Luận văn Xác định hiệu suất, đặc trưng tính chất của dịch oligo carrageenan từ rong sụn kappaphycus alvarezii thủy phân bằng axit

cả mono-, oligo- và polysacarit-) có độ dịch chuyển hóa học nằm trong khoảng từ 1-6 ppm. Các proton anomeric của mỗi monosacarit có độ dịch chuyển hóa học phụ thuộc vào cấu dạng α- hoặc β- của chúng. Ví dụ, hầu hết các proton của α-anomeric xuất hiện trong vùng từ 5-6 ppm, trong khi đó các proton β-anomeric xuất hiện ở vùng 4-5 ppm. Mặc dù phổ 13C-NMR có tín hiệu yếu hơn nhiều, nhƣng lại có nhiều thuận lợi hơn phổ 1H-NMR trong phân tích cấu trúc của polysacarit do các tín hiệu trong phổ 13C-NMR có độ dịch chuyển hóa học rộng hơn (0-220 ppm) so với phổ 1HNMR. Vì vùng giá trị  lớn nên các tín hiệu ít chồng lấp lên nhau nhƣ trong phổ proton NMR. Các tín hiệu của C-anomeric trong phổ 13C-NMR thƣờng xuất hiện trong vùng từ 90-100 ppm, trong khi đó các tín hiệu của C- nonanomeric xuất hiện trong vùng từ 60-85 ppm. Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân một chiều 13C và 1H của polysacarit thƣờng có độ phân giải thấp, các tín hiệu trùng lấp nhau khi trong phân tử của chúng có chứa nhiều gốc đƣờng tƣơng tự nhau. Điều này gây ra rất nhiều khó khăn trong việc giải thích chi tiết cấu trúc của polysacarit. Khi đó, phổ cộng hƣởng từ hạt nhân hai chiều sẽ giúp xác định thêm những thông tin về các liên kết trong phân tử, thông qua các tƣơng tác giữa proton với proton và giữa proton với cacbon. Phổ 1H, 1H-COSY (Correlation spectroscopy) biểu diễn mối tƣơng quan giữa 1H và 1H của hạt nhân cùng loại, phổ 1H, 13C-COSY (hay cũng đƣợc gọi là phổ HMQC (Heteronuclear Multiple Quantum Correlation) hay HECTOR (Heteronuclear Correlated Spectroscopy)) biểu diễn mối tƣơng quan giữa 1H và 13C của các hạt nhân khác loại. Phổ hai chiều 2D-NOESY (Nuclear Overhauser Effect Spectroscopy) thể hiện sự tƣơng tác về mặt không gian của các proton nằm trên các nguyên tử cacbon ở cách xa nhau nhƣng khoảng cách không gian giữa chúng nhỏ hơn 4Å. Phổ 2D-HMBC (Hecteronuclear Multiple Bond Coherence) thể hiện mối tƣơng quan của tín hiệu 1H ở một nguyên tử 13C với tín hiệu của nguyên tử 13C khác cách xa nó 2 37 hoặc 3 liên kết, ngƣợc lại phổ 13C-1H HMQC hay HETCOR thể hiện mối tƣơng tác của 1H với 13C liên kết trực tiếp với nhau. Phổ 2D-TOCSY (Totally Correlated Spectroscopy) là phổ tƣơng quan toàn phần biểu diễn sự tƣơng quan của các proton liên kết và không liên kết trực tiếp nhƣng trong cùng một hệ spin giống nhau. Ví dụ: tất cả proton của một gốc đƣờng là thuộc cùng một hệ spin giống nhau. Tóm lại, phổ cộng hƣởng từ hạt nhân hai chiều sẽ cho ta thêm những thông tin để xác định trình tự và vị trí của các liên kết trong phân tử polysacarit thông qua các tƣơng tác giữa proton với proton và proton với cacbon trong các liên kết trực tiếp đồng hạt nhân hoặc các liên kết dị hạt nhân không trực tiếp. 1.4.4.3. Phương pháp phổ khối lượng (MS) [48] Phổ khối là kỹ thuật phân tích dựa trên việc xác định số khối của các phân tử hoặc các mảnh phân tử mang điện tích. Nó là một trong