Luận văn Xác định tình hình nhiễm sốt rét và tình trạng thiếu glucose - 6 - phosphate - dehydrogenase (g6pd) ở người dân sống tại vùng sốt rét lưu hành tỉnh Đăk Nông năm 2017

ng lớp 1 do chúng gây nên những rối loạn chức năng nghiêm trọng, nhƣng thật ra xét về mặt hoạt độ enzyme invitro thì thậm chí lại còn cao hơn một số biến thể đƣợc xếp vào lớp 3. Những ngƣời bị thiếu hụt G6PD thƣờng không biểu hiện triệu chứng lâm sàng. Khi tiếp xúc với những tác nhân oxy hoá lúc đó mới biểu hiện ra mà triệu chứng chủ yếu là những cơn tan máu. Những trƣờng hợp tan máu ác tính nƣớc tiểu trở nên đen thẫm, hoặc bệnh nhân có những triệu chứng lâm sàng nặng hơn nhƣ sốt cao, vàng da... Với những trƣờng hợp thiếu G6PD mức độ trung bình nhƣ phân loại lớp 3 thì tan máu cũng chỉ ở mức độ vừa phải vì chỉ có những hồng cầu già bị phá hủy còn những hồng cầu non có hoạt tính enzym bình thƣờng thì không [11-12]. Vàng da kéo dài ở trẻ sơ sinh: Vàng da sinh lý là một hiện tƣợng hay gặp ở trẻ sơ sinh do vỡ hồng cầu trong những ngày đầu sau sinh. Những trƣờng hợp vàng da kéo dài có thể do nhiều nguyên nhân và một trong những nguyên nhân đó là do thiếu hụt G6PD. Thiếu G6PD có thể gây ảnh hƣởng đến tính mạng và sức khỏe của trẻ sơ sinh. Trên thế giới đã có những nghiên cứu về vàng da sơ sinh với thiếu G6PD. Ở Đài Loan và Quảng Đông khoảng 20- 40% vàng da sơ sinh có liên quan đến thiếu G6PD, trong khi đó ở Mỹ lại không đáng kể [11, 14]. 1.2.4. Các tác nhân gây đái huyết cầu tố ở ngƣời thiếu G6PD Ở ngƣời thiếu G6PD bị đái huyết cầu tố do các nguyên nhân khác nhau, cụ thể: Do tác dụng của thuốc: Việc thiếu G6PD đƣợc phát hiện ở những ngƣời chỉ xảy ra tan máu khi uống thuốc SR nhƣ Primaquin. Primaquin là một trong những thuốc làm giảm tuổi thọ hồng cầu ở những ngƣời thiếu G6PD. Sau khi cho bệnh nhân sử dụng thuốc này 1-2 ngày hàm lƣợng Hemoglobin đã giảm xuống. 15 Ngoài ra một số thuốc khi ta dùng cho bệnh nhân thiếu G6PD cần phải thận trọng nhƣ Acetaminophen (paracetamol), Ascorbic acid (vitamin C), Sulphaguanidin, chloramphenicol... [12, 17]. Do thức ăn: Một số ngƣời khi ăn đậu fava (đậu móng ngựa) có thể xuất hiện tình trạng tan máu mà nhiều khi rất dữ dội (gọi là Favism). Sau đó nhiều nghiên cứu cho thấy tình trạng này có liên quan đến thiếu hụt G6PD. Đa số các trƣờng hợp favism là những ngƣời thiếu G6PD. Nhƣng lại có một số ngƣời thiếu G6PD khi ăn đậu fava lại không có triệu chứng lâm sàng. Đậu fava chứa divicine (convicine và vicine) có khả năng oxy hoá rất mạnh, khi vào cơ thể hai chất này gây giảm glutathion khử rất nhanh và mạnh. Vì thế những bệnh nhân thiếu hụt G6PD type Địa Trung Hải (Mediterranean) khi ăn đậu fava sẽ xảy ra cơn tan máu cấp sau 24-48 giờ [10-11]. Do nhiễm trùng, nhiễm ký sinh trùng. 