Luận văn Xác định sự khuếch đại gen mycn ở bệnh nhân u nguyên bào thần kinh bằng kỹ thuật lai huỳnh quang tại chỗ

hần cuối của nhiễm sắc thể 14) hay 20-25% bệnh nhân u nguyên bào thần kinh có đột biến khuếch đại gen MYCN[40]. Hiện nay các bất thƣờng di truyền này đƣợc sử dụng rộng rãi trên thế giới trong việc tiên lƣợng và phân nhóm nguy cơ cho các b ệnh nhân u nguyên bào thần kinh. Tuy vậy, ở Việt Nam, việc phát hiện các biến đổi di truyền này vẫn chƣa đƣợc thực hiện, gây nhiều khó khăn cho các bác sĩ lâm sàng trong vi ệc tiên lƣợng bêṇh và lƣạ chọn phác đồ đi ều trị cho bệnh nhân. Vì vậy, từ nhiều năm nay, việc cần thiết có các xét nghiệm di truyền cho bệnh u nguyên bào thần kinh luôn đƣợc đặt ra. Xuất phát từ yêu cầu lâm sàng thực tiễn nhƣ vậy, nghiên cứu đề tài “Xác định sự khuếch đại gen MYCN ở bệnh nhân u nguyên bào thần kinh bằng kĩ thuật lai huỳnh quang tại chỗ” đƣợc thực hiện với các mục tiêu sau: 5 - Phát hiện được sự khuếch đại gen MYCN ở bệnh nhân u nguyên bào thần kinh bằng kĩ thuật lai huỳnh quang tại chỗ. - Xác định đượcsự liên quan với các yếu tố tiên lượng khác và ý nghĩa khuếch đại gen MYCN. 6 1 CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Lịch sử nghiên cứu U nguyên bào thần kinh (Neuroblastoma – u NBTK) đƣợc mô tả là bệnh ung thƣ tiến triển. Các tế bào thần kinh chƣa trƣởng thành đƣợc tìm thấy trong bào thai hoặc thai nhi, đƣợc gọi là các tế bào nguyên bào thần kinh (Neuroblast). Năm 1864, bác sĩ ngƣời Đức tên là Rudoft Virchow phát hiện các khối u đƣợc tìm thấy trong ổ bụng của trẻ em mắc bệnh u thần kinh đệm (glioma). Năm 1910, James Horner-Wright, một nhà giải phẫu bệnh ở Boston (Hoa Kỳ), đã công bố một mô tả một loạt khối u thƣợng thận ở trẻ em, có đặc điểm tế bào giống với các tế bào thần kinh nguyên thủy của tuyến tủy thƣợng thận bào thai. Vì vậy, ông đã đặt tên hiện tƣợng này là “u nguyên bào thần kinh”[31]. Các kiểu di căn của u NBTK cũng đƣợc mô tả với công bố của bác sĩ William Pepper về các nốt di căn gan của trẻ u NBTK giai đoạn 4S và công bố của bác sĩ Robert Hutchison về các ổ di căn tại mắt [31]. UNBTK ban đầu đƣợc phẫu thuật cắt bỏ và xạ trị tại Bệnh viện Nhi Boston từ những năm 1940 [31]. Đồng thời, giá trị tiên lƣợng của tuổi chẩn đoán và di căn xƣơng cũng đƣợc xác định. Hóa trị liệu bắt đầu đƣợc sử dụng vào năm 1951 bởi Farber [17]và 1964 bởi Thurman[34] với một vài thành công bƣớc đầu. 1.2 Bệnh u nguyên bào thần kinh U nguyên bào thần kinh là dạng khối u bào thai c ủa hệ thần kinh giao cảm .Ở đó tế bào khởi đầu là các tế bào tiền thân đang phát triển và chƣa biệt hóa xuất phát từ mô mào thần kinh. Chính vì thế, u NBTK thƣờng xảy ra ở trẻ nhỏ[10]. Tỷ lệ mắc mới của u NBTK là 10,2 ca trên một triệu trẻ em dƣới 15 tuổi; là một trong những dạng ung thƣ phổ biến nhất đƣợc chẩn đoán trong năm đầu tiên của cuộc đời [8, 10, 32]. 1.2.1 Đặc điểm lâm sàng Khối u bắt nguồn tƣ̀ các mô c ủa hệ thần kinh giao cảm, điển hình là tƣ̀ tủy tuyến thƣợng thận và các hạch thần kinh dọc hai bên cột sống, và vì vậy u có thể xuất hiêṇ ở nhiều vi ̣ trí khác nhau nhƣ ở cổ, ngực, bụng và tiểu khung. 