Luận văn Xác định một số hydrocacbon thơm đa vòng trong thực phẩm bằng kỹ thuật sắc ký khí khối phổ ms / ms

(pyrene) và 4- 14 nmol/l (B(a)P). 83±20 % (pyrene) và 75±13 % (B(a)P) 27 CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU Để xây dựng và thẩm định phương pháp phân tích PAHs trong thực phẩm, chúng tôi tiến hành nghiên cứu trên hai đối tượng là mì ăn liền và trà thành phẩm trên địa bàn thành phố Hà Nội. 2.2. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU - Khảo sát, lựa chọn các thông số tối ưu của hệ sắc ký khí ghép nối khối phổ GC - MS/MS để phân tích đồng thời 18 PAHs trong thực phẩm. - Xử lý mẫu bằng phương pháp chiết QuEChERS, tối ưu quy trình xử lý mẫu trên cơ sở phương pháp đáp ứng bề mặt RSM. - Đánh giá phương pháp phân tích trên thiết bị GC – MS/MS:  Xây dựng đường chuẩn.  Xác định giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng của phương pháp.  Đánh giá hiệu suất thu hồi, độ tái lặp của phương pháp. - Áp dụng phân tích các mẫu thực phẩm: mì ăn liền, trà thành phẩm. - Xử lý số liệu, thảo luận ý nghĩa các số liệu thu được 2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.3.1. Thiết bị sắc ký khí - khối phổ(GC-MS/MS) - Hệ thống sắc ký khí - khối phổ (GC-MS/MS) của hãng Thermo, USA. - Phần sắc ký: GC Trace 1310. - Bộ phận bơm mẫu tự động: TriPlus RSH Autosample. - Phần khối phổ: TSQ 8000. - Phần mềm xử lý số liệu: TraceFinder - Thermo. - Cột sắc ký khí DB5-MS (30 m x 0,25 mm; 0,25 µm) được sử dụng để phân tách PAHs (Agilent, USA). 28 Hình 2.1. Hệ thiết bị GC- MS/MS 2.3.2. Thiết bị, dụng cụ - Cân phân tích HR- 120 chính xác đến 0,1 mg và 0,01 mg (Japan). Máy ly tâm Universal 320 (Hittich) (có thể đạt 6000 vòng/phút). Bể rung siêu âm. Máy lắc vortex. Máy thổi khô N2. Máy đồng nhất mẫu. - Dụng cụ: Ống ly tâm 50 mL, Pipet các loại 100 L; 200 µL; 1,0 mL; 5,0 mL có thể điều chỉnh chính xác thể tích. Bình định mức các loại. Ống nghiệm thủy tinh 10 mL. Vial thủy tinh loại 1,8 mL. - Tất cả các dụng cụ thủy tinh đều phải được rửa sạch, tráng bằng nước cất, sau đó tráng bằng metanol và để khô, sấy ở 1050C trong vòng 1 giờ, lấy ra để nguội. Trước khi sử dụng tráng n - hexan 2 - 3 lần. 2.3.3. Hóa chất, chất chuẩn 2.3.3.1. Chất chuẩn, chuẩn trung gian và dung dịch chuẩn làm việc Các chất chuẩn hỗn hợp 18 PAHs trong dung môi acetonitrile: toluene (92: 8) (EPA Method 8310 PAHs Mixture, Restek, Bellefonte, PA, USA) bao gồm: acenaphthene, acenaphthylene, anthracene, benzo(a)anthracene, benzo(a)pyrene, benzo(b)fluoranthene, benzo(g,h,i)perylene, benzo(k) fluoranthene, chrysene, dibenz(a,h)anthracene, fluoranthene, fluorene, indeno (1,2,3-cd)pyrene, 1- methylnaphthalene, 2- methylnaphthalene, naphthalene, 29 phenanthrene, pyrene. Hai chuẩn đồng vị benzo(a)anthracence- 13C6, benzo (g,h,i)pyrylene- 13C12 (Augsburg, Germany). Dung dịch chuẩn gốc hỗn hợp 18 PAHs có nồng độ 100 mg/L. Dung dịch chuẩn làm việc 10,0 mg/L: chuyển 10,0 mL dung dịch chuẩn gốc hỗn hợp 18 PAHs nồng độ 100,0 mg/L vào bình định mức 100,0 mL, định mức đến vạch bằng dung môi n - hexan. Bảo quản dung dịch trong bình kín, bọc kín bằng giấy bạc và lưu trữ trong tủ lạnh âm sâu (40C, sử dụng trong 6 tháng). Đường chuẩn hỗn hợp 18 PAHs được xây dựng gồm 7 điểm chuẩn ở các mức nồng độ tăng dần, được pha loãng từ dung dịch chuẩn làm việc bằng dung môi n - hexan. 