Nghiên cứu thu nhận Coenzyme Q10 từ chủng Agrobacterium tumefaciens tái tổ hợp

m PCR trên phổ diện di với kích thước phù hợp với kích thước của gen dps (hình 3.2A) và dxs (hình 3.2B). Kích thước sản phẩm PCR từ khuôn DNA plasmid tương đương với kích thước sản phẩm PCR từ khuôn DNA tổng số của chủng A. tumefaciens TT4 ban đầu (hình 3.2). Kết quả nhận được chứng tỏ hai dòng được lựa chọn mang gen đích tương ứng là dps và dxs. Tuy nhiên, để chắc chắn hơn DNA plasmid của hai dòng này tiếp tục được xử lý bẳng các enzyme hạn chế thích hợp. Hình 3.2. Phổ điện di sản phẩm PCR khuếch đại gen dps (A) và dxs (B) từ DNA plasmid của các dòng tái tổ hợp. C3, C6 là khuôn DNA plasmid tách chiết từ clone số 3 và số 6. TT4 là khuôn DNA tổng số tách chiết từ chủng A. tumefaciens TT4. Đường chạy M là thang DNA chuẩn 100bp (Thermo Scienctific, Mỹ) C3 TT4 M Kb - 3,0 - 2,0 - 1,2 - 0,5 - 0,2 A C6 TT4 M Kb - 3,0 - 2,0 - 1,2 - 0,5 - 0,2 B 1077 bp  2100 bp  6 Theo thiết kế hai trình tự cắt của enzyme hạn chế SacI và BamHI được đưa vào đầu 5’ của cặp mồi DpsF/R và tương tự trình tự cắt của BamHI và SalI được đưa vào cặp mồi DxsF/R. Kết quả xử lý bằng enzyme cắt hạn chế cho thấy đối với cả hai clone 3 và 6 đều văng ra băng DNA có kích thước tương ứng với kích thước gen dps khoảng 1077 bp (hình 3.3A) và gen dxs khoảng 2100 bp (hình 3.3B). Từ các kết quả thu được có thể khẳng định rằng hai dòng số 3 và 6 là các dòng tái tổ hợp mang hai gen đích tương ứng là dps và dxs. Hình 3.3. Phổ điện di sản phẩm cắt DNA plasmid bằng các enzyme hạn chế đối với dòng số 3 mang gen dps (A) và dòng 6 mang gen dxs (B). Đường chạy 1, 3 là DNA plasmid chưa cắt; đường chạy 2, 4 là DNA plamid được cắt bằng cặp enzyme SacI/BamHI và BamHI/SalI tương ứng với clone 3 và 6. Đường chạy M là thang DNA chuẩn 100bp (Thermo Scienctific, Mỹ) Để kiểm tra trình tự và khung đọc của hai gen đích dps và dxs đã được tách dòng hai plasmid tái tổ hợp được sử dụng làm khuôn cho phản ứng xác định trình tự. Trình tự nuclecotide và axit amin suy diễn của gen dps và dxs đã được xác định. Kết quả cho thấy gen được tách dòng chứa một khung đọc mở cho phép dịch mã tổng hợp một protein nguyên vẹn. 3.2.2. Tạo cấu trúc biểu hiện mang gen dps và dxs Trong nghiên cứu này vector pCAMBIA1301 với kích thước 11837 bp được sử dụng làm vector biểu hiện phù hợp chủng chủ A. tumefaciens. Hai gen dps và dxs sẽ được đưa độc lập và đồng thời vào vector pCAMBIA1301 để tạo ra các cấu trúc biểu hiện pCAM-dps, pCAM-dxs và pCAM-dps-dxs. 3.2.2.1. Tạo cấu trúc biểu hiện mang gen dps và dxs độc lập Hai gen dps và dxs được cắt ra khỏi vector tách dòng bằng hai cặp enzyme cắt hạn chế tương ứng là SacI/BamHI và BamHI/SalI. Hai gen dps và dxs thu được đã được gắn vào vector biểu hiện pCAMBIA1301 đã được mở vòng bằng cặp enzyme 1 2 M Kb - 3,0 - 2,0 - 1,2 - 0,5 - 0,2 A 3 4 M Kb - 3,0 - 2,0 - 1,2 - 0,5 - 0,2 B  2100 bp   1077 bp  7 cắt hạn chế tương ứng. Sản phẩm nối ghép được biến nạp vào E. coli DH10b để chọn dòng. Kết quả biến nạp cho thấy xuất hiện 11 