những phƣơng pháp quan trọng trong phân tích cấu trúc của các polysacarit. Việc ứng dụng các phƣơng pháp phân tích khối phổ hiện đại trong phân tích cấu trúc của hợp chất carbohydrate phức tạp đã dẫn đến những tiến bộ nhanh chóng trong lĩnh vực khoa học sự sống suốt hai thập kỷ qua của thế kỷ 21. Các kỹ thuật ion hóa truyền thống nhƣ: ion hóa bằng va chạm điện tử, ion hóa hóa học, là những kỹ thuật ion hóa chỉ sử dụng đƣợc cho các hợp chất dễ bay hơi. Các kỹ thuật ion hóa mới nhƣ: bắn phá nguyên tử nhanh (fast atom bombardment-FAB), ion hóa phun mù điện tử (electrospray ionizationESI) và gần đây là kỹ thuật ion hóa phản hập thụ laser đƣợc hỗ trợ bởi chất nền (matrix-assisted laser desorption ionization-MALDI) đã đƣợc phát triển để ứng dụng phân tích cấu trúc của các hợp chất không bay hơi nhƣ các oligosacarit, các hợp chất polysacarit trọng lƣợng phân tử nhỏ, protein, glycoprotein và các glycolipid. Các kỹ thuật ion hóa mới có khả năng ứng dụng phân tích đƣợc nhiều hợp chất hơn với độ nhạy và độ chính xác khối cao hơn các kỹ thuật ion hóa truyền thống. Hiện nay, cấu trúc của nhiều hợp chất polymer sinh học phức tạp đã đƣợc phân tích thành công nhờ ứng dụng các kỹ thuật phân tích khối phổ hiện đại này 38 Đặc trưng tính chất của oligo carrageenan có thể được xác định bằng nhiều phương pháp khác nhau, tuy nhiên với mục tiêu của đề tài là ứng dụng sản phẩm thủy phân oligo carrageenan dùng làm phân bón lá cho cây trồng, vì vậy xác định trọng lượng phân tử trung bình và xác định đặc trưng cấu trúc carrageenan được xem là lựa chọn giới hạn thích hợp đối với nội dung nghiên cứu của luận văn. Qua quá trình thực nghiệm, tác giả nhận thấy dịch oligo sau thủy phân có độ nhớt rất thấp (tương đương với độ nhớt của nước ở nhiệt độ thường) nên rất khó để áp dụng phương pháp đo độ nhớt để xác định trọng lượng phân tử trung bình. Vì vậy phương pháp sắc ký thẩm thấu gel (GPC) được lựa chọn làm phương pháp để xác định trọng lượng phân tử trung bình của oligo carrageenan. Bên cạnh đó, một trong những ưu điểm quan trọng nhất của phương pháp phổ hồng ngoại vượt hơn những phương pháp phân tích cấu trúc khác (nhiễu xạ tia X, cộng hưởng từ điện tử...) là phương pháp này cung cấp thông tin về cấu trúc phân tử nhanh, không đòi hỏi các phương pháp tính toán phức tạp. Vì vậy, trong khuôn khổ đề tài luận văn với đối tượng nghiên cứu là carrageenan từ rong sụn Kappaphycus alvarezii đã được nghiên cứu rộng rãi, phương pháp phổ hồng ngoại được xem là phương pháp thích hợp và được sử dụng để xác định cấu trúc đặc trưng của carageenan. 39 2CHƢƠNG 2. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU Đối tƣợng nghiên cứu là rong sụn Kappaphycus alvarezii (Doty) Doty, nuôi trồng và khai thác tại huyện Ninh Hải tỉnh Ninh Thuận vào tháng 6 năm 2018. 2.2. HÓA CHẤT: H2SO4, HCl, HNO3, axit ascorbic, NaOH, KOH, cồn 96 0 và một số hóa chất khác. Các hóa chất đều đảm bảo độ tinh sạch sử dụng trong phân tích. 2.3. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.3.1. Phƣơng pháp phân tích thành phần hóa học rong sụn 2.3.1.1. Phân tích protein thô [46] Protein thô đƣợc xác định bằng phƣơng pháp micro Kjeldahl, đƣa vào bình nón chịu nhiệt 1 g mẫu rong, thêm vào đó 30 mL dung dịch H2SO4 đậm đặc, tiếp theo 10 g K2SO4 và 1 g CuSO4. Ban đầu hỗn hợp đƣợc đun nhẹ cho đến khi hết sủi bọt thì đƣợc tăng mạnh lên. Khi dung dịch trở nên không màu hoặc trong suốt, đƣợc đun thêm 1 h nữa, để nguội, pha loãng với nƣớc cất và chuyển vào bình Kjeldahl 800 mL. Đƣa vào bình 3 hoặc 4 hạt kẽm kim loại và 100 ml dung dịch NaOH 40 % và bình đƣợc nối với đầu phun của thiết bị chƣng cất. Tiếp theo đƣa 25 ml dung dịch H2SO4 0,1 N vào trong bình hứng và chƣng cất. Khi hai phần ba lƣợng chất lỏng đã đƣợc chƣng cất, kiểm tra xem phản ứng đã xảy ra hòa toàn chƣa. Bình thu đƣợc lấy ra chuẩn với dung dịch NaOH nồng độ 0,1 N. Từ lƣợng H2SO4 bị mất đi xác định hàm lƣợng nitơ. Sau đó chuyển đổi về hàm lƣợng protein: Tính kết quả Protein tổng số của rong biển đƣợc tính bằng công thức sau: mProtein = mNitrogen x 6,25 2.3.1.2. Phân tích lipid thô [47] Tách lipid từ mẫu: 40 Cân 1 g mẫu đã đƣợc bằm nhuyễn và trộn đều, cho vào ống thuỷ tinh vial cao thể tích 20 mL. Cho thêm 600 μl nƣớc cất, 5 mL methanol, 10 mL chloroform và 200 μL BHT (Butylated hydroxy toluen). Ngâm mẫu trong dung môi khoảng 10 phút. Đồng hóa mẫu bằng máy trong 1 phút. Đổ vào ống xilanh có lót tấm giấy lọc GF/C ở dƣới đáy cho dịch mẫu chảy xuống hết hoàn toàn. Cho thêm 5mL methanol và 10 mL chloroform vào vial và đồng hóa mẫu trong 20 giây. Đổ dung dịch này vào xilanh, cho mẫu đƣợc lọc hết hoàn toàn. Sử dụng pitton xilanh để ép tống dung dịch còn lại trong xilanh xuống phễu chiết 100 mL. Cho thêm 7,5 mL NaCl 0,9 % vào phễu chiết chứa dịch mẫu. Đảo trộn ngƣợc phễu chiết nhiều lần và giữ mẫu ở 5 oC trong khoảng 4 giờ để dịch mẫu phân chia thành 2 lớp. Chiết rút dung dịch lipid Tách lớp dƣới (chứa hàm lƣợng lipid hòa tan trong dung môi) cho chảy vào phễu chiết thể tích 50 ml. Loại bỏ lớp dịch phía trên (chứa phần hỗn hợp gồm các tạp chất đƣợc loại nhƣ nƣớc, muối, protein.). Xác định thể tích chiết ở trên (V). X = ¼ V (mL) Cho thêm 5 mL MeOH 50 % vào mỗi mẫu trong phễu chiết 100 mL. Đảo trộn ngƣợc phễu chiết nhiều lần. Cho phân chia tách thành 2 lớp và lắng qua đêm ở 5 oC. Định lƣợng lipid Lớp dƣới đƣợc rút chảy xuống bình cầu 100 mL. Cô quay chân không làm bay hơi dung môi trong bình cầu ở 37oC đến khi còn lại thể tích khoảng 1 mL. Hòa tan mẫu lại ngay lập tức bằng một lƣợng thể tích nhỏ chloroform (chỉ cho phép tiếp xúc rất nhỏ lƣợng mẫu đã làm khô với không khí). Chuyển lƣợng mẫu qua bình định mức 5 mL, tráng rửa bình cầu nhiều lần và định mức bằng chloroform vừa đủ 5 mL. Sau khi xử lý xong, dung dịch này đƣợc mang đi xác định hàm lƣợng lipid tổng. Dung dịch này có thể lƣu giữ trong tủ đông –20 oC. Xác định hàm lƣợng lipid tổng 41 Lấy chính xác 2 mL dung dịch mẫu đã xử lý cho vào một ống thuỷ tinh có nắp 4 mL đã đƣợc sấy chân không và cân với lƣợng không đổi, làm khô bằng khí nitơ. Cho vào tủ sấy chân không đến khối lƣợng không đổi, áp suất