Luận văn Xác định giá trị trung vị của afp, hcg, ue3 ở thai phụ từ tuần thai 15 – 19 để phát hiện sớm thai có nguy cơ rối loạn nhiễm sắc thể

vào trong máu mẹ, estriol nhanh chóng được gan mẹ chuyển hóa thành dạng liên kết: estriol sunphate và glucuronide. Sau đó, estriol liên kết sẽ được bài tiết ra nước tiểu. Dạng estriol tự do hay estriol không liên kết (uE3) có tỷ lệ thấp, chỉ chiếm 9 % tổng số estriol trong vòng tuần hoàn, lượng estriol sunphate chiếm khoảng một nửa tổng số estriol [5, 6]. Hình 8: Cấu trúc hóa học của estriol Trong quá trình có thai, nồng độ estriol liên kết và estriol không liên kết (uE3) tăng dần, cao nhất vào khoảng tuần 36. Cuối thời kỳ thai nghén nồng độ uE3 là 15 ng/ml và estriol toàn phần là 250 ng/ml. Sau 40 tuần, nồng độ estriol giảm đều khoảng 12%/tuần. Nồng độ estriol ở các sản phụ rất khác nhau và dao động trong khoảng từ 50% đến 200% giá trị trung vị tính theo tuần thai. Thời gian uE3 tồn tại trong máu mẹ rất ngắn, khoảng 40 – 60 phút vì thế có thể thay đổi khác nhau trong 24h, do đó định lượng uE3 là phương pháp đánh giá nhanh và thuận tiện tình trạng hiện tại của thai. Nồng độ estriol thấp kéo dài hoặc nồng độ estriol giảm đột ngột gợi ý đến thai bệnh lý. Ngoài ra, nồng độ uE3 có thể bị ảnh hưởng nếu mẹ bị bệnh tiểu đường, cao huyết áp, thai già tháng và không xác định được ngày thai [1, 2, 3, 5]. Xét nghiệm triple test là loại xét nghiệm không xâm lấn và hoàn toàn không gây ảnh hưởng đến mẹ và thai. Quy trình xét nghiệm bao gồm thu thập thông tin về thai phụ và thai, lấy máu thai phụ và gửi mẫu đến phòng xét nghiệm. Kết quả thường có sau 3 – 5 ngày làm việc. Triple test có thể thực hiện khi thai 15 – 20 tuần. Tuy nhiên, kết quả chính xác nhất khi thai 16 – 18 tuần. Tất cả phụ nữ mang thai đều nên được thực hiện xét nghiệm này. Đặc biệt những thai phụ sau đây rất cần được xét nghiệm: Tiền sử gia đình có dị tật bẩm sinh Trên 35 tuổi Có sử dụng thuốc hoặc các chất có thể gây hại cho thai Bệnh tiểu đường và có sử dụng insulin Bị nhiễm virus trong thời kỳ mang thai Có tiếp xúc với phóng xạ liều lượng cao Xét nghiệm Triple test không thể chẩn đoán tình trạng thai mà chỉ cho biết thai hiện tại có nguy cơ bị rối loạn di truyền nhiễm sắc thể như thế nào và có cần phải làm thêm xét nghiệm khác nữa không. Nồng độ của các chỉ thị sinh học này được xác định bằng phương pháp miễn dịch phát quang.Vào năm 1988, Wald và cs đã thực hiện bộ xét nghiệm triple test, cho thấy khi kết hợp tuổi mẹ, AFP huyết thanh mẹ với hai chất khác trong huyết thanh mẹ là HCG và uE3 ở tuần thai 15 – 20 có thể xác định được 65% thai Down với tỷ lệ dương tính giả 5%. Kết quả này đã được khẳng định trong một số nghiên cứu sau đó. Hiện nay trên thế giới, sàng lọc bằng triple test được sử dụng rộng rãi để sàng lọc thai Down, trisomi 18, các dị tật ống thần kinh hở, các dị tật mở khác (thoát vị rốn, dạ dày), các chức năng bất thường của rau thai, hội chứng Smith – Lemli – Opitz, và các bất thường NST khác. Kết quả xét nghiệm triple test cho mỗi chỉ thị sinh học được biểu diễn dưới dạng bội số trung vị (MoM-Multiple of Median). Với xét nghiệm triple test, ngưỡng