Tóm tắt Luận án Nghiên cứu chế tạo kit chẩn đoán nhanh streptococcus suis type 2 ở lợn

kích thước nhỏ mức nano mét,chúng được gọi là các cấu trúc nano vàng. 6 2.6.2. Kỹ thuật sắc ký miễn dịch 2.6.2.1. Giới thiệu Kỹ thuật sắc ký miễn dịch (immunochromatographic assay (ICA)) dựa trên nguyên lý kết hợp kháng nguyên - kháng thể mà một trong hai thành phần này được gắn cộng hợp (conjugate) để phát hiện thành phần kia, sau đó nhờ phức hợp này chuyển dịch do tác dụng mao dẫn trên màng, để rồi được tóm bắt bằng kháng thể (hoặc kháng nguyên) đã bố trí sẵn tại vạch phát hiện. Đây là công nghệ được mở rộng từ kỹ thuật ngưng kết hạt latex lần đầu tiên được phát triển vào nĕm 1956 bởi Singer and Plotz (1956). 2.6.2.2. Cấu tạo của KIT chẩn đoán nhanh Một que thử nhanh điển hình bao gồm có: màng nitroncellulose (NC), đệm mẫu (sample pad), đệm kháng thể cộng hợp (conjugate pad) và đệm hút (adsorbent pad). Màng NC được phun 2 loại kháng thể khác nhau tạo thành 2 đường song song là đường kiểm tra (vạch T) và đường đối chứng (vạch C) (hình 2.2) Hình 2.2. Cấu trúc que thử nhanh Nguồn: O’Farrell (2008) 2.6.2.3. Nguyên tắc hoạt động và đánh giá kết quả Mẫu bệnh phẩm xử lý bằng dung môi phù hợp được nhỏ vào đệm mẫu (sample pad). Toàn bộ huyễn dịch sẽ được chuyển dịch theo mao dẫn xuyên qua tấm cộng hợp, đến vạch T và vạch C và đi về phía đệm hút (Hình 2.3), có 2 trường hợp xảy ra: a) Nếu trong mẫu kiểm tra có kháng nguyên thì sẽ xuất hiện màu ở vạch T và vạch C. b) Nếu trong mẫu kiểm tra không có kháng nguyên thì chỉ xuất hiện màu ở vạch C. Hình 2.3. Cơ chế hoạt động của KIT chẩn đoán nhanh Nguồn: Lee et al. (2013) 7 PHẦN 3. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1. VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU Chuột nhắt trắng swiss albino (SA) 10 tuần tuổi, có khối lượng 30-32g/con được nuôi trong chuồng nhựa có lớp trấu đã hấp khử trùng, nhiệt độ phòng nuôi duy trì ở 25oC. Chuột được cho uống nước vô trùng và ĕn thức ĕn tổng hợp AniFood (Viện Vắc xin và Sinh phẩm y tế). Các chất bổ trợ khác nhau dùng trong sản xuất vắc xin: Freund's adjuvant (Sigma Aldrich), Montanide ISA 201 VG (Seppic, Pháp), Montanide ISA 50V2 (Seppic, Pháp). Các hóa chất và vật dụng chế tạo Kit chẩn đoán nhanh: Gold colloid 40nm (DCN, Mỹ), Đệm mẫu và đệm hút (whatman, Anh), sợi thủy tinh (whatman, Anh), màng nitrocellulose (whatman, Anh) Vật liệu, dụng cụ, máy móc phòng thí nghiệm: Tĕm bông vô trùng lấy mẫu, ống falcon 15 ml, máy ly tâm Eppendorf (Centrifuge 5415D), máy PCR (PTC- 100) của MJ. Research Inc (Mỹ), máy soi gel Dolphin- Doc (Wealtech, USA), tủ ấm CO2, tủ cấy vô trùng, Máy ELISA tự động BIO-RAD Coda Automated EIA, Bộ tinh sạch kháng thể IgG Econo-Pac protein A Kit (Bio-Rad, Mỹ) máy phun Biodot XYZ3060D0003, máy Strip Guillotine Cutter ZQ4000. Môi trường, hóa chất thí nghiệm Môi trường nuôi cấy, phân lập vi khuẩn: Brain heart infusion (BHI, Eiken chemical), thạch máu, môi trường bile esculin agar, môi trường Todd Hewitt Broth (THB), thuốc thử Kovac (Biomerieux, Pháp), môi trường Kligler iron agar (KIA – Biomerieux, Pháp), dung dịch 3% H2O2, môi trường kiểm tra tính di động của vi khuẩn (Pepton: 10g, cao thịt: 3g, NaCl: 5g, agar: 4g, genlatin: 80g, nước cất: 1000ml). 