và 2 khuẩn lạc tương ứng với gen dps và dxs trên môi trường LB thạch chứa kanamycin (100 µg/ml). DNA plasmid từ các dòng đã được sử dụng để sàng lọc sơ bộ cho các nghiên cứu tiếp theo. Đối với gen dps, 8 dòng đã được lựa chọn để kiểm tra sự có mặt của gen đích bằng phản ứng PCR sử dụng mồi đặc hiệu (hình 3.4A) và xử lý bằng cặp enzyme cắt hạn chế SacI/BamHI (hình 3.4B). Kết quả cho thấy cả 8 dòng đều xuất hiện băng DNA khoảng 1,1 kb tương ứng với kích thước gen dps (1077bp) (hình 3.4B). Hình 3.4. Phổ điện di sản phẩm PCR (A) và cắt enzyme hạn chế (B) của các dòng được lựa chọn đối với gen dps. Đường chạy 1-8 tương ứng với 8 dòng được lựa chọn. ĐC là sản phâm PCR từ khuôn plasmid pCAMBIA1301 đối chứng không mang gen. Đường chạy (+) là sản phẩm PCR từ khuôn gốc. Đường chay (-) là sản phẩm cắt plasmid đối chứng. M là thang DNA chuẩn 100bp (Thermo Scienctific, Mỹ). Hình 3.5. Phổ điện di sản phẩm PCR (A) và cắt enzyme hạn chế (B) của các dòng được lựa chọn đối với gen dxs. Đường chạy 1-2 tương ứng với 2 dòng được lựa chọn. ĐC là sản phâm PCR từ khuôn plasmid pCAMBIA1301 đối chứng không mang gen. M là thang DNA chuẩn 100bp (Thermo Scienctific, Mỹ). 1 2 3 4 5 6 7 8 ĐC M Kb - 3,0 - 2,0 - 1,2 - 0,5 - 0,2 1 2 3 4 5 6 7 8 + - M Kb - 3,0 - 2,0 - 1,2 - 0,5 - 0,2 A B 1 2 ĐC M Kb - 3,0 - 2,0 - 1,2 - 0,5 1 2 M Kb - 3,0 - 2,0 - 1,2 - 0,5 A B 2100 bp  2100 bp  1077 bp  8 Tương tự đối với gen dxs, 2 dòng đã được lựa chọn để kiểm tra sự có mặt của gen đích bằng phản ứng PCR sử dụng mồi đặc hiệu (hình 3.5A) và xử lý bằng cặp enzyme BamHI/SalI (hình 3.5B). Kết quả cho thấy cả 2 dòng đều xuất hiện băng DNA khoảng 2,1 kb tương ứng với kích thước đọan gen đích dxs (2103 bp) (hình 3.5B). Các kết quả thu được cho thấy rằng gen dps và dxs đã được tách dòng thành công trong vector biểu hiện pCAMBIA1301. Các cấu trúc tái tổ hợp được ký hiệu pCAM-dps và pCAM-dxs tương ứng. 3.2.2.2. Tạo cấu trúc biểu hiện mang đồng thời hai gen dps và dxs Để tạo cấu trúc biểu hiện tái tổ hợp chứa đồng thời hai gen dps và dxs, gen dps thu được từ vector tách dòng sau khi xử lý bởi cặp enzyme cắt hạn chế SacI và BamHI được nối vào vector pCAM-dxs đã được mở vòng bởi SacI/BamHI. Sản phẩm nối ghép được biến nạp vào E. coli DH10b và kết quả thu được 10 khuẩn lạc. Kết quả PCR từ khuôn plasmid sử dụng cặp mồi DpsF/R cho thấy cả 10 khuẩn lạc đều cho sản phẩm có kích thước tương đương với kích thước đoạn gen dps (1077 bp) (hình 3.6A). Đối chứng sử dụng khuôn pCAM-dxs không thấy xuất hiện sản phẩm, điều đó chứng tỏ plasmid từ 10 dòng thu được mang gen dps. Dòng số 9 được lựa chọn để kiểm tra plasmid bằng việc cắt với SacI/BamHI, kết quả cho thấy xuất hiện 1 băng DNA xấp xỉ 1,2 kb (hình 3.6B). Từ kết quả này có thể khẳng định rằng đã gắn được gen dps vào vector tái tổ hợp pCAM-dxs để tạo cấu trúc tái tổ hợp mới chứa đồng thời hai gen dps và dxs, được ký hiệu pCAM-dps-dxs. Hình 3.6. Phổ điện di sản phẩm PCR từ khuôn plasmid của 10 dòng sử dụng cặp mồi DpsF/R (A) và sản phẩm cắt enzyme hạn chế (B). Đường chạy 1-10, sản phẩm PCR từ khuôn plasmid của 10 dòng tương ứng; mẫu đối chứng sử dụng khuôn pCAM-dxs (ĐC); RE/9, dòng số 9 được xử lý bởi SacI/BamHI thang DNA chuẩn 100 bp (M1) và 1kb (M2). 