sàng lọc cho hội chứng Down thường là: AFP ≤ 0,7 – 0,75 MoM HCG, free β HCG ≥ 2 – 2,5 MoM uE3 ≤ 0,7 – 0,75 MoM Bảng dưới thể hiện giá trị MoM của 3 chỉ thị sinh học do Đỗ Thị Thanh Thủy và cộng sự so sánh với kết quả công bố của những công trình khác trên thế giới. Các giá trị MoM trong Bảng 2 đã được chuẩn hóa với cân nặng của thai phụ vì nếu không được hiệu chỉnh, những thai phụ có cân nặng lớn, nồng độ của các thành phần trong máu bị pha loãng thì MoM của các dấu ấn huyết thanh sẽ bị giảm đi, do đó số trường hợp nguy cơ cao sẽ tăng lên đáng kể [2, 3]. Bảng 1: Bảng so sánh các giá trị MoM giữa các tác giả Trên thế giới có nhiều phần mềm để tính nguy cơ mắc hội chứng Down, ngưỡng nguy cơ mắc bệnh (cut – of level) của hội chứng Down thường được chọn ở mức độ nhạy hay tỷ lệ dương tính giả là 5%. Theo kết quả thống kê từ 3 công trình nghiên cứu liệt kê trong Bảng 1.2, giá trị log10 của các MoM thu được từ quần thể thai phụ bình thường và thai phụ mang thai mắc hội chứng Down tuân theo phân phối Gauss. Từ các giá trị log10 MoM của ba chỉ thị sinh học, kèm với tuổi thai, tuổi và cân nặng thai phụ cho mỗi trường hợp xét nghiệm, các phần mềm như PRISCA hay RiskCalc sẽ tính toán nguy cơ mang thai hội chứng Down dựa trên hai phân phối Gauss này. Nguy cơ mang thai bất thường được thể hiện dưới dạng tỷ số, ví dụ 1/300, nghĩa là có đến 299 thai phụ mang thai bình thường cho kết quả xét nghiệm giống với trường hợp đang xét và chỉ có 1 thai phụ mang thai bất thường với kết quả xét nghiệm đó. Giá trị ngưỡng cho nguy cơ mang thai mắc hội chứng Down được sử dụng rộng rãi trên thế giới là 1/250. Các trường hợp xét nghiệm cho giá trị nguy cơ cao hơn ngưỡng này được xem là “dương tính” với một hay nhiều loại bất thường nhiễm sắc thể và phải được chẩn đoán bằng các phương pháp chuyên sâu hơn [2, 3]. Theo một tài liệu hướng dẫn do Hiệp hội Sản và Phụ Khoa và trường Đại học Di truyền Y học Canada công bố, công tác sàng lọc dị tật thai nhi được thực hiện ở 3 tháng giữa thai kỳ như sau: Ba tháng giữa thai kỳ (tuần 15 đến tuần 20): tuổi mẹ, chỉ thị sinh học AFP, hCG, uE3. Khả năng phát hiện hội chứng Down là 75% đến 80% với tỷ lệ dương tính giả là 3% đến 5%. Ngưỡng xác định dương tính cho chỉ số nguy cơ là 1/230. Ngoài ra, để nâng cao khả năng phát hiện và giảm tỷ lệ dương tính giả, phương pháp sàng lọc kết hợp bao gồm việc sàng lọc dị tật ở 3 tháng đầu và 3 tháng giữa thai kỳ cũng được khuyến khích. Khi sử dụng quadruple test ở 3 tháng giữa thai kỳ thì khả năng phát hiện của phương pháp sàng lọc kết hợp là 85% đến 87% và tỷ lệ dương tính giả chỉ còn 0,8% đến 1,5%. Nếu chỉ sử dụng triple test thì tỷ lệ dương tính giả tăng lên xấp xỉ 2,5%. Trong trường hợp phòng xét nghiệm không có điều kiện thực hiện siêu âm đo độ mờ da gáy thì phương pháp sàng lọc kết hợp cũng đạt được khả năng phát hiện là 83% và tỷ lệ dương tính giả là 4% [5, 6]. Trong xét nghiệm triple test, các chất AFP, HCG và uE3 của từng thai phụ có nồng độ khác nhau theo từng tuổi thai. Để dễ sử dụng và phân tích, các nghiên cứu đều chuyển đổi kết quả thu được sang bội số trung vị so sánh (MOM) với giá trị trung vị (median) của mỗi chất tại mỗi độ tuổi thai. Từ đó chúng ta có thể thiết lập giá trị từng chất AFP, HCG và uE3 của từng tuần tuổi thai của sản phụ. Giá trị trung vị của các ba chất trong xét nghiệm này phụ thuộc vào cân nặng, chiều cao của thai phụ, ngoài ra còn phụ thuộc vào bộ hóa chất sử dụng phòng xét nghiệm. Vì vậy, để giảm tỷ lệ dương tính giả cho bộ xét nghiệm, mỗi một phòng xét nghiệm cần phải thiết lập đường hồi quy giá trị trung vị riêng cho ba chất định lượng trong bộ xét nghiệm triple test này. 1.2.2.4. Các phương pháp đánh giá chương trình sàng lọc Muốn đánh giá giá trị xét nghiệm sàng lọc cần phải dựa trên tiêu chuẩn vàng là kết quả của các xét nghiệm chẩn đoán xác định trước sinh hoặc sau sinh. So sánh hiệu quả của các bộ xét nghiệm sàng lọc với tiêu chẩn vàng thường được đánh giá thông qua các giá trị: tỷ lệ phát hiện (độ nhạy), tỷ lệ dương tính giả (1 - độ đặc hiệu), giá trị tiên đoán dương tính hoặc OAPR (tỷ lệ dương tính thật/ dương tính giả) [11]. Tỷ lệ phát hiện và tỷ lệ dương tính giả được sử dụng để đánh giá giá trị của một nghiệm pháp chẩn đoán từ đó đưa ra quyết định áp dụng trong thực tế. Khi đã được áp dụng vào thực tế, trong thực hành lâm sàng cần phải xác định các giá trị tiên đoán dương tính và giá trị tiên đoán âm tính hoặc OAPR riêng đối với mỗi quần thể [11, 52]. Để hạn chế bỏ sót các cá thể mắc bệnh trong sàng lọc tỷ lệ phát hiện được chú trọng hơn, và tương ứng, tỷ lệ dương tính giả của các xét nghiệm sàng lọc luôn ở mức cao. Khi sử dụng ngưỡng sàng lọc khác nhau trên cùng một bệnh sẽ có tỷ lệ phát hiện cũng như tỷ lệ dương tính giả khác nhau. Phần lớn các phòng xét nghiệm lấy ngưỡng sàng lọc thai Down ở mức tỷ lệ dương tính giả 5% . Hiện nay sàng lọc trước sinh thường được sử dụng để sàng lọc các dị tật của ống thần kinh, các dị tật hình thái của thai nhi, các bất thường lệch bội NST. Các hội chứng Down, trisomy 18, dị tật hở ống thần kinh đã có nhiều phần mềm tính nguy cơ mắc bệnh của thai dựa trên các kết quả xét nghiệm như: Prisca, phần mềm a, Prenatal Interpretive, T21, DIANASoft, PrenatScreen, MuiltiCalc [37, 42]. 1.2.3. Các phương pháp lấy mẫu tế bào thai Chọc hút dịch ối Chọc hút dịch ối là một trong những thủ thuật trước sinh xâm phạm thai có thể gây một tai biến cho thai. Các nguy cơ ảnh hưởng đến thai nhi khi sử dụng phương pháp chọc ối bao gồm: - Sẩy thai: khoảng 0,5 – 1%. Theo trường Đại học Thực hành Sản phụ khoa Mỹ, tỷ lệ sẩy thai do chọc ối vào khoảng 1/300 – 1/500. - Bất đồng nhóm máu Rh mẹ con: khoảng 2 -3% trường hợp chọc ối ba tháng có thể chảy máu từ thai sang mẹ gây phản ứng miễn dịch đối với trường hợp mẹ Rh (-). Để tránh biến chứng này, có thể phòng bằng cách tiêm 100- 300 µg kháng thể Rh D cho mẹ trước khi chọc ối - Chảy máu bánh rau: gây nhiễm tế báo máu mẹ trong dịch ối. - Nhiễm trùng mẹ: rất hiếm gặp và có thể phòng tránh nếu đảm bảo nghiêm ngặt điều kiện vô trùng. - Rỉ ối hoặc thấm máu âm đạo gặp vào khoảng 2-3%. Nước ối chảy ra vài giờ sau chọc, sau đó tự cầm [4, 5]. Sinh thiết tua rau Ngoài các biến chứng như nhiễm trùng, chảy máu bánh rau sinh thiết tua rau còn có tỷ lệ sẩy thai cao, tăng 