3.2. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 3.2.1. Nghiên cứu sản xuất kháng nguyên của Streptococcus suis type 2 + Xác định tình hình nhiễm Streptococcus suis type 2 ở lợn giết mổ; + Phân lập và xác định đặc tính sinh học phân tử của vi khuẩn S. suis type 2; + Chế tạo kháng nguyên thô từ vi khuẩn S. suis type 2. 3.2.2. Nghiên cứu chế tạo kháng thể đặc hiệu kháng Streptococcus suis type 2 + Xác định tính sinh miễn dịch của kháng nguyên; + Xác định liều lượng kháng nguyên thích hợp để gây tối miễn dịch cho chuột nhắt trắng thí nghiệm; + Xác định chất bổ trợ thích hợp để gây tối miễn dịch cho chuột nhắt trắng thí nghiệm; + Chế tạo, tách chiết và định lượng kháng thể IgG kháng S. suis type 2. 3.2.3. Nghiên cứu chế tạo conjugate-kháng thể kháng Streptococcus suistype 2 + Xác định pH của dung dịch gold colloid thích hợp để gắn kháng thể với hạt nano vàng; + Xác định nồng độ kháng thể kháng Streptococcus suis type 2 thích hợp để phản ứng với dung dịch gold colloid; + Chế tạo kháng thể cộng hợp. 8 3.2.4. Đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu của KIT chẩn đoán nhanh Streptococcus suis type 2 + Xác định nồng độ kháng thể bắt thích hợp phủ lên màng NC; + Xác định độ nhạy của KIT chẩn đoán nhanh vi khuẩn S. suis type 2; + Xác định độ đặc hiệu của KIT chẩn đoán nhanh vi khuẩn S. suis type 2. 3.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.3.1. Phương pháp sản xuất kháng nguyên của Streptococcus suis type 2 3.3.1.1. Phương pháp xác định tình hình nhiễm Streptococcus suis type 2 ở lợn giết mổ Mẫu dịch mũi lợn tại các lò mổ (Bạch Yến, Bãi Dâu và Xuân Phú) được thu thập bằng cách lấy tĕm bông vô trùng ngoáy sâu vào mũi và cho mẫu vào 5 ml môi trường BHI, nuôi trong tủ ấm CO2 5% ở 37oC trong 16 giờ rồi tiến hành tách ADN. a. Chuẩn bị dung dịch lysis mẫu - Dung dịch 1: 10 mM Tris HCl (pH 8.3), 100 mM KCl, 2,5 mM MgCl2; - Dung dịch 2: 10 mM Tris HCl (pH 8.3), 2,5 mM MgCl2, 1% Tween 20, 1% Triton X-100, 0,01% Nonidet P-10 (Marois et al., 2004). b. Tiến hành tách ADN Ly tâm ống nuôi 6000 vòng/phút trong 5 phút để thu cặn, sau đó giết vi khuẩn bằng cách cho ống fancol 15 chứa dịch vi khuẩn vào 100oC ủ trong 10 phút. Mẫu được hút cho vào ống eppendorf để tiến hành tách ADN. c. Trình tự primers Primer CPS2F: 5’-TTTGTCGGGAGGGTTACTTC-3’; Primer CPS2R: 5’-TTTGGAAGCGATTCATCTCC-3’. Với các cặp mồi được thiết kế ở trên, đoạn ADN cần nhân lên có độ dài khoảng 498 bp (Silva et al., 2006). d. Thành phần phản ứng và chu trình nhiệt cho PCR ADN của mẫu sau khi tinh sạch thì được dùng làm khuôn cho phản ứng nhân đoạn gene. Phản ứng PCR được thực hiện với 30 chu kỳ và nhiệt độ bắt mồi là 58oC. 3.3.1.2. Phương pháp phân lập, và xác định đặc tính sinh học phân tử của vi khuẩn S. suis type 2 a. Phương pháp phân lập vi khuẩn S. suis type 2 Dịch nuôi của mẫu được xác định dương tính với S. suis type 2 bằng phương pháp PCR được cấy ria trên môi trường thạch máu cừu 5%, nuôi 16 giờ trong tủ ấm CO2 5% ở 37oC. Sau khi nuôi, chọn ngẫu nhiên vài khuẩn lạc tròn lồi, khô, màu xám, nhỏ đặc trưng của Streptococcus spp để kiểm tra bằng phản ứng catalase và thử nghiệm bile esculin và các phản ứng sinh hóa khác. Bảo quản mẫu vi khuẩn để phục vụ các thí nghiệm tiếp theo. b. Phương pháp PCR xác định đặc tính sinh học phân tử + Trình tự primers 6PGD Primers 6PGD được thiết kế dựa vào trình tự ADN trên ngân hàng gene (gb/CP000407) (Tan et al., 2008b). 