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 ĐC M1 Kb - 3,0 - 2,0 - 1,2 - 0,5 RE/9 M2 Kb - 3,0 - 2,0 - 1,0 - 0,5 1077 bp  1077 bp  A B 9 3.2.2.3. Tạo chủng A. tumefaciens tái tổ hợp mang cấu trúc pCAM-dps-dxs Các cấu trúc tái tổ hợp pCAM-dps, pCAM-dxs, pCAM-dps-dxs được biến nạp vào tế bào A. tumefaciens EHA 105 khả biến bằng phương pháp xung điện. Các dòng tái tổ hợp được chọn lọc trên môi trường chứa kanamycin (100µg/ml). Tiến hành xác định khả năng sinh tổng hợp CoQ10 của các chủng tái tổ hợp pCAM-dps, pCAM- dxs, pCAM-dps-dxs, và chủng đối chứng pCAM (hình 3.7). Kết quả cho thấy chủng tái tổ hợp chứa đơn gen pCAM-dps và pCAM-dxs có khả năng sinh tổng hợp CoQ10 tăng lên 1,34 và 1,38 lần so với đối chứng. Khi kết hợp cả hai gen dps và dxs tạo chủng pCAM-dps-dxs đã làm tăng khả năng tổng hợp CoQ10 của A. tumefaciens lên 1,80 lần so với đối chứng. Do đó các dòng A. tumefaciens mang cấu trúc pCAM-dps- dxs được lựa chọn cho nghiên cứu tiếp theo. Hình 3.7. Khả năng sinh tổng hợp CoQ10 của các chủng A. tumefaciens tái tổ hợp. Chủng tái tổ hợp chứa vector tái tổ hợp mang đơn gen pCAM-pds và pCAM-dxs và đồng thời hai gen pCAM- dps-dxs. Chủng đối chứng mang vector pCAMBIA1301. Kết quả khảo sát khả năng sinh tổng hợp CoQ10 của 28 dòng A. tumefaciens pCAM-dps-dxs tái tổ hợp cho thấy khả năng sinh tổng hợp CoQ10 là khác nhau (hình 3.8). Trong số 28 dòng có dòng số 12 có khả năng tổng hợp CoQ10 cao nhất so với dòng khác (19 mg/l) gấp 2,16 lần so với chủng gốc mang vector pCAM, vì vậy dòng số 12 được lựa chọn cho các nghiên cứu tiếp theo. Hình 3.8. Khả năng sinh tổng hợp CoQ10 của các dòng A. tumefaciens tái tổ hợp mang cấu trúc pCAM-dps-dxs 0 5 10 15 20 pCAM pCAM-dps pCAM-dxs pCAM-dps-dxs C o Q 1 0 ( m g/ l) 0.0 2.0 4.0 6.0 8.0 10.0 12.0 14.0 16.0 18.0 20.0 1 2 3 8 10 11 12 14 15 20 pCAM C oQ 10 (m g/ L ) Các dòng tái tổ hợp 10 Dòng số 12 được kiểm tra cấu trúc pCAM-dps-dxs bằng cách tiến hành tách plasmid, thực hiện phản ứng PCR và xử lý bởi enzyme hạn chế. Kết quả PCR từ khuôn plasmid sử dụng cặp mồi DpsF/R và DxsF/R cho thấy đều cho sản phẩm có kích thước tương đương với kích thước đoạn gen dps (1077 bp) và dxs (2103bp) (hình 3.9B, 3.9A). Để kiểm tra plasmid bằng việc cắt với SacI/BamHI, kết quả cho thấy xuất hiện 1 băng DNA xấp xỉ 1,2 kb (hình 3.9C). Từ kết quả này có thể khẳng định rằng vector tái tổ hợp pCAM-dps-dxs đã được đưa vào thành công trong A. tumefaciens. Dòng số 12 được ký hiệu là A. tumefaciens DPXS12. A B C Hình 3.9. Phổ điện di sản phẩm PCR khuếch đại gen dps (A, giếng 1) và dxs (B, giếng 2), sản phẩm cắt enzyme hạn chế SacI/BamHI (C, giếng 3) từ DNA plasmid của A. tumefaciens DPSX12. M, thang DNA chuẩn 100 bp (Thermo Scientific) 3.3. KHẢO SÁT CÁC YẾU TỐ ẢNH HƢỞNG ĐẾN SINH TỔNG HỢP COQ10 TỪ A. TUMEFACIENS TÁI TỔ HỢP 3.3.1. Ảnh hƣởng của các điều kiện