0,8% so với chọc hút ối kinh điển. Theo Dunn và Golmilow, tỷ lệ này là 1,9 – 2,1 %. Chọc hút máu cuống rốn Chọc hút máu cuống rốn được thực hiện từ tuần thai 18, đây là kỹ thuật có tai biến cao như: sẩy thai (1,4 %), chết trước sinh (1,4%), chảy máu kéo dài, chảy máu từ thai sang mẹ, bất thường cấu trúc thai, thai chậm phát triển, nang nước... Sinh thiết mô thai và nội soi phôi thai Quan sát thai bằng nội soi được tiến hành lần đầu tiên vào những năm 1950. Cho đến nay, tỷ lệ tai biến của kỹ thuật nội soi thai vẫn ở mức cao: tỷ lệ sẩy thai là 5 -7%, đẻ non khoảng 10%, rỉ ối, nhiễm trùng ối, chảy máu, tổn thương bàng quang, ruột... Vì vậy, chỉ áp dụng kỹ thuật này khi cần sinh thiết thai lấy mẫu cho những xét nghiệm đặc biệt như bệnh về da. 1.3. Tình hình nghiên cứu ở thế giới và Việt Nam Trên thế giới, sàng lọc DTBS đã được đề xướng thực hiện từ những năm 70. Thời gian đầu, người ta sử dụng các xét nghiệm đơn lẻ để phát hiện sự tăng hoặc giảm bất thường của một số chất trong máu mẹ (được gọi là chất Chỉ điểm huyết thanh) như Alpha Fetoprotein (1984), HCG toàn phần hay bán phần alpha và beta (từ 1987), Estriol không liên hợp (1987), Inhibin A (1996), PAPP-A (1990)...Tiếp đó các bộ xét nghiệm kết hợp phát hiện sự bất thường của một số chất trong máu mẹ được thực hiện để tăng mức độ chính xác (bảng 1.2). Bảng 2: Các bộ xét nghiệm sàng lọc trước sinh sản phẩm thai qua huyết thanh mẹ Loại test Bắt đầu áp dụng Chỉ điểm huyết thanh Double test 1988 AFP, hCG hoặc uE3 Tripple test 1988 AFP, hCG, uE3 Quadruple test 1996 AFP, hCG, uE3, InhA Từ những năm đầu thập kỷ 90, người ta đã phát hiện ra mối tương quan thống kê giữa dấu hiệu siêu âm về khoảng sáng vùng da gáy (còn gọi là khoảng sáng sau gáy) của thai nhi (NT-Nuchael translucency, clarté nucale) được phát hiện ở 12-14 tuần tuổi thai có liên quan đến các bất thường về nhiễm sắc thể. Việc kết hợp xác định khoảng sáng sau gáy bằng siêu âm (dấu hiệu chỉ điểm) và các xét nghiệm sinh hoá máu mẹ để xác định nguy cơ có các rối loạn nhiễm sắc thể đã được nhiều nước trên thế giới áp dụng. Bảng 3: Các bộ xét nghiệm sàng lọc trước sinh phối hợp siêu âm và định lượng sản phẩm thai qua máu mẹ Loại test Bắt đầu áp dụng Chỉ điểm Combined test 1997 NT(*) + hCG + PAPP-A Integrated test 1999 PAPP-A + NT(*) Tripple/Quadruple (*) NT: Khoảng sáng sau gáy Trong những năm gần đây, tại Việt Nam bắt đầu áp dụng bộ Triple test ở những cơ cở y tế lớn (Đại học Y Hà Nội, Đại học Y Dược thành phố Hồ Chí Minh, Bệnh viện Phụ sản Trung Ương, Bệnh viện Sản Từ Dũ ..) để sàng lọc thai Down, thai dị tật ống thần kinh và thai trisomy 18. Bộ môn Y Sinh học – Di truyền, Đại học Y Hà Nội đã có một số nghiên cứu về sàng lọc trước sinh thai hộ chứng Down, thai di tật ống thần kinh trong cộng đồng. Theo nghiên cứu của tác giả Trần Thị Thanh Hương khi định lượng AFP, βHCG, uE3 ở nhóm thai phụ nguy cơ cao sinh con di tật, với ngưỡng nồng độ AFP ≤ 0,7 Mo, uE3 ≤ 0,7 MoM, βHCG ≥ 2 MoM thấy tỷ lệ dương tính là 30 đến 40 % và đã xác định được các thai rối loạn nhiễm sắc thể và một số di tật khác. Hoàng Thị Ngọc Lan đã nghiên cứu sàng lọc và chẩn đoán trước