7 Hình 1.1. Các vị trí xuất hiện khối u[26] Các biểu hiện lâm sàng rất đa daṇg phu ̣thuôc̣ vào vi ̣ trí u tiên phát và các biểu hiêṇ di căn . Các triệu chứng nhƣ chƣớng bụng, đau bụng, nôn và kém ăn hay gặp trƣờng hợp u ổ bụng. Các khối u ở lồng ngực thƣờng đƣợc chẩn đoán một cách tình cờ khi bệnh nhân đƣợc chụp X quang tim phổi trong những trƣờng hợp chấn thƣơng hay nhiễm trùng. Trong các trƣờng hợp khác, bệnh nhân có thể có các bệnh lý hô hấp kèm theo nhƣ viêm phổi, tràn dịch màng phổi. Các khối u nằm cao trong lồng ngực hay ở cổ có thể có triệu chứng sụp mi mắt một bên, co đồng tử, giảm tiết mồ hôi (Hội chứng Horner). Những khối u rất to ở cạnh lồng ngực có thể gây chèn ép cơ giới các cơ quan xung quanh[1]. U NBTK di căn theo đƣờng bạch huyết và đƣờng máu. Tế bào u theo đƣờng bạch huyết di căn vào hạch lympho khu vực hoặc hạch xa. Theo đƣờng máu tế bào u thƣờng di căn vào tủy xƣơng, xƣơng, gan, da, hiếm khi vào phổi hay não[7, 30].Các bệnh nhân ở giai đoạn này thƣờng có biểu hiện toàn thân nhƣ sốt, mệt mỏi, sụt cân. 8 Biểu hiện di căn trên lâm sàng ở trẻ dƣới 1 tuổi có một số đặc điểm khác biệt với trẻ lớn: hay gặp di căn gan và da, di căn vào tủy xƣơng và xƣơng ít gặp hơn[29, 39].Các trƣờng hợp di căn não thƣờng có khuếch đại gen MYCN và mô bệnh học không thuận lợi. Các bệnh nhân này có tiến triển xấu, thƣờng nhanh chóng tử vong. U NBTK còn có thể di căn vào phổi, màng phổi[5]. 1.2.2 Phân loại u NBTK ChẩnđoánmôbệnhhọcuNBTKchủyếudựatrênhìnhtháihọc. Năm 2003, Hiệp hội Giải phẫu bệnh U nguyên bào thần kinh Quốc tế (INPC, International Neuroblastoma Pathology Committee) đã thống nhất đƣa ra HệthốngphânloaiuNBTKquốctếdựatrêncácbiếnđổihìnhtháiphốihợpvớiquátrìnhbiệthoá cũngnhƣcácyếutốtiênlƣợngMBH,phânloạiuNBTKthành4nhómnhƣsau[31] UNBTK(neuroblastoma)là các u mà thành phần mô đệm Schwann chiếm dƣới 50% toàn bộ khối u. Dựa trên thành phần nguyên bào thần kinh, các u nguyên bào thần kinh đƣợc chia thành chƣa biệt hóa, ít biệt hóa và đang biệt hóa:  U nguyên bào thần kinh chƣa biệt hóa (undifferentiatedneuroblastoma) chiếm khoảng 2-3% tổng số u nguyên bào thần kinh.  U nguyên bào thần kinh ít biệt hóa (poorly differentiatedneuroblastoma), chiếm tới 65-75% các u nguyên bào thần kinh  U nguyên bào thần kinh đang biệt hóa (differentiatingneuroblastoma) chiếm khoảng 5% các u nguyên bào thần kinh UhạchNBTK,hỗnhợp(ganglioneuroblastoma, intermixed) là các khối u giàu mô đệm Schwann, quá trình biệt hóa chƣa hoàn thành, chiếm 2-3% các u nguyên bào thần kinh UhạchTK(ganglioneuroma) bao gồm u hạch thần kinh đang biệt hóa và u hạch thần kinh biệt hóa. U hạch thần kinh đang biệt hóa là các u mà thành phần mô đệm Schwann chiếm ƣu thế chủ yếu kèm theo các tế bào đang biệt hóa (nguyên bào thần kinh, tế bào hạch) và đã biệt hóa hoàn toàn (tế bào hạch trƣởng thành). Khác với u hạch nguyên bào thần kinh hỗn hợp, thành phần tế bào ở đây rất ít, không tạo thành các ổ vi thể mà chỉ là các tế bào riêng lẻ pha trộn lẫn vào. U hạch thần kinh biệt hóa bao