môi trƣờng đến khả năng sinh tổng hợp CoQ10 Khi tiến hành thí nghiệm nghiên cứu ảnh hưởng của nguồn cacbon tới khả năng sinh tổng hợp CoQ10 từ A. tumefaciens trên môi trường với các loại đường khác nhau. Kết quả thể hiện trên hình 3.10A và 3.10B cho thấy, trong môi trường có chứa nguồn cacbon là sucrose cho sinh tổng hợp CoQ10 cao nhất (16 mg/l) và nồng độ đường sucrose 5% cho sinh tổng hợp CoQ10 cao nhất. Cũng tương tự như thế khi tiến hành thí nghiệm nghiên cứu ảnh hưởng của nguồn nitơ tới khả năng sinh tổng hợp CoQ10 từ A. tumefaciens. Kết quả thể hiện trên hình 3.10C và 3.10D cho thấy, trong môi trường có chứa nguồn nitơ là cao ngô (CSL) cho sinh tổng hợp CoQ10 cao nhất (26,68 mg/L) và nồng độ cao ngô 1% cho sinh tổng hợp CoQ10 cao nhất. Kb 3,0 - 2,0 - 1,0 - Kb - 3,0 - 2,0 - 1,0 - 0,5 3,0 - 2,0 - - 0,5 - 1077 bp  1077 bp 2100bp M 1 M 2 3 M 11 3.3.2. Ảnh hƣởng của pH đầu môi trƣờng Kết quả hình 3.11A cho thấy, với pH đầu là 8,0 hàm lượng CoQ10 thu được là cao nhất đạt 68,8 mg/L, vì vậy pH đầu là 8,0 được lựa chọn cho các nghiên cứu tiếp theo. 3.3.3. Ảnh hƣởng của tỷ lệ giống Kết quả hình 3.11B cho thấy, hàm lượng CoQ10 thu được cao nhất đạt khi OD = 0,8 đạt 108 mg/l cao gấp 1,6 lần so với OD = 0,05. Vì vậy tỷ lệ cấp giống với OD = 0,8 được lựa chọn cho các nghiên cứu tiếp theo. 3.3.4. Ảnh hƣởng của nhiệt độ nuôi cấy Kết quả hình 3.11C cho thấy, nhiệt độ tối ưu cho sinh tổng hợp CoQ10 của A. tumefaciens DPXS12 là 28 o C. Vì vậy cứu nhiệt độ 28oC được lựa chọn cho các nghiên cứu tiếp theo. 3.3.5. Ảnh hƣởng của thời gian Từ kết quả hình 3.11D cho thấy, thời gian lên men càng tăng thì hàm lượng CoQ10 được sinh tổng hợp cũng tăng. Tuy nhiên hàm lượng CoQ10 thu được từ 96 giờ đến 144 giờ tăng không đáng kể, sau 144 giờ hàm lượng CoQ10 chỉ tăng 1,03% 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 C o Q 1 0 ( m g /L ) Nguồn cacbon (đƣờng) 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 0.0% 2.5% 5.0% 7.5% 10% C o Q 1 0 ( m g /L ) Nồng độ sucrose (w/v) 0 5 10 15 20 25 30 C o Q 1 0 ( m g/ L) Nguồn nitơ 0 10 20 30 40 50 60 0.5% 1% 2% 3% 4% 5% C o Q 1 0 ( m g /L ) Nồng độ CSL (w/v) A B Hình 3.10. Ảnh hưởng của nguồn cacbon (A), nồng độ sucrose (B), nguồn nitơ (C), nồng độ CSL(D) đến lên men sinh tổng hợp CoQ10 từ A. tumefaciens tái tổ hợp. C D 12 (tăng 2,57 mg/L) so với 96 giờ lên men. Từ kết quả thu được thời gian 96 giờ được lựa chọn để thu nhận CoQ10 trong quá trình lên men. Hình 3.11. Ảnh hưởng của pH đầu môi trường (A), OD giống (B), nhiệt độ nuôi cấy (C), thời gian (D) đến lên men sinh tổng hợp CoQ10 từ A. tumefaciens tái tổ hợp. 3.4. TỐI ƢU HÓA ĐIỀU KIỆN LÊN MEN SINH TỔNG HỢP COQ10 TỪ A. TUMEFACIENS 3.4.3. Tối ƣu hóa quá trình sinh tổng hợp CoQ10 từ A. tumefaciens tái tổ hợp Dựa trên cơ sở đã khảo sát ảnh hưởng của các yếu tố đến quá trình lên men sinh tổng hợp CoQ10 từ A. tumefaciens tái tổ hợp, tiến hành xác định ảnh hưởng đồng thời của nồng độ đường sucrose (X1), nồng độ cao ngô (X2), nhiệt độ (X3) . Kết quả được thể hiện trên bảng 