sinh hội chứng Down ở Viêt Nam. Các dấu hiệu sàng lọc trên siêu âm là tăng khoảng sáng sau gáy, hình ảnh quả bong đôi do hẹp tá tràng và một số di tât tim, thận. Sàng lọc thai hội chứng Down bằng định lượng AFP, βHCG, uE3 huyết thanh mẹ với ngưỡng nồng độ AFP ≤ 0,7 Mo, uE3 ≤ 0,7 MoM, βHCG ≥ 2 đã phát hiện hội chứng Down. Tác giả đã áp dụng kỹ thuật nuôi cấy tế bàos ối xác định thai bất thường NST trong số những thai sàng lọc hội chứng Down dương tính, đã phát hiện được các thai hội chứng Down và một số bất thường khác [5, 6]. Siêu âm được sử dụng rộng rãi trong theo dõi sự phát triển của thai và đã phát hiện được nhiều bất thường về hình thái của thai. Theo nghiên cứu của Trần Danh Cường tại bệnh viện phụ sản Trung Ương (2006) đã phát hiện 8.4 % thai có NBH khi siêu âm ở các thai phụ có nguy cơ cao sinh con di tật. Ở Việt Nam đã có xét nghiệm tritest để sàng lọc và chẩn đoán trước sinh đã được thực hiện nhiều. Năm 2006, tác giả Đỗ Thị Thanh Thủy và cộng sự đã làm nghiên cứu dùng phương pháp Elisa để định lượng AFP, HCG, uE3 trong huyết thanh mẹ. Kỹ thuật định lượng này độ chính xác kém kỹ thuật hóa phát quang, các thao tác chưa tự động nên viêc làm đại trà cho số lượng bênh nhân lớn là chưa hiệu quả. Gần đây có nghiên cứu của tác giả Vũ Công Thành và cộng sự báo cáo thống kê đánh giá tình trạng nguy cơ các dị tật bẩm sinh của các thai phụ một cách cụ thể tại Bệnh viện Đa khoa Medlatec. Ngoài ra có một số nghiên cứu về xác định giá trị trung vị của AFP với kỹ thuật định lượng AFP nano của tác giả Võ Thị Mỹ Duyên và cộng sự. Định lượng AFP, HCG, uE3 trong huyết thanh mẹ bằng phương pháp miễn dịch hóa phát quang là kỹ thuât mới, cho độ chính xác cao hơn kỹ thuật Elisa kinh điển. Hiện tại chưa có báo cáo nào đánh giá việc ứng dụng giá trị trung vị mới trong sàng lọc trước sinh. Vì vậy thực hiện nghiên cứu này là việc cần thiết [5, 7, 9].. CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Đối tượng nghiên cứu Đối tượng nghiên cứu của đề tài là những thai phụ có thai từ tuần thứ 15 đến 19 đến làm xét nghiệm sàng lọc trước sinh tại Labo sàng lọc trước sinh Thái hà, Bộ môn Y Sinh học – Di truyền Đại học Y Dược Hải Phòng, Bệnh viện phụ sản Trung Ương, Bệnh viện phụ sản Hà Nội, Bộ môn Y Sinh học Di truyền Đại học Y Hà Nội từ năm 2010 đến 2014. 2.1.1.Tiêu chuẩn lựa chọn đối tượng nghiên cứu: - Là phụ nữ có thai từ tuần thứ 15 đến 19. - Là người Việt Nam, dân tộc Kinh; - Thai được thụ tinh tự nhiên; - Đơn thai - Có kết quả siêu âm thai và được theo dõi sau khi sinh con bình thường. 2.1.2. Tiêu chuẩn loại trừ đối tượng nghiên cứu: Để thiết lập giá trị trung vị từ nhóm đối tượng nghiên cứu, chúng tối đã loại trừ các yếu tố sau: Thai phụ mắc bệnh tiểu đường, nhiễm HIV, các bệnh về gan (viêm gan, ung thư gan) và các bệnh cấp tính khác (nhiễm Rubella ). Thai phụ có tiền sử sản khoa bất thường như sảy thai, thai chết lưu ≥ 2 lần, có thai hoặc sinh con bị dị tật. Thai thụ có thai do thụ tinh nhân tạo. Thai phụ nghiện thuốc lá, rượu hoặc tiếp xúc với các yếu tố có hại như tác nhân vật lý, hóa chất độc hại[5] 2.1.3.Cỡ mẫu nghiên cứu * Cỡ mẫu để thiết lập giá trị trung vị