Tóm tắt Luận án Nghiên cứu cải thiện khả năng mang thuốc chống ung thư cisplatin của chất mang nano dendrimer

(-CH2-) (a) : Tổng số proton ở vị trí (e) và (a) tính trong công thức phân tử của PAMAM Dendrimer. MLT : Khối lượng phân tử của Dendrimer tính theo lý thuyết. Kết quả tính toán như sau: Bảng 3.1. Kết quả tính toán KLPT Dendrimer theo 1H-NMR ෍ H(-CH2-) (e) ෍ H(-CH2-) (a) χLT M(LT) χNMR M(NMR) Sai lệch G-0.5 8 (vị trí b) 4 2 404 2,01 405,62 0,40% G0 8 4 2,00 517 1,99 515,02 0,32% G0.5 8 12 0,67 1205 0,67 1205,42 0,06% G1.0 24 12 2,00 1430 1,95 1396,18 2,36% G1.5 24 28 0,86 2808 0,81 2668,19 4,96% G2.0 56 28 2,00 3257 1,95 3181,78 2,30% G2.5 56 60 0,93 6012 0,90 5774,30 3,95% G3.0 120 60 2,00 6910 1,90 6556,70 5,11% G3.5 120 124 0,97 12420 0,92 11809,71 4,91% G4.0 248 124 2,00 14216 1,90 13510,97 4,96% G4.5 248 252 0,98 25237 0,90 23103,55 8,45% Các phân tử PAMAM dendrimer các thế hệ từ G-0.5 đến G4.5 đã được tổng hợp thành công và có cấu trúc tương đối đồng đều và ổn định nên có thể ứng dụng làm các chất mang thuốc. 3.2. Phổ FTIR các sản phẩm phức của PAMAM dendrimer với Cisplatin 3.2.1. Phổ FTIR PAMAM Dendrimer G2.5, G3.5, G4.5 và phức G2.5-CisPt, G3.5-CisPt, G4.5- CisPt Phổ FTIR của PAMAM G2.5, G3.5 có một tín hiệu hấp thu có cường độ mạnh và một tín hiệu có cường độ trung bình yếu tại các vị trí 1731 cm-1, 1045 cm-1 (G2.5); 1736 cm-1, 1646 cm-1 (G3.5) tương ứng với νC=O, νC-O của nhóm chức ester. Một tín hiệu hấp thu có cường độ mạnh, mũi bầu rộng đặc trưng cho dao động của nối –OH tại 3294 cm-1 (G2.5); 3302 cm-1 (G3.5); 3426 cm-1 (G4.5), tín hiệu hấp thu của amide cũng nằm trong vùng này và bị tín hiệu của nối –OH che khuất. Tín hiệu đặc trưng cho dao động bất đối xứng của nhóm –CH2, CH3, tín hiệu đặc trưng cho dao động của nối –CH3 tại 2952 cm-1, 2832 cm-1 (G2.5); 2952 cm-1, 2830 cm-1 (G3.5), và tín hiệu dao động biến dạng ngoài mặt phẳng của nhóm CH3 tại 1360 cm-1 (G2.5), 1359 cm-1 (G3.5), 1399 cm-1 (G4.5). Các mũi với các tín hiệu dao động đặc trưng phù hợp với các nhóm có trong công thức của sản phẩm PAMAM dendrimer G2.5, 3.5, 4.5. So với PAMAM G2.5, 3.5, 4.5 phổ FTIR của các phức tương ứng PAMAM G2.5-Cisplatin, G3.5- Cisplatin, G4.5-Cisplatin cũng có các tín hiệu hấp thu tương tự. Tuy nhiên, cường độ của các tín hiệu hấp thu này có sự thay đổi khá rõ. Do trong quá trình tạo phức, phần lớn các nhóm ester ngoài cùng của PAMAM được chuyển thành COO- nên dao động νC=O, νC-O của nhóm ester có cường độ giảm xuống. Đồng thời, do dao dộng hóa trị bất đối xứng, đối xứng của nhóm COO- chồng lên tín hiệu amide I, amide II và δC-H của nhóm CH3 nên 9 cường độ của tín hiệu hấp thu tăng lên liên quan đến dao động kéo căng của N-H của Cisplatin. Kết quả này cho thấy có sự hình thành liên kết phối trí giữa ion Pt2+ với nhóm carboxylate -COO- của PAMAM dendrimer. 