Tóm tắt Luận án Nghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố đến quá trình ra hoa của cây hoa mõm chó (torenia fournieri l.) nuôi cấy in vitro

i trường bổ sung 50 g/l sucrose kết hợp 1,0 mg/l IBA giúp các bộ phận hoa phát triển hoàn chỉnh. 1.3.2. Một số nghiên cứu ngoài nước Hiện nay, đã có nhiều nghiên cứu về sự ra hoa in vitro trên các loài lan thuộc chi Dendrobium như ở loài D. madame, D. chao-praya-smile và D. candididum. Ở các loài lan khác như C. goeringii và C. hybridium, sự ra hoa trong ống nghiệm cũng đã được ghi nhận trong nghiên cứu của Li-Ming và Ji-Liang (2006). Cảm ứng ra hoa in vitro bằng cách sử dụng cytokinin và gibberellin đã được nghiên cứu ở cây Pharbitis nil, cây Passiflora suberosa và cây Lilium longiflorum. Một số nỗ lực thành công trong việc tạo ra hoa hồng in vitro đã được báo cáo. Năm 2013, Zeng và đồng tác giả đã nghiên cứu thành công sự ra hoa in vitro ở cây hoa hồng mini (Rosa hybrida cv. Fairy Dance). Sự ra hoa trong ống nghiệm cũng đã được nghiên cứu khi nuôi cấy phôi soma ở một số cây như cây B. vulgaris và cây D. giganteus. John và Nadgauda (1997) đã tạo được hoa in vitro ở cây Bambusa vulgaris var. vittata và cây B. arundinacea. Một số loài tre khác đã được dùng làm nguồn vật liệu để nghiên cứu ra hoa như cây B. edulis, cây D. hookeri và cây D. latiflorus. 6 Những nỗ lực nghiên cứu sự ra hoa in vitro thành công đã được thực hiện trên một số cây dược liệu. Seidlova và đồng tác giả (1981) nghiên cứu ảnh hưởng của ABA đối với sự ra hoa trong cây ngày ngắn Chenopodium rubrum. Ở cây nhân sâm (Panax ginseng), Tang (2000) đã nghiên cứu ra sự ra hoa trong ống nghiệm từ nuôi cấy phôi. Những thay đổi của hàm lượng chất điều hòa sinh trưởng nội sinh trong quá trình phân biệt chồi hoa và chồi sinh dưỡng trong nuôi cấy lớp mỏng tế bào của cây Cichorium intybus đã được nghiên cứu bởi Ying-zhang và Bi-wen (1996). Sự ra hoa trong ống nghiệm đã được nghiên cứu ở các cây thuốc có giá trị như cây Solanum nigrum, cây Centaurium pulchellum và cây Chamomilla recutita, Vadawale và đồng tác giả (2006) đã nghiên cứu thành công sự ra hoa ở cây ngũ chảo (Vitex negundo) in vitro. CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Vật liệu Cây hoa T. fournieri, giống hoa màu tím trắng được sử dụng làm nguồn vật liệu ban đầu. Lá của cây hoa T. fournieri ex vitro được khử trùng sơ bộ bề mặt với xà phòng loãng và đặt dưới vòi nước chảy trong 30 phút. Chuyển mẫu vào trong tủ cấy, lắc mẫu bằng dung dịch HgCl2 0,1% với 1-2 giọt tween 20 trong thời gian 5 phút. Sau đó, mẫu được rửa lại bằng nước cất đã khử trùng 3 lần rồi cấy vào môi trường Murashige và Skoog (MS) bổ sung 30 g/l sucrose, 8 g/l agar và 0,5 mg/l BA để tái sinh chồi. Sau đó, các mẫu chồi này được cấy chuyền sang môi trường MS để tạo mẫu chồi khỏe mạnh và đồng nhất, những chồi đạt chiều cao 2,0 cm được sử dụng làm nguồn nguyên liệu cho các thí nghiệm. 