9 Primer 6PGD F: 5- GCG GAT CCA TGA CTA AAG CAA ATT TTG-3; Primer 6PGD R: 5- CCG TCG ACC TAT TTT GAT TCG CTA TAC-3. + Phản ứng PCR với Gotaq Green Mastermix Kit (promega, Mỹ) Với các cặp mồi được thiết kế ở trên, đoạn ADN cần nhân lên có độ dài khoảng 1428 bp. ADN của mẫu sau khi tinh sạch thì được dùng làm khuôn cho phản ứng nhân đoạn gene. Phản ứng PCR được thực hiện với 30 chu kỳ và nhiệt độ bắt mồi là 55oC. c. Tinh sạch sản phẩm PCR Sau khi thực hiện phản ứng PCR, một số lượng lớn các phân tử ADN của vùng cần nghiên cứu đã được nhân lên. Sản phẩm tinh sạch có thể được dùng để giải trình trình tự trực tiếp hoặc dòng hóa vào plasmid vector với hiệu suất tiếp nhận cao hơn. Tiến hành tinh sạch sản phẩm PCR bằng KITWizard®SV Gel and PCR CleanUp System của hãng Promega (Mỹ) (xem Phụ lục 1). d. Phương pháp tạo dòng và phân tích trình tự gene +. Tạo vector tái tổ hợp Sản phẩm PCR sẽ được gắn vào vector pGEM® -T Easy Vector System theo phương pháp dòng hóa TA (TA-cloning), có enzyme T4 ADN ligase làm enzyme nối. Phản ứng nối ADN ngoại lai - sản phẩm của PCR được thực hiện ở 16ºC trong 16 giờ. +. Biến nạp vào tế bào Biến nạp bằng phương pháp sốc nhiệt. +. Tách ADN plasmid tái tổ hợp Sử dụng bộ hóa chất tách chiết plasmid tái tổ hợp của hãng Invitrogene (Mỹ) (PureLink® Quick Plasmid ADN Miniprep Kits) được sử dụng hiện nay (xem Phụ lục 2). +. Kiểm tra ADN tái tổ hợp Sử dụng phương pháp PCR với cặp mồi M13 và cặp mồi 6PGD được sử dụng để kiểm tra sự có mặt của ADN ngoại lai trong plasmid. + Phương pháp kiểm phân tích trình tự của gene 6PGD Trình tự nucleotide của gene 6PGD được gửi phân tích ở Công ty 1st BASE, Malaysia thông qua Công ty TNHH phát triển Công nghệ ứng dụng Việt Nam VNDAT bằng phương pháp dideoxy terminator trên máy 3031 Analysis. Kết quả giải trình tự gene được phân tích bằng phần mềm BioEdit và so sánh mức độ tương đồng với trình tự đã được công bố trên ngân hàng gene NCBI. 3.3.1.3. Phương pháp chế tạo kháng nguyên từ vi khuẩn S. suis type 2 Chủng vi khuẩn S. suis 2 thuần được nuôi trong môi trường Todd Hewitt Broth trong 7 giờ, sau đó được thu và tái huyền phù với nước cất vô trùng; cấy lên đĩa thạch máu để đếm khuẩn lạc. Phần vi khuẩn còn lại được bất hoạt trong 1% formaldehyde ở 37oC trong 7 ngày (Ju et al., 2010). Vi khuẩn đã bất hoạt được thu và rửa 3 lần với PBS để loại bỏ formaldehyde. 10 3.3.2. Phương pháp chế tạo kháng thể đặc hiệu kháng S. suis type 2 3.3.2.1. Thí nghiệm xác định tính sinh miễn dịch kháng nguyên S. suis 2 bất hoạt Để kiểm tra tính sinh miễn dịch của kháng nguyên S. suis 2, thí nghiệm được thực hiện trên 2 nhóm chuột chuột, mỗi lô 5 con; Nhóm được tiêm kháng nguyên: tiêm 400 µl/chuột hỗn hợp vi khuẩn (1x108CFU) và montanide ISA 50V2 (200µl); Nhóm đối chứng: tiêm 400 µl/chuột hỗn hợp PBS và montanide ISA 50V2; Chuột được tiêm 2 lần cách nhau 14 ngày, và tiến hành lấy máu kiểm tra vào ngày thứ 19 tính từ mũi tiêm lần 1. 