3.2.2. Phổ FTIR của phức PAMAM Dendrimer G3.0-Cisplatin, G4.0-Cisplatin Phổ FTIR của PAMAM dendrimer G3.0 và G3.0-Cisplatin; G4.0 và G4.0-Cisplatin cho thấy có sự dịch chuyển của peak do dao động biến dạng -NH của tại 1643 cm-1 thành 1639 cm-1 (G3.0, G3.0-Cisplatin); 1643 cm-1 thành 1642 cm-1 (G4.0, G4.0-Cisplatin). Điều này cho thấy có sự hình thành phức chất trên cơ sở liên kết phối trí giữa cation Pt2+ và các nhóm NH2 trên bề mặt của PAMAM dendrimer G3.0. Ngoài ra, phổ FTIR còn cho thấy sự suy giảm cường độ và dịch chuyển các peak của các dao động kéo căng đối xứng và bất đối xứng của nhóm -CH2 tại 2944 cm-1 và 2839 cm-1 của PAMAM dendrimer G3.0 thành 2944 cm-1 và 2899 cm-1 của phức G3.0-Cisplatin); tại 2944 cm-1 và 2839 cm-1 của PAMAM G4.0 thành 2975 cm-1 và 2884 cm-1 của phức G4.0-Cisplatin, peak hấp thu dạng mũi nhọn tại 3437 cm-1 (G3.0-Cisplatin) và 3427 cm-1 (G4.0- Cisplatin) liên quan đến dao động kéo căng của N-H của Cisplatin. Hình 3.2. Phổ FTIR của PAMAM dendrimer G2.5, G3.5, G4.5 và phức G2.5-Cisplatin, G3.5-Cisplatin, G4.5-Cisplatin 10 3.3. Phổ FTIR của phức G3.0-PAA với Cisplatin Phổ FTIR cho thấy sự dịch chuyển nhẹ các peak do dao động kéo căng bất đối xứng -COO chồng lên peak amide -NH của G3.0-PAA tại 1644 cm-1 và 1571 thành 1642 cm-1 và 1565 cm-1 đối với G3.0-PAA- Cisplatin. Các peak có cường độ thấp do dao động kéo và dao động uốn của -CH2 và CH-CO của G3.0-PAA tại 1454 cm-1 và 1409 cm-1 dịch chuyển tới 1453 cm-1 và 1406 cm-1 đối với G3.0-PAA-Cisplatin. Peak hấp thu mũi nhọn tại 3435 cm-1 liên quan đến dao động kéo căng của N-H của Cisplatin Kết quả phổ cho thấy có sự tương tác giữa cation Pt2+ với nhóm chức bề mặt -COO- của G3.0-PAA. Hình 3.3. Phổ FTIR của PAMAM dendrimer G3.0, G4.0 và phức G3.0-Cisplatin, G4.0-Cisplatin 11 3.4. Phổ FTIR của phức G4.0-PAA-Cisplatin Phổ FTIR cho thấy sự dịch chuyển nhẹ các peak do dao động kéo căng bất đối xứng -COO chồng lên peak amide -NH của G4.0-PAA tại 1572 cm-1 thành 1564 cm-1 và 1635 cm-1 đối với G4.0-PAA-Cisplatin. Các peak có cường độ thấp do dao động kéo và dao động uốn của -CH2 và CH-CO của G4.0-PAA tại 1454 cm-1 và 1407 cm-1 thành 1447 cm-1 và 1400 cm-1 đối với G4.0-PAA-Cisplatin. Peak 3619 cm-1 liên quan đến dao động nối -O-H của nhóm -COOH của G4.0-PAA. Kết quả phổ cho thấy có sự tương tác giữa cation Pt2+ với nhóm chức bề mặt -COO- của G4.0-PAA. 3.5. Kết quả phổ 1H-NMR PAMAM G3.0 và G 3.5 biến tính với PNIPAM Quan sát phổ 1H-NMR của G3-PNIPAM (tỉ lệ mol 1:8) ta thấy ngoài các peak đặc trưng của PAMAM G3.0 thì còn có các peak đặc trưng của PNIPAM-COOH như là peak của nhóm –CH3 (f) ở vị trí từ 1,10-1,26 ppm, -(CH3)2CHNH- (l) ở vị trí 3,97 ppm. Ngoài ra diện tích peak của nhóm –CH2CH2CONH (c) cũng tăng từ 2,0 lên 2,68 ppm cho ta thấy có sự hình thành liên kết CO-NH của PAMAM G3.0 với nhóm –COOH của PNIPAM-COOH. Kết quả trên cho ta thấy việc tổng hợp chất mang nano nhạy nhiệt dendrimer đã thành công. Hình 3.5. Phổ FTIR của G4.0-PAA và phức G4.0-PAA-Cisplatin Hình 3.4. Phổ FTIR của G3.0-PAA và phức G3.0-PAA-Cisplatin 12 Từ phổ 1H-NMR của G3-PNIPAM ta có thể tính được hiệu suất và số nhóm PNIPAM-COOH gắn lên PAMAM G3.0 bằng công thức: Trong đó: %X = SH(-CH3) (f) SH(-CH2-) (a) ∑ H(-CH3) (f) ∑ H(-CH2-) (a) .100% SH(-CH2-) (a) , SH(-CH3) (f) : Diện tích peak của peak (a) và peak (f) xuất hiện trong phổ 1H-NMR ∑ H(-CH2-) (a) , ∑ H(-CH3) (f) : Tổng số proton tại vị trí peak (a) và (f) trong phân tử dẫn xuất của dendrimer tính theo lý thuyết. %X : Mức độ phản ứng amide hóa Theo công thức ta tính được %X là 15,12 % và số nhóm PNIPAM-COOH gắn lên PAMAM G3.0 là 4,84 nhóm (hiệu suất 96,8 %). Tính toán tương tự dựa trên các phổ 1H-NMR với các tỉ lệ mol G3.0: PNIPAM = 1:5 và 1:10, ta được kết quả ở bảng 3.2. Bảng 3.2. Số nhóm PNIPAM gắn vào G3.0 và ước lượng KLPT Mẫu Số nhóm PNIPAM KLPT tính theo 1H-NMR Nhiệt độ chuyển pha G3.0-PNIPAM (1:5) 3,34 30.605 37,5 oC G3.0-PNIPAM (1:8) 4,84 40.776 34 oC G3.0-PNIPAM (1:10) 7,00 55.880 33 oC Kết quả phân tích GPC đối với mẫu G3.0-PNIPAM (1:8) cho thấy KLPT của sản phẩm là 39.600 gần giống với kết quả tính toán dựa trên phổ 1H-NMR.Kết quả phổ 1H-NMR của của chất mang nano nhạy nhiệt G3.5-PNIPAM cho thấy ngoài các peak đặc trưng của PNIPAM-COOH, còn xuất hiện thêm các peak đặc trưng của PAMAM dendrimer ở thế hệ G3.5 như peak –COOCH3 (h) (3,73-3,78 ppm); peak – CONHCH2CH2N- (e) (3,26-3,36 ppm); peak –CH2CH2N (a) (2,57-2,63 ppm). Từ đó cho thấy có sự hình thành liên kết giữa nhóm –COOCH3 với nhóm amin bề mặt phân tử G3.0- PNIPAM. Kết quả trên cho thấy việc tổng hợp nên chất mang nano nhạy nhiệt G3.5-PNIPAM đã thành công. Hình 3.6. Phổ 1H-NMR của chất mang nano G3.0-PNIPAM (tỉ lệ mol 1:8) Hình 3.7. Kết quả GPC của G3.0- PINIPAM (1:8) 13 3.6. Kết quả 1H-NMR PAMAM G3.0 biến tính với PAA Phổ 1H-NMR của G3.0-PAA cho thấy ngoài peak đặc trưng của PAMAM dendrimer G3.0 như: peak –CH2CH2N (a) (2,63ppm), peak –CONHCH2CH2N- (e) (3,30 ppm) còn có peak đặc trưng của acid polyacrylic >CHCOOH (b) (2,07 ppm) >CHCH2CH< (c) (1,61 ppm). Như vậy, có thể khẳng định có sự hình thành liên kết -CO-NH giữa nhóm -NH2 trên bề mặt của PAMAM dendrimer G3.0 với nhóm -COOH của PAA. Kết quả trên cho thấy đã tổng hợp thành công chất mang G3.0-PAA. Từ kết quả phổ 1H-NMR của G3.0-PAA, ta tính được số nhóm PAA gắn vào PAMAM dendrimer G3.0 là 6,01 nhóm (hiệu suất 50,1%). Thực hiện phản ứng khác với tỉ lệ mol PAMAM dendrimer G3.0: PAA là 1:6 cho kết quả số nhóm PAA gắn lên bề mặt PAMAM dendrimer G3.0 là 5 nhóm (hiệu suất 83,3%). 3.7. Kết quả 1H-NMR PAMAM G4.0 biến tính với PAA Tương tự như hệ G3.0-PAA, kết quả phổ 1H-NMR cho thấy đã tổng hợp thành công chất mang G4.0- PAA. Từ kết quả phổ 1H-NMR của G4.0-PAA, ta tính được số nhóm PAA gắn vào PAMAM dendrimer G4.0 là 15,16 nhóm (hiệu suất 94,7%). Thực hiện phản ứng khác với tỉ lệ mol PAMAM dendrimer G4.0: PAA là 1:8 cho kết quả số nhóm PAA gắn lên bề mặt PAMAM dendrimer G4.0 là 7,28 nhóm (hiệu suất 91,0%). Tiến hành thực hiện thí nghiệm khác với tỉ lệ mol PAMAM dendrimer G4.0: PAA là 1: 24 nhưng phản ứng không thành công (xảy ra hiện tượng đóng rắn trong bình phản ứng). Hình 3.9. Phổ 1H-NMR PAMAM dendrimer G3.0 biến tính với PAA (tỉ lệ mol 1:12) Hình 3.10. Phổ 1H-NMR