Luận văn Xây dựng quy trình phát hiện đột biến rtA181V/T và rtN236T kháng Adefovir của virus viêm gan B (Hepatitis B Virus) bằng kỹ thuật real-Time PCR

TTP; - Taq DNA polymerase; - Dung dịch MgCl2. 2.2 Nội dung nghiên cứu - Thiết kế các cặp primer và TaqMan probe đặc hiệu với các vị trí đột biến kháng ADV của HBV bằng phần mềm chuyên dụng và các công cụ trên NCBI và IDT. - Tối ưu hóa các điều kiện của phản ứng real-time PCR, tiến hành khảo sát các thông số sau: khả năng nhân bản của hệ primer-probe, nhiệt độ lai, nồng độ primer và probe, nồng độ Mg2+, độ nhạy của phản ứng, độ đặc hiệu của hệ primer và probe. - Thiết lập quy trình phản ứng phát hiện đột biến rtA181V/T và rtN236T kháng ADV của HBV bằng kỹ thuật real-time PCR. - Tiến hành chạy trên một số mẫu bệnh phẩm. 2.3 Phương pháp nghiên cứu 2.3.1 Phương pháp thiết kế và kiểm tra các oligonucleotide (mồi và mẫu dò) bằng cơ sở dữ liệu trên IDT và các phần mềm sinh học chuyên dụng như ClustalX và Annhyb 2.3.1.1 Các bước tiến hành Vì đột biến kháng ADV nằm trên vùng RT của gen HBV polymerase, do vậy, chúng tôi thu thập tất cả các trình tự về vùng gen HBV Polymerase đã được xác định cho đến nay từ ngân hàng dữ liệu gen NCBI (National Center for Biology Information). Sau đó, chúng tôi tiến hành so hàng (alignment) trên tất cả các trình tự tải về bằng phần mềm ClustalX. Dựa trên sự so hàng và kết quả công bố của các bài báo trước đó, chúng tôi chọn các vùng gen để thiết kế các cặp mồi (primer) và mẫu dò (probe) tương ứng với các đột biến kháng ADV tại hai vị trí là rt181 và rt236. Đặc tính của các oligonucleotide thiết kế được kiểm tra và chỉnh sửa để phù hợp với tiêu chuẩn (%GC, Tm…) bằng phần mềm trực tuyến OligoAnalyzer (IDT) và Annhyb. Sau khi đã thiết kế được các cặp mồi và mẫu dò có các thông số phù hợp, tôi tiến hành Blast search với các trình tự DNA có trên Ngân hàng dữ liệu gen của NCBI để xác định các trình tự mồi và mẫu đã thiết kế là đặc hiệu cao với DNA đích của HBV. 2.3.1.2 Các nguyên tắc thiết kế các oligonucleotide * Nguyên tắc thiết kế mồi [10,17,21] - Chúng tôi thiết kế các mồi ngược bắt cặp đặc hiệu với các vị trí đột biến, mồi xuôi bắt cặp hoàn toàn với cả bản mẫu hoang dại và đột biến. - Mồi thường dài từ 15-30 nucleotide. Hàm lượng GC cho phép khoảng 20-80% (tốt nhất là 50- 60%). Nucleotide G và C phải được phân bố đều khắp trình tự thiết kế. Thiết kế mồi sao cho base G và C nằm ở hai đầu của mồi. Tránh trường hợp đầu 3’ của mồi có nhiều hơn 3 nucleotide G hoặc C, vì mồi không đặc hiệu có thể được tạo ra. - Nhiệt độ nóng chảy của các mồi xuôi và ngược chênh nhau không quá 50C, và kiểm soát nhiệt độ nóng chảy (Tm) của các mồi nằm trong khoảng 50-65 0C. - Mồi không được tự bắt cặp bổ sung hoặc bắt cặp bổ sung với mồi khác trong hỗn hợp phản ứng tạo thành các cấu trúc thứ cấp như:  Self-dimer: Cấu trúc được hình thành do sự bắt cặp bổ sung giữa các base của các mồi giống nhau.  Hairpin loop (Cấu trúc kẹp tóc): Cấu trúc được hình thành do sự bắt cặp bổ sung giữa các base trong cùng một mồi, đặc biệt nên tránh cấu trúc kẹp tóc chìm sâu ở đầu 3’ của mồi.  