1.2.5. Chẩn đoán và xử trí thiếu hụt G6PD 1.2.5.1 Chẩn đoán Vì những ngƣời thiếu G6PD ít có biểu hiện lâm sàng nên xét nghiệm để chẩn đoán bệnh nhân có thiếu G6PD hay không cần có các phƣơng pháp xác định. Sau đây là một 1 số phƣơng pháp hiện nay đã đƣợc đƣa vào áp dụng tại Việt Nam: + Phương pháp huỳnh quang của Beutler (1966): đây là một phƣơng pháp định tính dựa trên nguyên lý: Glucose 6 Phosphate (G6P) là một chất không phát quang khi có mặt của G6PD và NADP, chuyển thành 6 Phospho Glucononolacton (6PG) là một chất phát quang, do vậy có thể nhận biết dễ dàng dƣới ánh sáng của đèn cực tím [18- 19]. Phƣơng pháp này hiện nay đƣợc đƣợc nhiều hãng đƣa vào sản xuất thành kít bán trên thị trƣờng. + Phương pháp tạo vòng formazan của Fujii (1984) [20]: là phƣơng pháp định tính dựa trên nguyên lý chuyển màu của MTT, từ một chất có màu vàng nhạt sang màu xanh sẫm với sự có mặt của NADPH, mà NADPH đƣợc tạo thành với sự có mặt của G6PD. Phƣơng pháp này có ƣu điểm là có thể tiến hành trên các mẫu máu khô (máu đƣợc lấy vào giấy thấm), sau đó các 16 mảnh giấy thấm chứa máu đƣợc đặt lên thạch chứa hóa chất. Các trƣờng hợp thiếu G6PD sẽ không tạo thành vòng màu xanh sẫm (formazan). Đƣờng kính của vòng màu xanh nói lên hoạt độ G6PD có trong mẫu máu. Tuy nhiên, phƣơng pháp này trả lời kết quả nhanh nhất cũng phải sau 8 giờ và phụ thuộc vào điều kiện và thời gian bảo quản mẫu máu. + Phương pháp Hirono (1998) [21] là phƣơng pháp định tính dựa trên nguyên lý nhƣ phƣơng pháp tạo vòng formazan. Phƣơng pháp này có ƣu điểm là trả lời kết quả nhanh chỉ sau 30 phút và không cần các thiết bị đắt tiền + Phương pháp định lượng hoạt độ của G6PD bằng cách đo tốc độ tăng mật độ quang ở bước sóng 340nm do sự tăng nồng độ của NADPH: Là phƣơng pháp đã đƣợc dùng để định lƣợng hoạt độ G6PD trong những năm gần đây. + Phương pháp phân tích gen: Gần đây phƣơng pháp này đã đƣợc áp dụng để xác định các dạng đột biến và các biến thể của G6PD. 1.2.5.2 Xử trí trong trường hợp thiếu G6PD Bệnh di truyền không có thuốc điều trị đặc hiệu. Trong những trƣờng hợp tan máu do dùng thuốc chúng ta phải ngay lập tức ngừng dùng thuốc. Nếu tan máu nặng cần phải truyền máu. Với những bệnh nhân thiếu G6PD đã biết trƣớc cần chủ động phòng tránh những thức ăn và thuốc có tính chất oxy hoá. Những bệnh nhân có chỉ định các thuốc oxy hoá nên xét nghiệm G6PD trƣớc khi dùng. 1.3. TÌNH HÌNH SỐT RÉT TRÊN THẾ GIỚI VÀ VIỆT NAM 1.3.1. Tình hình sốt rét trên thế giới Theo báo cáo của WHO (2017) có 91 Quốc gia trên toàn cầu có SRLH, ƣớc tính có khoảng 3 tỷ ngƣời có nguy cơ mắc SR. Trong năm 2016, ƣớc tính có 216 triệu trƣờng hợp mắc SR tăng 5 triệu trƣờng hợp so với năm 2015, hơn 4 trăm nghìn ngƣời tử vong do SR. Hầu hết các trƣờng hợp SR trong năm 2016 đều nằm trong Khu vực Châu Phi (90%), tiếp theo là Khu vực Châu Á (7%) và Khu vực Đông Địa Trung Hải (2%) [1]. 17 Hình 3. Phân bố sốt rét trên thế giới năm 2016. (nguồn: https://travelhealthpro.org.uk/factsheet/52/malaria) Tác động của SR ở các nƣớc khu vực Tây Thái Bình Dƣơng khá nặng nề, theo báo cáo của WHO (2014): SR lây truyền mạnh tại Papua New Guinea, Solomon, Vanuatu và một số quốc gia khác của khu vực. Đối tƣợng mắc SR chủ yếu ở các nhóm dân tộc thiểu số và dân di cƣ. Hầu hết các trƣờng hợp mắc KSTSR là P. falciparum và P. vivax. Trong những năm gần đây, số trƣờng