7 2.2. Phương pháp bố trí thí nghiệm 2.2.1. Nội dung 1: Nghiên cứu vai trò của một số yếu tố đến sự ra hoa của cây T. fournieri in vitro 2.2.1.1. Thí nghiệm 1.1: Nghiên cứu vai trò của ánh sáng đến sự ra hoa của cây T. fournieri in vitro 2.2.1.2. Thí nghiệm 1.2: Nghiên cứu vai trò của đường đến sự ra hoa của cây T. fournieri in vitro 2.2.1.3. Thí nghiệm 1.3: Nghiên cứu vai trò của chất điều hoà sinh trưởng thực vật ngoại sinh đến sự ra hoa của cây T. fournieri in vitro 2.2.1.4. Thí nghiệm 1.4: Nghiên cứu vai trò của môi trường khoáng đến sự ra hoa của cây T. fournieri in vitro 2.2.1.5. Thí nghiệm 1.5: Nghiên cứu vai trò của acid amin (L-tyrosine, arginine và proline) đến sự ra hoa của cây T. fournieri in vitro 2.2.1.6. Thí nghiệm 1.6: Nghiên cứu vai trò của polyamine (spermidine, spermine, putrescine) đến sự ra hoa của cây T. fournieri in vitro 2.2.2. Nội dung 2: Quan sát hình thái, cấu trúc mô phân sinh và hoạt động biến dưỡng của cây T. fournieri in vitro trong quá trình ra hoa. 2.3. Điều kiện nuôi cấy Các thí nghiệm nuôi cấy được đặt trong điều kiện chiếu sáng với thời gian chiếu sáng là 10 giờ/ngày, cường độ ánh sáng là 45 ± 2 µmol m-2 s-1, nhiệt độ: 25 ± 2°C, độ ẩm trung bình: 60 ± 5%. 2.4. Phương pháp nghiên cứu • Phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật • Phương pháp giải phẫu hình thái mô phân sinh • Phương pháp đo hàm lượng chlorophyll ở thực vật • Phương pháp đo hàm lượng đường tổng số ở thực vật • Phương pháp đo cường độ quang hợp và hô hấp ở thực vật • Phương pháp đo diện tích lá 8 • Phương pháp thu thập, thống kê và xử lý số liệu CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1. Nội dung 1. Ảnh hưởng của một số yếu tố lên sự ra hoa của cây T. fournieri in vitro 3.1.1. Vai trò của ánh sáng đến sự ra hoa ở cây T. fournieri in vitro Một trong những con đường quan trọng trong sự cảm ứng ra hoa ở thực vật là con đường ánh sáng. Chất lượng, cường độ và thời gian chiếu sáng của ánh sáng ảnh hưởng trực tiếp đến sự sinh trưởng và phát triển thực vật. Nghiên cứu của Dương Tấn Nhựt và đồng tác giả (2013) trên cây T. fournieri cho thấy cây T. fournieri khi được nuôi cấy trong điều kiện chiếu sáng với cường độ là 45 µmol m-2 s-1 và thời gian chiếu sáng là 10 giờ/ngày, sau 60 ngày nuôi cấy, cây có thân to cứng cáp, lá xanh và tỷ lệ ra hoa cao (70,06%). Kế thừa những nghiên cứu trước đó, trong nghiên cứu này chất lượng hay bước sóng của ánh sáng được khảo sát nhằm xác định vai trò của bước sóng ánh sáng lên sự ra hoa của cây T. fournieri in vitro. Chất lượng ánh sáng khác nhau ảnh hưởng khác nhau đến sự ra hoa của cây T. fournieri in vitro. Sau 40 ngày nuôi cấy, kết quả ở bảng 3.1 cho thấy có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê giữa các nghiệm thức sử dụng đèn LED và nghiệm thức sử dụng đèn huỳnh quang. Tỷ lệ ra hoa của cây T. fournieri in vitro cao nhất ở 50% LED đỏ kết hợp với 50% LED xanh và tỷ lệ ra hoa là 19,59% với số nụ hoa/chồi là 0,33. Khi tăng tỷ lệ ánh sáng LED đỏ lên 60% thì tỷ lệ ra hoa giảm còn 13,34%. Khi tỷ lệ ánh sáng LED đỏ vượt qua tỷ lệ này thì sự ra hoa bắt đầu giảm mạnh. Điều này phù hợp với nghiên cứu của Dewir và đồng tác giả (2006) trên cây Euphorbia millii, sự ra hoa trong ống