Hetero-dimer: Cấu trúc được hình thành do sự bắt cặp bổ sung giữa các base của oligonucleotide khác nhau. - Năng lượng tự do (∆G) giữa các cấu trúc thứ cấp không vượt quá -9kcal.mol-1. * Nguyên tắc thiết kế mẫu dò [17,21] Nguyên tắc thiết kế mẫu dò cũng tương tự như nguyên tắc thiết kế mồi: - Mẫu dò bắt cặp đặc hiệu với cả bản mẫu hoang dại và đột biến, nằm giữa hai mồi xuôi và ngược. - Thành phần GC trong trình tự nucleotide của mẫu dò phải nằm trong khoảng 30-80%. - Nhiệt độ nóng chảy (Tm) của mẫu dò phải lớn hơn nhiệt độ nóng chảy của các mồi từ 5-10 0C nhằm đảm bảo cho việc bắt cặp hoàn toàn với sợi DNA khuôn trong bước bắt cặp và kéo dài của chu kỳ PCR. - Không nên có G ở đầu 5’ của mẫu dò vì G có thể hấp thu ánh sáng huỳnh quang ngay cả khi mẫu DNA bị phân giải bởi Taq polymerase. 2.3.1.3 Các phần mềm máy tính sử dụng - ClustalX 1,83; - Annhyb 4,930 (Olivier Friard, Hoa Kỳ); - Phần mềm trực tuyến BLAST (NCBI, Hoa Kỳ); - Phần mềm trực tuyến Oligo Analyzer 3,0 (IDT, Hoa Kỳ); - Phần mềm trực tuyến thiết kế primer: 2.3.2 Phương pháp thu nhận và xử lý mẫu bệnh phẩm - Lấy 3ml máu từ bệnh nhân cho vào ống nghiệm thu máu chuyên dụng. - Ly tâm ống nghiệm chứa máu 3000 vòng/phút trong 15 phút. - Thu khoảng 0,5ml huyết thanh chuyển vào 1 eppendorf 1,5ml sạch. - Giữ eppendorf huyết thanh ở -200C cho đến khi tiến hành xét nghiệm. 2.3.3 Phương pháp tách chiết HBV DNA Để tách chiết HBV DNA, chúng tôi sử dụng phương pháp tủa (Chomczynski & Sacchi, 1987). 2.3.3.1 Nguyên tắc Nguyên tắc cơ bản của phương pháp này là dùng các tác nhân biến tính mạnh để phá vỡ vỏ bao của virus và loại bỏ các thành phần không mong muốn (protein…). Để thu nhận DNA tinh sạch, ta cần loại bỏ những thành phần tạp nhiễm, mà quan trọng nhất là protein. DNA sẽ được tủa bởi isopropanol ở điều kiện lạnh và thu lại qua các lần ly tâm. Sau đó, cặn DNA được huyền phù trong TE 1X và bảo quản ở -20oC. 2.3.3.2 Cách tiến hành - Đánh dấu các tube vô trùng bằng ký hiệu mẫu. - Cho 200μl mẫu (huyết thanh) vào 1 tube vô trùng có sẵn 900μl dung dịch 1, vortex 30 giây, để yên 10 phút. Thêm vào 200μl dung dịch 2, trộn đều, để yên 10 phút. Ly tâm 13000 vòng/phút trong 10 phút. - Thu 600μl dịch nổi có chứa DNA (chú ý chỉ thu dịch nổi) vào 1 tube vô trùng khác có sẵn 600μl dung dịch 3 (trộn đều trước khi sử dụng). Sau đó, trộn đều, để yên 10 phút. Ly tâm 13000 vòng/phút trong 10 phút. - Loại bỏ dịch nổi, thu cặn màu xanh (tránh loại bỏ phần cặn). Cho từ từ 900μl dung dịch 4 vào. Ly tâm 13000 vòng/phút trong 5 phút. - Loại bỏ hết dịch nổi (dùng pipet 200μl hút sạch phần dịch nổi), thu cặn (tránh loại bỏ luôn phần cặn). Để khô ở 600C trong 10-15 phút. Cho vào 50μl dung dịch 5. - Bảo quản mẫu DNA ở -200C. 2.3.4 Phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction) Phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction – Phản ứng tổng hợp dây chuyền nhờ polymerase) do Karl Mullis và cộng sự phát minh năm 1985. Thực chất đây là một phương pháp tạo dòng in vitro (không cần sự hiện diện của tế bào) tổng hợp DNA dựa trên khuôn