hợp mắc SR do P. knowlesi đã làm tăng số lƣợng mắc SR trong khu vực [22]. Mặc dù SR đã giảm nhiều tại nhiều nƣớc trên thế giới cũng nhƣ ở Việt Nam, tuy nhiên các nƣớc đặc biệt là các nƣớc tiểu vùng sông Mê Kông đang phải đối mặt với nhiều thách thức nhƣ: SR tập trung tại khu vực vùng sâu, vùng xa nơi có trình độ dân trí thấp, mạng lƣới y tế thôn bản còn thiếu và yếu, tình hình SR kháng thuốc diễn ra phức tạp. Các trƣờng hợp mắc SR tập trung ở đối tƣợng đi rừng, ngủ rẫy, giao lƣu qua biên giới. Ba nƣớc Việt Nam, Lào, Campuchia cùng nằm trên bán đảo Đông Dƣơng. Tổng dân số của 3 nƣớc khoảng 120 triệu ngƣời, ƣớc tính có khoảng 55 triệu ngƣời có nguy cơ mắc SR, 25% dân số trong vùng SRLH nặng và có chung thách thức về công tác PCSR. Ba nƣớc Đông Dƣơng có đặc điểm văn hóa đa dạng, nhiều dân tộc khác nhau với các tập quán sống du canh, du cƣ 18 hoặc bán du canh, du cƣ, có nhiều ngôn ngữ, phong tục và nhận thức khác nhau. Các nhóm dân tộc thiểu số này sinh sống trong các vùng sâu, vùng xa, nghèo và hạn chế trong việc tiếp cận các dịch vụ y tế [23]. 1.3.2. Tình hình sốt rét tại Việt Nam và tỉnh Đăk Nông Trƣớc những năm 1990, tình hình SR tại Việt Nam rất nặng nề, hàng năm có hàng triệu ca mắc, hàng nghìn ca tử vong và hàng trăm vụ dịch SR. Theo số liệu thống kê của CTQG-PCSR từ năm 1991-2011 cho thấy: năm 1991 có 1.091.251 BNSR, trong đó có 187.994 KSTSR (2,8 KSTSR/1.000 dân), 4.646 trƣờng hợp tử vong sốt rét (TVSR)(6,91 TVSR/100.000 dân). Đến năm 2011, số mắc KSTSR còn 16.612 (0,19/1.000 dân) và 14 trƣờng hợp TVSR (0,02/100.000 dân). Theo báo cáo tổng kết công tác PCSR năm 2017 của CTQG-PCSR tổng số bệnh nhân SR năm 2017 của cả nƣớc là 8.411 trƣờng hợp, giảm 19,48% so với năm 2016 và giảm 80,76% so với năm 2012 (26.058 trƣờng hợp). Số lƣợng KSTSR năm 2017 tăng ở khu vực Tây Nguyên, Đông Nam Bộ, miền núi phía Bắc và đồng bằng sông Cửu Long so với cùng kỳ năm 2016, tăng cao nhất ở khu vực Tây Nguyên (63,40%); riêng khu IV cũ giảm 78,48% (65/302), khu vực ven biển miền Trung giảm 28,81% (986/1.385), đồng bằng trung du Bắc Bộ giảm 51,92%. Mƣời tỉnh có số lƣợng bệnh nhân SR cao nhất chiếm 85,99% tổng số bệnh nhân SR toàn quốc (3.911/4.548), gồm: Bình Phƣớc (1.352), Gia Lai (842), Đắk Lắk (525), Đắk Nông (262), Quảng Trị (245), Ninh Thuận (164), Lâm Đồng (149), Khánh Hòa (144), Quảng Bình (122) và Kon Tum (106). Khu vực Tây Nguyên năm 2017 là một trong những vùng có tỷ lệ mắc SR tăng so với năm 2016. Theo số liệu thống kê thì năm 2016 có 1.153 ca mắc SR, thì đến năm 2017 có 1.884 ca mắc SR, tăng 63,40%. Đăk Nông nằm ở cửa ngõ phía Nam của Tây Nguyên - là tỉnh thuộc vùng SRLH, trong địa bàn có nhiều huyện nhƣ huyện Tuy Đức, Đăk R’lấp, Đăk Mil và Cƣ Jút nằm trong vùng SRLH nặng. Năm 2016 số mắc SR là 200 trƣờng hợp, năm 2017 là 262 trƣờng hợp, tăng 31,0%. 19 Kinh tế của ngƣời dân khó khăn, chủ yếu sống bằng việc đi rừng, làm rẫy, các vùng giáp ranh biên giới hay vùng ven Vƣờn Quốc gia đều có diễn biến phúc tạp. Tình hình SR P. falciparum kháng thuốc artemisinin và dẫn chất tại Đăk Nông diễn biến phức tạp, năm 2016 tại điểm nghiên cứu ở Đăk Nông cho thấy tỷ lệ điều trị thất bại gia tăng lên đến 26,7% [2]. 