nghiệm giảm khi tỷ lệ đèn LED đỏ tăng. 9 Bảng 3.1. Một số chỉ tiêu sinh trưởng và phát triển của cây T. fournieri in vitro ở các điều kiện chiếu sáng khác nhau sau 40 ngày nuôi cấy. Nghiệm thức Tỷ lệ chồi ra hoa (%) Số nụ hoa/chồi Chiều cao chồi (cm) Diện tích lá (cm2) HQ 0,00d 0,00 6,60a 1,33a Xanh 0,00d 0,00 5,00b 0,94bc Đỏ 0,00d 0,00 5,90ab 0,72c 5Đ:5X 19,59a 0,33 6,66a 1,31a 6Đ:4X 13,34b 0,13 6,32a 0,90bc 7Đ:3X 0,59c 0,06 6,33a 0,79c 8Đ:2X 0,61c 0,06 5,77ab 0,76c 9Đ:1X 0,00d 0,00 5,84ab 0,69c P * ns * * Trong cùng một cột, những số có chữ cái theo sau khác nhau thì có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê ở mức 5% (*); ns: sự khác biệt không có ý nghĩa thống kê; Đỏ: 100% LED đỏ; Xanh: 100% LED xanh; 9Đ:1X: 90% LED đỏ + 10% LED xanh; 8Đ:2X: 80% LED đỏ + 20% LED xanh; 7Đ:3X: 70% LED đỏ + 30% LED xanh; 5Đ:5X: 50% LED đỏ + 50% LED xanh; HQ: Ánh sáng đèn huỳnh quang (Philip, 36W, 1,2 m). Kết quả nghiên cứu của Heo và đồng tác giả (2006) cũng cho thấy tỷ lệ ra hoa cùng với số lượng nụ hoa của cây nho nhiều hơn khi sử dụng đèn LED đỏ kết hợp với đèn LED xanh và cao hơn so với các điều kiện chiếu sáng chỉ sử dụng đèn LED ở một loại bước sóng đơn lẻ (xanh hoặc đỏ). Kết quả của nghiên cứu trên cây T. fournieri in vitro cũng tương tự với nghiên cứu của Heo và đồng tác giả (2006). Các chồi được đặt dưới điều kiện chiếu sáng là 100% LED đỏ hay 100% LED xanh thì hầu như không có sự cảm ứng ra hoa. Sự cảm ứng ra hoa ở cây T. fournieri chỉ xảy ra khi nhận được tín hiệu thích hợp của ánh sáng LED xanh kết hợp với ánh sáng LED đỏ. Điều này có thể được giải thích rằng ánh sáng LED đỏ kích thích sự hoạt động của phytochrome, ánh sáng LED xanh kích thích cho sự hoạt động của cryptochrome; sự kết hợp ánh sáng LED xanh và ánh sáng LED đỏ tạo một tỷ lệ thích hợp để kích thích sự biểu hiện của gene liên quan đến cảm ứng ra hoa như gene flc, 10 một trong những loại gene mã hóa protein MADs-box. Từ đó, sự hoạt động của flc sẽ thúc đẩy chuỗi hoạt động ra hoa sau này bao gồm kích thích sự hoạt động của tổ hợp gene xác định thời điểm ra hoa như ft, soc1 và lfy và kích thích sự hoạt động của mô phân sinh phác thể hoa, sau cùng là dẫn đến sự ra hoa. 3.1.2. Vai trò của loại và nồng độ đường đến sự ra hoa của cây T. fournieri in vitro Khi so sánh kết quả tác động của các loại đường với nồng độ khác nhau lên tỷ lệ ra hoa, kết quả cho thấy các cây T. fournieri được nuôi cấy trên môi trường MS bổ sung fructose với nồng độ 50 g/l cho tỷ lệ ra hoa tốt nhất (53,14%), kế tiếp là glucose ở nồng độ 50 g/l (tỷ lệ ra hoa là 51,48%) (Hình 3.1). Tuy nhiên, trong thí nghiệm sử dụng fructose, số lượng cây bị vàng, hóa nâu và chết, tỷ lệ mẫu cây chết tương đối cao hơn so với thí nghiệm ở các loại đường khác. Vì vậy, glucose với nồng độ 50 g/l phù hợp nhất cho sự sinh trưởng và phát triển, đặc biệt là cảm ứng ra hoa ở cây T. fournieri in vitro. Đối với cây T. fournieri in vitro, 2 loại đường đơn như fructose và glucose tác động lên sự ra hoa hiệu quả hơn 2 loại đường đôi như sucorse và maltose. Kết quả của nghiên cứu