Nghiên cứu tổng hợp hệ chất mang thuốc nano polyamidoamine (pamam) biến tính có khả năng hướng đích đến tế bào ung thư

theo lý thuyết ζ (%): hiệu số sai lệch so với lý thuyết (%) 2.1.2.6 Thử độc tính tế bào Khả năng ức chế sự tăng trƣởng tế bào của dendrimer PAMAM G3.0 và các dẫn xuất alkyl-dendrimer PAMAM G3.0 đã đƣợc thử nghiệm trên các tế bào MCF-7 (Frederick, MD, USA) bằng EZ-Cytox Cell Viability Assay Kit, tại trƣờng Đại học Ajou, TP. Suwon, Hàn Quốc. EZ-Cytox Cell Viability Assay Kit cung cấp phƣơng tiện rất thuận tiện và nhạy cảm nhất để xác định số lƣợng tế bào và khả năng tồn tại. Xét nghiệm này đƣợc dựa trên sự phân cắt của muối tetrazolium để tạo ra formazan tan trong nƣớc bằng hệ thống reductase succinate-tetrazolium thuộc chuỗi hô hấp của mithochondria và chỉ hoạt động trong các tế bào sống. Do đó, lƣợng thuốc nhuộm formazan là tỷ lệ thuận với số lƣợng các tế bào sống. Các thuốc nhuộm formazan sản xuất bởi tế bào sống có thể đƣợc định lƣợng bằng quang phổ bằng cách đo độ hấp thụ của dung dịch thuốc nhuộm ở 450 nm. 2.1.2.7 Khảo sát khả năng mang nhả thuốc chống ung thư 5-fluorouracil (5-FU) Sử dụng siêu âm để tăng hiệu quả mang thuốc, xác định lƣợng thuốc nang hóa gián tiếp trong phân tử dendrimer PAMAM G3.0 và dẫn xuất thông qua HPLC 48 (High-Performance Liquid Chromatography). Lƣợng 5-FU đƣợc nhả ra đƣợc xác định bằng phƣơng pháp đo HPLC. 2.1.2.8 Khảo sát khả năng thâm nhập tế bào Khả năng thâm nhập tế bào của dendrimer PAMAM G3.0 và dẫn xuất đƣợc tiến hành thử nghiệm trên dòng tế bào Hela bằng kính hiển vi quét laser đồng tiêu (Confocal laser scanning microscopy) tại trƣờng Đại học Ajou, TP. Suwon, Hàn Quốc. 2.2 THỰC NGHIỆM 2.2.1 Hóa chất Bảng 2.3 Một số thông số vật lý của hóa chất Hóa chất Khối lƣợng riêng (g/ml) Khối lƣợng phân tử (g/mol) Nguồn gốc 1-Ethyl-3-(3- dimethylaminoprop yl)carbodiimide hydrochloride (EDC) 191.7 Acros Organics 5-Flurouracil 130.08 Sigma-Aldrich Acetyl chloride 1.104 78.50 Acros Organics Acid acetic 1.049 60.05 Acros Organics Acid decanoic 0.893 172.26 Acros Organics Acid folic 441.40 Acros Organics Acid hexanoic 0.927 116.16 Acros Organics Acid myristic 228.37 Acros Organics Butylamine 0.74 73.14 Acros Organics Decanoyl chloride 0.922 218.76 Acros Organics Decylamine 0.787 157.30 Acros Organics Dimethyl formamide (DMF) 0.970 75.08 Merck, Đức 49 Dimethyl sulfoxide (DMSO) 1.10 78.13 Merck, Đức Dodecanol 0.833 186.33 Acros Organics Dodecylamine 0.806 185.35 Acros Organics Ethanol 0.789 46.07 Acros Organics Ethylenediamine (EDA) 0.899 60.10 Acros Organics Hexanol 0.814 102.17 Acros Organics Hexanoyl chloride 0.963 134.60 Acros Organics Methanol 0.79 32,04 Merck, Đức Methyl Acrylate (MA) 0.956 86.09 Acros Organics Myristoyl chloride 0.908 246.82 Acros Organics Octanol 0.827 130.23 Acros Organics Octylamine 0.782 129.24 Acros Organics p-Nitrophenyl chloroformate (NPC) 201.56 Acros Organics Toluen 0.87 92 Merck, Đức Triethylamine (TEA) 0.726 101.19 Acros Organics 2.2.2 Thiết bị và dụng cụ - Dụng cụ: Bình cầu cổ nhám hai cổ, bình cầu cổ nhám