là một trình tự đích DNA ban đầu, nhờ hoạt động của DNA polymerase và một cặp mồi đặc hiệu. Mạch khuôn thường là một trình tự DNA của gen (gọi là trình tự DNA mục tiêu) đặc trưng cho loài vi sinh vật mục tiêu. Mồi là những đoạn DNA ngắn, có khả năng bắt cặp bổ sung với một đầu của mạch khuôn. Nhờ hoạt động của DNA polymerase, đoạn mồi này được nối dài để hình thành mạch mới có trình tự bổ sung ngược chiều với mạch khuôn. Nếu có hai mồi chuyên biệt bắt cặp bổ sung ở hai đầu của một trình tự DNA, ở điều kiện đảm bảo hoạt động của DNA polymerase trong phản ứng PCR, số lượng bản sao của đoạn DNA nằm giữa hai mồi sẽ được nhân lên (khuếch đại) đến mức có thể thấy được vạch DNA sau khi nhuộm bằng ethidium bromide. Vậy để khuếch đại một trình tự DNA xác định, cần phải có những thông tin tối thiểu về trình tự của DNA, đặc biệt là trình tự base ở hai đầu đoạn DNA đủ để tạo cặp mồi chuyên biệt. Cặp mồi này gồm một mồi xuôi (sense primer) và một mồi ngược (antisense primer) so với chiều phiên mã của gen [5]. Phản ứng PCR nhân bản sao DNA là một chuỗi gồm nhiều chu kỳ nối tiếp nhau, mỗi chu kỳ gồm 3 giai đoạn: Hình 2.1: Nguyên tắc của phương pháp PCR  Giai đoạn biến tính (Denaturation): ở nhiệt độ cao 90 – 950C (cao hơn Tm của DNA khuôn) trong vòng 30 giây đến 1 phút. Mục đích: Làm đứt các liên kiết hydro của phân tử DNA. DNA tách mạch, từ mạch đôi thành mạch đơn.  Giai đoạn gắn mồi (Annealing): Nhiệt độ khoảng 45 – 700C (thấp hơn Tm của các mồi cho phép các mồi bắt cặp với mạch khuôn). Giai đoạn này khoảng 30 giây đến 1 phút.  Giai đoạn tổng hợp (Elongation): Nhiệt độ 70 – 720C thích hợp cho điều kiện hoạt động của enzyme DNA polymerase chịu nhiệt. Mạch mới được hình thành từ mồi được nối dài theo chiều 5’- 3’, thường kéo dài từ 30 giây đến nhiều phút. Chu kỳ gồm ba giai đoạn như trên sẽ được lặp đi lặp lại nhiều lần và mỗi lần lại làm tăng gấp đôi lượng mẫu của lần trước. Đây là sự khuếch đại theo cấp số nhân [5,11,12,13,15]. 2.3.5 Phương pháp real-time PCR Trong phản ứng PCR truyền thống, sản phẩm khuếch đại được phát hiện qua phân tích điểm kết thúc, bằng cách điện di trên gel agarose. Ngược lại, real-time PCR cho phép phát hiện và định lượng sự tích lũy DNA khuếch đại ngay khi phản ứng đang xảy ra, đó là ý nghĩa của cụm từ “real-time”. Real- time PCR gồm hai quá trình diễn ra đồng thời: khuếch đại DNA bằng PCR và đo độ phát quang tỷ lệ thuận với số lượng phân đoạn DNA tạo thành [17]. Khả năng này được thực hiện nhờ bổ sung vào phản ứng những phân tử phát huỳnh quang. Những hóa chất phát huỳnh quang bao gồm thuốc nhuộm liên kết DNA và những trình tự gắn huỳnh quang liên kết đặc hiệu với primer gọi là probe. Hệ thống real-time PCR bao gồm máy luân nhiệt (PCR) được nối với máy phát hiện quang phổ huỳnh quang và máy vi tính. Nguyên lý chủ yếu của real-time PCR là dựa trên cơ sở phát hiện và định lượng thể thông báo huỳnh quang [17]. Ưu điểm chính của real-time PCR so với PCR truyền thống là nó cho phép xác định số lượng bản sao khuôn mẫu ban đầu với sự chính xác và độ nhạy cao trong một phạm vi biến thiên