1.4. NHỮNG NGHIÊN CỨU Ở TRONG VÀ NGOÀI NƢỚC VỀ TỶ LỆ THIẾU G6PD Các tài liệu nghiên cứu trong và ngoài nƣớc trƣớc đây cho thấy tỷ lệ thiếu G6PD khác nhau ở nhiều vùng và nhiều nhóm dân tộc. 1.4.1. Các nghiên cứu ở nƣớc ngoài Theo Beutler, trên thế giới có khoảng 400 triệu ngƣời thiếu G6PD, bệnh gặp ở tất cả các dân tộc. Tỷ lệ hiếu hụt G6PD khác nhau tùy thuộc vào dân tộc và vùng địa lý, nhƣng cao nhất là Địa Trung Hải, Châu Phi và Nam Á, ít gặp hơn ở Bắc Âu [10]. Theo Matsuoka et al. (2001) tỷ lệ thiếu G6PD Ở Lào là 7,2%; Thái Lan 11,5%; Indonesia 3,7%; Myanma 5,4% [24]. Theo điều tra của Bouma et al. (1995) tại Pakistan, tỷ lệ thiếu enzym cũng rất khác nhau ở các dân tộc khác nhau, tỷ lệ thiếu enzym ở nhóm dân tộc Pathan là 15,8 %, Uzbak là 9,1%, Tajik 2,9% và Tukoman là 2,1% [25]. Có nhiều nghiên cứu cho rằng thiếu hụt G6PD hay gặp ở những vùng sốt rét lƣu hành nặng [20, 26]. 1.4.2 Các nghiên cứu trong nƣớc Tại Việt Nam các nhà khoa học đã nghiên cứu về G6PD từ rất lâu: Năm 1978, Hoàng Văn Sơn, đã nghiên cứu cho biết tỷ lệ thiếu enzyme G6PD từ 2-6% ở những vùng không có SR, một số vùng SRLH nặng tỷ lệ thiếu hụt lên tới 20-24% [27]. Nghiên cứu của Đoàn Hạnh Nhân và cộng sự tiến hành theo phƣơng pháp chọn mẫu ngẫu nhiên trên 1.676 nam học sinh phổ thông cơ sở tuổi từ 6- 15 tại 8 huyện thuộc 4 tỉnh Hoà Bình, Hà Giang, Sơn La và Thanh Hoá từ 20 tháng 9/1996 - 1/1997. Kết quả cho thấy, thiếu G6PD hồng cầu có tỷ lệ cao tại một số vùng SRLH nhẹ nhƣ Kim Bôi (34,1%), Mai Châu (20,4%), Nhƣ Xuân (19,7%), Mƣờng La (17,8%) và thấp tại một số vùng sốt rét không lƣu hành nhƣ Mèo Vạc (0,3%) và Nga Sơn (0,5%). Tỷ lệ thiếu enzym ở các nhóm dân tộc khác nhau cho kết quả khác nhau, cao nhất là nhóm dân tộc Mƣờng (31%), dân tộc Thổ (22,6%) và dân tộc Thái (19,3%); thấp ở nhóm dân tộc Kinh (0,5%) và dân tộc H’mông (0,3%) [28-29]. Thiếu hụt G6PD là một nguyên nhân gây thiếu máu tan máu di truyền. Thông thƣờng trên lâm sàng hay gặp thiếu máu do tan máu mạn tính. Những trƣờng hợp tan máu cấp tính hay xảy ra khi có tác động của một số tác nhân gây oxy hoá, đặc biệt là thuốc SR (primaquin, quinin ...) [12, 30]. Theo Sane et al. (1975) khi điều trị cho 15 bệnh nhân thiếu G6PD bằng Primaquin liều 13,2mg x 1,5 viên /ngày tại bệnh viện E thì có hai ngƣời bị tán huyết mạnh phải dừng thuốc và xử trí ngay [31]. Điều này cho thấy việc xác định tỷ lệ thiếu G6PD ở một số nhóm dân tộc và những cá thể thiếu G6PD hiện đang sống trong vùng dịch tễ SR là cấp thiết từ đó áp dụng những biện pháp phòng tránh tai biến trong điều trị. 21 CHƢƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. ĐỊA ĐIỂM VÀ THỜI GIAN Nghiên cứu đƣợc thực hiện tại 6 xã thuộc 2 huyện Cƣ Jut và Tuy Đức, tỉnh Đăk Nông. Các xã đƣợc lựa chọn nằm trong vùng SRLH [2]. Cụ thể: - Huyện Tuy Đức tiến hành tại 3 xã: Quảng Trực, Quảng Tân và Đăk Ngo. - Huyện Cƣ Jut tiến hành tại 3 xã: Đăk Wil, Ea Pô, Đăk ĐRông. Hình 4. Bản đồ hành chính tỉnh Đăk Nông. (Nguồn: https://bandohanhchinh.com/ban-do-dak-nong-va-nhung-thong-tin- huu-ich/) Thời gian tiến hành điều tra cắt ngang tháng 10 năm 2017. Phân tích IFA từ tháng 2 năm 2018 đến tháng 4 năm 2018. 