một cổ, ống nhỏ giọt, pipet, becher, ống đong, khóa nhám cung cấp nitơ, túi thẩm tách Por 7 Regenerated Cellulose Membrane, MWCO 3.000D- 5.000D và các dụng cụ khác. - Micropipet 200μl. - Cân phân tích điện tử - HADAM AEP – 250G. - Máy khuấy từ gia nhiệt C-MAG HS 7 và cá từ. 50 - Máy cô quay chân không Bũchi Rotavapor R-200, Heating Bath B-490. - Bể siêu âm hiệu Bransonic, USA, tần số 42kHz, công suất 100W. - Máy đông khô chân không FDU-2100 Eyela, Nhật Bản, đông khô ở -80oC, tại viện Công nghệ Hóa học, Viện Hàn lâm Khoa học và công nghệ Việt Nam. - Máy đo khối phổ Agilent 1100 LC-MSD Trap, tại viện Công nghệ Hóa học, Viện Khoa học và công nghệ Việt Nam, dùng kỹ thuật ESI (Electron Spray Ionization Mass Spectra). - Máy cộng hƣởng từ hạt nhân NMR, BRUCKER 500MHz, tại viện Công nghệ Hóa học, Viện Hàn lâm Khoa học và công nghệ Việt Nam. - Kính hiển vi điện tử truyền qua TEM, JEM 1010 (JEOL, Japan), Đại học Bách khoa, TP. HCM. 2.2.3 Thực nghiệm 2.2.3.1 Tổng hợp dendrimer PAMAM từ thế hệ G-0.5 đến G3.0 a. Tổng hợp dendrimer PAMAM G-0.5 (tổng hợp lõi, thế hệ lẻ) Cho 37ml (35g; 0,407mol) dung dịch methylacrylate (MA) vào bình cầu hai cổ 500ml, sau đó cho 20ml methanol (MeOH) vào và khuấy đều. Tiếp theo, cho từ từ từng giọt dung dịch của 5.5ml (5g; 0,083mol) ethylenediamine (EDA) và 20ml MeOH vào hỗn hợp trên. Giữ lạnh hỗn hợp ở 0-4oC trong 1giờ, sau đó ở nhịêt độ phòng trong 48 giờ tiếp theo, khuấy đều và cung cấp khí N2 trong suốt quá trình phản ứng. Tỷ lệ mol giữa MA và EDA phản ứng là 5:1. Sau khi phản ứng kết thúc, cô quay loại bỏ tác chất trong 48 giờ, nhịêt độ cô quay luôn giữ thấp hơn 45oC, áp suất chân không 700-760mmHg. Cho MeOH vào trong lúc cô quay để đuổi hết MA dƣ. Sản phẩm G-0.5 đƣợc bảo quản trong MeOH ở 4-5 o C, H=89% (sơ đồ 2.9). 51 Sơ đồ 2.9: Quy trình tổng hợp dendrimer PAMAM G-0.5 Phổ 1H-NMR của các dendrimer PAMAM từ G-0.5 đến G3.0 (500 MHz, MeOD, δ ppm) xuất hiện tín hiệu proton của các peak đặc trƣng của hợp chất: - CH2CH2N< (a) ; -CH2CH2CO- (b); -CH2CH2CONH- (c); -CH2CH2NH2 (d, thế hệ chẵn); -CONHCH2CH2N- (e); -CH2CH2COOCH3 (g, thế hệ lẻ ) và -COOCH3 (h, thế hệ lẻ). Phổ 1H-NMR (dendrimer PAMAM G-0.5, MeOD, ppm): 2.49 (a), 2.75-2.78 (b), 2.38-2.45 (g) và 3.62-3.70 (h). (hình 3.4) Phổ MS (dendrimer PAMAM G-0.5): m/z 407 (M+ + H). (phụ lục 1) b. Tổng hợp dendrimer PAMAM G0.0 (thế hệ chẵn) Cho 85ml (75g; 1,248mol) EDA vào bình cầu hai cổ 500ml, sau đó cho 100ml MeOH vào và khuấy đều. Tiếp theo, cho từ từ từng giọt dung dịch của 5g (0,083mol) dendrimer PAMAM G-0.5 và 20ml MeOH vào hỗn hợp trên. Giữ lạnh hỗn hợp ở 0- 4 oC trong 1giờ, sau đó ở nhiệt độ phòng trong 96 giờ tiếp theo, khuấy đều và cung cấp khí N2 trong suốt quá trình phản ứng. Tỷ lệ mol giữa EDA và dendrimer PAMAM G- 0.5 phản ứng là 50:1. 