khoảng 65-70 psi trong một giờ. Lipid tổng số (%) tính theo công thức: % Xt (g/g) = [(m1 - m0).Vdm.100] / m.Vm % Xk (g/g) = [(m1 - m0).Vdm.100] / m.T.Vm Xt: Hàm lƣợng lipid tổng số tính theo trọng lƣợng tƣơi của mẫu Xk: Hàm lƣợng lipid tổng số tính theo trọng lƣợng khô của mẫu m1: Trọng lƣợng cân ống vial và mẫu sau sấy (g). m0: Trọng lƣợng cân ống vial khối lƣợng không đổi (g). m: Trọng lƣợng cân mẫu (g). Vdm: Thể tích định mức sau xử lý (mL) Vm: Thể tích mẫu sau xử lý lấy để sấy (mL) T: thành phần khô của mẫu, T = (100 - W)/100 W: Độ ẩm của mẫu (%) 2.3.1.3. Phân tích hàm lượng tro [46] Chén nung đƣợc rửa sạch và nung ở nhiệt độ 550 ÷ 600 oC đến khối lƣợng không đổi, sau đó cân mẫu rong 1,0 g cho vào cốc nung, đem đun trên bếp điện đến khi hóa than đen. Sau khi hóa than ta chuyển vào lò nung ở nhiệt độ 550 ÷ 600 oC để hóa tro hoàn toàn (chuyển màu trắng), lặp lại ít nhất 2 lần và cân đến khối lƣợng không đổi. Tính kết quả Tính ra tỷ lệ % của tro chứa trong rong biển theo công thức sau: X (%) = (A - B).100 / m A: Khối lƣợng chén nung + tro (g) 42 B: Khối lƣợng chén nung (g) m: Số gam rong biển dùng để thí nghiệm. 2.3.1.4. Phân tích độ ẩm [46] Sấy cốc đến khối lƣợng không đổi: Rửa sạch cốc, để khô, sấy ở nhiệt độ 130 oC trong khoảng 1 giờ, lấy ra làm nguội trong bình hút ẩm, cân, tiến hành sấy tiếp ở nhiệt độ 130 oC khoảng 1 giờ, làm nguội trong bình hút ẩm, cân, sấy tiếp đến khi nào khối lƣợng cốc giữa hai lần cân không lệch nhau quá 5.10 -4 là đƣợc. Cân chính xác 1,0 g rong biển khô (đã cắt nhỏ) cho vào cốc sấy đã xác định khối lƣợng không đổi. Chuyển cốc vào tủ sấy, sấy ở nhiệt độ 80 oC trong 30 phút. Sau đó nâng nhiệt độ lên 130 oC trong 1 giờ. Sau đó lấy ra để nguội trong bình hút ẩm, cân khối lƣợng rồi tiếp tục cho vào tủ sấy trong thời gian 1 giờ, lấy ra để nguội ở bình hút ẩm và cân nhƣ trên cho tới khi khối lƣợng không đổi. Kết quả giữa 2 lần cân không lệch nhau quá 0,5 mg cho mỗi mẫu chất thử. Tính kết quả Độ ẩm tính theo % X = Hiệu số khối lƣợng mẫu trƣớc và sau khi sấy / Khối lƣợng mẫu trƣớc khi sấy Carbohydrate tổng số: Carbohydrate (%) = 100 - (% độ ẩm+ % protein+ % lipid +% tro) [52] 2.3.2. Phƣơng pháp chiết carrageenan Bột rong sụn đƣợc cho vào nƣớc máy sạch với tỉ lệ bột rong : nƣớc = 1 :50 và đun nóng đến nhiệt độ 80 – 90 0C, khuấy trộn liên tục cho đến khi rong nát. Sau khi lọc nóng, dịch chiết đƣợc để riêng và để nguội đến 400C, tủa carrageenan từ dịch chiết bằng cồn với tỉ lệ cồn : dịch chiết = 1 : 3. Tiếp tục lọc lấy tủa carrageenan và đem đi sấy ở 60 0C cho đến khi khối lƣợng không đổi, sau nghiền ta đƣợc bột carrageenan. 