PAMAM dendrimer G 4.0 biến tính với PAA (tỉ lệ mol 1:16) Hình 3.8. Phổ 1H-NMR của G3.5-PNIPAM 14 3.8. Kết quả đo hàm lượng Pt 3.8.1. Kết quả đo hàm lượng Pt của phức PAMAM dendrimer thế hệ chẵn-Cisplatin Bảng 3.3. Hàm lượng Pt phức PAMAM thế hệ chẵn - Cisplatin (không thủy phân) TT Tên mẫu %Cisplatin 1 G3.0-Cisplatin 9,63  1,47 2 G4.0-Cisplatin 16,95  1,29 Kết quả được biểu diễn dưới dạng: trung bình  SD (độ lệch chuẩn), số lần đo n=3 3.8.2. Kết quả đo hàm lượng Pt của phức PAMAM dendrimer thế hệ lẻ– Cisplatin (không thủy phân) Bảng 3.4. Hàm lượng Pt phức PAMAM thế hệ lẻ - Cisplatin (không thủy phân) TT Tên mẫu %Cisplatin 1 G2.5-Cisplatin 15,89 ± 1,41 2 G3.5-Cisplatin 7,90 ± 1,92 3 G4.5-Cisplatin 5,90 ± 0,68 Kết quả được biểu diễn dưới dạng: trung bình  SD (độ lệch chuẩn), số lần đo n=3 Đối với các PAMAM dendrimer G lẻ hàm lượng Cisplatin bị giảm đi khi thế hệ dendrimer tăng. Khả năng mang thuốc thấp của các PAMAM dendrimer G lẻ thế hệ cao có thể được giải thích là do sự cản trở không gian của các nhóm carboxylate trên bề mặt, các nhóm này có xu hướng co cụm lại dẫn đến giảm khả năng mang thuốc Cisplatin. Ngược lại với các PAMAM dendrimer thế hệ lẻ, hàm lượng Cisplatin trong PAMAM dendrimer thế hệ chẵn G4.0 tăng khoảng 1,7 lần so với PAMAM dendrimer G3.0. 3.8.3. Kết quả đo hàm lượng Pt của phức PAMAM thế hệ lẻ– Cisplatin (thủy phân) Bảng 3.5. Hàm lượng Pt trong phức G2.5-Cisplatin, G3.5-Cisplatin và G4.5-Cisplatin TT Tên mẫu %Cisplatin 1 G2.5-Cisplatin 28,99  2,01 2 G2.5-Cisplatin (SA) 31,82  1,39 3 G3.5-Cisplatin 30,23  1,29 4 G3.5-Cisplatin (SA) 33,01  1,56 5 G4.5-Cisplatin 31,11  1,48 6 G4.5-Cisplatin (SA) 34,03  1,96 Kết quả được biểu diễn dưới dạng: trung bình  SD (độ lệch chuẩn), số lần đo n=3; SA: có sử dụng siêu âm Kết quả cho thấy, hiệu quả gắn Cisplatin thu được là khá cao so với kết quả nghiên cứu trước đó của nhóm nghiên cứu với kết quả hàm lượng Cisplatin trong phức G2.5-Cisplatin và G3,5- Cisplatin lần lượt là 10,33% và 2,3%. Sự khác biệt khá lớn là do chúng tôi tiến hành thủy phân trước Cisplatin với AgNO3. Bằng cách này, Cisplatin gần như được thủy phân hoàn toàn thành cation [Pt(NH3)2(H2O)]2+ nên hiệu quả gắn Cisplatin vào PAMAM dendrimer các thế hệ lẻ tăng lên rất nhiều. Khi thế hệ PAMAM dendrimer tăng lên thì số nhóm bề mặt cũng tăng và số phân tử Cisplatin gắn vào PAMAM dendrimer cũng tăng lên. Tuy nhiên, so với sự gia tăng của nhóm bề mặt thì hiệu quả gắn Cisplatin vào PAMAM sẽ giảm khi thế hệ dendrimer tăng. Kirkpatrick cho rằng khi thế hệ dendrimer càng tăng thì việc chuyển các nhóm ngoài cùng của PAMAM dendrimer thành nhóm carboxylate càng khó khăn và do hiệu ứng không gian tăng cũng làm giảm khả năng phản ứng của Cisplatin với các nhóm amine và amide bên trong của PAMAM dendrimer. 