2.3.3.2. Hóa chất sử dụng - n-hexan (Merck) - Acetonitril (ACN) (Merck). - MgSO4 tinh khiết phân tích (đã được nung để loại nước) (Merck). - NaCl tinh khiết phân tích (Merck). - Chất hấp phụ PSA (Primary secondary amine) và Octadecylsilan (C18) được cung cấp bởi Agilent ( Mỹ). 2.3.4. Lấy mẫu và bảo quản mẫu Để thực hiện hướng nghiên cứu của đề tài, chúng tôi đã thu thập 105 mẫu bao gồm 65 mẫu mì ăn liền từ các nhãn hiệu khác nhau; 40 mẫu trà thuộc 3 nhóm trà (trà xanh, trà ô long và trà đen) của các nhà sản xuất khác nhau ở phía Bắc (tỉnh Thái Nguyên) và phía Nam (tỉnh Lâm Đồng) của Việt Nam. Các mẫu trà và mì ăn liền được mua từ các siêu thị trên thị trường Hà Nội năm 2018. Bảo quản mẫu: Trước khi phân tích, các mẫu được lưu trữ theo các khuyến nghị được đưa ra trên các gói, tức là, ở nơi khô ráo tránh ánh sáng. Các mẫu được phân loại và ký hiệu như trong bảng 2.1. Trước khi phân tích, mẫu được xay nhỏ để đồng nhất. 30 Bảng 2.1. Các đối tượng mẫu trong nghiên cứu Loại thực phẩm Số lượng mẫu Kí hiệu mẫu 1. Mì ăn liền Mỳ chiên dầu 45 M1 – M45 Mỳ không chiên 20 M46 – M65 2. Trà Trà xanh Thái Nguyên 7 GN1 – GN7 Trà xanh Lâm Đồng 7 GS1 – GS7 Trà Ôlong Thái Nguyên 5 ON1 – ON5 Trà Ôlong Lâm Đồng 5 OS1 – OS5 Trà đen Thái Nguyên 11 BN1 – BN11 Trà đen Lâm Đồng 5 BS1 – BS5 2.4. ĐỊNH LƯỢNG PAHs TRÊN NỀN MẪU THỰC PHẨM BẰNG KỸ THUẬT GC - MS/MS 2.4.1. Xác định các thông số kỹ thuật cho hệ thống GC - MS/MS Mỗi chất phân tích đều có độ phân cực, khả năng hóa hơi, khả năng ion hóa, độ phân hủy nhiệt khác nhau. Việc khảo sát và tối ưu hóa các thông số của hệ thống GC- MS/MS có ý nghĩa quan trọng, ảnh hưởng lớn đến kết quả phân tích. Chúng tôi tiến hành tối ưu hóa hệ thống để xác định PAHs như sau: - Bơm hỗn hợp chuẩn PAHs 100 µg/L trên hệ thống GC – MS/MS. - Bơm các chất chuẩn đơn 100 µg/L để định tính các PAHs dựa vào thời gian lưu. - Chọn ion định lượng và ion xác nhận cho từng PAHs. - Tối ưu hóa lại ở chế độ SIM. - Xác định tỷ lệ ion xác nhận trên ion định lượng và khoảng dao động. 2.4.2. Thông số kỹ thuật ban đầu cho hệ thống GC Việc tách những cấu tử trên cột mao quản phụ thuộc vào bản chất cấu tử, pha tĩnh và ái lực của cấu tử với pha tĩnh. Lợi thế của MS là có thể xác nhận và 31 định lượng thông qua sắc đồ khối và khối phổ, nhưng việc xác nhận và định lượng sẽ trở nên cực kỳ khó nếu vị trí và cường độ mũi sắc ký chịu ảnh hưởng của nền mẫu. Vì vậy, để tăng độ nhạy, độ đúng, độ chính xác của phương pháp phân tích chúng ta phải tìm cách khử ảnh hưởng nền ngay trên GC. Tham khảo các nghiên cứu xác định PAHs bằng phương pháp sắc ký khí, chúng tôi tiến hành khảo sát các thông số GC để tìm ra những thông số tối ưu nhất cho các hợp chất PAHs cần nghiên cứu. Các thông số cần khảo sát như sau: Chương trình