này cũng tương đồng với nghiên cứu của Taylor và đồng tác giả (2007). Nghiên cứu của Taylor và đồng tác giả (2007) cũng đã chứng minh tỷ lệ ra hoa của cây K. leucocephala tăng lên khi các chồi được nuôi trên môi trường bổ sung các loại đường đơn, điều này được giải thích là do sự tác động của loại đường này đối với sự phân chia tế bào tại mô phân sinh chồi đỉnh, vấn đề này rất quan trọng đối với sự cảm ứng ra hoa ở thực vật. Glucose và fructose không phải lúc nào cũng kích thích sự cảm ứng hình thành hoa, nên hiệu ứng này có thể không phổ biến và có thể phụ thuộc vào loài 11 thực vật, bản chất của mẫu cấy và khả năng của mẫu cấy sử dụng các nguồn carbon khác nhau. Hình 3.1. Ảnh hưởng của loại và nồng độ đường lên sự ra hoa của cây T. fournieri in vitro sau 40 ngày nuôi cấy. Việc phân biệt giữa cảm ứng ra hoa và phát triển hoa liên quan đến hoạt động của đường là một vấn đề cần xem xét. Trong khi một loại đường cụ thể nào đó có thể không kích thích cảm ứng hoa, nhưng có thể có tác động tích cực đến sự phát triển của hoa như được ghi nhận ở cây T. fournieri. Trong nghiên cứu này, mặc dù sucrose không ảnh hưởng đáng kể đến sự cảm ứng hình thành hoa, nhưng trong nghiên cứu trước đó trên cây T. fournieri, khi bổ sung sucrose với nồng độ 60 g/l vào môi Tỷ lệ c hồ i r a ho a (% ) 12 trường cảm ứng ra hoa (môi trường ¼MS) thì tỷ lệ ra hoa cũng như số nụ hoa cao hơn so với các nghiệm thức đối chứng (nghiệm thức sử dụng môi trường cảm ứng). Điều này cũng cho thấy, sucrose không có vai trò trong sự cảm ứng ra hoa mà chỉ có vai trò thúc đẩy sự phát triển hoa T. fournieri in vitro. 3.1.3. Vai trò của chất điều hoà sinh trưởng thực vật trong sự ra hoa của cây T. fournieri in vitro Ảnh hưởng của GA3 kết hợp với ABA lên sự cảm ứng ra hoa ở cây T. fournieri in vitro Tanimoto và đồng tác giả (1985) đã cho thấy khi nuôi cấy chồi T. fournieri trên môi trường không bổ sung CĐHST thực vật, sự hình thành hoa bị ảnh hưởng bởi các nhân tố nội sinh bên trong mẫu, trong đó có hàm lượng ABA nội sinh. Do đó, khi bổ sung 0,1 mg/l ABA vào môi trường nuôi cấy đã kích thích sự hình thành hoa ở các mẫu chồi cây T. fournieri in vitro. Kết quả này phù hợp với kết quả trong thí nghiệm này, khi sử dụng ABA ở các nồng độ khác nhau đã cảm ứng sự hình thành hoa. Ở nồng độ 1,5 mg/l ABA cho tỷ lệ hình thành hoa cao hơn so với các nghiệm thức còn lại (các nghiệm thức kết hợp ABA với GA3) và cao hơn so với nghiệm thức đối chứng, tỷ lệ ra hoa ở nghiệm thức này là 80% so với 40% ở nghiệm thức đối chứng (Bảng 3.2). Điều này cho thấy, đối với cây T. fournieri, ABA đóng vai trò quan trong trong sự cảm ứng hình thành hoa. Một số nghiên cứu gần đây cho thấy tác động của ABA đối với sự cảm ứng ra hoa có thể được giải thích là do sự biểu hiện của gene abi3, abi5 và basic leucine zipper, những gene này đóng vai trò quan trọng trong sự cảm ứng ra hoa bằng cách điều hòa biểu hiện gene flc. Một protein khác cũng tham gia trong sự điều khiển sự ra hoa là HAB1 (HYPERSENSITIVE TO ABA 1), là yếu tố ức chế của sự đáp ứng các tín 13 hiệu ABA. Biểu