Cỡ mẫu cần thiết để thiết lập giá trị trung vị được tính theo công thức sau [7] (ví dụ tính cho AFP tại tuần thai 15): Trong đó: Z1-a/2: hệ số tin cậy, với độ tin cậy 95%, Z1-a/2 = 1,96. d: sai số ước lượng lấy là 5%. s: độ lệch chuẩn. Theo số liệu của phần mềm Prisca [46], giá trị trung vị và s của AFP, HCG, uE3 huyết thanh mẹ ở các tuần thai 15 à19 như sau (bảng 2.1): Áp dụng công thức, cỡ mẫu cần thiết để tính giá trị trung vị AFP, HCG và uE3 của người Việt Nam từ 124 – 168 thai phụ cho một tuần thai. Trong nghiên cứu, chúng tôi tính median của 4679 thai phụ, tuổi thai từ 15 - 19 tuần. * Cỡ mẫu sàng lọc và chẩn đoán trước sinh Cỡ mẫu nghiên cứu được tính theo công thức sau [7]: Trong đó: a là mức ý nghĩa thống kê = 0,05 tương ứng hệ số tin cậy Z1-a/2 = 1,96. e là sai số cho phép giữa tỷ lệ thu được của mẫu nghiên cứu với tỷ lệ của quần thể được chọn, thường lấy giá trị 20%. p là con số kinh nghiệm dựa vào kết quả nghiên cứu trước. q = 1 – p Trong nghiên cứu, cỡ mẫu của chúng tôi lên đến 6454 2.2. Phương pháp nghiên cứu 2.2.1. Loại hình nghiên cứu: Nghiên cứu ngang mô tả . Địa điểm nghiên cứu: Trường Đại học Y Dược Hải Phòng, Labo Sàng lọc trước sinh Thái Hà, bệnh viện Phụ sản Trung Ương, bệnh viện Phụ sản Hà Nội. 2.2.2. Quy trình nghiên cứu Để xác định giá trị trung vị của AFP, hCG, uE3 của huyết thanh thai phụ tại mỗi độ tuổi thai, chúng tôi tiến hành tuần tự theo các bước sau Lấy mẫu, tách huyết thanh đúng qui trình Định lượng AFP, hCG , uE3 huyết thanh mẹ Sàng lọc dương tính Sàng lọc âm tính Chọc ối làm xét nghiệm NST Lập hồ sơ các thai phụ đủ tiêu chuẩn NC (6554 thai phụ) Xử lý số liệu, viết báo cáo Theo dõi sau sinh hoặc sau can thiệp Hình 9: Quy trình nghiên cứu 2.2.2.1. Lập hồ sơ các thai phụ làm xét nghiệm sàng lọc trước sinh 2.2.2.1 Lập hồ sơ các thai phụ Lập hồ sơ cho tất cả các thai phụ khi đến làm xét nghiệm sàng lọc trước sinh. Khai thác đầy đủ thông tin Khi các thai phụ đến làm xét nghiệm sàng lọc trước sinh, chúng tôi đề nghị thai phụ điền thông tin vào phiếu hồ sơ dành cho xét nghiệm sàng lọc trước sinh. Cụ thể là những thông tin sau [phụ lục 2]: - Họ tên, ngày sinh, địa chỉ của thai phụ - Cân nặng/ chiều cao, - Hình thức thụ thai: có thai tự nhiên hay có hỗ trợ sinh sản - Số lượng thai - Có tiền sử bản thân, gia đình hay yếu tố tiếp xúc có độc hại hay không: + Có hút thuốc/ uống rượu hay không? + Tình trạng bệnh tật: có ốm sốt, bị các bệnh gan, tiểu đường - Kết quả siêu âm đo được: Chiều dài đầu mông, tuổi thai, độ mờ da gáy, đường kính lưỡng đỉnh, kết quả khảo sát các bộ phận 2.2.2.2 Lấy máu thai phụ và tách huyết thanh thai phụ Quy trình lấy máu, tách huyết thanh xét nghiệm sàng lọc trước sinh được thực hiện theo các bước sau: - Cho thai phụ khai đầy đủ thông tin vào tờ hồ sơ xét nghiệm sàng lọc. - Lấy 3ml máu vào ống chông đông - Ly tâm (3000 vòng/phút × 5 phút) tách huyết thanh trong vòng 15 phút, đảm bảo huyết thanh đã tách sợi huyết (bảo quản lạnh 40C nếu chưa kịp xử lý). - Hút huyết thanh ra tuýp riêng (ống efendorf hoặc ống nắp trắng không có chất chống đông). - Bảo quản huyết thanh đã tách trong tủ lạnh âm 200C 2.2.2.3. Định lượng AFP, HCG, uE3 trong huyết thanh thai phụ Định lượng AFP, HCG, uE3 trong huyết thanh thai phụ được thực hiện tại Labo Sàng lọc trước sinh Thái Hà và Bộ môn Y sinh học - Di truyền, trường Đại học Y Dược Hải Phòng. 