52 Sau khi phản ứng kết thúc, cô quay loại bỏ tác chất trong 5 ngày. Do nhiệt độ sôi của EDA là 116oC nên khó có thể tách ở điều kiện nhịêt độ <50oC, áp suất chân không 700-750mmHg, nên phải dùng hỗn hợp Toluen và MeOH với tỷ 9:1 để tạo hỗn hợp đẳng phí với EDA. Sau khi loại bỏ hết EDA, sử dụng MeOH để loại bỏ toluen [13]. Sản phẩm dendrimer PAMAM G0.0 đƣợc bảo quản trong MeOH ở 4-5oC, H=83 % (sơ đồ 2.10). Sơ đồ 2.10: Quy trình tổng hợp dendrimer PAMAM G0.0 Phổ 1H NMR (dendrimer PAMAM G0.0, MeOD, ppm): 2.56-2.57 (a), 2.77-2.81 (b), 2.37-2.40 (c), 2.72-2.75 (d) và 3.24-3.33 (e). (hình 3.5). Phổ MS (dendrimer PAMAM G0.0): m/z 517 (M+ + H). (phụ lục 1) c. Tổng hợp dendrimer PAMAM G0.5 (thế hệ lẻ) Quy trình tổng hợp tƣơng tự nhƣ tổng hợp dendrimer PAMAM G-0.5, sử dụng 30ml (29g; 0,33mol) MA trong 100ml MeOH; 15g dendrimer PAMAM G0.0 trong 53 20ml MeOH. Tỷ lệ mol giữa MA và dendrimer PAMAM G0.0 phản ứng là 10:1, H=88% (sơ đồ 2.11). Sơ đồ 2.11: Quy trình tổng hợp dendrimer PAMAM G0.5 Phổ 1H-NMR (dendrimer PAMAM G0.5, MeOD, ppm): 2.53-2.56 (a), 2.73-2.78 (b), 2.33-2.39 (c), 3.25-3.31 (e), 2.42-2.49 (g) và 3.63-3.67 (h). (hình 3.6). Phổ MS (dendrimer PAMAM G0.5): m/z 1207 (M+ + H). (phụ lục 1) d. Tổng hợp dendrimer PAMAM G1.0 (thế hệ chẵn) Tƣơng tự nhƣ quy trình tổng hợp dendrimer PAMAM G0.0, sử dụng 420ml (378,30g; 6,30mol) EDA trong 100ml MeOH; 20g dendrimer PAMAM G0.5 trong 50ml MeOH; MeOH. Tỷ lệ mol giữa EDA và dendrimer PAMAM G0.5 phản ứng là 50:1, H=87 %. Phổ 1H-NMR (dendrimer PAMAM G1.0, MeOD, ppm): 2.58-2.60 (a), 2.80-2.82 (b), 2.37-2.40 (c), 2.73-2.75 (d) và 3.25-3.27 (e). (hình 3.7). Phổ MS (dendrimer PAMAM G1.0): m/z 1429 (M+ + H). (phụ lục 1) e. Tổng hợp dendrimer PAMAM G1.5 (thế hệ lẻ) 54 Tƣơng tự nhƣ quy trình tổng hợp dendrimer PAMAM G0.5, sử dụng 13ml (12g; 0,14mol) MA trong 50ml MeOH; 20g dendrimer PAMAM G1.0 trong 50ml MeOH. Tỷ lệ mol giữa MA và dendrimer PAMAM G0.0 phản ứng là 10:1, H=83%. Phổ 1H-NMR (dendrimer PAMAM G1.5, MeOD, ppm): 2.56-2.65 (a), 2.77-2.84 (b), 2.39-2.41 (c), 3.26-3.36 (e), 2.47-2.49 (g) và 3.68 (h). (hình 3.8). Phổ MS (dendrimer PAMAM G1.5): m/z 2809 (M+ + H). (phụ lục 1) f. Tổng hợp dendrimer PAMAM G2.0 (thế hệ chẵn) Tƣơng tự nhƣ quy trình tổng hợp dendrimer PAMAM G0.5, sử dụng 72,82ml (65,54g; 1,09mol) EDA trong 100ml MeOH; 20g dendrimer PAMAM G1.5 trong 50ml MeOH; MeOH. Tỷ lệ mol giữa EDA và dendrimer PAMAM G1.5 phản ứng là 160:1, H=76%. Phổ 1H-NMR (dendrimer PAMAM G2.0, MeOD, ppm): 2.58-2.60 (a), 2.79-2.82 (b), 2.36-2.39 (c), 2.69-2.74 (d) và 3.25-3.32 (e). (hình 3.9). Phổ MS (dendrimer PAMAM G2.0): m/z 3260 (M+ + H). (phụ lục 1) g. Tổng hợp dendrimer PAMAM G2.5 (thế hệ lẻ) Tƣơng tự nhƣ quy trình tổng hợp dendrimer PAMAM G0.5, sử dụng 12ml (10,58g; 0,12mol) MA trong 50ml MeOH; 20g dendrimer PAMAM G2.0 trong 50ml MeOH. Tỷ lệ mol giữa MA và dendrimer PAMAM G0.0 phản ứng là 20:1. Với dendrimer PAMAM G2.5, sau khi loại MA bằng cô quay chân không, sản phẩm đƣợc thẩm tách 4 lần bằng MeOH với màng Cellulose MWCO 3.500-5.000D trong 12 giờ để loại bỏ những tác chất thừa có trọng lƣợng phân tử dƣới 5000D, H=71%. (sơ đồ 2.12). 