hiện của protein HAB1 được tìm thấy trong khi cảm ứng sự ra hoa ở cây A. thaliana. Protein HAB1 tương tác với phức hợp protein SWI/SNF. Nhóm tác giả cho rằng sự tương tác của protein HAB1 và phức hợp SWI/SNF (phức hợp chromatin) trong sự phiên mã để đáp ứng lại các tín hiệu ABA cần thiết cho sự điều hòa các gene liên quan đến sự đáp ứng các tín hiệu ABA. Có rất nhiều gene miRNA cũng được ghi nhận có liên quan đến sự ra hoa theo con đường ABA. Gene miR159 liên quan đến sự phát triển hoa, điều khiển sự biểu hiện gene myb101, myb33 cũng được điều hòa bởi ABA. Gene miR160 điều khiển sự phát sinh hình thái hoa cũng được điều khiển bởi ABA. Mặt khác, sự biểu hiện quá mức của miR172c làm giảm sự mất nước của cây và thúc đẩy ra hoa sớm bằng các điểu khiển sự biểu hiện gene ft và lfy trong điều kiện ngày dài. Gene miR172 được cảm ứng bởi ABA, liên quan đến sự chịu hạn làm tăng độ nhạy đối với ABA, đẩy nhanh những đáp ứng với sự khô hạn. Trong nghiên cứu này, ở các thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của GA3 riêng lẻ hay GA3 kết hợp với ABA ở các nồng độ khác nhau lên sự ra hoa của cây T. fournieri in vitro, sau 40 ngày nuôi cấy, kết quả thu được cho thấy tỷ lệ ra hoa ở các nghiệm thức này thấp hơn so với nghiệm thức chỉ sử dụng ABA riêng lẻ và nghiệm thức đối chứng. Điều này cho thấy GA3 ảnh hưởng không đáng kể đến sự cảm ứng ra hoa ở loài cây này. Vai trò của GA3 lên sự cảm ứng ra hoa ở những cây không phụ thuộc vào quang kỳ vẫn chưa được chứng minh cụ thể, có thể GA3 là nhân tố thúc đẩy sự ra hoa ở loài cây này nhưng không ảnh hưởng lên sự ra hoa ở một loài cây khác. 14 Bảng 3.2. Ảnh hưởng của GA3 kết hợp với ABA lên sự ra hoa của cây T. fournieri in vitro sau 40 ngày nuôi cấy CĐHSTTV Tỷ lệ chồi ra hoa (%) Số nụ hoa /mẫu Chiều cao chồi (cm) GA3 (mg/l) ABA (mg/l) 0,0 0,0 40,00bc 5,92bcd 0,63bc 0,5 40,00bc 6,37b 0,63bc 1,0 46,67ab 5,58bcd 0,73ab 1,5 80,00a 8,08a 1,33a 2,0 20,00bcd 5,45bcd 0,30bc 0,5 0,0 13,33bcd 5,60bcd 0,20bc 0,5 26,67bcd 5,08bcd 0,37bc 1,0 20,00bcd 6,41b 0,27bc 1,5 23,33bcd 6,19bc 0,47bc 2,0 0,00d 5,43bcd 0,00c 1,0 0,0 0,00d 6,12bcd 0,00c 0,5 0,00d 6,37b 0,00c 1,0 0,00d 5,56bcd 0,00c 1,5 3,33d 5,73bcd 0,07bc 2,0 10,00cd 5,98bcd 0,13bc 1,5 0,0 6,67cd 5,91bcd 0,10bc 0,5 6,67cd 5,27bcd 0,13bc 1,0 0,00d 4,63cd 0,00c 1,5 3,33d 4,59d 0,03c 2,0 10,00cd 4,65cd 0,17bc 2,0 0,0 3,33cd 5,32bcd 0,03c 0,5 10,00cd 5,59bcd 0,10bc 1,0 0,00d 5,50bcd 0,00c 1,5 0,00d 5,43bcd 0,00c 2,0 3,33d 5,11bcd 0,03c PGA * * * PABA * * * PGA*ABA * * * Trong cùng một cột, những số có chữ cái theo sau khác nhau thì có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê ở mức 5% (*). 