nhiệt độ ở 700C (giữ trong 1 phút), tăng 100C/phút đến 2700C, tăng 20C/phút đến 2800C (giữ trong 3 phút), tăng 20C/phút đến 3100C (giữ trong 1phút). Nhiệt độ buồng bơm mẫu: 3100C. Chế độ tiêm mẫu không chia dòng, thời gian không chia dòng: 1 phút. Khí mang Heli, tốc độ dòng 1,0 mL/phút. Nhiệt độ bộ phận kết nối sắc ký khí và khối phổ: 3100C. Thể tích tiêm mẫu 1 μL. Tổng thời gian phân tích là 35 phút. Kiểm tra tính phù hợp của thông số GC thông qua sắc ký đồ của 18 PAHs. 2.4.3. Thông số kỹ thuật ban đầu cho hệ thống MS Dựa vào trị số m/z tương ứng của ion sinh ra từ mỗi chất để nhận danh chúng. Như vậy hai chất cùng thời gian lưu nhưng phân mảnh ion khác nhau vẫn có thể nhận biết và định lượng được. Đầu dò khối phổ có tính chọn lọc hơn so với các đầu dò khác trong sắc ký khí, tránh được sự nhầm lẫn khi chỉ dựa vào thông số thời gian lưu làm yếu tố nhận danh. Trên cơ sở các nghiên cứu về PAHs, chúng tôi lựa chọn các thông số tối ưu của đầu dò khối phổ như sau: Nguồn ion hóa: EI 70 eV, nhiệt độ nguồn ion: 2500C. Thời gian cắt dung môi: 5 phút. Chế độ phân tích đa phản ứng (MRM) với các giá trị ion mẹ, ion con và năng lượng va chạm được lựa chọn và tối ưu đối với từng PAHs. Ion con có tín hiệu lớn và ổn định hơn được sử dụng để làm ion định lượng, ion con còn lại được dùng để xác nhận. 2.4.4. Quy trình khảo sát khoảng tuyến tính và xây dựng đường chuẩn Dung dịch chuẩn làm việc 10,0 mg/L: chuyển 10,0 mL dung dịch chuẩn gốc hỗn hợp 18 PAHs nồng độ 100,0 mg/L vào bình định mức 100,0 mL, định mức đến vạch bằng dung môi n - hexan. Bảo quản dung dịch trong 32 bình kín, bọc kín bằng giấy bạc và lưu trữ trong tủ lạnh âm sâu (40C, sử dụng trong 6 tháng). Đường chuẩn hỗn hợp 18 PAHs được xây dựng gồm 7 điểm chuẩn ở các mức nồng độ tăng dần từ 1,0; 5,0; 10,0; 20,0; 50,0; 100,0 và 200,0 µg/kg, được pha loãng từ dung dịch chuẩn làm việc bằng dung môi n - hexan. 2.4.5. Tối ưu hóa phương pháp xử lý mẫu thực phẩm 2.4.5.1. Dự kiến quy trình xử lý mẫu Trên cơ sở tham khảo một số quy trình xử lý mẫu theo phương pháp chiết QuEChERS [25], [55], [59], chúng tôi dự kiến quy trình xử lý mẫu thực phẩm để phân tích PAHs như hình 2.2. Các thông số như lượng mẫu, thể tích dung môi, lượng muối chiết sẽ được khảo sát trong quá trình thiết kế thí nghiệm tối ưu sử dụng phương pháp đáp ứng bề mặt RSM. Hình 2.2. Quy trình dự kiến xử lý mẫu phân tích PAHs Xay đều mẫu tới đồng nhất, cân Xg mẫu vào ống ly tâm 50 mL. Thêm H2O, dung môi chiết, lắc trong khoảng 1 phút. Thêm 4g MgSO4, 1g NaCl, lắc trong 3 phút, ly tâm 6000 vòng/ phút trong 5 phút. Hút một thể tích nhất định pha hữu cơ (dịch chiết mẫu) phía trên sang ống ly tâm 15mL (có sẵn muối để loại nước dư, chất hấp phụ để tách chất béo và màu) lắc 3 phút, ly tâm 6000 vòng/phút trong 3 phút. Hút một thể tích nhất định pha hữu cơ sang ống nghiệm khác, bay hơi dung môi. Hòa cặn bằng n-hexan, lọc qua màng polytetrafluoroetylen (PTFE) 0,22µm. Phân tích trên GC- MS/MS. 33 2.4.5.2. Lựa chọn dung môi chiết và hỗn hợp muối chiết Về bản chất, n- hexan và diclometan