rộng. Kết quả real-time PCR có thể là kết quả định tính (hiện diện hay vắng mặt một trình tự DNA) hay định lượng (số lượng bản sao DNA). Real-time PCR sử dụng để định lượng được gọi là PCR định lượng. Ngược lại, PCR truyền thống chỉ được xem là bán định lượng. Thêm vào đó, dữ liệu real-time PCR có thể được đánh giá mà không cần phải điện di trên gel, giúp tiết kiệm thời gian và gia tăng số lượng thí nghiệm thực hiện. Đồng thời, việc tiến hành phản ứng và đánh giá dữ liệu trong một hệ thống đóng kín giúp làm giảm nguy cơ ngoại nhiễm và loại bỏ những thao tác sau phản ứng khuếch đại. Hình 2.2: Nguyên tắc real-time PCR sử dụng TaqMan probe 2.3.6 Phương pháp tối ưu hóa phản ứng real-time PCR [17,21] Phản ứng real-time PCR thường chịu nhiều ảnh hưởng của các thành phần và điều kiện phản ứng. Trong phần thực nghiệm này, chúng tôi kiểm chứng một số điều kiện tối ưu trong phản ứng real-time PCR như: khả năng nhân bản của hệ primer-probe, nhiệt độ lai của phản ứng, nồng độ mồi, mẫu dò và nồng độ ion Mg2+, độ nhạy và độ đặc hiệu của phản ứng. Sau một số chu kỳ nhất định, các thành phần trong phản ứng bị phân hủy hay bị cạn kiệt, các sản phẩm phụ hình thành gây ức chế phản ứng và các bản sao vừa được tổng hợp không bắt cặp với mồi mà tự bắt cặp với nhau, làm cho hiệu quả khuếch đại giảm. Vì vậy, để thu được kết quả cao cần thực hiện phản ứng không quá 40 chu kỳ. Để đảm bảo tính ổn định về nhiệt độ giữa các lần khảo sát nên sử dụng cùng một loại thiết bị và dụng cụ. Đồng thời, để tránh các trường hợp ngoại nhiễm, cần sử dụng tất cả dụng cụ mới cho phản ứng. 2.3.6.1 Khảo sát khả năng nhân bản của hệ mồi, mẫu dò Trong phương pháp real-time PCR, mồi và mẫu dò và yếu tố quyết định tính đặc hiệu của phản ứng. Khả năng bắt cặp của mồi, mẫu dò với DNA bản mẫu là hết sức quan trọng. Nó quyết định sự thành công hay thất bại của toàn bộ quy trình từ khâu thiết kế cho đến các kết quả trong thực nghiệm. Nếu mồi và mẫu dò hoạt động tốt thì khi khảo sát sẽ cho kết quả dương tính với mẫu chứa amplicon 1 - Biến tính 3 - Kéo dài 2 - Bắt cặp đột biến và cho kết quả âm tính với mẫu chứa codon hoang dại. Nếu mồi và mẫu dò không hoạt động tốt hoặc không cho ra kết quả thì không đạt yêu cầu và phải thiết kế lại [17]. Tiến hành khảo sát khả năng nhân bản của hệ primer và probe trên hai chủng đối chứng với đầy đủ các thành phần của một phản ứng real-time ở thể tích 25μl. 2.3.6.2 Khảo sát nhiệt độ lai của phản ứng Nhiệt độ lai (nhiệt độ bắt cặp) của phản ứng phụ thuộc trực tiếp vào độ dài và thành phần của các oligonucleotide. Nên sử dụng nhiệt độ bắt cặp Ta (annealing temperature) thấp hơn 5 0C so với nhiệt độ nóng chảy Tm của cặp mồi sử dụng. Nếu tạo ra sản phẩm không đặc hiệu, nhiệt độ bắt cặp phải được tối ưu bằng cách tăng từng bước từ 1-20C. Khi nhiệt độ bắt cặp Ta quá thấp, các mồi có thể bắt cặp với các trình tự đích khác do những base đơn bắt cặp nhầm có thể xảy ra. Điều này rất tốt với mục đích khuếch đại các trình tự tương tự hay họ hàng. Tuy nhiên, nó có thể dẫn tới khuếch đại không đặc hiệu và giảm hiệu suất sản phẩm mong muốn nếu base đầu 3’ của mồi bắt cặp với trình tự đích. Nếu giá trị Ta quá cao, rất ít sản phẩm được tổng hợp do sự bắt cạp của mồi bị giảm. Thời gian bắt cặp không lâu, hầu hết trong 30 giây hoặc ít hơn [17]. Do vậy, nhiệt độ lai tối ưu của phản ứng sẽ khắc phục được các sai sót trên và cho hiệu quả khuếch đại tối đa. Tiến hành khảo sát nhiệt độ lai theo dãy Gradient nồng độ sau: 70,0; 69,5; 68,3; 66,4; 63,9; 62,1; 60,8; 60,00C trên máy BIORAD. 