gồm mô đệm Schwann và các tế bào hạch trƣởng thành, không có thành phần 9 nguyên bào thần kinh. U hạch thần kinh chiểm tỷ lệ thấp hơn 1% các u nguyên bào thần kinh. UhạchNBTK,nốt(ganglioneuroblastoma, nodular) thƣờng là các ổ nguyên bào thần kinh chảy máu trên đại thể (nghèo mô đệm Schwann); kèm theo u hạch nguyên bào thần kinh hỗn hợp (giàu mô đệm Schwann) và u hạch thần kinh (mô đệm Schwann chủ yếu)[35]. Ngoài racókhoảng4-5 %các uNBTKkhông xếp loại đƣợc. 1.2.3 Phân loại giai đoạn u NBTK Hệ thống phân loại u NBTK đƣợc sử dụng rộng rãi hiện nay là hệ thống INSS (International Neuroblastoma Staging System), sử dụng kết quả của cuộc mổ đầu tiên, ra đời năm 1988 bởi Brodeur và cộng sự (Bảng 1.1)[41]. Bảng 1.1. Các giai đoạn theo INSS Giai đoạn Lâm sàng 1 Khối u khu trú có khả năng cắt bỏ hoàn toàn, có hoặc không có tồn dƣ bệnh vi thể; biểu hiện qua không di căn hạch bạch huyết 1 bên cơ thể ở mức độ vi thể. 2A Khối u khu trú không có khả năng cắt bỏ hoàn toàn, biểu hiện qua không có di căn hạch bạch huyết ở xa khối u 1 bên cơ thể ở mức độ vi thể. 2B Khối u khu trú có hoặc không có khả năng cắt bỏ hoàn toàn; có di căn hạch bạch huyết ở xa khối u 1 bên cơ thể. Hạch bạch huyết mở rộng đối bên phải không có tế bào u di căn ở mức độ vi thể 3 Khối u 1 bên không thể cắt bỏ đã vƣợt qua đƣờng giữa cơ thể, có hoặc không có di căn hạch bạch huyết lân cận 4 Bất kỳ khối u tiên phát nào đã di căn các hạch bạch huyết ở xa, tủy, tủy xƣơng, gan, và/hoặc các nội tạng khác 4S Khối u tiên phát khu trú, đã di căn có giới hạn đến da, gan và/hoặc tủy xƣơng (tỷ lệ di căn ít hơn 10%), giới hạn với trẻ nhỏ hơn 12 tháng. 10 Hệ thống phân loại INRGSS (International Neuroblastoma Risk Group Staging System) (Bảng 1.2) sử dụng hệ thống các yếu tố nguy cơ về hình ảnh chặt chẽ[28]. Bảng 1.2. Các giai đoạn theo INRGSS Giai đoạn Lâm sàng L1 Khối u khu trú không liên quan đến các tạng thiết yếu và giới hạn ở một bên của cơ thể L2 Khối u khu trú ở một khu vực kèm theo một hoặc nhiều hơn yếu tố nguy cơ về hình ảnh M Bệnh đã di căn xa (trừ giai đoạn MS) MS Bệnh di căn ở trẻ ít hơn 18 tháng tuổi, và vị trí di căn là da, gan và/hoặc tủy xƣơng. Tuy nhiên, với INRGSS, giai đoạn MS còn phải xem xét đến 2 yếu tố là tuổi chẩn đoán (từ 12 đến 18 tháng) và khối u tiên phát lớn không thể cắt bỏ đƣợc. Bên cạnh đó, nghiên cứu một số lƣợng lớn bệnh nhân đã cho thấy việc sử dụng 18 tháng làm mốc chia nhóm tuổi chẩn đoán có nhiều ý nghĩa với lâm sàng hơn so với việc sử dụng 12 tháng tuổi nhƣ trƣớc đó.Hiện nay, việc sử dụng hệ thống phân giai đoạn INSS hay INRGSS tùy thuộc vào cơ sở vật chất và bác sĩ. INSS đƣợc lựa chọn ở những nơi có cơ sở vật chất hay bác sĩ chẩn đoán hình ảnh có nhiều hạn chế. Do đó, việc xác định giai đoạn sẽ dựa vào phẫu thuật và điều trị sẽ dựa theo phân loại đó. Còn ở những nơi có cơ sở vật chất và tay nghề bác sĩ tốt hơn, các nhà lâm sàng lại sử dụng hệ thống INRGSS. Vì khi đó, nhiều bệnh nhân không cần có sự can thiệp về y tế mà vẫn có thể khỏi bệnh, đặc biệt là các khối u khu trú ở trẻ ít hơn 1 tuổi. 1.2.4 Một số yếu tố tiên lượng của u NBTK 1.2.4.1 Sự khuếch đại gen MYCN Nhiều biến đổi di truyền đã đƣợc xác định ở u NBTK có ý nghĩa tiên lƣợng bệnh, dựa trên đó có thể xác định đƣợc các bệnh nhân có nguy cơ tái phát hoặc có xu hƣớng tiến triển nặng. Trong đó việc xác định khuếch đại gen MYCN có giá trị tiên lƣợng cao đƣợc sử dụng để phân nhóm nguy cơ [11]. 