2.2.2.3.1. Kỹ thuật định lượng AFP, HCG, uE3 trong huyết thanh thai phụ Định lượng AFP, HCG, uE3 trong huyết thanh thai phụ được thực hiện bằng máy Immulite 2000 của hãng Siemen (Mỹ). Nguyên lý định lượng ba chất AFP, HCG, uE3 trong huyết thanh mẹ: - Định lượng AFP và HCG bằng phương pháp sandwich (hình 2.2): nồng độ cao kháng thể kháng nguyên kháng thể gắn chất phát quang nồng độ thấp Hình 10: Nguyên lý phương pháp miễn dịch hoá phát quang sandwich [46] Bước 1: AFP/ HCG của thai trong huyết thanh mẹ gắn với kháng thể đặc hiệu AFP/ HCG. Bước 2: Bổ sung enzym có gắn gốc hoá chất phát quang. Phức hợp kháng thể - AFP/HCG gắn với enzym có gốc phát quang tạo thành phức hợp đặc hiệu: kháng thể - AFP/HCG – enzym gắn gốc hoá chất phát quang. Bước 3: Rửa loại hết hoá chất dư. Bổ sung dung dịch hiển thị màu, đo mức độ hiển thị màu. Nồng độ AFP/ HCG tỷ lệ thuận với mức độ hiển thị màu. - Định lượng uE3 bằng phương pháp cạnh tranh (competitive) (hình 2.3): kháng thể kháng nguyên kháng nguyên và kháng thể gắn chất phát quang nồng độ thấp nồng độ cao Hình 11: Nguyên lý phương pháp miễn dịch hoá phát quang cạnh tranh [46] Bước 1: uE3 của thai trong huyết thanh mẹ gắn với kháng thể trên bi. Bước 2: bổ sung enzym có gắn gốc hoá chất phát quang, enzym có gắn chất phát quang sẽ gắn vào phần kháng thể còn dư trên giá đỡ. Bước 3: Rửa trôi phần hoá chất còn dư, bổ sung dung dịch hiển thị màu, đo mức độ hiển thị màu. Nồng độ uE3 tỷ lệ nghịch với mức độ hiển thị màu. Mức độ hiển thị màu được đo bằng mật độ quang hấp thụ ở ba bước sóng 450nm hay 450/650 nm hay 450/690nm. Trước khi tiến hành đo định lượng mẫu huyết thanh của thai phụ, với mỗi một đợt hóa chất đưa vào hệ thống định lượng, việc thực hiện hai bước chuẩn hóa kỹ thuật là chuẩn adjuster và chuẩn QC (Quallity control). Chuẩn adjuster là được chuẩn lại đường biểu thị giữa mật độ quang hấp thụ hay CPS với nồng độ chất đo. Chuẩn adjuster được thực hiện đo chỉ số CPS của kháng nguyên từng chất cần đo với hai mức nồng độ cao và thấp. Mỗi nồng độ được đo lặp lại 4 lần, dựa vào sự sai số giữa các lần đo từ đó máy sẽ hiệu chỉnh lại đường cong chuẩn trong máy. Sau khi chuẩn lại chính xác đồ thị đường biểu thị mật độ quang hấp thụ với nồng độ chất đo rồi, cần thiết phải đo lại với mẫu huyết thanh chuẩn để kiểm tra lại đồ thị đã hiệu chỉnh. Chuẩn QC (Quallity control) là kiểm tra kết quả đo đạc của máy bằng huyết thanh mẫu đã biết chính xác nồng độ các chất. Bước chuẩn này gọi là chuẩn QC (Quallity control) với 3 nồng độ ở ba mức cao, trung bình, thấp đo lặp lại 4 lần. Nếu chuẩn QC chính xác thì đảm bảo được đo nồng độ huyết thanh bệnh nhân chính xác. 2.2.2.4. Theo dõi sau sinh hoặc sau can thiệp 6454 thai phụ đều được theo dõi cho đến sau sinh hoặc sau can thiệp đình chỉ thai. Kết quả theo dõi được đối chiếu lại với kết quả của sàng lọc và chẩn đoán xác định để đánh giá giá trị của các xét nghiệm sàng lọc và kiểm