3.3. Phương trình hồi quy biểu diễn hàm lượng CoQ10 mô tả ảnh hưởng của các yếu tố độc lập và các mối tương tác giữa chúng được biểu diễn như sau: Hàm lượng CoQ10= - 634,73 + 36,11.X1 + 32,92.X2 + 344,62.X3 + 4,2.X1X2 - 0,32.X1X3 + 3,66.X2X3 – 2,78.X1 2 – 75,27.X2 2 – 81,98.X3 2 0 10 20 30 40 50 60 70 80 6.0 6.5 7.0 7.5 8.0 C o Q 1 0 ( m g /L ) pH 0 20 40 60 80 100 120 0.05 0.1 0.2 0.4 0.8 1.2 1.6 2.0 C o Q 1 0 ( m g /L ) OD giống 0 20 40 60 80 100 120 140 20 25 28 30 37 C o Q 1 0 ( m g /L ) Nhiệt độ (độ C) 0 20 40 60 80 100 120 140 0 24 48 72 96 120 144 C o Q 1 0 ( m g/ l) Thời gian (giờ) B D A C 13 Bảng 3.1. Ma trận thực nghiệm Box-Behnken ba yếu tố và hàm lượng CoQ10 thu được TN Nồng độ sucrose (%) Nồng độ cao ngô (%) Nhiệt độ ( o C) Hàm lượng CoQ10 (mg/l) 1 2,5 0,5 28 82,885 2 2,5 1,5 28 78,048 3 7,5 0,5 28 90,872 4 7,5 1,5 28 107,285 5 5,0 0,5 24 93,571 6 5,0 1,5 24 85,433 7 5,0 0,5 32 93,571 8 5,0 1,5 32 109,518 9 2,5 1,0 24 78,912 10 7,5 1,0 24 101,791 11 2,5 1,0 32 95,831 12 7,5 1,0 32 105,901 13 5,0 1,0 28 127,177 14 5,0 1,0 28 124,478 15 5,0 1,0 28 126,506 16 5.0 1.0 28 126,58 17 5.0 1.0 28 125,35 Từ kết quả trên dựa vào phương pháp tối ưu hóa tìm được điều kiện lên men tối ưu nhất: nồng độ sucrose 5 %, nồng độ bột cao ngô 1 % và nhiệt độ 28oC. Khi đó, hàm lượng CoQ10 đạt được 127,18 mg/l. 3.5. NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH TÁCH CHIẾT COENZYME Q10 TỪ CHỦNG A. TUMEFACIENS TÁI TỔ HỢP 3.5.1. Đánh giá các phƣơng pháp phá vỡ tế bào Hiệu quả phá vỡ tế bào sẽ ảnh hưởng rất lớn đến hiệu suất tách chiết CoQ10. Trong nghiên cứu này màng tế bào A. tumefaciens được phá vỡ bằng bốn phương pháp khác nhau bao gồm siêu âm, xử lý bằng axit HCl theo mô tả của Tian, xử lý bằng ethanol theo mô tả của Ranadive và xử lý bằng enzyme theo mô tả của Zahiria kết hợp với các bước tách chiết. Kết quả được biểu diễn trên hình 3.12. Kết quả cho thấy phương pháp xử lý tế bào bằng ethanol cho hiệu quả thu nhận CoQ10 cao hơn so với các phương pháp khác được sử dụng. Tương tự như những vi khuẩn Gram âm khác, A. tumefaciens có chứa một lớp màng trong và màng ngoài mỏng do đó dưới tác động của ethanol sẽ làm các tương tác kỵ nước trên màng bị yếu đi dẫn đến cấu trúc màng tế bào bị phá vỡ và giải phóng các thành phần nằm trên màng hoặc trong màng ra môi trường. Vì vậy, phương pháp xử lý tế bào bằng ethanol đã được lựa chọn để tiếp tục nghiên cứu tối ưu và sử dụng trong các nghiên cứu tiếp theo. 14 Hình 3.12.Các phương pháp xử lý phá vỡ tế bào 3.5.2. Xác định điều kiện xử lý tế bào bằng ethanol 3.5.2.1. Xác định tỷ lệ ethanol/sinh khối Kết quả cho thấy hàm lượng CoQ10 được chiết xuất tăng lên khi tỷ lệ ethanol/sinh khối tăng (hình 3.13A). Khi so sánh hàm lượng CoQ10 thu được với các tỷ lệ chiết khác nhau cho thấy tỷ lệ 10:1 cao hơn 1,32 lần (tương đương 24,3%) so với tỷ lệ 5:1, trong khi đó hàm lượng CoQ10 thu được ở tỷ lệ 15:1 chỉ cao hơn so với tỷ lệ 10:1 là 1,08 lần. Từ kết quả thu được tỷ lệ ethanol/sinh khối (10 ml/g) sẽ được sử dụng để tách chiết CoQ10 trong các nghiên cứu tiếp theo. 3.5.2.2. Xác định thời gian đồng hóa Kết quả hình 3.13B cho thấy hàm lượng CoQ10 thu được tăng lên khi thời gian đồng hóa tăng và đạt cao nhất ở thời gian 3 phút. Tuy nhiên khi thời gian đồng hóa tăng tiếp thì hiệu quả thu hồi CoQ10 lại giảm. Sự giảm này có thể là do tác động của sóng siêu âm trong thời gian dài đã làm phá hủy cấu trúc của CoQ10. 