55 Sơ đồ 2.12: Quy trình tổng hợp dendrimer PAMAM G2.5 Phổ 1H-NMR (dendrimer PAMAM G2.5, MeOD, ppm): 2.53-2.63 (a), 2.74-2.85 (b), 2.39-2.41 (c), 3.26-3.33 (e), 2.47-2.49 (g) và 3.68-3.68 (h). (hình 3.10). h. Tổng hợp dendrimer PAMAM G3.0 (thế hệ chẵn) Tƣơng tự nhƣ quy trình tổng hợp dendrimer PAMAM G0.5, sử dụng 68ml (61,4g; 1,02mol) EDA trong 50ml MeOH; 20g dendrimer PAMAM G2.5 trong 50ml MeOH; MeOH. Tỷ lệ mol giữa EDA và dendrimer PAMAM G2.5 phản ứng là 320:1. Với dendrimer PAMAM G3.0, sau khi loại EDA, toluen bằng cô quay chân không, sản phẩm đƣợc thẩm tách 4 lần bằng MeOH với màng Cellulose MWCO 3.500-5.000D trong 12 giờ để loại bỏ những tác chất thừa có trọng lƣợng phân tử dƣới 5000D, H=67%. (sơ đồ 2.13). 56 Sơ đồ 2.13: Quy trình tổng hợp dendrimer PAMAM G3.0 Phổ 1H NMR (dendrimer PAMAM G3.0, MeOD, ppm): 2.60-2.61 (a), 2.80-2.83 (b), 2.37-2.40 (c), 2.73-2.76 (d) và 3.26-3.33 (e). (hình 3.11). Ảnh TEM (dendrimer PAMAM G3.0): có cấu trúc hình cầu, kích thƣớc 3-4nm. 2.2.3.2 Biến tính bề mặt dendrimer PAMAM với tác nhân ankyl (acyl chloride, acid carboxylic, alcohol và alkylamine) a. Biến tính dendrimer PAMAM G3.0 với acyl chloride  Khảo sát thời gian phản ứng Thí nghiệm đƣợc thực hiện khảo sát với thời gian phản ứng 12 giờ, 24 giờ, 36 giờ, 48 giờ, mỗi khảo sát đƣợc lặp lại 3 lần, chọn ngẫu nhiên một mẫu cho hiệu suất cao nhất để đo phổ 1H-NMR. Quy trình phản ứng đơn giản theo Rachaneekorn Jevprasesphant [71], đƣợc thực hiện nhƣ sau: 57 0,332ml decanoyl chloride (1,6 mmol) cho từ từ vào 0,695g dendrimer PAMAM G3.0 (0,1mmol) hòa tan trong 2ml DMSO, cho tiếp vào 0,223ml TEA (1,6mmol). Hỗn hợp phản ứng đƣợc khuấy đều liên tục ở nhiệt độ phòng và khảo sát theo điều kiện thời gian phản ứng (12 giờ, 24 giờ, 36 giờ, 48 giờ). Sau khi kết thúc phản ứng, tiến hành thẩm tách bằng nƣớc cất (4 lần) và sau đó bằng MeOH (4 lần) trong 48 giờ với màng thẩm tách MWCO: 3.500-5.000D, loại MeOH thu đƣợc sản phẩm có màu vàng, dạng dẻo. Với thời gian 12 giờ (ký hiệu sản phẩm: G3.0-C10-12h, H=52,33%), thời gian 24 giờ (ký hiệu sản phẩm: G3.0-C10-24h, H=67.87 ), thời gian 36 giờ (ký hiệu sản phẩm: G3.0-C10-36h, H=73,53%), thời gian 48 giờ (ký hiệu sản phẩm: G3.0-C10- 48h, H=68,08%). Thời gian khảo sát phản ứng này cho kết quả chuyển hóa ổn định là 36 giờ (sơ đồ 2.14). Sơ đồ 2.14: Quy trình biến tính dendrimer PAMAM G3.0 với acyl chloride Sử dụng phƣơng pháp phân tích 1H-NMR xác định thành phần cấu trúc của dẫn xuất tổng hợp đƣợc. 58 Phổ 1H-NMR dẫn xuất dendrimer PAMAM G3.0 với acyl chloride (500 MHz, MeOD, δppm) xuất hiện tín hiệu proton của các peak đặc trƣng của hợp chất: - CH2CH2N< (a, 30 nhóm); -CH2CH2CO- (b, 60 nhóm); -CH2CH2CONH- (c, 60+z nhóm); -CH2CH2NH2 (d, 32- z nhóm); -CONHCH2CH2N- (e, 60+z nhóm); và -CH3 (j, z nhóm). (Hình 3.16). Phổ 1H-NMR (G3.0-C10-12h, MeOD, ppm): 2,53-2,54 (a); 2,73 (b); 2,34 (c); 2,836-2,96 (d); 3,21-3,34 (e) và 0.77 (j). (phụ lục 2). Phổ 1H-NMR (G3.0-C10-24h, MeOD, ppm): 2,68 (a); 2,75-2,77 (b); 2,35-2,44 (c); 2,82-2,89 (d); 3,32-3,46 (e) và 0,91 (j). (phụ lục 3). Phổ 1H-NMR (G3.0-C10-36h, MeOD, ppm): 2,57 (a); 2,77 (b); 2,37-2,45 (c); 3,01 (d); 3,24-3,40 (e) và 0,80 (j). (phụ lục 4). Phổ 1H-NMR (G3.0-C10-48h, MeOD, ppm): 2,62-2,64 (a); 2,84-2,85 (b); 