3.8.4. Kết quả đo hàm lượng Pt của các phức G3.0-PAA-Cisplatin và G4.0-PAA- Cisplatin (thủy phân) Bảng 3.6. Hàm lượng Pt trong phức G3.0-PAA- Cisplatin (thủy phân) và G4.0-PAA-Cisplatin (thủy phân) TT Tên mẫu %Cisplatin 1 G3.0-PAA-Cisplatin (1:6) 12,93  1,60 2 G3.0-PAA-Cisplatin (1:12) 13,89  1,39 3 G4.0-PAA-Cisplatin (1:8) 20,22  1,44 4 G4.0-PAA-Cisplatin (1:16) 40,44  1,29 Kết quả được biểu diễn dưới dạng: trung bình  SD (độ lệch chuẩn), số lần đo n=3 Hàm lượng Cisplatin tăng khi tăng tỉ lệ mol của polymer nhạy pH Poly acrylic acid (PAA). So sánh hàm lượng Cisplatin trong G3.0-Cisplatin, G4.0-Cisplatin với G3.0-PAA-Cisplatin, G4.0- 15 PAA-Cisplatin ta thấy sự có mặt của PAA làm tăng hàm lượng Cisplatin. Điều này có thể giải thích do PAA có nhiều nhóm -COOH nên tăng khả năng hình thành liên kết phức chất Pt-COO- do đó tăng khả năng mang thuốc Cisplatin. 3.9. So sánh khả năng mang thuốc Cisplatin của các hệ chất mang trong điều kiện không thủy phân và có thủy phân Cisplatin Bảng 3.7. Khả năng mang thuốc Cisplatin (không thủy phân) của các hệ chất mang PAMAM dendrimer T T Hệ chất mang Số nhóm chức bề mặt % Cisplatin NH2 COOH 1 G2.5-COOH 0 32 15,89  1,41 2 G3.5-COOH 0 64 7,90  1,92 3 G4.5-COOH 0 128 5,90  0,68 4 G4.0-PAA (1:16) 49 405 19,06  1,44 5 G3.0-NH2 32 0 9,63  1,47 6 G4.0-NH2 64 0 16,95  1,29 Khả năng mang thuốc Cisplatin (không thủy phân) của các hệ chất mang PAMAM dendrimer được tóm tắt trong bảng 3.7. Kết quả cho thấy các hệ chất mang không mang được nhiều thuốc Cisplatin so với các nghiên cứu trước đó. Tuy nhiên, nếu tiến hành thủy phân một cách triệt để Cisplatin bằng AgNO3 để tạo thành dạng [Pt(NH3)2(H2O)n]2+ thì khả năng tạo phức giữa Pt2+ của Cispaltin với nhóm bề mặt -COOH của các hệ chất mang PAMAM dendrimer sẽ tăng lên và làm tăng đáng kể khả năng mang thuốc Cisplatin của các hệ chất mang (bảng 3.8). Mặt khác, do liên kết giữa Pt2+ và nhóm amine bề mặt -NH2 của các hệ chất mang PAMAM dendrimer thế hệ chẵn (G3.0; G4.0) tương đối bền và Cisplatin sẽ khó giải phóng ra khỏi các hệ chất mang này cho nên chúng tôi đã không tiến hành khảo sát khả năng mang thuốc Cisplatin (thủy phân) của các PAMAM dendrimer có nhóm amine -NH2 bề mặt. Kết quả bảng 3.13 cũng cho thấy Cisplatin thủy phân dễ dàng tạo phức với nhóm carboxylate - COOH trên bề mặt của các hệ chất mang. Hệ chất mang PAMAM dendrimer G4.0-PAA (1:16) với số nhóm chức bề mặt -COOH vượt trội (405 nhóm) so với các hệ chất mang khác mang được lượng thuốc Cispaltin lên tới 40,44%. Bảng 3.8. Khả năng mang thuốc Cisplatin (thủy phân) của các hệ chất mang PAMAM dendrimer T T Hệ chất mang Số nhóm chức bề mặt % Cisplatin NH2 COO H 1 G2.5-COOH 0 32 31,82  1,39 2 G3.5-COOH 0 64 33,01  1,56 3 G4.5-COOH 0 128 34,03  1,96 4 G3.0-PAA (1:6) 27 75 12,93  1,60 5 G3.0-PAA (1:12) 26 90 13,89  1,39 6 G4.0-PAA (1:8) 57 189 20,22  1,44 7 G4.0-PAA (1:16) 49 405 40,44  1,29 3.10. Thử nghiệm khả năng mang đồng thời hai thuốc 5-FU và Cisplatin của hệ chất mang PAMAM dendrimer G3.5-PNIPAM Hệ chất mang G3.5-PNIPAM được tổng hợp từ PAMAM dendrimer G3.0 -PNIAM và carboxylate hóa các nhóm -COOCH3 ngoài cùng thành nhóm -COO- có khả năng tạo phức với Cisplatin. Hơn nữa, các nhóm PNIPAM nhạy nhiệt trên bề mặt của hệ chất mang thuộc loại polymer