15 Ảnh hưởng của GA3 kết hợp với BA lên sự cảm ứng ra hoa ở cây T. fournieri in vitro Đối với cây T. fournieri, kết quả cho thấy khi kết hợp BA với GA3, các chồi T. fournieri in vitro không có sự hình thành hoa, chỉ hình thành chồi mới với chiều cao chồi trung bình khoảng 3,0 cm, đốt thân dài và có hiện tượng thuỷ tinh thể. Các kết quả tương tự thu được ở khi nghiên cứu trên cây Tylophora indica. GA3 đã được báo cáo là thích hợp cho tái sinh chồi in vitro, thúc đẩy sự tăng trưởng, sản xuất sinh khối và kéo dài mạch xylem. Ảnh hưởng của BA kết hợp với NAA lên sự cảm ứng ra hoa ở cây T. fournieri in vitro Tương tự như nghiệm thức GA3 kết hợp với BA, sau 40 ngày nuôi cấy trên môi trường MS bổ sung BA và NAA, kết quả cũng cho thấy 2 loại chất điều hòa sinh trường này không ảnh hưởng đến sự ra hoa ở cây T. fournieri in vitro. Trên môi trường bổ sung BA ở nồng độ thấp (0,5 mg/l BA), chiều cao chồi trung bình cao hơn so với các mẫu cấy trên môi trường bổ sung BA nồng độ cao và có sự hình thành rễ ở mẫu cấy. 3.1.4. Vai trò của môi trường khoáng đến sự ra hoa của cây T. fournieri in vitro Nhằm đánh giá ảnh hưởng của môi trường khoáng đối với sự sinh trưởng và hình thành hoa của cây T. fournieri in vitro, thí nghiệm được thực hiện với môi trường MS và các cải biến của môi trường này đến sự hình thành hoa cây T. fournieri in vitro được thực hiện. Sau 40 ngày nuôi cấy, tỷ lệ hình thành hoa trên môi trường ¼MS là 60,00% cao hơn so với đối chứng và các môi trường còn lại. Các thành phần đa lượng trong môi trường ¼MS và ½MS đã bị giảm theo tỷ lệ lần lượt là ½; ¼ và thành phần vi lượng không đổi so với các môi trường MS, sự thay đổi này dẫn đến tỷ lệ C/N trong môi trường 16 đã bị thay đổi. Điều này có thể được giải thích khi các nguyên tố đa lượng, đặc biệt là N, hiện diện với hàm lượng cao đã phần nào ức chế sự chuyển đổi từ pha sinh dưỡng sang pha sinh sản hay là sự hình thành chồi hoa T. fournieri. Trong môi trường nuôi cấy, khi giảm hàm lượng khoáng đa lượng dẫn theo hàm lượng N cũng giảm theo trong khi đó hàm lượng C không đổi, sẽ dẫn đến tỷ lệ C/N cao, chính điều này đã kích thích sự ra hoa, ngược lại khi tỷ lệ C/N thấp, sự phát sinh dinh dưỡng chiếm ưu thế. Theo Tanimoto và Harada (1981), tỷ lệ C/N có vai trò quan trọng trong sự chuyển tiếp ra hoa ở thực vật. Tỷ lệ C/N trong môi trường ¼MS cao hơn so với môi trường MS, cây nuôi cấy trên môi trường có tỷ lệ C/N cao sẽ đi vào trạng thái sinh sản, kết quả này phù hợp với nghiên cứu của Wang và đồng tác giả (2002). Bảng 3.3. Ảnh hưởng của môi trường khoáng lên sự ra hoa của cây T. fournieri in vitro sau 40 ngày nuôi cấy NT Tỷ lệ chồi ra hoa (%) Số nụ hoa/chồi Chiều cao chồi (cm) ½MS 43,33ab 0,47 6,20b MS½ 23,33bc 0,33 6,34b ¼MS 60,0a 0,70 8,70a MS¼ 6,67c 0,07 9,13a MS 16,67bc 0,27 5,25b P * ns * Trong cùng một cột, những số có chữ cái theo sau khác nhau thì có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê ở mức 5% (*); ns: sự khác biệt không có ý nghĩa thống kê. 3.1.5. Vai trò của acid amin (proline, arginine và L-tyrosine) đến sự ra hoa của cây T. fournieri in vitro Trong 3 loại acid amine được khảo sát, kết quả cho thấy sự hình thành hoa thay đổi tùy vào từng loại và nồng độ acid amin được bổ sung vào môi trường nuôi cấy. Đối với cây T. fournieri, arginine ở nồng độ 1,5 mg/l thích hợp nhất cho sự hình thành hoa (Hình 3.2). Vai trò của acid amin đến sự cảm ứng hoa cũng không rõ ràng vì hầu hết các 17 nghiệm thức sử dụng acid amin thì sự cảm ứng ra