43 2.3.3. Phƣơng pháp thủy phân tạo oligo carrageenan Thủy phân carrageenan bằng phƣơng pháp hóa học sử dụng xúc tác axit hữu cơ là axit ascorbic và axit vô cơ là axit sulfuric với các điều kiện thủy phân nhƣ nồng độ axit, nhiệt độ và thời gian khác nhau. Với các quy trình thủy phân tham khảo từ các kết quả nghiên cứu của Faiqah Abd-Rahim và cộng sự, 2014 [19], Anna Kaminska-Dwórznicka và cộng sự, 2015 [53], Sang-Bum Lee và cộng sự, 2016 [18]: có thể thấy rằng nhiệt độ thủy phân dao động trong khoảng 60 OC đến 200 OC, thời gian thủy phân dao động trong khoảng 60 đến 180 phút. Để thuận lợi trong quá trình nghiên cứu cũng nhƣ phù hợp với thực tế, điều kiện thủy phân ban đầu là thời gian 90 phút và nhiệt độ 90 OC đƣợc sử dụng trong quá trình khảo sát ảnh hƣởng của nồng độ axit. Dịch oligo-carrageenan sau thủy phân đƣợc xác định hàm lƣợng carbohydrat tổng và trọng lƣợng phân tử trung bình. 2.3.4. Phƣơng pháp phân tích hàm lƣợng carbohydrat tổng - Xác định carbohydrate tổng số bằng phƣơng pháp phenol-sulfuric acid [48]. 2.3.5. Phƣơng pháp phân tích trọng lƣợng phân tử bằng phƣơng pháp sắc ký thẩm thấu gel (GPC) Phân tích trọng lƣợng phân tử bằng phƣơng pháp sắc ký thẩm thấu gel (GPC) đƣợc thực hiện tại Viện Công nghệ Hóa học TPHCM. 2.3.6. Phƣơng pháp phân tích đặc trƣng cấu trúc carrageenan bằng phổ IR Phổ hồng ngoại (IR) đƣợc đo trên máy FT-IR Bruker Viện Công nghệ Hóa học TPHCM. 44 2.4. THỰC NGHIỆM 2.4.1. Sơ đồ bố trí thí nghiệm Hình 2.1. Sơ đồ bố trí thí nghiệm Chiết bột rong:nƣớc = 1:50, 90 0 C, 3 - 4 giờ Carrageenan nguyên liệu Thủy phân Dịch Oligo Carrageenan Bột oligo Carrageenan Thu hồi Xử lý, xay nhuyễn Bột rong Xác định KLPTTB trƣớc thủy phân (GPC) và phổ IR Thí nghiệm thăm dò tìm giá trị trung tâm trên mỗi yếu tố: nồng độ axit, nhiệt độ, thời gian Quy hoạch tối ƣu hóa các điều kiện thủy phân Thử nghiệm phun bón lá trên cây ngô Rong sụn Kappaphycus alvarezii (Doty) Doty Đánh giá sản phẩm thủy phân Đánh giá khả năng kích thích sinh trƣởng: chiều cao cây và năng suất hạt Xác định hiệu suất thủy phân theo hàm lƣợng carbohydrat tổng Xác định thành phần hóa học Độ ẩm Tro Lipit Carbohydrat tổng Protein Xác định KLPTTB sau thủy phân (GPC) Xác định đặc trƣng cấu trúc (IR) 45 2.4.1.1. Thu và xử lý nguyên liệu Hình 2.2. Qui trình xử lý rong biển trƣớc khi chiết carrageenan Giải thích quy trình Rong sụn khô Kappaphycus alvarezii (Doty) Doty đƣợc thu mua tại các xã tại huyện Ninh Hải tỉnh Ninh Thuận. Cho rong vào nƣớc ngọt ngâm 20-30 phút, vừa ngâm vừa khuấy trộn nhằm rửa mặn và giảm bớt lƣợng tạp chất bám trên rong. Sau đó rong đƣợc sấy khô khoảng 600C cho đến khi lƣợng ẩm còn 5-10 %, rong đƣợc xay nhuyễn chuẩn bị cho quá trình chiết carrageenan. 2.4.1.2. Chiết carrageenan Bột rong sụn đƣợc cho vào nƣớc máy sạch với tỉ lệ bột rong : nƣớc = 1 :50 và đun nóng đến nhiệt độ 80 – 90 0C, khuấy trộn liên tục cho đến khi rong nát. Sau khi lọc nóng, dịch chiết đƣợc để riêng và để nguội đến 400C, tủa Bột rong sụn Kappaphycus alvarezii (Doty) Doty Bột rong sụn Kappaphycus alvarezii (Doty) Doty Ngâm nƣớc 20 – 30 phút Khuấy trộn Sấy khô 60 o C Loại tạp Xay nhuyễn 46 carrageenan từ dịch chiết bằng cồn với tỉ lệ cồn : dịch chiết = 1 : 3. Tiếp tục lọc lấy tủa carrageenan và đem đi sấy ở 60 0C cho đến khi khối lƣợng không đổi, sau nghiền ta đƣợc bột carrageenan. Hình 2.3. Qui trình chiết carrageenan từ bột rong sụn Kappaphycus alvarezii (Doty) Doty Rong sụn Kappaphycus alvarezii Bột rong sụn Kappaphycus alvarezii