, 25,00ml và 50,00ml; cốc, ống nghiệm, phễu. - Micropipet các loại: 200 µl và 1000 µl. - Một số dụng cụ thông thường trong phòng thí nghiệm. 2.3.1.3. Hóa chất Các hóa chất đều thuộc loại tinh khiết phân tích + Chất chuẩn: Bốn kháng sinh nhóm carbapenem: doripenem 95% số lô 2-HBS-109-1, meropenem sodium salt 98% số lô 6-ALN-168-1, imipenem monohydrate 98% số lô 3-XJZ-149-1, ertapenem disodium 90 % số lô 5- HBN-41-1 (Hãng Toronto Research Chemicals, Canada) + Hóa chất dung môi: - Tris (Sigma, Singapore, hàm lượng ≥99%) - Arigin (Sigma, Singapore, hàm lượng ≥99%) - Axit L-ascorbic (Sigma, Singapore, hàm lượng ≥99%) - Axit lacitc (Merck, Đức, hàm lượng ≥99%) - Axit axetic (Merck, Đức, hàm lượng ≥99%) 36 - Nước deion (theo tiêu chuẩn Mỹ, châu Âu) dùng cho phân tích điện di, sắc ký được lấy từ máy lọc nước Direct Q3-UV có sử dụng lọc cuối LC- pack (cỡ lọc 0,45 µm). + Chuẩn bị các dung dịch hóa chất: - Dung dịch chuẩn gốc bốn kháng sinh doripenem, meropenem, imipenem và ertapenem 1000ppm được pha từ chất chuẩn như sau: cân chính xác 0,0106g doripenem 0,0116g meropenem, 0,0108g imipenem, 0,0116g ertapenem, chuyển vào từng bình định mức 10,00ml, lắc đều. Sau đó định mức đến vạch bằng nước deion. Dung dịch được bảo quản trong tủ lạnh từ - 4oC-2 oC, tránh ánh sáng và có thể sử dụng trong vòng 3 tháng. - Dung dịch đệm điện di được pha như sau: cân chính xác 0,0303g Tris, chuyển vào bình định mức 25,00ml, lắc đều. Sau đó định mức đến vạch bằng nước deion. Dung dịch được chuẩn lại pH=8 bằng axit axetic trước khi đẩy vào mao quản. Dung dịch đệm được pha mới hàng ngày. 2.4. Phương pháp xử lý mẫu 2.4.1. Mẫu dược phẩm Các mẫu dược phẩm sử dụng trong nghiên cứu được mua tại các nhà thuốc tư nhân và cơ sở y tế đã liệt kê ở PL3. 2.4.2. Xử lý mẫu dược phẩm - Mẫu kháng sinh nhóm carbapenem dạng bột Cân chính xác trên cân phân tích một lượng 0,0100g mẫu đã trộn đều, sau đó, cho vào bình định mức 10,00ml hòa tan bằng nước deion và định mức tới vạch bằng nước deion, rung siêu âm và lọc qua màng 0,45µm. Pha loãng 20 lần bằng nước deion trước khi tiến hành bơm vào thiết bị CE. 37 2.5. Phương pháp đánh giá độ tin cậy của phương pháp phân tích Độ tin cậy của phương pháp CE-C4D trong phân tích được đánh giá qua các thông số: giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng, độ lặp lại, hiệu suất thu hồi. 2.5.1. Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng Giới hạn phát hiện (LOD) [38, 39, 40] được xem là nồng độ thấp nhất của chất phân tích mà hệ thống phân tích còn cho tín hiệu phân tích khác có nghĩa với tín hiệu của mẫu trắng hay tín hiệu nền. Đối với quá trình điện di, LOD là nồng độ nhỏ nhất mà cho tín hiệu/nhiễu (S/N) bằng 3. Giới hạn định lượng (LOQ) là nồng độ thấp nhất của chất phân tích mà hệ thống phân tích định lượng với tín hiệu phân tích khác có ý nghĩa định lượng với tín hiệu của mẫu trắng hay tín hiệu nền. Thông thường với quá trình sắc kí, LOQ là nồng độ nhỏ nhất mà cho tín hiệu/nhiễu (S/N) bằng 10. 