hoa chỉ xuất hiện ở ngày thứ 80 sau nuôi cấy, so với các yếu tố khác thì sự hình thành hoa đã xảy ra ở ngày thứ 40 sau nuôi cấy. Hình 3.2. Ảnh hưởng của acid amin lên sự ra hoa của cây T. fournieri in vitro sau 80 ngày nuôi cấy. P1.0, P1.5, P2.0, P2.5, P3.0, P3.5, P4.0, P4.5, P5.0: tương ứng với proline ở các nồng độ từ 1,0 đến 5,0 mg/l; A1.0, A1.5, A2.0, A2.5, A3.0, A3.5, A4.0, A4.5, A5.0: tương ứng với arginine ở các nồng độ từ 1.0 đến 5.0 mg/l; T1.0, T1.5, T2.0, T2.5, T3.0, T3.5, T4.0, T4.5, T5.0: tương ứng với L-tyrosine ở các nồng độ từ 1,0 đến 5,0 mg/l. 0 20 40 60 80 MS P1,0 P1,5 P2,0 P2,5 P3,0 P3,5 P4,0 P4,5 P5,0 A1,0 A1,5 A2,0 A2,5 A3,0 A3,5 A4,0 A4,5 A5,0 T1,0 T1,5 T2,0 T2,5 T3,0 T3,5 T4,0 T4,5 T5,0 MS P1,0 P1,5 P2,0 P2,5 P3,0 P3,5 P4,0 P4,5 P5,0 A1,0 A1,5 A2,0 A2,5 A3,0 A3,5 A4,0 A4,5 A5,0 T1,0 T1,5 T2,0 T2,5 T3,0 T3,5 T4,0 T4,5 T5,0 TY LE RA HOA CCC A ci d am in e 18 3.1.6. Vai trò của polyamine (spermidine, spermine, putrescine) đến sự ra hoa của cây T. fournieri in vitro Polyamine (PA) được xem là một nhóm các chất điều hòa sinh trưởng trong thực vật, do đó tác động của PA lên sự cảm ứng ra hoa tùy thuộc vào từng loại thực vật khác nhau, nồng độ và loại PA được khảo sát. Năm loại enzyme sinh tổng hợp quan trọng liên quan đến sinh tổng hợp PA ở thực vật bậc cao hiện đang được nghiên cứu: arginine decarboxylase (ADC), ornithine decarboxylase (ODC), S- adenosylmethionine decarboxylase (SAMDC), Spd synthase (SPDC) và Spm synthase (SPMS). Các chức năng sinh lý quan trọng của PA nội sinh trong cảm ứng hoa và hình thành cơ quan và sơ khởi hoa đã được xác nhận trong nhiều nghiên cứu khác nhau. Triamine Spd, quan trọng nhất trong ba PA nói trên, có liên quan đến nhiều quá trình sinh lý. Trong Polianthes tuberosa, Spd và Cad là những điểm đánh dấu cho sự biệt hóa tạo hoa. Các thí nghiệm trên Cucurbita pepo và Ginkgo biloba cũng đã phát hiện ra rằng Spd chiếm ưu thế trong quá trình biệt hóa tạo hoa. Khi Spd đạt đến một mức độ nhất định sẽ dẫn đến việc thúc đẩy sự biểu hiện của gen ra hoa, do đó kích hoạt sự tổng hợp của một protein đặc biệt và cuối cùng là sự hình thành của sơ khởi hoa. Điều này cũng đã giải thích vai trò quan trọng của Spd ngoại sinh trong sự ra hoa của cây T. fournieri in vitro. Trong nghiên cứu này, các loại polyamine khác nhau ảnh hưởng khác nhau đến sự cảm ứng ra hoa của cây T. fournieri in vitro. Spermidine và spermine thích hợp cho sự cảm ứng ra hoa của cây T. fournieri, tỷ lệ hình thành hoa đạt 43,33% và số nụ hoa/mẫu đạt 0,47 nụ hoa khi nuôi cấy cây T. fournieri trên môi trường bổ sung 40 mg/l spermidine. Tỷ lệ hình thành hoa của cây T. fournieri ở trên môi trường có bổ sung 40 mg/l spermine là 43,33% và số chồi hoa/mẫu đạt 0,80 chồi hoa/mẫu. 19 Hình 3.3. Ảnh hưởng của các polyamine lên sự ra hoa của cây T. fournieri in vitro sau 80 ngày nuôi cấy. SPD1, SPD10, SPD20, SPD30, SPD40: tương ứng với spermidine ở các nồng độ từ 1,0 đến 40 mg/l; SPM1, SPM10, SPM20, SPM30, SPM40: tương ứng với spermine ở các nồng độ từ 1,0 đến 40 mg/l; PUT1, PUT 10, PUT 20, PUT 30, PUT 