Bột rong sụn Kappaphycus alvarezii (Doty) Doty Bột carrageenan nguyên liệu Lọc nóng Tỉ lệ rong:nƣớc = 1:50, 900C, 3 - 4 giờ Tủa cồn 960, tỉ lệ dịch chiết : cồn = 1:3 Lọc Bã Sấy khô 600C Cồn thu hồi 47 Bột Carrageenan Bột oligo carrageenan Hình 2.4. Sản phẩm bột oligo carrageenan trƣớc và sau khi thủy phân 2.4.2. Thủy phân rong sụn bằng các axít ở các điều kiện khác nhau 2.4.2.1. So sánh hiệu suất thủy phân theo nồng độ axit Hình 2.5. Qui trình thủy phân các loại axit theo nồng độ Bột carrageenan nguyên liệu Lựa chọn nồng độ axit thích hợp Thủy phân: Bột carrageenan: 2 % (w/v); Xúc tác axit: H2SO4, C6H8O6 (axit ascorbic) Thời gian: 90 phút Nhiệt độ: 90 0C; Nồng độ axit (M) Xác định hiệu suất dựa trên hàm lƣợng carbohydrat tổng 0,05 0,3 0,1 0,4 0,2 48 2.4.2.2. So sánh hiệu suất thủy phân các loại axit theo thời gian Hình 2.6. Qui trình thủy phân các loại axit theo thời gian Carrageenan dạng bột với hàm lƣợng 2 % (w/v) đƣợc thủy phân hóa học bằng xúc tác axit với hai loại axit hữu cơ (axit ascorbic) và axit vô cơ (axit sulfuric) ở các điều kiện thủy phân khác nhau. Sau quá trình thủy phân, đánh giá hiệu suất thủy phân dựa trên hàm lƣợng carbohydrat tổng, từ đó lựa chọn giá trị trung tâm của các điều kiện thủy phân để thực hiện quá trình tối ƣu hóa. Lựa chọn thời gian thủy phân thích hợp Thủy phân: Bột carrageenan: 2 % (w/v); H2SO4, C6H8O6,: Nồng độ lựa chọn Nhiệt độ: 90 0C; Thời gian (phút) Xác định hiệu suất dựa trên hàm lƣợng carbohydrat tổng 30 120 60 150 90 Bột carrageenan nguyên liệu 49 2.4.2.3. So sánh hiệu suất thủy phân các loại axit theo nhiệt độ Hình 2.7. Qui trình thủy phân các loại axit theo nhiệt độ 2.4.3. Thu hồi oligo carrageenan Dịch sau khi thủy phân bằng phƣơng pháp thủy phân với xúc tác axit đƣợc đem đi thu hồi oligo-carrageenan bằng phƣơng pháp tủa cồn: tỉ lệ dịch thủy phân:cồn 960 = 1:9, lọc và sấy khô oligo-carrageenan thu đƣợc ở nhiệt độ 60 0C. 2.4.4. Phân tích hàm lƣợng carbohydrat tổng Lấy 200 µl dung dịch cần xác định có hàm lƣợng carbohydrate trong khoảng 20-100 µg/mL, thêm vào 200 µL thuốc thử phenol 5 % lắc đều đến khi dung dịch trở nên trong suốt, thêm tiếp 1 mL axít sulfuric đậm đặc lắc đều Thủy phân: Bột carrageenan: 2 % (w/v); H2SO4, C6H8O6: Nồng độ lựa chọn Thời gian: Thời gian lựa chọn Nhiệt độ (0C) Xác định hiệu suất dựa trên hàm lƣợng carbohydrat tổng 60 80 70 90 Bột carrageenan nguyên liệu Lựa chọn nhiệt độ thủy phân thích hợp 50 rồi đem đun cách thủy trong thời gian 5 phút, lấy ra để nguội, đo độ hấp thụ quang ở bƣớc sóng λ = 490 nm, sử dụng glucose làm chất chuẩn. 2.4.5. Xác định hiệu suất thủy phân và trọng lƣợng phân tử dịch thủy phân [54] Sau quá trình thủy phân, tiến hành lọc dịch thủy phân: xác định hàm lƣợng carbohydrat tổng và tính hiệu suất thủy phân theo công thức: Trọng lƣợng phân tử trung bình của oligo carrageeenan trong dịch sau thủy phân đƣợc xác định bằng phƣơng pháp sắc ký thẩm thấu gel (GPC). 