2.2. ĐỐI TƢỢNG Ngƣời dân sống ở vùng có SRLH tại điểm nghiên cứu. 22 * Tiêu chuẩn lựa chọn: - ≥ 6 tháng tuổi (cả nam và nữ) - Đồng ý tham gia nghiên cứu hoặc có sự đồng ý của cha mẹ hoặc ngƣời giám hộ trong trƣờng hợp là trẻ em. * Tiêu chuẩn loại trừ - < 6 tháng tuổi - Đang mắc bệnh cấp tính, thiếu máu, phụ nữ mang thai - Không đồng ý tham gia vào nghiên cứu. 2.3. THIẾT KẾ NGHIÊN CỨU Trong nghiên cứu này chúng tôi sử dụng thiết kế nghiên cứu là điều tra cắt ngang mô tả. 2.4. CỠ MẪU VÀ PHƢƠNG PHÁP CHỌN MẪU 2.4.1 . Cỡ mẫu Cỡ mẫu đƣợc tính theo công thức tính cỡ mẫu cho một tỷ lệ: Z 2 1-/2 x p (1-p) n = 2 Trong đó: n: Cỡ mẫu p: Tỷ lệ thiếu G6PD ƣớc tính theo nghiên cứu của Tạ Thị Tĩnh (2006) tại một số khu vực SRLH là 6,8% [32]. Vì vậy chúng tôi lấy p= 0,068 : 0,05 (khoảng tin cậy 95%) tƣơng ứng có Z1-/2 = 1,96 : khoảng sai lệch mong muốn giữa mẫu và quần thể (= 0,035) Cỡ mẫu ở mỗi xã: n = 198, chúng tôi lấy tròn 200 ngƣời/xã 23 Tổng số mẫu điều tra: 200 ngƣời/xã x 6 xã = 1.200 ngƣời. 2.4.2. Phƣơng pháp chọn mẫu ₋ Tại tỉnh Đăk Nông chọn chủ đích 2 huyện Cƣ Jut và Tuy Đức là nơi có tình hình SR nặng nhất của tỉnh. ₋ Tại mỗi huyện: Lập danh sách các xã có SRLH và chọn 3 xã theo phƣơng pháp chọn mẫu ngẫu nhiên đơn. ₋ Tại mỗi xã đƣợc chọn sẽ chọn ngẫu nhiên 2 thôn/bản theo phƣơng pháp chọn ngẫu nhiên đơn. ₋ Tại 2 thôn/bản đƣợc chọn: Lập danh sách những ngƣời từ 6 tháng tuổi trở lên, chọn 200 ngƣời tham gia nghiên cứu từ danh sách đã lập bằng phƣơng pháp chọn mẫu ngẫu nhiên hệ thống. 2.5. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU Nghiên cứu sẽ xác định thực trạng thiếu G6PD, tình hình mắc SR và tình trạng miễn dịch với bệnh SR ở cộng đồng nghiên cứu. Đồng thời phân tích mối tƣơng quan giữa bệnh SR với tình trạng thiếu G6PD. Các biến số cần thu thập trong nghiên cứu này gồm: Mục tiêu Biến số nghiên cứu Định nghĩa biến số Công cụ thu nhập Thông tin chung Dân số (Số dân tại điểm nghiên cứu) Dân số hiện có của địa phƣơng Phỏng vấn theo bộ câu hỏi Tuổi (Tỷ lệ % nhóm tuổi 6 tháng ≤ 5 tuổi, > 5-15 tuổi, > 15 - 60 tuổi, > 60 tuổi) Tuổi đƣợc tính theo năm 24 Giới (Tỷ lệ % nam và nữ) Nam và nữ Dân tộc (Tỷ lệ % các nhóm dân tộc) Dân tộc của ngƣời đƣợc điều tra Tiền sử sốt rét Xác định tình trạng thiếu G6PD Tỷ lệ % ngƣời thiếu G6PD Số ngƣời thiếu G6PD trên số ngƣời đƣợc điều tra Xét nghiệm máu theo phƣơng pháp phát quang (Kit của hãng Trinity Biotech) Tỷ lệ % ngƣời không thiếu G6PD Số ngƣời không thiếu G6PD trên số ngƣời đƣợc điều tra Xác định tình trạng mắc sốt rét Tỷ lệ % ngƣời có KSTSR Số ngƣời có KST (+) trong máu trên tổng số điều tra Tỷ lệ % số ngƣời nhiễm P. falciparum Số ngƣời nhiễm P. falciparum trên tổng số điều tra Tỷ lệ % số ngƣời nhiễm P. vivax Số ngƣời nhiễm P. vivax trên tổng số điều tra Tỷ lệ % số ngƣời nhiễm phối hợp Mật