là các dung môi không phân cực, vì vậy chúng phù hợp với các đặc tính của PAHs. Tuy nhiên, hai dung môi này không tan trong nước nên chỉ chiết xuất được PAHs trên bề mặt mẫu. Trong nghiên cứu này, mẫu được chuẩn bị theo phương pháp QuEChERS, vì vậy dung môi acetonitrile (ACN) đã được chọn làm dung môi chiết do có nhiều ưu điểm hơn so với các dung môi diclometan, n-hexan....Thứ nhất, acetonitril có thể trộn lẫn với nước nhưng lại có thể tách lớp với nước khi cho thêm các muối như MgSO4. Thứ hai, acetonitril hạn chế hòa tan nhiều tạp chất như lipit hoặc protein, muối nên dịch chiết sẽ ít chịu ảnh hưởng của nền mẫu. Muối MgSO4 khan đóng vai trò quan trong trong việc tách lớp giữa acetonitril và nước. Thực tế sau khi ly tâm, vẫn còn một lượng nhỏ nước trong dung môi acetonitrile (khoảng 8% xác định bằng NMR). Các nghiên cứu cũng cho thấy việc sử dụng đồng thời MgSO4 và NaCl với tỉ lệ 4:1 cho kết quả chiết tốt nhất [25], [55], [59]. Trên cơ sở đó, chúng tôi lựa chọn hỗn hợp muối chiết là MgSO4 và NaCl và cố định tỉ lệ là 4:1. 2.4.5.3. Khảo sát quá trình làm sạch Quá trình làm sạch sử dụng chiết phân tán pha rắn (d-SPE). Trong bước này MgSO4 khan có vai trò loại nước còn dư trong dịch chiết acetonitril. Ngoài ra một số chất hấp phụ PSA và C18 có thể được sử dụng để tăng hiệu quả làm sạch. PSA là một chất hấp phụ trao đổi anion yếu trên nền silicagel dùng để hấp phụ các axit béo, axit hữu cơ có chứa nhóm amin bậc hai, PSA có tác dụng tốt hơn amino propyl trong việc làm sạch. Vai trò của C18 dùng để loại các chất béo, màu. Trên cơ sở các nghiên cứu kết hợp với tính chất của nền mẫu, trong nghiên cứu này chúng tôi sử dụng kết hợp hai chất hấp phụ là C18 và PSA trên cả hai đối tượng thí nghiệm là mì ăn liền và trà thành phẩm. 2.4.5.5. Khảo sát quá trình bay hơi dung môi Phương pháp thêm chuẩn được sử dụng để đánh giá hiệu quả thu hồi từ quá trình bay hơi dung môi. Dung dịch chuẩn hỗn hợp PAHs được thêm vào 34 3,0 mL dung môi acetonitrile để được nồng độ 10 µg/kg. Ba điều kiện khác nhau được sử dụng để bay hơi dung môi đó là: Phương pháp bay hơi dung môi sử dụng khí N2 ở nhiệt độ phòng; sử dụng khí N2 ở nhiệt độ 10C và hệ thống cô quay chân không. Các mẫu sau bay hơi, phần cặn còn lại được hòa tan trong 1,0 mL n-hexan. 2.4.5.5. Thiết kế thí nghiệm tối ưu hóa Phương pháp đáp ứng bề mặt (Response surface methodology: RSM) được phát triển từ những năm 50 của thế kỉ trước bởi nhà khoa học Box và đồng sự. Phương pháp đáp ứng bề mặt bao gồm một nhóm các kĩ thuật toán học và thống kê dựa trên sự phù hợp của mô hình thực nghiệm để các dữ liệu thực nghiệm thu được liên quan đến thiết kế thí nghiệm. Theo hướng mục tiêu này, các hàm đa thức bậc hai hay bậc nhất được sử dụng để mô tả hệ nghiên cứu đó và khảo sát các điều kiện thực nghiệm để tìm ra sự tối ưu. Ứng dụng kĩ thuật tối ưu RSM cần trải qua các bước sau: (1) Lựa chọn các biến độc lập ảnh hưởng quan trọng tới hệ nghiên cứu trong phạm vi giới hạn của nghiên cứu đó trên cơ sở khảo sát thực tế, mục tiêu và kinh nghiệm của người nghiên cứu; (2) Thiết kế thí nghiệm và tiến hành thực hiện các thí nghiệm đó theo một ma trận đã vạch ra trước đó; (3) Xử lý về mặt thống kê toán học các dữ liệu thực nghiệm thu được thông qua sự tương thích của hàm đa thức; (4) Đánh giá tính tương thích của mô hình; (5) Xác minh tính khả thi và tính thiết yếu để tiến hành chuyển hướng sang ranh giới tối ưu; (6) Tiến hành thí nghiệm dựa trên kết quả tối ưu cho từng biến. Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng phương pháp tối ưu RSM với 4 thông số cần khảo sát là tỉ lệ ACN/mẫu, tỉ lệ H2O/mẫu, tỉ lệ C18/PSA và tỉ lệ MgSO4/Vdịch chiết để tối ưu hóa hiệu suất thu hồi PAHs (hàm mục tiêu Y) trong quá trình xử lý mẫu thực phẩm. Các biến độc lập kí hiệu lần lượt là X1, X2, X3, X4 được bố trí thí nghiệm ở năm mức - α, -1, 0, +1 và +α. Số thí nghiệm cần thực hiện là 31 (24 thí nghiệm tại mức gốc, 8 thí nghiệm tại điểm sao và 7 thí nghiệm lặp lại tâm với một hàm mục tiêu là hiệu suất thu hồi PAHs). Ngoài ra, để đánh giá độ tương thích của mô hình, phân tích hồi quy ANOVA được sử dụng dựa trên các hệ số R2 và P để đưa ra mức ý nghĩa về mặt thống kê của mô 35 hình đạt được. Phần mềm MODDE 12.1 được sử dụng để thiết kế ma trận thí nghiệm, tính toán các giá trị hồi quy và phân tích phương sai. Bảng 2.2. Giá trị mã hóa các yếu tố thực nghiệm Kí hiệu Biến số Mức thí nghiệm - α -1 0 + 1 +α X1 Tỉ lệ ACN/mẫu 1 1,5 2,0 2,5 3,0 X2 Tỉ lệ H2O/mẫu 0,5 0,75 1,0 1,25 1,5 X3 Tỉ lệ C18/PSA 0,5 0,75 1,0 1,25 1,5 X4 Tỉ lệ MgSO4/Vdịch chiết 0,05 0,10 0,15 0,20 0,25 Thiết kế thí nghiệm với các mức được mã hoá trong bảng 2.3 Bảng 2.3. Thiết kế thí nghiệm ở các mức Số thí nghiệm Tỉ lệ ACN/mẫu Tỉ lệ H2O/mẫu Tỉ lệ C18/PSA Tỉ lệ MgSO4/Vdịch chiết N1 -1 -1 -1 -1 N2 +1 -1 -1 -1 N3 -1 +1 -1 -1 N4 +1 +1 -1 -1 N5 -1 -1 +1 -1 N6 +1 -1 +1 -1 N7 -1 +1 +1 -1 N8 +1 +1 +1 -1 N9 -1 -1 -1 +1 N10 +1 -1 -1 +1 N11 -1 +1 -1 +1 N12 +1 +1 -1 +1 N13 -1 -1 +1 +1 N14 +1 -1 +1 +1 N15 -1 +1 +1 +1 N16 +1 +1 +1 +1 N17 -α 0 0 0 N18 +α 0 0 0 36 N19 0 -α 0 0 N20 0 +α 0 0 N21 0 0 -α 0 N22 0 0 +α 0 N23 0 0 0 -α N24 0 0 0 +α N25 0 0 0 0 N26 0 0 0 0 N27 0 0 0 0 N28 0 0 0 0 N29 0 0 0 0 N30 0 0 0 0 N31 0 0 0 0 Ảnh hưởng của các yếu tố cũng như sự tương tác giữa chúng với hàm mục tiêu (hiệu suất thu hồi PAHs) được tiến hành xây dựng bởi hàm hồi quy bậc 2 cho hàm mục tiêu như sau: Y = β0 + βi∑xi + βii∑xi2 + βij ∑xixj Trong đó Y là hàm mục tiêu, β0 là hằng số; βi, βij, và βii lần lượt là hệ số tuyến tính được xác định qua thực nghiệm. 2.5. ĐÁNH GIÁ PHƯƠNG PHÁP 2.5.1. Đánh giá độ lặp của thiết bị Phương pháp phân tích thể hiện tính chính xác trước tiên phải thể hiện độ lặp lại. Trong nghiên cứu của chúng tôi, đánh giá độ ổn định của hệ thiết bị GC-MS/MS được khảo sát sau khi lựa chọn các điều kiện tối ưu. Đánh giá độ lặp của hệ thiết bị dựa trên độ lặp thời gian lưu của các cấu tử trong dung dịch khảo sát. Dung dịch chuẩn để khảo sát độ lặp có nồng độ 50 µg/L được bơm vào hệ sắc ký 5 lần sau đó lấy thời gian lưu trung bình của các lần và tính được giá trị % RSD. Giá trị này đánh giá độ lặp cần khảo sát. 37 2.5.2. Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng của phương pháp 2.5.2.1. Giới hạn của thiết bị (IDL, IQL) IDL (Instrumental detection limit) là lượng chất nhỏ nhất đưa vào máy mà detector có thể đo được và cho tín hiệu peak cao gấp 3 - 5 lần đường nền. IDL cho phép đánh giá thiết bị hoạt động có ổn định không, bao gồm các loại nhiễu từ linh kiện cơ - điện tử của thiết bị, điều kiện vận hành máy và điều kiện môi trường xung quanh và thường được ước lượng qua các dung dịch chuẩn. IQL (Instrumental quantification limit) là lượng chất nhỏ nhất đưa vào máy để tạo tín hiệu của peak cao gấp khoảng 10 lần đường nền. Thông thường lấy IQL = 3 IDL. IQL cho phép đánh giá thiết bị có đủ điều kiện để định lượng các cấu tử cần phân tích hay không và cho biết nồng độ cấu tử khi bơm vào máy có đủ điều kiện để định lượng hay không. 2.5.2.2. Giới hạn của phương pháp a. Giới hạn phát hiện của phương pháp (Limit of Detection - viết tắt là LOD) được xem là nồng độ thấp nhất của chất phân tích mà hệ thống phân tích còn cho tín hiệu phân tích khác có nghĩa với tín hiệu của mẫu trắng hay tín hiệu nền. Có nhiều cách để xác định giới hạn phát hiện của phương pháp. Với phương pháp phân tích sử dụng kỹ thuật sắc ký khí và có nền mẫu phức tạp, việc xác định giới hạn của phương pháp dựa trên tỉ lệ tín hiệu/nhiễu (S/N: Signal to noise ratio). Phân tích mẫu (mẫu thực, mẫu thêm chuẩn hoặc mẫu chuẩn) ở nồng độ thấp còn có thể xuất hiện tín hiệu của chất phân tích. LOD được chấp nhận tại nồng độ mà tại đó tín hiệu lớn gấp 2-3 lần nhiễu đường nền, thông thường thường lấy S/N =3 Trên cùng một phương pháp phân tích, các phòng thí nghiệm khác nhau sẽ công bố các giới hạn phát hiện khác nhau tuỳ thuộc vào tay nghề của kỹ thuật viên, sự hoạt động ổn định của máy móc thiết bị và chất lượng của các hoá chất/ chất chuẩn. Trong trường hợp các yếu tố nêu trên không đảm bảo yêu cầu, giới hạn phát hiện của phương pháp sẽ tăng lên nhiều lần so với 38 khuyến nghị của phương pháp gốc. Do đó, việc xác định và công bố giới hạn phát hiện của phương pháp sẽ thể hiện được năng lực của phòng thí nghiệm. b. Giới hạn định lượng của phương pháp (Limit of quantification – viết tắt là LOQ) được xem là nồng độ thấp nhất của chất phân tích mà hệ thống phân tích định lượng được với tín hiệu phân tích khác có ý nghĩa định lượng với tín hiệu của mẫu trắng hay tín hiệu nền. LOQ được chấp nhận tại nồng độ mà tại đó tín hiệu lớn gấp 10- 20 lần nhiễu đường nền, thông thường thường lấy S/N = 10. Trong nghiên cứu này, LOD và LOQ của phép phân tích PAHs được xác định bằng cách thêm chuẩn hỗn hợp 18 PAHs vào mẫu trắng ở nồng độ thấp nhất mà thiết bị có thể quan sát được và có tín hiệu S/N tương ứng với 3 và 10. Dựa vào tỷ lệ S/N để xác nhận các giá trị LOD và LOQ. 2.5.3. Tính toán kết quả Hàm lượng các chất PAHs được định lượng bằng phương pháp đường chuẩn với khoảng tuyến tính xây dựng từ 1,0 đến 200 µg/kg, hệ số tương quan R2 > 0,995. Hàm lượng PAHs trong mẫu được tính toán trên công thức sau: 𝑿 = 𝑪𝒎. 