11 Sự khuếch đại MYCN thƣờng xảy ra ở các u nguyên bào thần kinh tiên phát trên các bệnh nhân chƣa đƣợc điều trị. Sự khuếch đại này thƣờng gặp ở các giai đoạn muộn của bệnh với kết quả điều trị thấp, nhƣng cũng có thể đƣợc tìm thấy ở các u tiến triển nhanh và có tiên lƣợng xấu, hoăc̣ th ậm chí ở trẻ sơ sinh hay bệnh nhân ở giai đoạn khu trú. Tỷ lệ khuếch đại MYCN ở các bệnh nhân u nguyên bào thần kinh là 20 – 25% [6, 11, 20]. Hình 1.2. Phân loại bệnh nhân theo nhóm nguy cơ [34] Nhóm bệnh nhân nguy cơ cao: - Bệnh nhân u NBTK ở giai đoạn 1,2,3 hoặc 4S có khuếch đại gen MYCN - Bệnh nhân u NBTK ở giai đoạn đoạn 4 và tuổi chẩn đoán ≥12 tháng - Bệnh nhân u NBTK giai đoạn 4, tuối chẩn đoán ≤ 12 tháng, và có khuếch đại gen MYCN. Nhóm bệnh nhân nguy cơ trung bình: - Bệnh nhân u NBTK không có khuếch đại gen MYCN, giai đoạn 2 hoặc 3,có mất đoạn 1p. Nguy cơ trung bình Nguy cơ thấp Phân nhóm nguy cơ u NBTK 2004 Nguy cơ cao Nguy cơ trung bình Giai đoạn 1-3 hoặc 4S Không khuếch đại gen MYCN Khuếch đại gen MYCN Giai đoạn 4 Tuổi  1 Tuổi < 1 Không khuếch đại gen MYCN Khuếch đại gen MYCN Giai đoạn 1 hoặc 4S Giai đoạn 2 hoặc 3 Mất đoạn 1p Không mất đoạn 1p Giai đoạn 2 Giai đoạn 3 Tuổi 2 Tuổi < 2 12 - Bệnh nhân u NBTK không có khuếch đại gen MYCN, giai đoạn 3, không mất đoạn 1p, tuổi chẩn đoán ≥24 tháng. - Bệnh nhân u NBTK giai đoạn 4, tuổi chẩn đoán ≤ 12 tháng, không có khuếch đại gen MYCN. Nhóm bệnh nhân nguy cơ thấp: - Bệnh nhân u NBTK giai đoạn 1 hoặc 4S không có khuếch đại gen MYCN - Bệnh nhân u NBTK giai đoạn 2, không có khuếch đại gen MYCN, không mất đoạn 1p - Bệnh nhân u NBTK giai đoạn 3, không có khuếch đại gen MYCN, không mất đoạn 1p, tuổi chẩn đoán ≤24 tháng. 1.2.4.2 Tuổi của bệnh nhân u NBTK Ngay từ những thời điểm đầu nghiên cứu và chẩn đoán u nguyên bào thần kinh (1950), các nhà lâm sàng đã nhận thấy sự liên hệ giữa tuổi chẩn đoán của bệnh nhân với tiên lƣợng điều trị. Các bệnh nhân sơ sinh có đáp ứng điều trị tốt hơn so với các bệnh nhân nhi lớn tuổi[16]. Đến năm 1971, Breslow và McCann đã chứng minh rằng tuổi chẩn đoán vừa là một yếu tố tiên lƣợng quan trọng, vừa là một yếu tố tham gia vào việc xác định giai đoạn cho bệnh nhân [9]. Năm 2009, trong báo cáo của tổ chức Ung thƣ Trẻ em (Children’s Oncology Group - COG) do Susan Cohn và cộng sự công bố, điểm cắt giữa 2 nhóm tuổi chẩn đoán có những tiên lƣợng khác nhau đã đƣợc thông qua với sự đồng thuận quốc tế là 18 tháng. Tuy nhiên với các bệnh nhân giai đoạn M và không có khuếch đại gen MYCN, việc đánh giá tiên lƣợng về tuổi sẽ áp dụng điểm cắt về tuổi là 12 tháng [14]. Có 3 nhóm nguy cơ đƣợc xác định tỷ lệ sống sót trong vòng 5 năm dựa trên độ tuổi, giai đoạn và trạng thái của gen MYCN nhƣ sau:  Các bệnh nhân ở giai đoạn 1, 2, hay 4S ở tất cả các độ tuổi mà không có khuếch đại MYCN thì tỷ lệ đó là 95% [23].  