2.4.6. Đƣa ra điều kiện thủy phân tối ƣu cho dịch chiết sau thủy phân Sử dụng phần mềm Design Expert (DE 10.0.8) để thiết lập bài toán tối ƣu dựa trên phƣơng trình hồi quy xác định bằng phƣơng pháp quy hoạch thực nghiệm; là hàm mô tả sự phụ thuộc của hàm lƣợng carbohydrat tổng vào các nhân tố điều kiện thủy phân nhƣ nồng độ axit, thời gian và nhiệt độ thủy phân. Sau bƣớc sàng lọc ban đầu, thí nghiệm theo phƣơng pháp RSM-CCD đƣợc thực hiện để tối ƣu hóa giá trị các yếu tố đang đƣợc nghiên cứu. Đây là phƣơng pháp quy hoạch thực nghiệm nhiều yếu tố dựa trên cơ sở mô hình hình hóa toán học. Nguyên tắc cơ bản của phƣơng pháp đáp ứng bề mặt (RSM) là làm thực nghiệm tại một số điểm của các yếu tố để mô tả kết quả bằng một phƣơng trình hồi quy dạng đa thức bậc 2. Phƣơng trình đó giúp vẽ trên hệ trục tọa độ một đồ thị dạng mặt – gọi là bề mặt đáp ứng, điểm tối ƣu là điểm cực trị của đồ thị đó. 2.4.7. Khảo sát khả năng kích thích sinh trƣởng của dịch oligo carrageenan trên cây ngô. Dịch oligo carrageenan sau khi thu đƣợc từ quá trình thủy phân carrageenan ở các điều kiện tối ƣu, đƣợc xác định trọng lƣợng phân tử trung 51 bình và đặc trƣng cấu trúc hóa học; sau đó đƣợc sử dụng làm phân bón lá và phun trên cây ngô ở các nồng độ carbohydrat khác nhau, quá trình thực nghiệm đƣợc trình bày ở Phụ lục 3. 2.5. XỬ LÝ SỐ LIỆU Hàm lƣợng carbohydrat tổng đƣợc phân tích 3 lần, kết quả lấy trung bình cộng của các lần phân tích, xử lý số liệu bằng phần mềm Excel với hệ số tƣơng quan R ≥ 0,95. Phần mềm Design Expert (DE 10.0.8) đƣợc sử dụng để tối ƣu hóa các điều kiện thủy phân. 52 3CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. THÀNH PHẦN HÓA HỌC RONG SỤN Kết quả phân tích thành phần hóa học của rong Sụn – Kappaphycus Alvarezii đƣợc thể hiện ở Bảng 3.1. Bảng 3.1. Thành phần hóa học của rong Sụn – Kappaphycus alvarezii Thành phần hóa học Tỉ lệ (%) Carbohydrate 53,15 Tro 30,75 Độ ẩm 9,73 Protein 5,72 Lipid 0,65 Kết quả phân tích thành phần hóa học cho thấy rong biển sinh trƣởng tại Ninh Thuận và thu hoạch vào tháng 6 năm 2018 có hàm lƣợng protein nhỏ hơn, hàm lƣợng tro và lipit là tƣơng đƣơng so với các công trình công bố trên thế giới; theo nhƣ Fujiwara và cộng sự [55], Ruperes [56] và Hertreau [57], thì hàm lƣợng protein trong rong đỏ chứa từ 10 đến 47 %, hàm lƣợng tro dao động từ 20 đến 40 % và hàm lƣợng lipit < 4 %. Hàm lƣợng tro cao trong rong biển có liên quan đến khả năng hấp thụ khoáng chất và các nguyên tố vi lƣợng từ môi trƣờng xung quanh. Ngoài ra kết quả này cũng tƣơng đồng với kết quả phân tích thành phần rong sụn Kappaphycus alvarezii thu hoạch tại Ninh Thuận tháng 04 năm 2009 của TS. Bùi Minh Lý và cộng sự [58]: protein 4,5 %, lipit 0,4 %, tro 28,6 %. 