độ KSTSR Số KSTSR thể vô tính/mm3 25 Tỷ lệ % số ngƣời có sốt Số ngƣời có nhiệt độ hố nách ≥ 37,5 0C trên tổng số điều tra Tỷ lệ % ngƣời có xét nghiệm IFA (+) Số ngƣời có xét nghiệm IFA (+) trên tổng số ngƣời xét nghiệm IFAT 2.6. CÁC KỸ THUẬT SỬ DỤNG TRONG NGHIÊN CỨU 2.6.1. Phỏng vấn cá nhân Tất cả những đối tƣợng >15 tuổi tại điểm nghiên cứu, các trƣờng hợp < 15 tuổi thì phỏng vấn bố, mẹ hoặc ngƣời đỡ đầu về tiền sử SR, tiền sử đái huyết cầu tố. 2.6.2. Khám lâm sàng Đo nhiệt độ cơ thể bằng nhiệt kế cặp nách đối với những ngƣời đang sốt. 2.6.3. Kỹ thuật xét nghiệm phát hiện thiếu G6PD Xác định thiếu G6PD theo phƣơng pháp phát quang của Beutler: đơn giản và dễ thực hiện, có kết quả trong vòng 1 giờ, độ nhạy và độ đặc hiệu cao. Tuy nhiên đây là phƣơng pháp xét nghiệm định tính, khả năng pháp hiện không cao ở phụ nữ thiếu G6PD dị hợp tử. - Nguyên lý: G-6-PDH Glucose-6-Phosphate + NADP 6-Phosphogluconate+ NADPH (Không phát quang) (Có phát quang) - Hóa chất: của hãng Trinity Biotech 26 Một lọ dung dịch G6PDH chứa: Glucose 6 – phosphate, NADP, Glutathione và dung dịch ly giải hồng cầu pha loãng trong dung dịch đệm TRIZMA. - Các bƣớc tiến hành: +Lấy 10 microlit máu ở đầu ngón tay, trộn với 0.2 ml G6PDH. + Nhỏ hỗn hợp vừa trộn vào giấy Whatman (khoảng 15 microlit). + Cứ sau 5 phút lại nhỏ tiếp vào giấy Whatman (5 phút và 10 phút) + Khi giấy whatman khô (khoảng 30 – 40 phút), đọc kết quả dƣới ánh sáng của đèn cực tím. - Đọc kết quả + Mẫu máu thiếu G6PD: Dung dịch trộn trên giấy Whatman không phát quang. + Mẫu máu không thiếu hoặc bán thiếu với G6PD: có phát quang hoặc phát quang yếu. Hình 5. Kết quả G6PD. 27 2.6.4. Xét nghiệm lam máu phát hiện KSTSR Phát hiện KSTSR bằng phương pháp giêm sa: theo kỹ thuật thƣờng qui của Viện Sốt rét - Ký sinh trùng - Côn trùng Trung ƣơng Phƣơng pháp lấy lam máu nhuộm Giêmsa soi kính hiển vi phát hiện KSTSR là kỹ thuật cổ điển, đƣợc áp dụng rộng rãi và đƣợc WHO coi là “tiêu chuẩn vàng” trong các kỹ thuật phát hiện KSTSR Dụng cụ, hóa chất: - Kim chích máu, găng tay, lam sạch, lam kéo, giá lam, hộp petri, bông khô, bông cồn, phiếu xét nghiệm, bút chì, bút bi xanh, bút bi đỏ, khay men, ống đong, pipet, cốc có mỏ 50ml, 100ml, đồng hồ báo giờ, kính hiển vi quang học, dầu soi kính, máy đếm KSTSR. Các bước tiến hành: - Hỏi và ghi các thông tin vào phiếu xét nghiệm - Sát trùng đầu ngón tay, chích máu. Với trẻ nhỏ ở ngón chân cái hoặc gót chân. - Cho máu vào lam: + Lấy 1 giọt máu tƣơng đƣơng 1mm3 vào giữa lam làm giọt mỏng. + Lấy 3 giọt, mỗi giọt tƣơng đƣơng 1 mm3 vào ¼ lam còn lại làm giọt dày. - Làm khô lam máu: để khô tự nhiên. - Ghi số hiệu lam: dung bút chì ghi số hiệu lam, ngày lấy máu vào phần đầu của giọt máu đàn. - Nhuộm lam máu: Pha nồng độ giemsa 4% nhuộm thƣờng quy 1 lam giọt dày cần 1ml dung dịch giemsa nhuộm 1 lam giọt mỏng cần 1,5 ml dung dịch giêm sa nhuộm. Từ đó tính ra số ml dung dịch giêm sa mẹ, số ml dung dịch đệm pH 7,2 cần pha cho số lƣợng tiêu bản. + Kỹ thuật nhuộm: 28  Với giọt mỏng: cố định giọt mỏng bằng cách nhỏ cồn methanol trùm kín lên giọt mỏng.  