Các bệnh nhân ở giai đoạn 3 cũng nhƣ các bệnh nhân sơ sinh ở giai đoạn 4, không có khuếch đại MYCN thì tỷ lệ đó khoảng 75% [10].  Các bệnh nhân lớn hơn 1 tuổi ở giai đoạn 4, ở giai đoạn 2 hay 3 mà có 13 khuếch đại MYCN cũng nhƣ các bệnh nhân sơ sinh đã di căn, có khuếch đại MYCN thì tỷ lệ đó chỉ là 30% [16]. U NBTK ở trẻ lớn (> 13 tuổi) và ngƣời lớn có một số đặc điểm cận lâm sàng, lâm sàng, tiến triển và tiên lƣợng bệnh khác với u NBTK ở trẻ em [15]. 1.2.4.3 Yếu tố mô bệnh học Chỉ số MKI MKI (mitotic – karyorrhectic index) là tỷ lệ giữa số lƣợng tế bào ở kỳ nguyên phân và kỳ phân hủy nhân. Hình ảnh nguyên phân đặc trƣng bởi các khối đặc chất nhiễm sắc hình tròn, có mấu nhọn và không có màng nhân. Tế bào phân hủy có hình ảnh các khối đặc từng đoạn kèm theo bào tƣơng đặc bắt kiềm. Chỉ số MKI đƣợc chia thành 3 loại (Bảng 1.3): Bảng 1.3. Chỉ số MKI Tỷ lệ phần trăm Số lƣợng tế bào MKI thấp <2% < 100/5000 tế bào MKI trung bình 2-4% 100-200/5000 tế bào MKI cao >4% >200/5000 tế bào Chỉ số MKI cao thƣờng gặp ở các u NBTK chƣa hoặc ít biệt hóa có khuếch đại gen MYCN[31]. Tiên lƣợng mô bệnh học Hiệp hội Giải phẫu bệnh U nguyên bào thần kinh Quốc tế phân biệt thành 2 nhóm tiên lƣợng mô bệnh học: mô bệnh học thuận lợi và mô bệnh học không thuận lợi (Bảng 1.4). Việc phân chia bệnh nhân vào 2 nhóm tiên lƣợng này dựa vào tuổi chẩn đoán, trạng thái biệt hóa của khối u và một số đặc điểm khác nhƣ chỉ số nhân chia/nhân tan (MKI), nốt canxi hóa. Từ các yếu tố tiên lƣợng trên kết hợp với tuổi chẩn đoán của bệnh nhân, hai nhóm mô bệnh học đƣợc phân chia 14 Bảng 1.4. Bảng phân loại mô bệnh học Mô bệnh học MKI Tuổi chẩn đoán Nhóm mô bệnh học thuận lợi U NBTK ít biệt hóa MKI trung bình Ít hơn 1,5 tuổi U NBTK ít biệt hóa MKI thấp Ít hơn 1,5 tuổi U NBTK đang biệt hóa MKI trung bình Ít hơn 1,5 tuổi U NBTK đang biệt hóa MKI thấp Ít hơn 5 tuổi U hạch NBTK thể hỗn hợp Không áp dụng Mọi độ tuổi U hạch NBTK thể nốt Không áp dụng Mọi độ tuổi U hạch thần kinh Không áp dụng Mọi độ tuổi Nhóm mô bệnh học không thuận lợi U NBTK không biệt hóa Mọi MKI Mọi độ tuổi U NBTK ít biệt hóa Mọi MKI Mọi độ tuổi U NBTK ít biệt hóa MKI trung bình Trên 1,5 tuổi U NBTK ít biệt hóa MKI thấp Trên 1,5 tuổi U NBTK đang biệt hóa MKI cao Mọi độ tuổi U NBTK đang biệt hóa MKI trung bình Trên 1,5 tuổi U NBTK đang biệt hóa Không áp dụng Trên 5 tuổi U hạch NBTK thể nốt Không áp dụng Mọi độ tuổi Nhiều nghiên cứu đã xác định yếu tố MBH có giá trị tiên lƣợng quan trọng, nhóm u có MBH thuận lợi có kết quả điều trị tốt hơn có ý nghĩa thống kê so với nhóm MBH không thuận lợi. Yếu tố MBH đƣợc sử dụng trong nhiều phác đồ để phân nhóm nguy cơ [21, 31, 32]. 1.3 Các biến đổi di truyền liên quan đến bệnh u nguyên bào thần kinh 1.3.1 Khuếch đại gen MYCN Gen MYCN là một gen tiền ung thƣ, nằm trên cánh ngắn của nhiễm sắc thể số 2 tại vị trí 2p24.3. Gen có kích thƣớc 2602 bp gồm có 3 exon, mã hóa cho protein MYCN gồm 464 axit amin[19]. 