2,18- 2,21 (c); 3,03 (d); 3,30-3,45 (e) và 0,91 (j). (phụ lục 5). Dựa vào độ dịch chuyển các tin hiệu proton có trên phổ 1H-NMR, áp dụng công thức 2.1, chúng tôi xác định đƣợc độ chuyển hóa, số nhóm chuyển hóa và khối lƣợng phân tử của dân xuất tổng hợp đƣợc. b. Biến tính dendrimer PAMAM G3.0 với tác nhân acyl chloride khác (acetyl chloride, hexanoyl chloride, myristoyl chloride) Biến tính dendrimer PAMAM G3.0 với các acyl chloride khác theo thời gian phản ứng khảo sát 36 giờ: với acetyl chloride (ký hiệu sản phẩm: G3.0-C2, H=70 ), hexanoyl chloride (ký hiệu sản phẩm: G3.0-C6, H=72%), myristoyl chloride (ký hiệu sản phẩm: G3.0-C14, H=75 ). Quy trình phản ứng tƣơng tự nhƣ các phản ứng biến tính sản phẩm G3.0-C10-36 giờ (G3.0-C10). Sản phẩm thu đƣợc có màu vàng, dạng dẻo. Sử dụng phƣơng pháp phân tích 1H-NMR xác định thành phần cấu trúc của dẫn xuất tổng hợp đƣợc. Phổ 1H-NMR (G3.0-C2, MeOD, ppm): 2,56-2,57 (a); 2,76 (b); 2,37-2,39 (c); 2,82 (d); 3,24-3,29 (e) và 1,92 (j). (phụ lục 6). 59 Phổ 1H-NMR (G3.0-C6, MeOD, ppm): 2,58 (a); 2,78-2,79 (b); 2,39 (c); 2,97 (d); 3,26 (e) và 0,82 (j). (phụ lục 7). Ảnh TEM (G3.0-C6): có cấu trúc hình cầu, kích thƣớc 4-6nm. (Hình 3.35, 3.36). Phổ 1H-NMR (G3.0-C14, MeOD, ppm): 2,59-2,60 (a); 2,81-2,82 (b); 2,40 (c); 2,86-2,87 (d); 3,28-3,36 (e) và 0,91 (j). (phụ lục 8). Dựa vào độ dịch chuyển các tín hiệu proton có trên phổ 1H-NMR, áp dụng công thức 2.1, chúng tôi xác định đƣợc độ chuyển hóa, số nhóm chuyển hóa và khối lƣợng phân tử của dẫn xuất tổng hợp đƣợc. c. Biến tính dendrimer PAMAM G3.0 với acid carboxylic Biến tính PAMAM G3.0 bằng acid carboxylic: với acid acetic (ký hiệu sản phẩm: G3.0-C2-EDC, H=68 ), acid hexanoic (ký hiệu sản phẩm: G3.0-C6-EDC, H=70 ), acid decanoic (ký hiệu sản phẩm: G3.0-C10-EDC, H=74%), acid myristic (ký hiệu sản phẩm: G3.0-C14-EDC, H= 68 – 75 ). Quy trình phản ứng đơn giản cho hiệu suất chuyển hóa cao. Phản ứng biến tính đƣợc thực hiện theo quy trình của Quintana [74] và James R. Baker [75] nhƣ sau: Hòa tan hoàn toàn 0,613g EDC (3,2mmol) trong 2ml nƣớc, sau đó cho vào thêm 1,6 mmol acid carboxylic (acid acetic, acid hexanoic, acid decanoic, acid myristic) và khuấy đều trong 1 giờ. Nhỏ từng giọt hỗn hợp trên vào dung dịch chứa 0,695g dendrimer PAMAM G3.0 (0,1mmol) trong 2ml DMSO. Hỗn hợp phản ứng đƣợc khuấy đều liên tục ở nhiệt độ phòng trong 12 giờ. Sau khi kết thúc phản ứng, tiến hành thẩm tách bằng nƣớc cất (4 lần) và sau đó bằng MeOH (4 lần) trong 48 giờ với màng thẩm tách MWCO: 3.500-5.000D, loại MeOH thu đƣợc sản phẩm là dẫn xuất dendrimer PAMAM G3.0-acid carboxylic (G3.0-C2-EDC, G3.0-C6-EDC, G3.0-C10- EDC, G3.0-C14-EDC) có màu vàng, dạng dẻo (sơ đồ 2.15). 