2.3.6.3 Khảo sát nồng độ mồi của phản ứng Mồi là yếu tố quan trọng quyết định độ đặc hiệu và ảnh hưởng đến kết quả của phản ứng. Việc thiết kế mồi đặc hiệu và sử dụng nồng độ mồi thích hợp sẽ dẫn đến phản ứng có sản phẩm hay không. Nồng độ mồi quá cao có thể cho kết quả không đặc hiệu và tạo ra cấu trúc nhị phân mồi. Nồng độ mồi quá thấp sẽ ảnh hưởng đến kết quả phản ứng, trừ khi mồi có độ suy biến cao [17]. Khi tiến hành khảo sát nồng độ mồi, chúng tôi thực hiện các phản ứng real-time PCR ở cùng một điều kiện với nhiệt độ lai là nhiệt độ lai tối ưu đã khảo sát ở trên. Thành phần các chất trong phản ứng cũng giống nhau, chỉ có một sự khác biệt giữa các phản ứng là nồng độ mồi có trong phản ứng. Trong nội dung đề tài này, để tìm nồng độ mồi tối ưu, chúng tôi khảo sát nồng độ mồi theo dãy nồng độ sau: 100, 200, 300, 400, 500nM trong một thể tích phản ứng. 2.3.6.4 Khảo sát nồng độ probe của phản ứng Mẫu dò (probe) phải đặc hiệu với trình tự đích và để tạo ra tín hiệu huỳnh quang thì mẫu dò phải nằm giữa hai mồi xuôi và ngược. Trong phản ứng real-time PCR với mẫu dò TaqMan, khuếch đại không đặc hiệu do mồi sai vị trí hoặc do hiện tượng nhị phân mồi cũng không tạo ra tín hiệu [17]. Do vậy, nồng độ probe cũng ảnh hưởng đến sự phát huỳnh quang và đọc tín hiệu sau mỗi chu kỳ của phản ứng. Nồng độ probe quá cao hay quá thấp đều ảnh hưởng xấu đến kết quả phản ứng. Để lựa chọn nồng độ probe tối ưu, chúng tôi tiến hành khảo sát nồng độ probe theo dãy nồng độ sau: 100, 200, 300, 400, 500nM. Thành phần phản ứng đều như nhau, nhiệt độ lai và nồng độ mồi tối ưu đã khảo sát ở trên, chỉ có nồng độ probe là thay đổi. 2.3.6.4 Khảo sát nồng độ Mg2+ của phản ứng Ion Mg2+ cũng là một trong những thành phần ảnh hưởng tới kết quả phản ứng. Ở một nồng độ tối ưu, ion này làm tăng khả năng bắt cặp của mồi vào bản mẫu và hoạt động kéo dài của Taq DNA polymerase, tạo sự kết hợp chặt chẽ giữa các dNTP. Nếu nồng độ Mg2+ quá thấp (< 0,5mM) sẽ làm giảm phản ứng kéo dài mạch DNA do hoạt động của Taq DNA polymerase bị ức chế. Ngược lại, nếu nồng độ Mg2+ quá cao sẽ không cho sản phẩm khuếch đại hoặc cho sản phẩm khuếch đại không đặc hiệu. Vì vậy để xác định nồng độ Mg2+ tối ưu cho phản ứng, chúng tôi tiến hành khảo sát nồng độ Mg2+ theo dãy nồng độ sau: 1,5; 2,0; 2,5; 3,0; 3,5; 4,0; 4,5; 5,0mM. Trong phản ứng khảo sát nồng độ Mg2+, các chỉ tiêu về nhiệt độ lai tối ưu, nồng độ mồi, probe tối ưu được giữ nguyên, chỉ có nồng độ Mg2+ là thay đổi. 2.3.6.5 Khảo sát độ lặp lại của phản ứng real-time PCR Tính biến động của phản ứng real-time PCR là một yếu tố rất quan trọng, chính điều này có thể làm