15 Là một gen trội điển hình, sự biểu hiện của MYCNcó thể thấy trong các tế bào xô-ma, và thƣờng có sự kết hợp với các yếu tố gây ung thƣ khác. Sự biểu hiện quá mức của genMYCN có thể biến đổi các tế bào nguyên bào sợi từ giai đoạn bào thai sang giai đoạn lão hóa. Đồng thời, sự có mặt với số lƣợng lớn của protein MYCN trong các dòng tế bào nguyên bào thần kinh có có thể làm chậm sự phát triển hoặc giảm quá trình biệt hóa [25]. Mặc dù sự khuếch đại genMYCN đã đƣợc khẳng định trong bệnh u nguyên bào thần kinh với tiên lƣợng xấu, protein MYCN có vai trò khuếch đại trong khối u hay không vẫn còn gây nhiều tranh cãi. Một số các dòng tế bào u nguyên bào thần kinh có biểu hiện mức độ cao với protein MYCN mà không có khuếch đại gen.Điều này có thể do sự thay đổi trong chu trình suy thoái protein hơn là trong quá trình tự điều hòa dịch mã gene MYCN. Ở giai đoạn đầu, sự biểu hiện của protein MYCN có thể đƣợc tìm thấy ở tất cả các giai đoạn của bệnh. Điều này đƣợc cho rằng sự biểu hiện của MYCN không liên quan đến kiểu hình lâm sàng. Tuy nhiên, trong nhóm các khối u không có sự khuếch đại genMYCN, một số nghiên cứu cho thấy sự biểu hiện protein MYCN có liên quan tới khả năng sống sót; trong khi đó, một số nghiên cứu khác lại không thấy sự liên quan nào. Trong tƣơng lai, với các nghiên cứu lớn hơn về việc điều trị bệnh nhân với các phƣơng pháp tiêu chuẩn là cần thiết để tìm hiểu về mức độ biểu hiện protein MYCN có liên quan đến tiên lƣợng tiến triển các khổi u khi thiếu sự khuếch đại genMYCN[25] Các nghiên cứu đầu tiên về u nguyên bào thần kinh cho thấy các tế bào u nguyên bào thần kinh đều có các mảnh nhỏ chất nhiễm sắc kép (double-minute chromatin bodies (DM)) cũng nhƣ các vùng bắt màu đồng nhất (homogeneously staining regions (HSR)) trên các nhiễm sắc thể lớn. Về sau, những bất thƣờng nhiễm sắc thể này đều đƣợc khẳng định là biểu hiện về mặt di truyền tế bào của một sự khuếch đại, gen MYCN. Tuy nhiên, sự khuếch đại MYCN thƣờng đƣợc tìm thấy ở ngoài vị trí này: hoặc trong vùng HSR của nhiễm sắc thể khác, hoặc trong DM ngoài nhiễm sắc thể, hoặc cả hai. 16 Hình 1.3. Cơ chế khuếch đại gen[27] Cơ chế khuếch đại MYCN đến nay vẫn chƣa đƣợc hiểu hết. Theo nghiên cứu của Matsui A. và cộng sự (2013), đầu tiên DSB (Double - stranded break) xuất hiện ở vùng đứt gẫy telomere trên nhiễm sắc thể. Để thay thế, sợi chromatid bị mất vùng telomere đƣợc tái tạo. Hai đầu bị mất vùng telomere đƣợc ghép nối và tạo thành dạng nhiễm sắc thể có hai tâm (dicentric chromosome). Tại thời điểm phân bào, hai tâm này sẽ đƣợc kéo về hai đầu tâm động của thoi vô sắc và tạo thành cầu nối chromatid. Sự phân chia bất thƣờng của nhiễm sắc thể sẽ gây ra các vị trí đứt gẫy ngẫu nhiên của các cầu nối chromatid, và tạo ra các vùng kết thúc mới nhƣng thiếu đoạn telomere mới. Cuối giai đoạn phân bào sẽ tạo ra một tế bào sẽ có dạng nhiễm sắc thể hai tâm và một tế bào sẽ có một đoạn nhiễm sắc thể thiếu vùng telomere. Các chu kỳ trên sẽ đƣợc lặp 17 lại và khuếch đại với các trình tự lặp đảo ngƣợc (HSR) - (A) hoặc