53 3.2. HIỆU SUẤT THỦY PHÂN THEO CARBOHYDRAT TỔNG 3.2.1. Ảnh hƣởng của nồng độ axit 3.2.1.1. Đánh giá hiệu suất thủy phân của hai loại axit Kết quả xác định hàm lƣợng carbohydrat tổng theo nồng độ axit đƣợc thể hiện trong Bảng 3.2 cho thấy hàm lƣợng carbohydrat tổng thu đƣợc dao động trong khoảng từ 7,73±0,34 g/L đến 11,12±0,44 g/L. Ảnh hƣởng của nồng độ axit đến hiệu suất thủy phân đƣợc biểu diễn ở hình 3.1 cho thấy thủy phân bằng axit ascorbic tạo ra hiệu suất cao hơn so với axit sulfuric ở tất cả các nồng độ. Khi tăng nồng độ cao hơn 0,2 M thì hiệu suất khi thủy phân bằng axit sulfuric có dấu hiệu tăng chậm, trong khi đó axit ascorbic làm hiệu suất tăng cao. Để xác định ảnh hƣởng của nồng độ đến hiệu suất có mối tƣơng quan hay không, lập phƣơng trình hồi qui Y1 = 40,79 + 36,6*X1 (bảng PL1.1), với Y1 là biến phụ thuộc ứng với hiệu suất thủy phân, X1 là biến độc lập ứng với nồng độ axit ascorbic. Nhƣ vậy quan hệ giữa hiệu suất và nồng độ là mối quan hệ tuyến tính bậc 1, với hệ số hồi qui bằng + 36,6 thì nồng độ axit ascorbic và hiệu suất thủy phân là mối quan hệ thuận. Mặt khác có thể thấy hệ số tƣơng quan R = 0,9785 (0,9 ≤ R ≤ 1) nên có thể kết luận rằng giữa nồng độ axit và hiệu suất thủy phân có mối liên hệ tƣơng quan thuận và rất chặt, hay nói cách khác hàm lƣợng carbohydrat tổng tăng khi nồng độ axit tăng. Cụ thể khi thủy phân rong sụn bằng axit ascorbic 0,05 M đã thu nhận hàm lƣợng carbohydrat tổng là 8,26±0,32 g/L. Khi tăng nồng độ axit lên 0,1 M thì hàm lƣợng carbohydrat tổng thu đƣợc tăng cao lên 9,19±0,38 g/L. Tiếp tục tăng nồng độ lên các khoảng 0,2 và 0,3 M thì hàm lƣợng carbohydrat tổng có xu hƣớng tăng và ở nồng độ axit cao nhất trong phạm vi nghiên cứu là 0,4 M thì hàm lƣợng carbohydrat tổng tăng lên 11,12±0,44 g/L, tƣơng ứng với hiệu suất thủy phân 55,6 % (Hình 3.1). Trong khi đó khi sử dụng axit vô cơ, phƣơng trình hồi qui có dạng Y2 = 39,68 + 20,52*X2 (bảng PL1.2) với Y2 là biến phụ thuộc ứng với hiệu suất thủy phân, X2 là biến độc lập ứng với nồng độ axit sulfuric, nhƣ vậy giữa 54 nồng độ axit sulfuric và hiệu suất thủy phân cũng là mối quan hệ tuyến tính bậc 1 và là mối quan hệ thuận do có hệ số hồi qui dƣơng là + 20,52. Với hệ số tƣơng quan R = 0,8762 (0,7 ≤ R < 0,9), thấp hơn so với axit ascorbic, nên có thể kết luận rằng mối phụ thuộc giữa nồng độ axit sulfuric và hiệu suất thủy phân là mối phụ thuộc thống kê (có liên hệ tƣơng quan chặt) và quan hệ thuận với nhau. Hàm lƣợng carbohydrat tổng tăng trong khoảng nồng độ từ 0,05 M đến 0,2 M, tăng 18,11 % (từ 7,73±0,34 g/L lên 9,13±0,08 g/L) và hầu nhƣ tăng chậm trong khoảng từ 0,2 đến 0,4 M, tăng 2,19 % (từ 9,13±0,08 lên 9,33±0,45 g/L). Nhƣ vậy có thể thấy hiệu suất thủy phân khi thủy phân bằng axit ascorbic cao hơn so với axit sulfuric ở cùng nồng độ 0,4 M tƣơng ứng là 55,6 % và 46,65 %, trong khi đó ở cùng nồng độ axit 0,2 M sự chênh lệch hiệu suất thủy phân của hai loại axit không đáng kể, axit ascorbic là 48,6 % và axit sulfuric là 45,65 %. Bảng 3.2. Hàm lƣợng carbohydrat tổng (g/L) sau thủy phân của các loại axit theo nồng độ khác nhau, thời gian 90 phút, nhiệt độ 90 0C, 2 % (w/v) bột carrageenan Để đánh giá giữa hai dãy số liệu từ thực nghiệm có sự khác biệt về trung bình tổng thể mang ý nghĩa thống kê hay không, tiến hành xử lý thống kê bằng phần mềm Excel với phƣơng pháp thống kê t-test: là phƣơng pháp kiểm định giả thuyết về sự khác biệt giữa hai trung bình tổng thể khi hai tổng thể độc lập và số lƣợng các quan sát trong mẫu là nhỏ