2.5.2. Độ chụm (độ lặp lại của phương pháp) Độ lặp lại, một cách tương đối, là độ sai lệch của các giá trị riêng lẻ xi và giá trị trung bình trên các mẫu thử giống hệt nhau trong những điều kiện thí nghiệm giống nhau (cùng người phân tích, cùng trang thiết bị, phòng thí nghiệm) trong những khoảng thời gian ngắn. Độ lặp lại có thể xác định qua độ lệch chuẩn hoặc độ lệch chuẩn tương đối (RSD%). Khi độ lệch chuẩn càng lớn thì sai số của phép đo hay phương pháp càng lớn [38, 39, 40]. Công thức tính độ lệch chuẩn và độ lệch chuẩn tương đối là: RSD(%) = SD/Stb x 100% Trong đó: - Si là diện tích pic thứ i 38 - Stb là diện tích trung bình của n lần chạy - N là số lần chạy lặp lại 2.5.3. Độ đúng, độ thu hồi của phương pháp Độ đúng chỉ mức độ gần nhau giữa giá trị trung bình của dãy lớn các kết quả thí nghiệm và các giá trị quy chiếu được chấp nhận. Do đó, thước đo độ đúng thường đánh giá qua sai số tương đối hay cách xác định độ thu hồi [37, 38, 39]. Hiệu suất thu hồi (H): H = Ctt/Clt x100% Trong đó - H là hiệu suất thu hồi (%) - Ctt là nồng độ thực tế của chất phân tích thu được - Clt là nồng độ lý thuyết được tính toán từ lượng chuẩn thêm vào. Nếu chất chuẩn thêm vào mẫu trước khi xử lý mẫu ta có độ đúng của phương pháp, còn nếu chất chuẩn được thêm vào trước khi bơm vào thiết bị CE ta có độ đúng của thiết bị. 2.5.4. Độ phân giải Định nghĩa: Độ phân giải được mô tả khả năng tách giữa hai pic. Nếu R là lớn hơn hoặc bằng 1,5 thì khả năng tách của 2 pic là 99%. Công thức tính độ phân giải [38, 39, 40]: R = 2x tb − ta Wa + Wb Wa, Wb: độ rộng giữa 2 pic ta, tb : thời gian di chuyển của 2 pic tính theo đỉnh pic đó. 39 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Khảo sát điều kiện tối ưu trong việc tách và xác định bốn kháng sinh nhóm carbapenem bằng phương pháp CE-C4D 3.1.1. Khảo sát ảnh hưởng của dung dịch đệm pH, thành phần và nồng độ của dung dịch đệm điện di là những yếu tố ảnh hưởng rất lớn trong phương pháp điện di mao quản, nó gây ảnh hưởng đến quá trình di chuyển của các chất trong mao quản và dòng điện di thẩm thấu (EOF). Vì vậy, các yếu tố được lựa chọn khảo sát trước tiên là pH, thành phần và nồng độ đệm của hệ đệm điện di, bên cạnh các yếu tố khác như thời giam bơm mẫu, thế tách và các yếu tố ảnh hưởng khác. 3.1.1.1. Khảo sát đồng thời các loại đệm và pH của đệm Do các chất phân tích có cấu tạo phân tử cồng kềnh, điện tích ít, do đó việc sử dụng phân cực thuận (sử dụng phân cực cùng dấu tại đầu bơm mẫu: áp thế dương với các chất phân tích là cation, áp thế âm với các chất phân tích là anion) sẽ khó cho kết quả tốt. Trên thực tế, việc phân tích theo phân cực thuận đã được thực hiện và kết quả không cho tín hiệu các chất phân tích. Vì vậy, kỹ thuật phân cực ngược (sử dụng thế dương khi phân tích các anion) trong đó lợi dụng dòng EOF kéo các chất phân tích với độ linh động thấp đã được sử dụng. Kết quả đã cho tín hiệu các chất phân tích rõ ràng và phân tách tốt. Để thực hiện phân cực ngược sử dụng dòng EOF, cần phải lựa chọn pH thích hợp: pH cao để tạo dòng EOF đủ lớn nhưng nếu pH cao quá sẽ cho độ lặp kém hơn và nhiễu đường nền tăng cao. Thêm vào đó, do sử dụng detector độ dẫn thì các đệm sử dụng trong phương pháp CE-C4D phải đảm bảo độ điện ly nhưng độ dẫn không được quá cao sẽ làm giảm độ nhạy của phương pháp. Vì vậy, các loại đệm được lựa chọn khảo sát đồng thời thành phần và pH đệm 40 nhằm lựa chọn được hệ đệm phù hợp nhất gồm: arginin 10mM/ axit axetic, arginin 10mM/ axit ascobic, arginin 10mM/ axit lactic, Tris (hydroxymetyl) aminometan 10mM/ axit lactic và Tris (hydroxymetyl) aminometan 10mM/ axit axetic với các pH 7,0; 7,5; 8,0; 8,5 và 9,0. Đầu tiên, hệ đệm Arg/Ace với các pH 7,0; 7,5; 8,0; 8,5 và 9,0 với nồng độ đệm 10mM, thế tách 20kV, chiều cao bơm mẫu 10cm và thời gian bơm mẫu 20s được chọn để khảo sát. Các kết quả thu được trong hình 3.1 và bảng 3.1. Hình 3.1: Điện di đồ phân tích bố