3.3.2.2. Thí nghiệm xác định lượng kháng nguyên thích hợp để gây tối miễn dịch Xác định lượng kháng nguyên thích hợp gây tối miễn dịch được thực hiện trên 3 nhóm chuột SA (4 con/nhóm) được tiêm phúc mạc 400 µl hỗn hợp kháng nguyên với liều khác nhau (2x108 CFU/chuột, 1,5x108 CFU/chuột và 1x108 CFU/chuột)và chất bổ trợ montanide ISA 50V2 (200µl). Chuột được tiêm 3 lần, cách nhau 14 ngày/lần. Bảng 3.1. Bố trí thí nghiệm xác định lượng kháng nguyên thích hợp để gây tối miễn dịch Nội dung Nhóm 1 Nhóm 2 Nhóm 3 Số chuột thí nghiệm (con) 4 4 4 Lượng kháng nguyên (tế bào vi khuẩn/chuột) 2x108 1,5x108 1x108 Chất bổ trợ Montanide ISA 50V2 Montanide ISA 50V2 Montanide ISA 50V2 3.3.2.3. Thí nghiệm xác định chất bổ trợ thích hợp để gây tối miễn dịch Xác định chất bổ trợ thích hợp (Freund's, Montanide ISA 201 VG và Montanide ISA 50V2) được thực hiện trên ba nhóm chuột SA (4 con/nhóm) với liều kháng nguyên được xác định cĕn cứ vào kết quả của thí nghiệm xác định lượng. Chuột được tiêm 3 lần, cách nhau 14 ngày/lần. 3.3.2.4. Phương pháp tách chiết và định lượng kháng thể kháng S. suis type 2 a. Phương pháp chế tạo kháng thể kháng S. suis type 2 Kháng thể kháng S. suis type 2 được chế tạo bằng cách tiêm vào phúc mạc chuột 15 con chuột SA 400 µl huyễn dịch gồm 200 µl kháng nguyên và 200 µl chất bổ trợ. Lượng vi khuẩn bất hoạt và chất bổ trợ thích hợp được xác định theo các thí nghiệm trên (mục 3.3.2.2 và mục 3.3.2.3). Nhóm đối chứng gồm 3 con chuột được tiêm tiêm 400 µl/chuột hỗn hợp gồm 200 PBS và 200 chất bổ trợ tương tự. Chuột được tiêm 3 lần, mỗi lần cách nhau 14 ngày. b. Tách chiết kháng thể kháng S. suis type 2 Để tinh chế kháng thể IgG kháng S. suis type trong huyết thanh chuột, nghiên cứu này sử dụng KIT Econo-Pac protein A (Biorad) (xem phụ lục 3). c. Phương pháp định lượng kháng thể kháng S. suis type 2 sau tinh sạch + Phương pháp định lượng kháng thể BCA Sau khi tách chiết, hàm lượng kháng thể được xác định bằng Pierce BCA Protein Assay Kit của hãng Thermo. 11 + Phương pháp xác định hiệu giá kháng thể Hiệu giá kháng thể kháng S. suis type 2 được xác định bằng phương pháp ELISA gián tiếp. Mẫu kháng thể được pha loãng dẫn theo cấp số 2. Hiệu giá kháng thể được xác định bằng độ pha độ pha loãng cao nhất của mẫu mà ở đó vẫn xuất hiện phản ứng kết hợp kháng nguyên-kháng thể. c. Phương pháp kiểm tra độ tinh sạch của kháng thể Độ tinh sạch của kháng thể sau lọc được kiểm tra bằng điện di polyacrylamide gel 15% có SDS ở 80 V. Sau đó, gel được nhuộm với dung dịch Coomassie Blue R250. Phân tích kết quả điện di dựa theo sự xuất hiện và kích thước của các bĕng protein được nhuộm so mới thang protein chuẩn (marker). d. Phương pháp ELISA gián tiếp Phủ đĩa với kháng nguyên vi khuẩn S. suis 2 bất hoạt đã được pha loãng với dung dịch carbonate-bicarbonate buffer (Sigma) với nồng độ 2,5x107 vi khuẩn/ml. Cơ chất được sử dụng là OPD. Đọc kết quả bằng máy đọc ELISA ở bước sóng 492 nm theo đề nghị của nhà sản xuất cơ chất OPD. Mẫu dương tính khi giá trị OD> giá trị giới hạn (Cut off). Giá trị giới hạn = trung bình OD của nhóm đối chứng + (3x Sai số chuẩn của nhóm đối chứng) (Classen et al., 1987). 