sai lệch kết quả. Trên cùng một mẫu bệnh phẩm, kết quả thu được có thể khác nhau giữa các lần thí nghiệm, cũng như giữa các phòng thí nghiệm khác nhau. Khả năng gây ra sự khác biệt này có thể là do thao tác của người tiến hành, sự biến động của các thành phần hóa chất trong phản ứng hoặc do sự khác biệt giữa các phương pháp chuẩn bị mẫu, cũng như phương pháp tách chiết HBV DNA… Để đánh giá độ lặp lại của phản ứng real-time PCR, chúng tôi tiến hành khảo sát độ lặp lại trong cùng một lần thí nghiệm (intra-assay) và độ lặp lại giữa các lần thí nghiệm khác nhau (inter-assay). 2.3.6.6 Khảo sát độ nhạy của phản ứng Dung dịch HBV DNA gốc có nồng độ 2.105 copies/ml được pha loãng bậc 10 liên tiếp trước khi tiến hành khảo sát độ nhạy của phản ứng. Chuẩn bị các eppendorf vô trùng chứa 90μl dung dịch TE 1X đã vô trùng. Sử dụng pipetman và đầu tip vô trùng, hút 10μl dung dịch HBV DNA gốc cho vào eppendorf có chứa sẵn 90μl dung dịch TE 1X, đồng nhất mẫu bằng máy vortex và ly tâm ở tốc độ dưới 2000 vòng/phút để được dung dịch có độ pha loãng ở nồng độ 10-1. Tiếp tục thực hiện các thao tác tương tự để được dung dịch HBV DNA có độ pha loãng 10-2, 10-3… Dung dịch HBV DNA sau khi được pha loãng thành nhiều nồng độ bậc 10 liên tiếp được sử dụng để khảo sát độ nhạy. Độ nhạy của phản ứng tương ứng với nồng độ amplicon đột biến thấp nhất cho kết quả dương tính. Hình 2.3: Pha loãng nồng độ HBV DNA theo nhiều nồng độ bậc 10 liên tiếp 2.3.7 Phương pháp khảo sát độ đặc hiệu của hệ mồi, mẫu dò Nhằm xác định khả năng nhân bản chọn lọc của mồi và probe đã thiết kế, đầu tiên chúng tôi tiến hành kiểm tra trên lý thuyết bằng cách sử dụng phần mềm Annhyb để kiểm tra sự bắt cặp của mồi trên genome của một số loài vi sinh vật thường gặp trong huyết thanh như MTB, EBV, HCV,HPV, CMV. Về mặt thực nghiệm, để đảm bảo các cặp mồi và probe được sử dụng trong phản ứng real-time PCR là đặc hiệu cho HBV, các phản ứng real-time PCR giữa các cặp mồi và probe cùng với DNA tách chiết của một số đối tượng vi sinh vật khác sẽ được thiết lập. Hệ primer, probe được xem là đặc hiệu đối với đột biến kháng ADV của HBV sẽ cho kết quả dương tính với mẫu chứng dương và cho kết quả âm tính với mẫu chứng âm và các chủng vi sinh vật khác. CHƯƠNG 3 – KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Đánh giá các thông số của các oligonucleotide thiết kế 3.1.1 Trình tự và vị trí của các oligonucleotide Trình tự của các primer và probe phát hiện đột biến rtA181V/T và rtN236T kháng ADV của HBV đã được trình bày trong bảng 3.1 ở chương 3. Vì các đột biến kháng thuốc trong đề tài nghiên cứu thuộc dạng đột biến điểm, do vậy trình tự hoang dại và trình tự đột biến chỉ khác nhau bởi một nucleotide. Để phân biệt sự khác nhau này chúng tôi thiết kế các đoạn mồi ngược bắt cặp hoàn toàn với trình tự đột biến và có một mismatch ở nucleotide thứ nhất tính từ đầu 3’-OH khi bắt cặp với trình tự hoang dại. Các mồi này đi kèm với các mồi xuôi bắt cặp hoàn toàn với cả trình tự hoang dại lẫn trình tự đột biến. Trình tự của mồi F181 và R236 có một số nucleotide thay thế vì tại