60 Sơ đồ 2.15: Quy trình biến tính dendrimer PAMAM G3.0 với acid carboxylic Sử dụng phƣơng pháp phân tích 1H-NMR xác định thành phần cấu trúc của dẫn xuất tổng hợp đƣợc. Phổ 1H-NMR dẫn xuất dendrimer PAMAM G3.0 với acid carboxylic (500 MHz, MeOD, δppm) xuất hiện tín hiệu proton của các peak đặc trƣng của hợp chất: - CH2CH2N< (a, 30 nhóm); -CH2CH2CO- (b, 60 nhóm); -CH2CH2CONH- (c, 60+z nhóm); -CH2CH2NH2 (d, 32- z nhóm); -CONHCH2CH2N- (e, 60+z nhóm); và -CH3 (j, z nhóm), tƣơng tự nhƣ trong sản phẩm dẫn xuất dendrimer PAMAM G3.0 với acyl chloride. (Hình 3.16). Phổ 1H-NMR (G3.0-C2-EDC, MeOD, ppm): 2,56-2,57 (a); 2,76 (b); 2,37-2,39 (c); 2,82 (d); 3,24-3,29 (e) và 1,92 (j). (phụ lục 9). Phổ 1H-NMR (G3.0-C6-EDC, MeOD, ppm): 2,59 (a); 2,78 (b); 2,38-2,47 (c); 3,06 (d); 3,25-3,43 (e) và 0,81 (j). (phụ lục 10). 61 Phổ 1H-NMR (G3.0-C10-EDC, MeOD, ppm): 2,63 (a); 2,83 (b); 2,45 (c); 3,06 (d); 3,31-3,45 (e) và 0,86 (j). (phụ lục 11). Phổ 1H-NMR (G3.0-C14-EDC, MeOD, ppm): 2,53 (a); 2,73 (b); 2,34-2,41 (c); 2,84-2,89 (d); 3,21-3,32 (e) và 0,78 (j). (phụ lục 12). Dựa vào độ dịch chuyển các tín hiệu proton trên phổ 1H-NMR, chúng tôi xác định đƣợc độ chuyển hóa, số nhóm chuyển hóa, khối lƣợng phân tử trên cơ sở phổ 1H- NMR d. Biến tính dendrimer PAMAM G3.0 với alcohol Biến tính dendrimer PAMAM G3.0 bằng alcohol mạch thẳng: với etanol (ký hiệu sản phẩm: G3.0-C2-NPC, H = 68 ), hexanol (ký hiệu sản phẩm: G3.0-C6-NPC, H = 73 ), octanol (ký hiệu sản phẩm: G3.0-C8-NPC, H = 78 ), dodecanol (ký hiệu sản phẩm: G3.0-C12-NPC, H = 79%) theo quy trình phản ứng của Tran Ngoc Quyen [94] và Ly Tu Uyên [47]. Phản ứng biến tính đƣợc thực hiện trong hai bƣớc sau: Bước 1: Hòa tan 0,645g NPC (3,2mmol) trong 2ml CH2Cl2, sau đó cho từ từ từng giọt alcohol (1,6mmol; etanol, hexanol, octanol, dodecanol). Hỗn hợp đƣợc khuấy đều liên tục 6 giờ trong môi trƣờng khí nitơ ở nhiệt độ 40oC, rồi cho thêm 0,029ml nƣớc cất (1,6mmol) để phản ứng với lƣợng NPC dƣ trong thời gian 1giờ. Bước 2: Cho từ từ hỗn hợp phản ứng ở trên vào 0,695g dendrimer PAMAM G3.0 (0,1mmol) hòa tan trong 2ml DMF. Hỗn hợp phản ứng đƣợc khuấy đều liên tục ở nhiệt độ phòng trong 12 giờ. Sau khi kết thúc phản ứng, tiến hành thẩm tách bằng nƣớc cất (4 lần) và sau đó bằng MeOH (4 lần) trong 48 giờ với màng thẩm tách MWCO: 3.500- 5.000D, loại MeOH thu đƣợc sản phẩm là dẫn xuất dendrimer PAMAM G3.0-alcohol (G3.0-C2-NPC, G3.0-C6-NPC, G3.0-C8-NPC, G3.0-C12-NPC) có màu vàng nhạt, dạng dẻo (sơ đồ 2.16). 62 Sơ đồ 2.16: Quy trình biến tính dendrimer PAMAM G3.0 với alcohol Sử dụng phƣơng pháp phân tích 1H-NMR xác định thành phần cấu trúc của dẫn xuất tổng hợp đƣợc Phổ 1H-NMR dẫn xuất dendrimer PAMAM G3.0 với tác nhân alcohol (500 MHz, MeOD, δppm) xuất hiện tín hiệu proton của các peak đặc trƣng của hợp chất: - CH2CH2N< (a, 30 nhóm); -CH2CH2CO- (b, 60 nhóm); -CH2CH2CONH- (c, 60 nhóm); -CH2CH2NH2 (d, 32-z nhóm); -CONHCH2CH2N- (e, 60+z nhóm); - NHCOOCH2- (f, z nhóm) và -CH3 (j, z nhóm) (hình 3.23). Phổ 1H-NMR (G3.0-C2-NPC, MeOD, ppm): 2,54 (a); 2,73 (b); 2,34 (c); 2,95 (d); 3,15-3,35 (e); 3,98 (f) và 1,13 (j). (phụ lục 13). Phổ 1H-NMR (G3.0-C6-NPC, MeOD, ppm): 2,59 (a); 2,79 (b); 2,37-2,42 (c); 3.07 (d); 3,16-3,43 (e); 3,90 (f) và 0,77 (j). (phụ lục 14). Phổ 1H-NMR (G3.0-C8-NPC, MeOD, ppm): 2,56 (a); 2,75 (b); 2,34-2,39 (c); 3.03 (d); 3,15-3,40 (e); 3,90-3.95 (f) và 0,77 (j). (phụ lục 15). 