Với giọt dày: máu lấy lâu > 3 ngày, mốc, bẩn hoặc quá dày phải dung giải trƣớc khi nhuộm bằng cách nhỏ dung dịch Giem sa lên giọt dày, để 1 -2 phút, lắc nhẹ, đổ đi rồi để khô.  Xếp lam lên giá: chọn giá lam thật phẳng, xếp các lam cách nhau 0,5 cm, giọt máu đàn quay về một phía.  Nhỏ hết dung dịch giemsa nhuộm đã pha phủ kín hết giọt máu (không có bọt và không tràn ra mép lam).  Để thời gian 40 -45 phút  Rửa tiêu bản bằng cách quay giọt máu đàn về phía vòi nƣớc, không đổ gieemssa nhuộm trƣớc khi rửa. Rửa dƣới vòi nƣớc chảy nhẹ cho đến khi nƣớc trong (lam cách vòi nƣớc khoảng 5cm). Cắm tiêu bản lên giá cài để khô tự nhiên rồi đem soi dƣới kính hiển vi quang học. + Soi tiêu bản: Soi bằng vật kính dầu có độ phóng đại 100×, thị kính 10×.  Nhỏ 1 giọt dầu vào giọt dày và 1 giọt dầu vào phần đuôi của giọt mỏng.  Đặt tiêu bản lên kính, soi giọt dày trƣớc, giọt mỏng sau.  Soi phát hiện KSTSR ở giọt dày và định loại KSTSR ở giọt mỏng.  Soi 100 vi trƣờng trên tiêu bản giọt dày nếu phát hiện đƣợc KSTSR thì dừng soi và trả lời kết quả.  Soi 200 vi trƣờng trong thời gian 10 phút trên tiêu bản giọt dày không thấy KSTSR mới kết luận âm tính.  Đánh giá mật độ KSTSR/mm3 máu (dựa vào số lƣợng bạch cầu chuẩn) Số lƣợng KSTSR đếm đƣợc x số lƣợng bạch cầu chuẩn KSTSR/ mm 3 máu = Số lƣợng bạch cầu đếm đƣợc 29 (Số lƣợng bạch cầu chuẩn của ngƣời đƣợc quy định khoảng 8000 bạch cầu/ mm3 máu). 2.6.5 Xét nghiệm miễn dịch phát hiện kháng thể kháng sốt rét Nghiên cứu đã sử dụng kỹ thuật huỳnh quang gián tiếp (Indirect Fluorescent Antibody Test - IFAT) để phát hiện kháng thể SR trong máu bệnh nhân. Đây làphƣơng pháp thƣờng quy của Viện Sốt rét - KST - CT TƢ nhằm xác định kháng thể chống SR trong mẫu máu. Các mẫu máu có trong giấy thấm đƣợc thu tại thực địa theo qui trình của Colline (1972), và sau đó đƣợc mang về phân tích tại Phòng thí nghiệm Miễn dịch, khoa Nghiên cứu và Điều trị sốt rét, Viện Sốt rét - KST - CT TƢ. Kỹ thuật IFAT có độ nhạy cao, phản ứng dƣơng tính từ 7-10 ngày sau khi nhiễm ký sinh trùng [33] Nguyên lý của phƣơng pháp: Huyết thanh bệnh nhân đƣợc nhỏ vào lam máu chứa kháng nguyên P. falciparum. Nếu trong máu bệnh nhân chứa kháng thể SR, sẽ có phản ứng tạo thành phức hợp kháng nguyên - kháng thể. Phức hợp này đƣợc cho phản ứng với huyết thanh kháng globulin miễn dịch (IgG) gắn huỳnh quang. Phức hợp kháng nguyên - kháng thể - kháng kháng thể gắn huỳnh quang sẽ đƣợc phát hiện dƣới kính hiển vi huỳnh quang. Các bước tiến hành: Chuẩn bị kháng nguyên - Kháng nguyên P.falciparum đƣợc lấy từ nuôi cấy P.falciparum trong lab; - Thu hồng cầu nhiễm KST từ đĩa nuôi cấy. Rửa hồng cầu bằng dung dịch PBS sử dụng (1X), rửa 3 lần với tốc độ ly tâm 2000 vòng/phút trong 10 phút, hút hết phần dung dịch phía trên, lấy phần cặn hồng cầu, xác định thể tích cặn hồng cầu. - Pha loãng hồng cầu lắng ở trên trong PBS (1X) theo công thức: V (Tổng thể tích cần có) = 5 x (mật độ KST x thể tích hồng cầu lắng) - Trộn đều, dùng pipet hút 20 µl nhỏ vào các giếng của lam kháng nguyên; - Để