khuếch đại tăng sinh nhiễm sắc thể (DMs) - (B) (Hình 1.3)[27] Trong quá trình nhân lên của tế bào, gen MYCN nằm trên NST số 2 cũng đƣợc nhân lên theo chu trình tế bào. Tuy nhiên, khi có rối loạn trong quá trình đó, gen MYCN đƣợc khuếch đại lên nhiều bản sao ở các NST khác tạo nên cùng HSRhoặc gen 1 đoạn lặp nhỏ gen MYCN tách trực tiếp khỏi NST hình thành vòng lặp (DM). Các DM này có thể đƣợc tích lũy lại nhờ quá trình phân chia không đều trong phân bào, hoặc trong một số trƣờng hợp khác, các DM sẽ tập hợp thành một locus nhiễm sắc thể để tạo nên HSR[12, 16, 24, 37]. Vùng khuếch đại trên NST số 2 có kích thƣớc thay đổi từ 350-2000kb nhƣng luôn có một cùng khuếch đại bảo thủ dài 130kb. Theo Westermann F. (2008)trong một công bố của mình đã giả thiết rằng khuếch đại gen MYCN là một tính chất sinh học xuất hiện ngay từ đầu ở nhóm U NBTK ác tính cao và các khối u không có khuếch đại gen tại thời điểm chẩn đoán hiếm khi có đặc điểm sinh học này. Khuếch đại gen MYCN hiện nay đƣợc chấp nhận rộng rãi có liên quan đến tiên lƣợng bệnh và trong phần lớn các phác đồ điều trị hiện nay đều cần có kết quả trạng thái gen MYCN trƣớc khi bắt đầu điều trị cho bệnh nhân [38]. 1.3.2 Các bất thường nhiễm sắc thể 1.3.2.1 Bất thường số lượng nhiễm sắc thể Phần lớn các khối u đều có nhiễm sắc đồ thể lƣỡng bội. Các khối u ở giai đoạn sớm của bệnh thƣờng ở thể đa bội hay gần tam bội. Nhiễm sắc đồ của các tế bào u có thể có giá trị tiên lƣợng, nhƣng phân tích nhiễm sắc thể khá khó khăn . Trạng thái bội thể này có ý nghiã tiên lƣơṇg vào vi ệc dự báo kết quả điều trị ở các bệnh nhân u nguyên bào thần kinh dƣới 1 tuổi nhƣng không có ý nghĩa tiên lƣ ợng đối với các bệnh nhân lớn. Điều này có thể là do ở các bệnh nhân dƣới 1 tuổi thể đa bội hay gần tam bội có thêm cả nhiễm sắc thể mà không có các biến đổi cấu trúc, trong khi với các bệnh nhân lớn hơn, các biến đổi này đi kèm với sự thay đổi cấu trúc nhiễm sắc thể [36]. 18 1.3.2.2 Các biến đổi liên quan đến cấu trúc nhiễm sắc thể  Mất đoạn ở cánh ngắn nhiễm sắc thể số 1 (1p) Mất đoạn ở cánh ngắn nhiễm sắc thể số 1 đƣợc tìm thấy ở khoảng 35% số ca u nguyên bào thần kinh. Các mất đoạn trên nhiễm sắc thể số 1 đƣợc tìm thấy nhiều hơn ở các bệnh nhân u nguyên bào thần kinh giai đoạn muôṇ , và mất đoạn dị hợp tử 1p rất hay đi kèm với sự khuếch đại MYCN. Ý nghĩa tiên lƣợng độc lập của mất đoạn dị hợp tử 1p vẫn còn đang đƣợc tranh luận nhƣng các bằng chứng hiện nay chỉ ra rằng mất đoạn dị hợp tử ở vị trí 1p36 đi kèm với kết quả điều trị thấp và là yếu t ố tiên lƣợng xấu ở các b ệnh nhân nguy cơ thấp và trung bình [4].  Thêm đoạn ở cánh dài nhiễm sắc thể số 17 (17q) Biến đổi di truyền hay gặp nhất ở các bệnh nhân u NBTK là thêm đoạn ở cánh dài nhiễm sắc thể số 17 (17q) (khoảng 50% số ca). Bên cạnh một phần nhất định số ca thêm đoạn 17q là kết quả của sự thêm đoạn không cân bằng xảy ra độc lập, phần nhiều các trƣờng hợp là do sự chuyển đoạn không cân bằng giữa 17q và nhiễm sắc thể khác. Vị trí chuyển đoạn với 17q hay gặp nhất là 1p, và tiếp theo sau là 11q [36].  