3.5.2.3. Xác định nhiệt độ xử lý Kết quả hình 3.13C cho thấy khi nhiệt độ ủ tăng lên thì hàm lượng CoQ10 thu được cũng tăng (1,15 và 1,17 lần ở 37 oC và 60oC tương ứng so với điều kiện 25oC. Từ kết quả nhận được, chúng tôi thấy rằng nhiệt độ 37oC là phù hợp để thực hiện xử lý tế bào bằng ethanol. Từ các kết quả thu được trong nghiên cứu này, quy trình tách chiết CoQ10 từ sinh khối A. tumefaciens đã được xác lập và mô tả tóm tắt như sau: trộn sinh khối vi khuẩn với ethanol 100% theo tỷ lệ 10:1 (v/w), đồng hóa bằng siêu âm 3 phút, ủ ở nhiệt độ 37oC trong 3 giờ, ly tâm loại bỏ xác tế bào, chiết với hexane theo tỷ lệ 1:1, cô đặc chân không ở 45oC. 0.00 0.10 0.20 0.30 0.40 0.50 0.60 Siêu âm HCl EtOH Enzyme C O Q 1 0 ( m g /g ) Phƣơng pháp xử lý tế bào 15 Hình 3.13. Ảnh hưởng của tỷ lệ ethanol/sinh khối (A), thời gian đồng hóa (B), nhiệt độ xử lý (C) đến hàm lượng CoQ10 tách chiết từ A. tumefaciens tái tổ hợp. 3.5.3. Nghiên cứu tinh sạch Coenzyme Q10 3.5.3.1. Đánh giá so sánh độ sạch của dịch chiết Coenzyme Q10 CoQ10 thu được theo quy trình trên được phân tích và định lượng trên hệ thống HPLC với các điều kiện sắc ký như sau: Pha động A: Metanol 100%. Pha động B: Ethanol 100%. Cột C18 kích thước 250 mm x 4 mm nhồi hạt với kích thước 5μm. Nhiệt độ cột 35oC, tốc độ dòng 0,5 ml/phút, thể tích tiêm 10 μl, detector UV – Vis tại bước sóng 275 nm. Kết quả được thể hiện trên hình 3.14A, 3.14B Hình 3.14. Phổ sắc ký HPLC của CoQ10 chuẩn (A) và dịch chiết từ A. tumefaciens tái tổ hợp (B) Kết quả cho thấy với bước sóng hấp thụ cực đại của CoQ10 (275 nm), chỉ thấy xuất hiện một số đỉnh phụ rất nhỏ so với đỉnh chính CoQ10 trên phổ sắc ký HPLC. So sánh với phổ CoQ10 chuẩn của hãng Sigma có thể thấy rằng dịch chiết CoQ10 là tương đối sạch khi so sánh ở bước sóng 275 nm. Tuy nhiên, trong dịch chiết còn có thể có chứa các hợp chất khác không hấp thụ cực đại tại bước sóng 275 nm. Do đó để đánh giá độ sạch, dịch chiết được phân tích bằng phương pháp quét phổ với bước sóng từ 200 – 800 nm và so sánh với CoQ10 chuẩn. Kết quả cho thấy phổ hấp phụ của dịch chiết CoQ10 và CoQ10 chuẩn đều xuất hiện một đỉnh hấp thụ cực đại ở bước sóng 275 nm, đây chính là đỉnh CoQ10. Khi so sánh phổ hấp thụ này so với dịch CoQ10 chuẩn chúng tôi thấy hoàn toàn tương tự. Tuy nhiên, ngoài đỉnh chính (bước sóng 247 – 309) thì cường độ hấp 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 5:1 10:1 15:1 C o Q 1 0 ( m g /g ) Tỷ lệ ethanol/sinh khối (ml/g) 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1 2 3 5 10 15 C o Q 1 0 ( m g /g ) Thời gian (phút) 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 25 37 