63 Phổ 1H-NMR (G3.0-C12-NPC, MeOD, ppm): 2,52 (a); 2,62 (b); 2,33 (c); 2,72 (d); 3,21-3,26 (e); 3,89 (f) và 0,78 (j). (phụ lục 16). Thí nghiệm đƣợc thực hiện khảo sát với thời gian phản ứng 12 giờ, 24 giờ, 36 giờ, 48 giờ, mỗi khảo sát đƣợc lặp lại 3 lần, chọn ngẫu nhiên một mẫu cho hiệu suất cao nhất để đo phổ 1H-NMR Dựa vào độ dịch chuyển các tín hiệu proton trên phổ 1H-NMR, chúng tôi xác định đƣợc độ chuyển hóa, số nhóm chuyển hóa, khối lƣợng phân tử trên cơ sở phổ 1H- NMR e. Biến tính dendrimer PAMAM G2.5 với alkylamine  Khảo sát nhiệt độ Khảo sát biến tính dendrimer PAMAM G2.5 với dodecylamine theo nhiệt độ phản ứng (nhiệt độ phòng, 60oC và 80oC): nhiệt độ phòng (ký hiệu sản phẩm: G2.5- C12-p oC, H=65 ), nhiệt độ 60oC (ký hiệu sản phẩm: G2.5-C12-60o, H=68 C), nhiệt độ 80oC (ký hiệu sản phẩm: G2.5-C12-80oC, H=68 ). Quy trình phản ứng đơn giản, đƣợc thực hiện nhƣ sau: 0,368ml dodecylamine (1,6mmol) cho từ từ vào 0,605g dendrimer PAMAM G2.5 (0,1mmol) đƣợc hòa tan trong 2ml MeOH. Hỗn hợp phản ứng đƣợc khuấy đều liên tục trong 24 giờ và khảo sát theo điều kiện nhiệt độ (nhiệt độ phòng, 60oC và 80 o C). Sau khi kết thúc phản ứng, tiến hành thẩm tách bằng nƣớc cất (4 lần) và sau đó bằng MeOH (4 lần) trong 48 giờ với màng thẩm tách MWCO: 3.500-5.000D, loại MeOH thu đƣợc sản phẩm là dẫn xuất dendrimer PAMAM G2.5-amine (G2.5-C12- p o C, G2.5-C12-60 oC , G2.5-C12-80 o C) có màu vàng nhạt, dạng dẻo. Nhiệt độ khảo sát phản ứng này cho kết quả chuyển hóa ổn định là 80oC (sơ đồ 2.17). 64 Sơ đồ 2.17: Quy trình biến tính dendrimer PAMAM G2.5 với amine Sử dụng phƣơng pháp phân tích 1H-NMR xác định thành phần cấu trúc của dẫn xuất tổng hợp đƣợc. Phổ 1H-NMR dẫn xuất dendrimer PAMAM G2.5 với tác nhân alkylamine (500 MHz, MeOD, δppm) với tín hiệu proton của các peak đặc trƣng của hợp chất: - CH2CH2N< (a, 30 nhóm); -CH2CH2CO- (b, 60 nhóm); -CH2CH2CONH- (c, 28+z nhóm); -CONHCH2CH2N- (e, 28+z nhóm); -CH2CH2COOCH3 (g, 32-z nhóm) - COOCH3 (h, 32-z nhóm) và -CH3 (j, z nhóm) (hình 3.26). Phổ 1H-NMR (G2.5-C12-poC, MeOD, ppm): 2,54-2,59 (a); 2,75-2,81 (b); 2,39- 2,38 (c); 3,24-3,34 (e); 2,44-2,47 (g); 3,66-3,67 (h) và 0,89 (j). (phụ lục 17). Phổ 1H-NMR (G2.5-C12-60o, MeOD, ppm): 2,56-2,62 (a); 2,78-2,83 (b); 2,40 (c); 3,26-3,36 (e); 2,47-2,49 (g); 3,68 (h) và 0,92 (j). (phụ lục 18). Phổ 1H-NMR (G2.5-C12-80o, G2.5-C12, MeOD, ppm): 2,56-2,62 (a); 2,74-2,82 (b); 2,34-2,40 (c); 3,16-3,36 (e); 2,47-2,51 (g); 3,68 (h) và 0,92 (j). (phụ lục 19). 65 Dựa vào độ dịch chuyển các tín hiệu proton trên phổ 1H-NMR, chúng tôi xác định đƣợc độ chuyển hóa, số nhóm chuyển hóa, khối lƣợng phân tử trên cơ sở phổ 1H- NMR.  