khô, đóng gói cất tủ âm sâu (- 30oC đến - 70 oC), có thể sử dụng trong 1 năm. 30 Chuẩn bị mẫu thử Đối với mẫu giấy thấm - Lấy mẫu máu khô trên giấy thấm Whatman 3 từ tủ âm ra, dung kìm bấm một mảnh đƣờng kính 5 mm, rồi dùng panh hoặc kim chấm cho mỗi mảnh vào một giếng của phiến nhựa 96 giếng; - Nhỏ vào mỗi giếng 200 µl PBS (1X) ta có độ pha loãng huyết thanh 1/40; - Ngâm 12 tiếng ở 4oC. Chuẩn bị chứng âm/dƣơng - Chứng âm: Huyết thanh của ngƣời không bị nhiễn sốt rét đƣợc kiểm tra bằng phƣơng pháp ELISA với OD 0.01 đến 0.5 bảo quản ở nhiệt độ < - 20o C. - Chứng dƣơng: Huyết thanh của ngƣời nhiễm sốt rét P.falciparum đƣợc kiểm tra bằng phƣơng pháp ELISA với OD 1.3 đến 1.5 bảo quản ở nhiệt độ < - 20 o C. Tiến hành kỹ thuật Test sàng lọc (xác định âm dƣơng) - Lấy lam kháng nguyên từ tủ âm để trong tủ hút ẩm hoặc bình hút ẩm chứa silicagene để làm khô lam. - Lấy mẫu thử đã chuẩn bị từ hôm trƣớc trong tủ lạnh để ở nhiệt độ phòng khoảng 30 phút. - Nhỏ mỗi giếng của lam 20 µl mẫu thử (pha loãng 1/40) đã chuẩn bị từ hôm trƣớc. Mỗi mẫu thử nhỏ 2 giếng. Mỗi lam 10 giếng tƣơng ứng 5 bệnh nhân. - Lam chứng: Pha loãng chứng dƣơng, chứng âm theo tỷ lệ 1/40 nhỏ các mẫu đã pha lên lam mỗi mẫu nhỏ 2 giọt. - Cho lam đã nhỏ mẫu ở trên vào ủ ở 37oC trong buồng ẩm trong 30 phút (buồng ẩm kích thƣớc đặt vừa giá lam). - Rửa lam: Lấy lam ra ngâm vào cóng có chứa PBS (1X) sau 5 phút đổ dung dịch PBS (1X) trong cóng đi, thêm dung dịnh PBS (1X) ngâm tiếp. Bƣớc này sẽ thực hiện 3 lần. 31 - Lấy lam ra khỏi cóng, cho lên giá lam đợi cho khô (có thể dung máy sấy nhẹ để lam nhanh khô). - Nhỏ cộng hợp kháng thể gắn huỳnh quang đã chuẩn bị trƣớc (20µl/giếng). - Ủ ở nhiệt độ 37oC trong buồng ẩm, thời gian 30 phút. - Rửa lam: Rửa 3 lần tƣợng tự nhƣ bƣớc rửa lam ở trên. - Để lam trên giá cho khô tự nhiên, khi lam khô, nhỏ dung dịch soi, - Soi lam dƣới kính hiển vi huỳnh quang, vật kính 100, thị kính 10. Nhận định kết quả Dƣơng tính: khi soi thấy tại các điểm nhân KST phát sáng, cƣờng độ mạnh. Âm tính: không phát quang. Mẫu IFAT (+) Mẫu IFAT (-) Hình 6. Hình ảnh mẫu IFAT soi trên kính hiển vi huỳnh quang. Hiệu giá kháng thể (đánh giá nồng độ kháng thể cao thấp) Các mẫu thử đƣợc xác định dƣơng tính sẽ đƣợc pha loãng tiếp nhƣ sau: - Pha loãng mẫu thử gấp đôi tăng dần: lấy 50 µl mẫu thử pha loãng 1/40 cộng thêm 50 µl PBS (1X) đƣợc mẫu thử pha loãng 1/80 (giếng 1), trộn đều giếng 1 lấy 50 µl cộng với 50 µl PBS (1X) đƣợc mẫu thử pha loãng 1/160. Cứ tiếp tục pha loãng đến khi đƣợc nồng độ cuối cùng là 1/1280. - Chứng dƣơng cũng pha loãng tƣơng tự. 32 - Nhỏ mỗi nồng độ pha loãng ở trên vào các giếng của lam (mỗi giếng 25 µl), mỗi bệnh nhân một dãy, nhỏ từ nồng độ pha loãng thấp nhất đến nồng độ pha loãng cao nhất, thông thƣờng pha loãng ra 5 nồng độ sau: 1/80, 1/160, 1/320, 1/640, 1/1280; 1 lam đƣợc 2 bệnh nhân. - Cho lam đã nhỏ mẫu thử ở trên vào ủ ở 37oC trong buồng ẩm trong 30 phút. - Lấy lam ra rửa 3 lần bằng BPS (1X) trong cóng rửa. - Nhỏ cộng hợp kháng thể gắn huỳnh quang đã chuẩn bị trƣớc (20µl/