60 C o Q 1 0 ( m g /g ) Nhiệt độ (oC) A B C A B 16 thụ dịch chiết CoQ10 cao hơn so với CoQ10 chuẩn (hình 3.15), điều đó chứng tỏ trong dịch chiết vẫn còn lẫn tạp chất. Phân tích tổng thể phổ hấp thụ (ngoại trừ đỉnh CoQ10) cho thấy cường độ hấp thụ của mẫu CoQ10 tách chiết cao hơn 2,59 lần so với CoQ10 chuẩn. Hình 3.15. So sánh độ sạch của dịch chiết CoQ10 và CoQ10 chuẩn. (L1) dịch chiết CoQ10 từ sinh khối vi khuẩn, (S) dịch CoQ10 chuẩn 3.5.3.2. Nghiên cứu tinh sạch Coenzyme Q10 theo phương pháp chiết bằng dung môi Trong nghiên cứu này, hệ dung môi để chiết tinh sạch CoQ10 là ethanol:hexane theo tỷ lệ 1:1 về thể tích. Dịch chiết CoQ10 với các lần chiết khác nhau: 1, 2, 3 được phân tích bằng phương pháp quét phổ với bước sóng từ 200 – 800 nm. Kết quả so sánh phổ hấp thụ dịch chiết thu được tương ứng với số lần chiết cho thấy cường độ phổ hấp thụ của dịch chiết với 3 lần chiết thấp hơn khoảng 3,25 lần so với 1 lần chiết và 1,62 lần so với 2 lần chiết (hình 3.16A). Điều đó chứng tỏ dịch chiết CoQ10 với 3 lần chiết sạch hơn so với 1 và 2 lần chiết. Hình 3.16. Phổ hấp thụ dịch chiết CoQ10 theo số lần chiết khác nhau (A). So sánh độ sạch của dịch tinh sạch CoQ10 và CoQ10 chuẩn. L1 dịch chiết CoQ10 từ sinh khối vi khuẩn sau 1 lần chiết, L3, dịch chiết CoQ10 sau 3 lần chiết, S dịch CoQ10 chuẩn (B) 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 200 250 300 350 400 450 500 550 600 650 700 750 800 C ư ờ n g đ ộ h ấ p t h ụ Bước sóng (nm) L1 S 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 200 250 300 350 400 450 500 550 600 650 700 750 800 C ư ờ n g đ ộ h ấ p t h ụ Bước sóng (nm) L1 L2 L3 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 200 250 300 350 400 450 500 550 600 650 700 750 800 C ư ờ n g đ ộ h ấ p t h ụ Bước sóng (nm) L1 L3 S A B 17 Tiến hành phân tích phổ hấp thụ của dịch tinh sạch và so sánh với phổ hấp thụ CoQ10 chuẩn. Kết quả phổ hấp thụ ở bước sóng 309 – 800 nm của dịch chiết sau 3 lần chiết có sự giảm rõ rệt và gần tương đương như cường độ hấp thụ của dịch CoQ10 chuẩn. Trong giải bước sóng 309 – 800 nm, cường độ hấp thụ giảm từ 5,46 lần (đối với dịch chiết 1 lần chiết) xuống còn 1,93 lần (đối với dịch chiết 3 lần chiết) so với dịch CoQ10 chuẩn. Phân tích tổng thể, cường độ hấp thụ giảm từ 2,59 xuống 1,91 đối với dịch chiết 3 lần chiết lần so với CoQ10 chuẩn. Từ kết quả thu được cho thấy phương pháp chiết bằng 3 lần chiết đã thu được dịch chiết CoQ10 sạch hơn đặc biệt là loại bỏ được các tạp chất hấp thụ ở bước sóng từ 309 – 800 nm. Phương pháp này tương đối đơn giản và sử dụng hệ dung môi rẻ không độc hại nên có thể được áp dụng ở quy mô lớn để tách chiết và tinh sạch CoQ10. 