Biến tính dendrimer PAMAM G2.5 với alkylamine khác (butylamine, octylamine và decylamine) Biến tính dendrimer PAMAM G2.5 với các alkylamine khác theo điều kiện nhiệt độ phản ứng 80oC với: butylamine (ký hiệu sản phẩm: G2.5-C4, H=60%), octylamine (ký hiệu sản phẩm: G2.5-C8, H=80%), decylamine (ký hiệu sản phẩm: G2.5-C10, H=76%). Quy trình phản ứng tƣơng tự nhƣ các phản ứng biến tính sản phẩm G2.5- C12. Sản phẩm thu đƣợc có màu vàng, dạng dẻo. Sử dụng phƣơng pháp phân tích 1H-NMR xác định thành phần cấu trúc của dẫn xuất tổng hợp đƣợc. Phổ 1H-NMR (G2.5-C4, MeOD, ppm): 2,63 (a); 2,78-2,83 (b); 2,47-2,49 (c); 3,26-3,36 (e); 2,51-2,59 (g); 3,69 (h) và 0,92 (j). (phụ lục 20). Phổ 1H-NMR (G2.5-C8, MeOD, ppm): 2,53-2,63 (a); 2,77-2,83 (b); 2,40 (c); 3,18-3,33 (e); 2,47-2,49 (g); 3,68-3,71 (h) và 0,92 (j). (phụ lục 21). Phổ 1H-NMR (G2.5-C10, MeOD, ppm): 2,541-2,59 (a); 2,46-2,47 (b); 2,37 (c); 3,18-3,33 (e); 2,47-2,49 (g); 3,68-3,73 (h) và 0,90 (j). (phụ lục 22). Dựa vào độ dịch chuyển các tín hiệu proton trên phổ 1H-NMR, chúng tôi xác định đƣợc độ chuyển hóa, số nhóm chuyển hóa, khối lƣợng phân tử trên cơ sở phổ 1H- NMR. 2.2.3.3 Biến tính dendrimer PAMAM G3.0 với tác nhân hướng đích - acid folic a. Biến tính dendrimer PAMAM G3.0 với acid folic (ký hiệu sản phẩm: G3.0-FA) Phản ứng biến tính đƣợc thực hiện theo quy trình của Quintana [74] và James R. Baker [75]. 0,4mmol FA đã đƣợc hòa tan hoàn toàn trong 10ml DMSO và thêm vào 0,8mmol EDC, khuấy đều trong thời gian 10 phút. Hỗn hợp này sau đó đã đƣợc thêm từng giọt vào dung dịch của 0,1mmol dendrimer PAMAM G3.0 trong 10ml dung dịch 66 DMSO. Hỗn hợp dung dịch đƣợc khuấy trong 24 giờ ở nhiệt độ phòng. Dung dịch sau phản ứng đƣợc thẩm tách bằng nƣớc cất (4 lần) và sau đó bằng MeOH (4 lần) trong 48 giờ với màng MWCO: 3.500-5.000D, loại MeOH bằng cô quay trong chân không thu đƣợc sản phẩm. Sản phẩm G3.0-FA thu đƣợc có màu vàng cam, dạng dẻo (H=81 ) (sơ đồ 2.18). Sơ đồ 2.18: Quy trình biến tính dendrimer PAMAM G3.0 với FA Sử dụng phƣơng pháp phân tích 1H-NMR xác định thành phần cấu trúc của dẫn xuất tổng hợp đƣợc (hình 3. 29, bảng 3.12, phụ lục 23). Phổ 1H-NMR (G3.0-FA, MeOD, ppm): 2,52 (a); 2,73-2,79 (b); 2,19-2,34 (c, i, s); 3,08-3,22 (e); 2,62 (d); 8,54 (k); 7,62-7,63 (m); 4,66 (p); 4,50 (q) và 6,73-6,75 (r). (hình 3. 29, bảng 3.12, phụ lục 23). Dựa vào độ dịch chuyển các tín hiệu proton trên phổ 1H-NMR, chúng tôi xác định đƣợc độ chuyển hóa, số nhóm chuyển hóa, khối lƣợng phân tử trên cơ sở phổ 1H- NMR. b. Biến tính dendrimer PAMAM G3.0 với hexanoyl chloride và tác nhân hƣớng đích - acid folic (ký hiệu sản phẩm: G3.0-C6-FA) 67 0,4mmol FA đã đƣợc hòa tan hoàn toàn trong 10ml DMSO và thêm vào 0,8mmol EDC, khuấy đều trong thời gian 10 phút. Hỗn hợp này sau đó đã đƣợc thêm từng giọt vào dung dịch của 0,1mmol dendrimer PAMAM G3.0 và 1,6mmol hecxanoyl chloride trong 10ml dung dịch DMSO. Hỗn hợp dung dịch đƣợc khuấy trong 24 giờ ở nhiệt độ phòng. Dung dịch sau phản ứng đƣợc thẩm tách bằng nƣớc cất (4 lần) và sau đó bằng MeOH (4 lần) trong 48 giờ với màng MWCO: 3.500-5.000D, loại MeOH bằng cô quay trong chân không thu đƣợc sản phẩm. Sản phẩm dendrimer PAMAM G3.0-C6- FA có màu vàng sậm, dạng dẻo (H=72 ). Phản ứng biến tính đƣợc thực hiện theo quy trình của Quintana [74] và James R. Baker [75] (sơ đồ 2.19). Sơ đồ 2.19: Quy trình biến tính dendrimer PAMAM G3.0 với hecxanoyl chloride và FA Sử dụng phƣơng pháp phân tích 1H-NMR xác định thành phần cấu trúc của dẫn xuất tổng hợp đƣợc (hình 3.