nhạy nhiệt có nhiệt độ tới hạn thấp (LCST, 320C). Ở điều kiện nhiệt độ dưới điểm LCST, PNIPAM trương nở cực đại trong dung dịch thuốc và mang các phân tử thuốc vào bên trong mạng của nó. Khi nhiệt độ tăng lên quá điểm LCST, mạch polymer co ngót lại thuốc được nhả ra bên ngoài môi trường. Trên cơ sở nguyên lý này, chúng tôi đã thực hiện việc mang thuốc 5-FU vào hệ PAMAM dendrimer G3.5-PNIPAM-Cisplatin. Kết quả nang hóa 30mg 5-FU vào 100 mg các hệ copolymer PAMAM dendrimer G3.5-PNIPAM và hệ phức chất PAMAM dendrimer G3.5-PNIPAM-Cisplatin như sau: 16 Bảng 3.9. Kết quả nang hóa 5-FU vào phức G3.5-PNIPAM-Cisplatin 5FU không nang hóa 5-FU nang hóa mg mg %DL % EE PAMAM dendrimer G3.5-PNIPAM-5FU- CisPt 4.32  0.26 25.68  0.26 20.43  0.17 85.61  0.88 PAMAM dendrimer G3.5-PNIPAM-5FU 3.73  0.29 26.27  0.29 20.81  0.18 87.57  0.97 PNIPAM-CisPt-5FU 11.90  0.27 18.10  0.27 15.32  0.20 60.33  0.91 Kết quả được biểu diễn dưới dạng: trung bình  SD (độ lệch chuẩn), số lần đo n=3 Phức chất PAMAM dendrimer G3.5-PNIPAM-Cisplatin thể hiện khả năng nang hóa được 5-FU tạo thành hệ nano-gel nhạy nhiệt có khả năng mang đồng thời hai thuốc chống ung thư 5-FU và Cisplatin. Phác đồ điều trị ung thư với Cispaltin thường kết hợp thêm các thuốc khác để làm tăng hoạt tính cũng như giảm tác dụng phụ của thuốc. Do đó, hệ PAMAM dendrimer G3.5-PNIPAM mang đồng thời hai thuốc chống ung thư 5-FU và Cisplatin là một hệ mang thuốc chống ung thư đầy hứa hẹn. 3.11. Kết quả đo TEM, DLS và thế zeta Kích thước các hạt nano của phức PAMAM dendrimer hế hệ lẻ với Cisplatin tương đối đồng đều và nằm trong khoảng 5-10 nm (hình 3.11). Kết quả TEM cho thấy được kích thước của hạt PAMAM dendrimer G3.0-PNIPAM tồn tại trong dung dịch là 190 nm (hình 3.12). So với kích thuớc ban đầu của PAMAM dendrimer G3.0 (3-4 nm) thì kích thước của hạt PAMAM dendrimer G3.0-PNIPAM tăng lên rất nhiều và do đó sẽ làm tăng khả năng mang thuốc của hạt. Kích thước hạt của hệ PAMAM dendrimer G3.5-PNIPAM-Cisplatin trong dung dịch là 184 nm lớn hơn rất nhiều do polymer PNIPAM bao bọc phía bên ngoài hạt PAMAM dendrimer G3.5. Ảnh TEM (hình 3.13) của mẫu PAMAM dendrimer G3.5-PNIPAM-Cisplatin cho thấy có khả năng Cisplatin tạo liên kết chéo với hệ chất mang PAMAM dendrimer G3.5-PNIPAM. Hình 3.11. Ảnh TEM phức PAMAM dendrimer thế hệ lẻ - Cisplatin 17 Hình 3.13. Ảnh TEM mẫu PAMAM dendrimer G3.5-PNIPAM-Cisplatin và DLS mẫu G3.5-PNIPAM- Cisplatin và mẫu PNIPAM-Cisplatin Hình 3.12. Ảnh TEM của mẫu G3.0, PAMAM dendrimer G3.0-PNIPAM và DLS mẫu PAMAM dendrimer G3.0-PNIPAM Hình 3.14. Ảnh TEM của PAMAM dendrimer G4.0 (A), G4.0-PAA (C) và DLS của PAMAM dendrimer G4.0 (B), G4.0-PAA (D) Hình 3.15. Ảnh TEM của hệ PAMAM dendrimer G3.0-PAA- Cisplatin và PAMAM dendrimer G4.0-PAA-Cisplatin 18 Ảnh TEM của PAMAM dendrimer G4.0 đã chứng minh sự hình thành các hạt nano hình cầu đồng nhất với đường kính khoảng 4,0 nm, gần giống với kết quả đo DLS là 7,8 ± 2,4nm. Kích thước hệ chất mang nano G4.0-PAA (28 nm) tăng gần 3,6 lần so với PAMAM dendrimer