𝑽. 𝒌 𝒎 Trong đó: X: hàm lượng PAHs (µg/kg hoặc µg/L) m: lượng mẫu (gam hoặc mL) V: thể tích sau khi hòa cặn trước khi phân tích trên GC – MS/MS (mL) k: hệ số pha loãng (nếu có) Cm: nồng độ dung dịch chiết mẫu phân tích tính theo đường chuẩn (ppb) 2.5.4. Hiệu suất thu hồi của phương pháp Hiệu suất thu hồi của phương pháp xử lý mẫu là một trong những đại lượng quan trọng để đánh giá hiệu quả của phương pháp. Nó cho biết lượng chất bị mất đi trong quá trình xử lý mẫu. Đánh giá hiệu suất thu hồi là đánh giá độ tin cậy của phương pháp xử lý mẫu đã chọn. 39 Phương pháp thêm chuẩn trên nền mẫu thực được sử dụng để đánh giá hiệu suất thu hồi của PAHs. Dung dịch chất chuẩn của 18 PAHs và hai chất chuẩn đồng vị (benzo(a)anthracence-13C6 và benzo(g,h,i)pyrylene-13C12) có nồng độ 50 µg/L (tương ứng 10 µg/kg) được thêm vào mẫu thực sau đó tiến hành xử lý mẫu. Các chuẩn đồng vị được sử dụng trong nghiên cứu với mục đích đánh giá hiệu suất thu hồi của phương pháp, đánh giá hiệu ứng nền cũng như kiểm soát sự không đảm bảo đo của phép phân tích GC-MS/MS. Trên cơ sở việc thêm chuẩn vào mẫu thử, cùng với việc tiến hành làm mẫu thực không thêm chuẩn, hiệu suất thu hồi được tính toán theo công thức sau: %𝑯 = 𝑪𝑺+𝒎ẫ𝒖 − 𝑪𝒎ẫ𝒖 𝑪𝑺𝟎 × 𝟏𝟎𝟎% Trong đó: % H: hiệu suất thu hồi CS+mẫu: nồng độ chuẩn thêm vào và mẫu thực đo được. Cmẫu: nồng độ thực đo được. CSo: nồng độ chuẩn biết trước 40 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. TỐI ƯU HÓA CÁC ĐIỀU KIỆN PHÂN TÍCH SẮC KÝ 3.1.1. Điều kiện sắc ký - Chương trình nhiệt độ ở 700C ( giữ trong 1 phút), tăng 100C/phút đến 2700C, tăng 20C/phút đến 2800C (giữ trong 3phút), tăng 20C/phút đến 3100C (giữ trong 1phút). - Nhiệt độ buồng bơm mẫu : 3100C. - Chế độ tiêm mẫu không chia dòng, thời gian không chia dòng: 1 phút. - Khí mang Heli, tốc độ dòng 1,0 mL/phút. - Nhiệt độ bộ phận kết nối sắc ký khí và khối phổ : 3100C. - Thể tích tiêm mẫu 1 μL. - Thời gian lấy tín hiệu: 35 phút. 3.1.2. Điều kiện MS/MS - Nguồn ion hóa : EI 70 eV, nhiệt độ nguồn ion: 250oC. - Thời gian cắt dung môi: 5 phút. - Chế độ phân tích đa phản ứng (MRM) với các giá trị ion mẹ, ion con và năng lượng va chạm được lựa chọn và tối ưu đối với từng PAHs như trong bảng 3.1 và hình 3.1. Ion con có tín hiệu lớn và ổn định hơn được sử dụng để làm ion định lượng, ion con còn lại được dùng để xác nhận. Bảng 3.1. Thời gian lưu và điều kiện MS/MS để phân tích PAHs TT Tên hợp chất viết tắt Hợp chất PAH Thời gian lưu (tR) (phút) Ion mẹ (m/z) Ion con (m/z) Năng lượng bắn phá (eV) Ghi chú 1 NaP Naphthalene 7,1 128,2 127,2 15 Định lượng 102,1 20 Xác nhận 2 M2N 2-Methylnaphthalene 8,63 141,1 89,1 16 Định lượng 115,1 14 Xác nhận 41 3 M1N 1-Methylnapththalene 8,87 141,1 89,1 32 Định lượng 115,1 15 Xác nhận 4 ACNP Acenaphthylene 10,69 154,1 153,0 15 Định lượng 152,0 20 Xác nhận 5 ACP Acenaphthene 11,14 152,1 151,0 15 Định lượng 150,0 20 Xác nhận 6 FL Fluorene 12,32 166,1 154,0 15 Định lượng 164,0 20 Xác nhận 7 PHN Phenalthrene 14,55 178,2 176,0 15 Định lượng 172,0 20 Xác nhận 8 AN Anthracene 