chứng lại kết quả chẩn đoán xác định. Quá trình theo dõi được kết hợp với các bệnh viện Phụ Sản Trung Ương, Phụ Sản Hà Nội, Phụ Sản Hải Phòng và khoa Sản của một số bệnh viện khác theo dõi tình hình sinh con dị tật tại các bệnh viện này. Những trường hợp sau sinh có nghi ngờ bất thường NST được làm các xét nghiệm chẩn đoán xác định nuôi cấy phân tích NST. 2.2.2.5. Xử lý số liệu * Xử lý số liệu bằng phần mềm Excell 2007 và SPSS 11.0 để lập được đường hồi quy giá trị trung vị cho từng chất AFP, hCG, uE3 Sau khi thu được kết quả đinh lượng AFP, hCG, uE3 trong huyết thanh của từng thai phụ ở từng độ tuổi thai, những kết quả của các thai phụ có hồ sơ không phù hợp được loại bỏ theo tiêu chuẩn nêu ở phần 2.1. Những số liệu này sau đó được đưa dưới dạng file excel. Trên file này, chúng tôi đưa ra giá trị trung vị ở giữa các tuần thai 15 đến 19 và đường hồi quy median của AFP/hCG/ uE3 theo tuổi thai dựa vào phần mềm thống kê SPSS. Để giảm bớt sự sai khác về nồng độ các chất do đặc điểm sinh lý của mẹ, giá trị median được hiệu chỉnh theo cân nặng mẹ bằng phần mềm Prisca. Giá trị median của các chất AFP/ hCG/ uE3 biến động theo cân nặng của thai phụ nên cần được hiệu chỉnh. Sau khi có đủ số liệu ít nhất có khoảng từ 124 – 168 thai phụ trở lên cho một tuần thai, thì dùng phần mềm mô tả thống kê tính giá trị trung vị cho giữa tuần mỗi tuần thai và đưa ra đường cong, phương trình hồi quy của nó theo tuổi thai. Các giá trị trung vị của AFP/ hCG/ uE3 được tính theo phương trình hồi quy số mũ: y = exp (a + b*x) y: là giá trị trung vị định lượng của AFP/ hCG/ uE3 x: là tuôi thai nhi tính theo ngày. * Cập nhập giá trị trung vị mới để xác định nguy cơ cho mỗi thai phụ tham gia sàng lọc trước sinh Đường hồi quy median mới theo tuần thai của các chất trong bộ xét nghiệm tripletest sẽ được áp dụng vào để tính nguy cơ dị tật của thai. Để tính nguy cơ dị tật của, kết quả định lượng hóa sinh huyết thanh của thai phụ sẽ được so sánh với giá trị trung vị của từng chất AFP/hCG/ uE3 theo tuổi thai để tìm bội số của giá trị trung vị (MoM – multiple of Median) theo công thức: MoM (Multiple of Median) = Kết quả định lượng AFP/ HCG/ uE3 huyết thanh mẹ Median AFP/ HCG/ uE3 Để giảm bớt sự sai khác về nồng độ các chất do đặc điểm sinh lý của mẹ, giá trị median được hiệu chỉnh theo một số yếu tố của mẹ khi mang thai như chủng tộc, cân nặng, tình trạng mẹ bị đái tháo đường, mẹ hút thuốc và hình thức thụ thai bằng phần mềm Prisca 5.020. Trong đó quan trọng nhất là cân nặng mẹ: phụ nữ nhẹ cân có nồng độ các chất trong huyết thanh cao hơn rõ rệt. Giá trị median được hiệu chỉnh cân nặng của mẹ theo công thức và bảng dưới đây. MoMhiệu chỉnh= 1/[(a+b/kg cân nặng)] * MoM Bảng 4: Giá trị hiệu chỉnh cân nặng a và b [45] a b AFP 0,28152 48,38095 HCG 0,41667 39,21723 uE3 0,73482 17,78367 Dựa trên các giá trị MoM đã được hiệu chỉnh này, phần mềm Prisca tính nguy cơ xác định tỉ lệ nguy cơ cho từng thai phụ. Trong phần mềm Prisca, giá trị MoM được hiệu chỉnh theo từng trường hợp cụ thể về cân nặng của mẹ, số lượng thai, hình thức thụ thai, bệnh lý tiểu đường của mẹ, tình trạng mẹ hút thuốc hay không. Từ