G4.0. Kích thước hạt cũng tăng lên rất nhiều khi mang thuốc Cisplatin. Để khảo sát độ ổn định của các hệ chất mang, thế zeta của các dung dịch chứa các hệ chất mang được đo ở các điều kiện khác nhau. Kết quả đo thế zeta của các hệ chất mang G3.0-PAA (tỉ lệ mol 1:12); G4.0-PAA (tỉ lệ mol 1:8) và G4.0-PAA (tỉ lệ mol 1:16) cho thấy thế zeta của các hệ chất mang này phụ thuộc vào giá trị pH của dung dịch. Các hệ chất mang tương đối ổn định ở pH trung tính và pH 7,4. Hệ G4.0-PAA tỉ lệ mol 1:16 dễ bị kết tụ ở pH 5,5 với ζ= 7,3 mV. Kết quả này cho thấy sự không ổn định của hạt dẫn đến khả năng hạt bị kết tụ và do kích thước hạt tăng nên hạt không thể khuếch tán vào hệ thống mạch bạch huyết nhưng lại gia tăng được việc tích tụ ở môi trường khối u pH 5,5 và lượng Cisplatin giải phóng cũng tăng do đó làm tăng khả năng diệt khối u của thuốc. Ở pH 7,4, G4.0-PAA tỉ lệ mol 1:16 có ζ= -58,6 mV cho thấy sự ổn định trong môi trường plasma nên làm tăng tính tuần hoàn thuốc trong hệ thống mạch máu và do đó tăng khả năng thuốc được vận chuyển đến các khối u. 0 20 40 60 80 100 2 4 6 8 10 Tr an sm itt an ce [% ] pH G3PAA 1:12 G4PAA 1:16 G4PAA 1:8 -13,9 mV -14,6 mV 19,0 mV b) c) a) a) b) c) -58,6 mV -19,2 mV 7,3 mV Hình 3.16. Thế zeta của hệ chất mang G3.0-PAA (tỉ lệ mol 1:12) tại a. pH 7,4; b. pH 7,0 và c. pH 5,5 Hình 3.17. Thế zeta của hệ chất mang G4.0-PAA (tỉ lệ mol 1:16) tại: a. pH 7,4; b. pH 7,0 và c. pH 5,5 a) b) c) -23,2 mV -17,2 mV 14,1 mV Hình 3.18. Thế zeta của hệ chất mang G4.0-PAA (tỉ lệ mol 1:8) tại: a. pH 7,4; b. pH 7,0 và c. pH 5,5 Hình 3.19. Độ tan của các hệ chất mang phụ thuộc vào pH dung dịch 19 Điểm đục của các hệ chất mang khi thay đổi pH dung dịch cũng được xác định. Hình 3.19 cho thấy, độ hòa tan của các hệ G3.0-PAA 1:12, G4.0-PAA 1:8 và G4.0-PAA 1:16 phụ thuộc pH theo ba vùng pH: vùng pH thấp, vùng kết tủa (vùng trung gian) và vùng pH cao. Tại vùng trung gian pH 3,5 - 5,5 (hệ G4.0-PAA 1:16), pH 4,0 - 6,0 (hệ G3.0-PAA 1:12, G4.0-PAA 1:8) các hệ chất mang bị trung hòa điện tích pH dung dịch  pH đẳng điện và gây ra hiện tượng kết tụ các hệ chất mang này. 3.12. Kết quả và bàn luận khả năng giải phóng thuốc in vitro 3.12.1. Khả năng giải phóng thuốc của phức PAMAM thế hệ lẻ - Cisplatin (thủy phân) Bảng 3.10. Kết quả giải phóng thuốc in vitro của các phức PAMAM dendrimer: G2.5-Cisplatin, G3.5- Cisplatin và G4.5 - Cisplatin Thời gian (giờ) G2.5-Cisplatin G3.5-Cisplatin G4.5 - Cisplatin %Cisplatin %Cisplatin %Cisplatin pH 5,5 pH 7,4 pH 5,5 pH 7,4 pH 5,5 pH 7,4 0 0 0 0 0 0 0 6 30,42  1,20 22,78  0,81 31,72  1,00 27,17  0,91 34,96  1,08 28,23  0,81 12 37,18  1,48 28,35  1,01 39,04  1,25 35,12  1,12 45,52  1,30 33,12  1,03 24 43,10  1,70 31,84  1,14 44,94  1,41 38,64  1,16 47,86 1,04 43,48  1,20 48 45,98  1,82 34,61  1,23 47,93  1,50 41,35  1,18 53,18  1,47 48,03  1,51 60 48,18  1,90 36,29  1,29 50,24  1,62 43,76  1,28 55,07  1,51 48,91  1,54 72 51,05  2,02 36,54  1,30 53,24  1,67 45,69  1,37 55,49  1,54 49,19  1,54 Kết quả phân tích phương sai ANOVA cho