3.5.3.3. Nghiên cứu tinh sạch Coenzyme Q10 theo phương pháp sắc ký lọc gel qua cột silica Trong nghiên cứu này, dịch chiết CoQ10 sau 3 lần chiết được tiếp tục tinh sạch sử dụng sắc ký cột silica gel. Kết quả cho thấy cường độ phổ hấp thụ của dịch CoQ10 sau khi tinh sạch bằng sắc ký cột silica giảm đi ở cả hai vùng bước sóng 200-248 nm và 309-800 nm. Cường độ hấp thụ trong dải bước sóng 200-248 nm giảm khoảng 13% sau khi tinh sạch; trong khi đó cường độ hấp thụ trong dải bước sóng 109 – 800nm giảm 58%. Phân tích tổng thể cho thấy cường độ hấp thụ giảm đi khoảng 24 % trong mẫu tinh sạch bằng silica gel (hình 3.17). Hình 3.17. So sánh độ sạch của dịch tinh sạch CoQ10 và CoQ10 chuẩn. L3, dịch chiết CoQ10 từ sinh khối vi khuẩn sau 3 lần chiết; E1, dịch CoQ10 sau khi tinh sạch bằng sắc ký cột silica gel; S, dịch CoQ10 chuẩn 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 200 250 300 350 400 450 500 550 600 650 700 750 800 C ư ờ n g đ ộ h ấ p t h ụ Bước sóng (nm) L3 S E 18 Khi so sánh với CoQ10 chuẩn, cường độ hấp thụ của dịch tinh sạch chỉ còn cao hơn là 1,46 lần và thấp hơn nhiều so với dịch CoQ10 chiết 1 lần (2,59) và dịch chiết 3 lần chiết (1,91). 3.5.4. Quy trình thu nhận Coenzyme Q10 từ A. tumefaciens tái tổ hợp Dựa vào các kết quả nghiên cứu tối ưu điều kiện nuôi cấy, phương pháp tách chiết CoQ10 từ A. tumefaciens tái tổ hợp luận án đã xây dựng quy trình thu nhận CoQ10 từ A. tumefaciens tái tổ hợp như hình 3.18. Hình 3.18. Quy trình thu nhận CoQ10 từ A. tumefaciens tái tổ hợp A. tumefaciens tái tổ hợp Lên men (28 oC, pH đầu 8, cấp giống OD giống 0.8, thời gian 96 giờ Ly tâm thu sinh khối Phá vỡ tế bào Trộn sinh khối với ethanol tỷ lệ 10:1 ml/g, đồng hóa 3 phút, ủ 37o trong 3 giờ Tách chiết n-hexane tỷ lệ 1:1 (v/v) Ly tâm thu dịch Cô đặc chân không, áp suất 260 mbar, nhiệt độ 45oC n –hexan tỷ lệ 1:1 Ethanol 100% Chế phẩmCoQ10 Tinh sạch Chiết bằng ethanol:hexane, cô đặc, tinh sạch bằng cột silica Cô đặc chân không, áp suất 260 mbar, nhiệt độ 45oC 19 3.6. KHẢO SÁT ĐẶC TÍNH HÓA LÝ CỦA COENZYME Q10 Nghiên cứu đặc tính cho thấy CoQ10 CoQ10 bền nhiệt 4 – 60oC, bền trong vùng pH 6 – 9, bị phá hủy bởi ánh sáng mặt trời và ánh sáng huỳnh quang (hình 3.39, 3.40, 3.41). Hình 3.19. Ảnh hưởng của nhiệt độ(A), pH (B), ánh sáng (C) đến độ bền của CoQ10 tách chiết từ tế bào A. tumefaciens tái tổ hợp. 3.7. XÁC ĐỊNH MỘT SỐ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA COENZYME Q10 3.7.1. Hoạt tính chống oxy hóa của CoQ10 Hoạt tính chống oxy hóa của CoQ10 có thể được xác định thông qua việc làm giảm màu của thuốc thử DPPH, được xác định bằng phép đo độ hấp thụ ở bước sóng 517 nm trên máy quang phổ. Kết quả cho thấy hoạt tính chống oxi hóa của Coenzyme Q10 tăng khi nồng độ Coenzyme Q10 tăng dần. Dựa trên kết quả tính toán, tại nồng độ 0,18 mM Coenzyme Q10 có khả năng làm giảm 50% gốc tự do 0,5 mM DPPH (EC50 = 0,18 mM). 3.7.2. Khả năng ức chế tế bào ung thƣ của CoQ10 Ảnh hưởng của CoQ10 đến tế bào ung thư được đánh giá thông qua tỷ lệ tế bào còn sống sau khi xử lý với CoQ10. Kết quả hình 3.20 cho thấy CoQ10 ảnh hưởng ít đến sự sinh trưởng của cả hai dòng tế bào ung thư ở nồng độ dưới 20 µM sau 72 giờ xử lý. Tuy nhiên ở nồng độ cao hơn 40 và 80 µM, CoQ10 đã có sự ảnh hưởng rõ rệt 0 20 40 60 80 100 120 0h 24h 48h 72h 96h 120h 144h Đ ộ b ề n tư ơ n g đ ố i ( % ) Thời gian (giờ) 4oC 25oC 37oC 60oC 0 20 40 60