các vị trí này có thể có hai hay nhiều loại nucleotide chiếm tỷ lệ tương đương nhau. Các mồi này còn gọi là các mồi suy biến, vì có nhiều lựa chọn khác nhau ở một số vị trí base trên trình tự. Mồi F181 chỉ có một vị trí sử dụng nucleotide thay thế và nó không nằm trong số 5 nucleotide ở mỗi đầu của mồi nên không ảnh hưởng đến sự nhân bản và độ đặc hiệu của mồi. Mồi R236 có 5 vị trí sử dụng base thay thế. Nó cho một hỗn hợp 256 oligonucleotide khác nhau. Nếu làm như thế thì rất tốn kém vì giá mồi rất đắt. Mồi suy biến được chứng minh là một công cụ rất hữu hiệu dùng để nhân bản hầu hết các gen của cùng một họ tương đồng về cấu trúc [17]. Căn cứ vào sơ đồ vị trí các oligonucleotide thiết kế, chúng tôi thiết lập 3 phản ứng real-time PCR riêng biệt: phản ứng 1, 2, 3 lần lượt phát hiện đột biến rtA181V, rtA181T và rtN236T kháng ADV của HBV. Phản ứng 1 và 2 chỉ khác nhau ở mồi ngược do khác nhau ở các nucleotide đột biến. Hình 3.1: Sơ đồ vị trí các primer và probe thiết kế (1): Hệ mồi, probe phát hiện đột biến tại rt181 trong phản ứng 1 và 2; (2): Hệ mồi, probe phát hiện đột biến tại rt236 trong phản ứng 3. Sau đó, chúng tôi sử dụng phần mềm Annhyb để kiểm tra lại trình tự và vị trí của các oligonucleotide thiết kế có đúng với mục đích của đề tài hay không. Dựa vào hình 3.2, cặp mồi và probe trong phản ứng 1 hoàn toàn đặc hiệu với HBV và cho phép khuếch đại đoạn trình tự có độ dài 99bp, sử dụng chất phát huỳnh quang FAM. Hình 3.2: Kết quả kiểm tra hệ primer và probe của phản ứng 1 bằng phần mềm Annhyb Hình 3.3: Kết quả kiểm tra hệ primer và probe của phản ứng 2 bằng phần mềm Annhyb Hình 3.3 cho thấy cặp mồi F181, R181-2 và probe P181 hoàn toàn đặc hiệu với HBV và cho phép khuếch đại đoạn trình tự có độ dài 99bp. Hình 3.4: Kết quả kiểm tra hệ mồi, probe của phản ứng 3 bằng phần mềm Annhyb Căn cứ vào kết quả Annhyb ở hình 3.4, cặp mồi F236, R236 và probe P236 khuếch đại đoạn trình tự có độ dài 136 bp. 3.1.2 Đặc tính của các oligonucleotide Tính chất vật lý của các oligonucleotide được thiết kế và kiểm tra bằng phần mềm OligoAnalysis trên IDT (Hoa Kỳ) về các thông số như chiều dài, thành phần %GC, nhiệt độ nóng chảy (Tm), cấu trúc kẹp tóc, cấu trúc tự thân giữa các oligonucleotide giống nhau được tổng hợp ở bảng 2.1.  Qua bảng 2.1, chúng tôi nhận thấy:  Kích thước và tỷ lệ các base trong các primer và probe đều phù hợp với tiêu chuẩn thiết kế.  Nhiệt độ nóng chảy (Tm) của các mồi chênh lệch nhau không quá 2 0C; nhiệt độ nóng chảy (Tm) của các mồi và probe chênh lệch nhau từ 5-80C hoàn toàn phù hợp với tiêu chuẩn.  Về thành phần GC: nằm trong khoảng tỷ lệ tốt nhất 40-60%.  