thấy hàm lượng Cisplatin giải phóng khỏi hệ chất mang PAMAM dendrimer phụ thuộc vào thời gian, pH khảo sát và thế hệ dendrimer dùng làm chất mang. Trong cùng một thế hệ PAMAM dendrimer, lượng Cisplatin giải phóng ở pH 5,5 cao hơn ở pH 7,4 và sự khác biệt này có ý nghĩa về mặt thống kê. Sau 60 giờ lượng Cisplatin giải phóng không có sự khác biệt đáng kể về mặt thống kê. Cisplatin giải phóng thuốc trong môi trường acid đệm ABS pH 5,5 cao hơn trong môi trường đệm PBS pH 7,4 có thể được giải thích là do trong môi trường acid các nhóm -COO- bề mặt của PAMAM dendrimer bị proton hóa chuyển thành dạng -COOH và làm giảm độ bền của phức PAMAM dendrimer thế hệ lẻ - Cisplatin. Lượng Cisplatin giải phóng trong 72 giờ khỏi hệ chất mang PAMAM G2.5, PAMAM G3.5 và PAMAM G4.5 lần lượt là 51,05%, 53,24% và 55,49%. 3.12.2. Khả năng giải phóng thuốc 5-FU và Cisplatin của hệ chất mang hai thuốc G3.5-PNIPAM- Cispaltin – 5FU 0% 10% 20% 30% 40% 50% 60% 0 12 24 36 48 60 72 % N hả th uố c Ci sp la tin Thời gian (h) pH 5.5 (G2.5cis) pH 7.4 (G2.5cis) pH 5.5 (G3.5cis) pH 7.4 (G3.5cis) pH 5.5 (G4.5cis) pH 7.4 (G4.5cis) Hình 3.20. Khảo sát giải phóng thuốc Cisplatin in vitro của hệ chất mang PAMAM G2.5, PAMAM G3.5 và PAMAM G4.5 trong môi trường đệm PBS pH 7,4 và đệm ABS pH 5,5 20 Bảng 3.11. Khảo sát khả năng giải phóng thuốc 5FU của hệ chất mang G3.5-PNIPAM-CisPt và PNIPAM- CisPt 3.12.3. Khả năng giải phóng thuốc Cisplatin của hệ chất mang PAMAM dendrimer G4.0-PAA Bảng 3.12. Kết quả giải phóng thuốc Cisplatin của hệ chất mang PAMAM dendrimer G4.0-PAA Thời gian (giờ) Cisplatin giải phóng (%) pH 5,5 pH 7,4 0 0 0 4 25,17  1,08 11,21  0,69 12 34,42  1,51 21,40  0,62 24 40,97  0,92 28,75  0,84 32 44,96  0,88 32,93  0,97 48 52,02  0,94 42,72  1,29 55 56,51  0,84 45,46  1,38 72 59,13  0,96 48,32  1,48 So sánh với hệ chất mang PAMAM dendrimer G4.5, lượng Cisplatin giải phóng từ PAMAM dendrimer G4.5 tăng nhanh trong khoảng thời gian 24 giờ (đạt 43,48%). Cisplatin tích lũy trong đệm PBS pH 7,4 (49,19 %) gần như tương tự như đệm ABS pH 5,5 lúc 72 giờ. Trong khi đó, Cisplatin giải phóng từ hệ PAMAM dendrimer G4.0- PAA là 28,75% (trong 24h) thấp hơn gần 2 lần so với hệ chất mang PAMAM dendrimer G4.5. Qua đó cho thấy sự khác biệt về cấu trúc nhóm chức bề mặt gây ra xu hướng nhả thuốc khác nhau của PAMAM dendrimer G4.5 và PAMAM dendrimer G4.0-PAA. 3.13. Động học quá trình giải phóng thuốc Cisplatin Mô hình động học phù hợp nhất với sự giải phóng thuốc được chọn lựa dựa theo tiêu chuẩn AIC (tiêu chuẩn thông tin Akaike) và R2hc (R2 hiệu chỉnh) được tính toán bằng phần mềm R. Bảng 3.13. Giá trị AIC và R2hc theo từng mô hình động học của các hệ mang thuốc Cisplatin tại pH 5,5 và pH 7,4 G2.5-CisPt G3.5-CisPt G4.5-CisPt G4.0-PAA- CisPt pH 5,5 Bậc 0 R2hc 0,527 0,523 0,465 0,759 AIC 58,397 59,032 60,893 62,509 Bậc 1 R2hc 0,638 0,641 0,585 0,875 AIC -15,041 -14,256 -11,745 -22,971 Higuchi R2hc 0,804 0,801 0,756 0,95 AIC 52,236 52,915 55,397 49,911 Korsmeyer-Peppas R2hc 0,964 0,961 0,9056 0,992 Thời