14,65 178,1 176,1 15 Định lượng 152,1 20 Xác nhận 9 FLA Floranthene 17,38 202,1 200,1 15 Định lượng 152,1 20 Xác nhận 10 Py Pyrene 17,88 202,1 200,2 15 Định lượng 152,1 20 Xác nhận 11 B(a)A Benzo (a) anthracene 20,76 228,1 226,1 30 Định lượng 202,2 35 Xác nhận 12 Chy Chrysene 20,84 228,1 226,2 30 Định lượng 202,1 35 Xác nhận 13 B(b)F Benzo (b) fluoranthene 23,6 252,2 250,0 25 Định lượng 226,0 30 Xác nhận 14 B(k)F Benzo (k) fluoranthene 23,6 252,2 250,1 25 Định lượng 226,1 30 Xác nhận 15 B(a)P Benzo (a) pyrene 24,41 252,0 250,1 25 Định lượng 226,1 30 Xác nhận 16 IP Indeno (1,2,3-cd) pyrene 28,77 276,0 274,1 30 Định lượng 250,0 40 Xác nhận 17 BDA Dibenz (a,h) anthracene 28,99 278,2 276,1 30 Định lượng 252,1 40 Xác nhận 18 B(ghi)P Benzo (g,h,i) perylence 29,91 276,1 274,1 30 Định lượng 250,1 40 Xác nhận 19 B(a)A 13C6 Benzo(a)anthracence-13C6 20,76 234,1 232,1 30 Định lượng 208,1 35 Xác nhận 20 B(ghi)P 13C12 Benzo(g,h,i)perylene-13C12 29,91 288,2 286,2 30 Định lượng 261,2 40 Xác nhận 42 Hình 3.1. Sắc ký đồ hỗn hợp chuẩn 18 PAHs ở nồng độ 100 ppb 3.1.3. Đánh giá độ lặp của thiết bị Với một hệ máy có độ nhạy cao thì sự ổn định và lặp lại đóng vai trò quan trọng trong phân tích. Lặp lại tốt mới có thể cho độ chính xác tốt, trong một phạm vi cho phép. Dung dịch chuẩn để khảo sát độ lặp có nồng độ 50 µg/L, với các điều kiện phân tích sắc ký đã tối ưu. Bảng 3.2 cho thấy kết quả độ lặp lại của thời gian lưu. Bảng 3.2. Độ lặp lại thời gian lưu của các PAHs trên thiết bị (phút, n = 5) PAHs Lần 1 Lần 2 Lần 3 Lần 4 Lần 5 Trung bình % RSD NaP 7,07 7,08 7,14 7,11 7,10 7,10 0,38 M2N 8,6 8,62 8,67 8,64 8,63 8,63 0,30 M1N 8,84 8,85 8,91 8,88 8,87 8,87 0,31 ACNP 10,66 10,67 10,74 10,7 10,69 10,69 0,29 ACP 11,10 11,12 11,18 11,14 11,13 11,13 0,27 FL 12,29 12,30 12,37 12,33 12,32 12,32 0,25 PHN 14,52 14,53 14,60 14,56 14,55 14,55 0,21 AN 14,62 14,64 14,7 14,67 14,65 14,66 0,21 FLA 17,34 17,36 17,42 17,39 17,37 17,38 0,17 Py 17,84 17,86 17,93 17,89 17,88 17,88 0,19 B(a)A 20,72 20,74 20,81 20,77 20,76 20,76 0,16 Chy 20,81 20,83 20,9 20,86 20,85 20,85 0,16 B(b)F 23,53 23,56 23,67 23,61 23,59 23,59 0,22 43 B(k)F 23,60 23,63 23,74 23,69 23,66 23,66 0,23 B(a)P 24,49 24,52 24,64 24,58 24,55 24,56 0,23 IP 28,69 28,73 28,93 28,83 28,78 28,79 0,32 BDA 28,89 28,94 29,14 29,04 29,01 29,00 0,33 B(ghi)P 29,81 29,86 30,08 29,97 29,93 29,93 0,35 Kết quả ở bảng trên cho thấy % RSD thời gian lưu trung bình của các lần lặp lại đều dưới 5%, phù hợp với tiêu chuẩn được quốc tế công nhận (thấp hơn tiêu chuẩn của US – EPA là 15%). Vậy thiết bị phân tích có độ ổn định cao, phù hợp để xác định đồng thời 18 PAHs trong nghiên cứu này. 3.1.4. Đường chuẩn hỗn hợp xác định 18 PAHs Dung dịch dựng đường chuẩn được pha từ các dung dịch chuẩn gốc. Các dung dịch được pha loãng sử dụng pipetman, định mức bằng n - hexan để được dãy nồng độ 1,0; 5,0; 10,0; 20,0; 50,0; 100,0 và 200,0 µg/kg. Mỗi dung dịch được bơm trên hệ sắc ký 3 lần, diện tích pic trung bình thu được sẽ là số liệu để dựng đường chuẩn sự phụ thuộc của di