40: tương ứng với putrescine ở các nồng độ từ 1,0 đến 40 mg/l; MS: nghiệm thức đối chứng sử dụng môi trường MS; CCC: chiều cao chồi Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng các PA ngoại sinh có thể ảnh hưởng đến sự cảm ứng ra hoa ở một số cây như cây Spirodela punctata, thuốc lá và cây Pharbitis nil. PA ngoại sinh đã được chứng minh là có thể đẩy nhanh quá trình biệt hóa tạo hoa và hàm lượng PA cao trong chồi đỉnh có lợi cho việc bắt đầu và duy trì sự biệt hóa tạo nụ hoa trong cây cúc. Ở cây A. thaliana, việc bổ sung PA ngoại sinh đã thúc đẩy đáng kể phản ứng ra hoa của loài cây này. Tuy nhiên, PA cũng gây ức chế sự ra hoa ở loài Lemna aequinoctialis dưới điều kiện cảm ứng quang kỳ. Tùy theo từng loại PA khác nhau mà sự tác động đến quá trình ra hoa ở 0 20 40 60 MS SPD1 SPD10 SPD20 SPD30 SPD40 SPM1 SPM10 SPM20 SPM30 SPM40 PUT1 PUT10 PUT20 PUT30 PUT40 MS SPD1 SPD10 SPD20 SPD30 SPD40 SPM1 SPM10 SPM20 SPM30 SPM40 PUT1 PUT10 PUT20 PUT30 PUT40 TY LE RA HOA CCC Po ly am in e 20 từng loại là khác nhau. Trong nghiên cứu này, Put một loại PA không ảnh hưởng đến sự ra hoa ở cây T. fournieri in vitro. Trong nghiên cứu này, khi so sánh các yếu tố ảnh hưởng đến sự ra hoa khác như ánh sáng, đường chất điều hòa sinh trưởng thực vật hay môi trường khoáng thì yếu tố PA chỉ cảm ứng ra hoa ở ngày thứ 80 sau nuôi cấy, ở ngày thứ 40 sau nuôi cấy hầu hết các nghiệm thức sử dụng polyamine đều không có sự hình thành hoa. Tuy nhiên, khi chồi T. fournieri in vitro được nuôi cấy trên môi trường ¼MS bổ sung spermidine ở nồng độ từ 0,2-0,4 mg/l spermidine thì tỷ lệ ra hoa tăng từ 72,22-77,78% cao hơn so với nghiệm thức đối chứng (61,11%) ở ngày thứ 40 sau nuôi cấy (Hình 3.3). Điều này cho thấy PA không đóng vai trò quan trọng lên sự cảm ứng ra hoa nhưng có vai trò trong việc thúc đẩy sự phát triển hoa. 3.2. Nội dung 2: Sự thay đổi hình thái, cấu trúc của mô phân sinh chồi và hoạt động biến dưỡng trong quá trình ra hoa của cây T. fournieri in vitro 3.2.1. Hình thái hoa và sự thay đổi của mô phân sinh chồi ngọn trong quá trình ra hoa của cây T. fournieri in vitro Trong quá trình ra hoa ở cây T. fournieri in vitro, ở ngày thứ 10, 20 thì hầu hết các cây không có sự xuất hiện nụ hoa, đến ngày thứ 30 thì thấy có sự xuất hiện của nụ hoa, đến ngày thứ 40 thì nụ hoa phát triển lớn hơn, sau đó ở ngày thứ 50 và 60 nụ hoa phát triển to hơn và nở thành hoa hoàn chỉnh. Nụ hoa T. fournieri in vitro ở giai đoạn 40 ngày sau nuôi cấy được cắt dọc để quan sát và nhận thấy hoa có cấu trúc hoàn chỉnh, không có sự khác biệt về kiểu hình so với hoa trồng bên ngoài. Dựa theo mô hình cấu trúc hoa ABC, hoa T. fournieri in vitro phát triển hoàn toàn bình thường, với cấu trúc gồm đài hoa, cánh hoa, nhị và noãn. Hoa T. fournieri in vitro thường hình thành ở đỉnh chồi và các nách lá. 21 Trong nghiên cứu này, một vấn đề được ghi nhận là màu hoa chuyển sang màu tím nhạt hay màu trắng hoàn toàn, có khác biệt so với vật liệu nghiên cứu ban đầu là giống hoa màu tím trắng. Điều này cũng đã được Dương Tấn Nhựt và đồng tác giả (2013) giả