Các biến đổi khác Ngoài 3 biến đổi di truyền nói trên, gần đây trên các bệnh nhân u nguyên bào thần kinh, ngƣời ta còn đánh giá thêm sự mất đoạn trên cánh dài của nhiễm sắc thể số 11 (11q23.3) và 14 (14q23-32). Mất đoạn 11q xảy ra ở 43% u nguyên bào thần kinh và là môṭ trong các m ất đoạn phổ biến nhất đối với loại ung thƣ này (tỷ lệ mất đoạn 14q là 23%) [13]. Mất đoạn 11q và 14q thƣờng xảy ra cùng nhau và ngƣợc với sự khuếch đại MYCN và mất đoạn 1p. 19 1.4 Mô hình di truyền trong u NBTK Dựa trên tất cả các biến đổi di truyền nói trên, một mô hình di truyền về sự phát triển của u nguyên bào thần kinh đã đƣợc đề xuất nhƣHình 1.4. Hình 1.4. Mô hình di truyền về sự phát triển của u nguyên bào thần kinh [10] Theo đó, từ các tế bào ban đầu, phụ thuộc vào các dạng đột biến xảy ra, u nguyên bào thần kinh sẽ đi theo một trong hai nhánh lớn: Nhánh thứ nhất đƣợc xác định bởi sự hoạt động giảm phân không bình thƣờng, dẫn đến thể đa bội hay gần tam bội (3N) với sự tăng số lƣợng các nhiễm sắc thể, có rất ít sự thay đổi về cấu trúc. Các khối u này thiên về hƣớng biệt hóa tiếp hay chết theo chƣơng trình (apoptosist), tùy thuộc vào sự có mặt hay không nhân tố phát triển thần kinh trong môi trƣờng nội bào. Các bệnh nhân thuộc nhánh này thƣờng dƣới 1 tuổi, khối u khu trú ở giai đoạn 1, 2 hoặc 4S và có tiên lƣợng tốt (tỷ lệ sống trong 5 năm là 95%). Nhánh thứ hai thƣờng có thể lƣỡng bội (2N) hay tứ bội (4N), nhƣng đƣợc xác định chủ yếu nhờ các bất thƣờng nhiễm sắc thể lớn, trong đó nhiều nhất là thêm đoạn 17q. Tại đây có hai nhóm nhỏ hơn đƣợc xác định phân biệt nhau. Một nhóm có sự mất đoạn 11q và/hoặc có mất đoạn 14q. Các bệnh nhân ở nhóm này thƣờng lớn hơn 1 tuổi, 20 khối u ở giai đoạn 3 hoặc 4 với sự tiến triển chậm, và hay tử vong (tỷ lệ sống trong 5 năm là 40 – 50%). Nhóm còn lại với sự xuất hiện của mất đoạn dị hợp tử 1p và khuếch đại MYCN. Đây là nhóm có tính chất ác tính nhất, có sự tiến triển của bệnh rất nhanh. Các bệnh nhân thuộc nhóm này thƣờng từ 1 – 5 tuổi, ở giai đoạn 3 hoặc 4 và hầu hết là tử vong (tỷ lệ sống trong 5 năm là 25%). Về sự di truyền của u nguyên bào thần kinh trong gia đình, cho đến thời điểm này vẫn chƣa có một bằng chứng cụ thể nào về sự di truyền bệnh qua các thế hệ. Các nhà nghiên cứu chỉ nhận thấy rằng độ tuổi chẩn đoán ở các đứa trẻ có u NBTK di truyền là 9 tháng, trong khi độ tuổi này trong quần thể là 18 tháng. Và ít nhất 20% u nguyên bào thần kinh di truyền có các khối u tiên phát ở cả hai bên thận hoặc tại nhiều vị trí khác nhau. Đã có rất nhiều các bất thƣờng di truyền (nhƣ mất đoạn 1p) đƣợc nghiên cứu, song cho đến nay vẫn chƣa có bất thƣờng nào có tính đặc hiệu và làm tăng tỷ lệ mắc u nguyên bào thần kinh đƣợc tìm ra[42] 1.5 Tính cấp thiết của đề tài Trƣớc đây, việc phân loại bệnh nhân lựa chọn pháp đồ điều trị và tiên lƣợng bệnh gặp nhiều khó khăn vì chỉ dựa vào các chỉ số sinh hóa và kết quả giải phẫu bệnh có độ chính xác không cao[4].Gần đây chỉ có một vài nghiên cứu nhỏ lẻ của Thạc sĩ Vũ Đình Quang và cộng sự về kết quả đánh giá khuếch đại ge