Năng lượng tự do (∆G) của các cấu trúc thứ cấp như cấu trúc kẹp tóc (Hairpin), cấu trúc self- dimer và cấu trúc hetero-dimer càng lớn hơn -9 kcal.mol-1 thì các cấu trúc đó càng kém bền vững và không ảnh hưởng đến phản ứng. Trong bảng trên, ta thấy ∆G trong cấu trúc self-dimer của probe có một dạng có ∆G = -9,20kcal.mol-1. Vì nó không quá nhỏ so với -9kcal.mol-1 nên có thể chấp nhận được và chúng ta có thể tăng nhiệt độ bắt cặp của phản ứng để khắc phục. Bảng 3.1: Một số đặc tính của các oligonucleotide Tên Số base % GC Tm ( 0C) Năng lượng tự do (∆G, kcal.mol-1) Hairpin Self-dimer F181 25 50,0 60,7 > - 2,77 > - 8,09 R181-1 26 39,7 58,3 - 0,07 > - 8,16 R181-2 27 41,7 59,6 - 0,07 > - 8,16 P181 25 60,0 65,6 - 1,23 > - 9,20 F236 28 39,3 58,1 > 0,71 > - 3,91 R236 25 48,0 58,5 - 1,61 > - 9,36 P236 30 50,0 64,2 > - 1,93 > - 9,28 Ghi chú: - Tm : Nhiệt độ nóng chảy (nhiệt độ biến tính); - ∆G: Chỉ số xác định độ bền của một cấu trúc bậc hai.  Kết quả kiểm tra cấu trúc thứ cấp của các oligonucleotide khác nhau trong một phản ứng được thể hiện trong bảng 3.2 và 3.3. Trong bảng 3.2, chỉ có một cấu trúc hetero-dimer của mồi xuôi F181 và probe Pro181 có ∆G = - 11,23 kcal.mol-1; và chúng ta có thể khắc phục được bằng cách tăng nhiệt độ bắt cặp của phản ứng. Vì sẽ thiết lập hai phản ứng real-time PCR riêng biệt để phát hiện 2 đột biến tại rt181 nên chúng tôi không kiểm tra cấu trúc hetero-dimer của 2 mồi ngược là R181-1 và R181-2. Bảng 3.2: Năng lượng tự do (∆G, kcal.mol-1) của các cấu trúc Hetero-dimer trong phản ứng 1 và 2 F181 R181-1 R181-2 P181 F181 --- > - 6,5 > - 6,5 > - 11,23 R181-1 > - 6,5 --- --- > - 6,21 R181-2 > - 6,5 --- --- > - 6,21 P181 > - 11,23 > - 6,21 > - 6,21 --- Bảng 3.3: Năng lượng tự do (∆G, kcal.mol-1) của cấu trúc Hetero-dimer ở phản ứng 3 F236 R236 P236 F236 --- > - 6,5 > - 8,16 R236 > - 6,5 --- > - 11,16 P236 > - 8,16 > - 11,16 --- Qua kết quả trong bảng 3.3, cấu trúc Hetero-dimer của mồi ngược R236 với P236 có ∆G = -11,16 kcal.mol-1, là thấp so với tiêu chuẩn, nhưng cũng không cách biệt quá xa. Để khắc phục, chúng ta sẽ tăng nhiệt độ bắt cặp của phản ứng (Ta) lên cao so với Tm của chúng để tăng năng lượng phá vỡ liên kết. 3.1.3 Khả năng bắt cặp đặc hiệu của primer, probe theo lý thuyết Để xác định khả năng bắt cặp đặc hiệu của các primer, probe thiết kế ở trên, chúng tôi thực hiện ClustalX với 123 trình tự gen của HBV từ NCBI. Đồng thời, chúng tôi kiểm tra độ đặc hiệu của các oligonucleotide bằng công cụ Blast trên NCBI. 3.1.3.1 Khả năng bắt cặp đặc hiệu của mồi xuôi F181 Vì mồi xuôi F181 bắt cặp với sợi (-) nên không cần reverse mồi trước khi so hàng và blast trên NCBI. Hình 3.5: Mức độ bắt cặp của mồi xuôi F181 đối với vùng RT của gen HBV polymerase của HBV (sử dụng phần mềm CluxtalX 1.83) Hình 3.6: Khả năng đặc hiệu của primer F181 đối với vùng RT của gen HBV polymerase của HBV bằng công cụ Blast (NCBI) Dựa vào kết quả ClustalX ở hình 3.5, chúng tôi thấy có 1 vị trí không bảo tồn, vì có 2 loại nucleotide nên chúng tôi sử dụng nucleotide Y để thay thế như đã trình bày ở trên và điều này không ảnh hưởng đến kết quả của phản ứng. Căn cứ vào hình 3.6, khả năng đặc hiệu của F181 đối với HBV rất cao vì các chỉ số Query coverage và Max ident lần lượt là 100% và 95%. 3.1.3.2 Khả năng bắt cặp đặc hiệu của mồi ngược R181-1 Mồi ngược R181-1 bắt cặp với sợi (+) nên chúng tôi tiến hành reverse trước khi tiến hành so hàng và blast trên NCBI. Hình 3.7: Mức độ bắt cặp của mồi ngược R181-1 đối với vùng RT của gen HBV polymerase của HBV