3.3.3. Phương pháp nghiên cứu chế tạo conjugate-kháng thể chống Streptococcus suis type 2 3.3.3.1. Xác định pH của dung dịch gold colloid thích hợp để gắn kháng thể với hạt nano vàng pH của dung dịch gold colloid thích hợp để gắn kháng thể với hạt vàng nano được xác định bằng cách trộn 250 µl dung dịch gold colloid (pH từ 6.5 - 8.5) với 25 µl dung dịch kháng thể kháng S. suis type 2 (C= 500 µg/ml), lắc nhẹ trong 30 phút, sau đó thêm 250 µl dung dịch NaCl 10%. Ủ 10 phút và quan sát. pH thích hợp để gắn là pH mà ở đó hỗn hợp dung dịch trên vẫn giữ được màu hồng tươi. Màu hồng tươi được phát hiện ở bước sóng 520 nm (Paek et al., 2000). 3.3.3.2. Xác định nồng độ kháng thể kháng Streptococcus suis type 2 thích hợp để phản ứng với dung dịch colloidal gold Nồng độ kháng thể kháng S. suis 2 tối ưu để gắn với hạt vàng nano vàng trong dung dịch đươc xác định bằng cách trộn 250 µl dung dịch gold colloid với 25 µl dung dịch kháng thể kháng S. suis type 2 (0, 100, 200, 300, 400, 500, 600 µg/ml) lắc nhẹ trong 30 phút, sau đó thêm 250 µl dung dịch NaCl 10%. Ủ 10 phút và quan sát ống có nồng độ thấp nhất không bị đổi từ màu hồng sang màu xanh (đo ở bước sóng 520 nm). Nồng độ protein của ống đó chính là nồng độ protein tối thiểu cần để gắn với gold colloid. 3.3.3.3. Phương pháp chế tạo kháng thể cộng hợp Kháng thể cộng hợp được chế tạo bằng cách ủ kháng thể kháng S. suis 2, với gold colloid (DCN, 40 nm, Mỹ) với tỷ lệ (1:10, vol/vol) ở nhiệt độ phòng trong 30 phút. Sau đó thêm 10% albumin huyết thanh bò (BSA) để cố định các phân tử đã gắn kết. Ly tâm 12.000 vòng trong 30 phút ở 40C, bỏ dịch nổi. Phần cặn được rửa bằng hỗn hợp 10mM Tris-HCl (pH 8.2) chứa 1% BSA, 5% sucrose. Sau khi ly tâm bỏ dịch nổi, kháng thể cộng hợp được pha loãng trong 100 µl hỗn hợp rửa (Chaudhuri and Raychaudhuri, 2001). Cuối cùng kháng thể 12 cộng hợp được cho lên giấy thủy tinh sợi (glass fiber), phơi khô ở nhiệt độ phòng qua đêm. 3.3.4. Phương pháp đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu của KIT chẩn đoán nhanh Streptococcus suis type 2 3.3.4.1. Phương pháp xác định nồng độ kháng thể bắt thích hợp phủ lên màng nitrocellulose Nồng độ kháng thể chuột kháng S. suis type 2 (kháng thể bắt) thích hợp được xác định bằng cách phun lên màng nitrocellulose (NC) ở đường kiểm tra với các nồng độ khác nhau (1,5; 1,75; 2,0 mg/ml), đồng thời phun Anti-Mouse IgG antibody produced in goat (Sigma-Aldrich, 1 µg/cm) lên màng NC ở đường đối chứng bằng máy Biodot XYZ3060D0003. 3.3.4.2. Phương pháp xác định độ nhạy và độ đặc hiệu của KIT chẩn đoán nhanh a. Thí nghiệm xác định lượng vi khuần tối thiểu cho kết quả dương tính với KIT chẩn đoán nhanh Tiến hành cho vào đệm mẫu của KIT 100 µl dung dịch chứa vi khuẩn S. suis type 2 với lượng khác nhau. Lượng vi khuẩn tối thiểu KIT chẩn đoán có thể phát hiện được xác định ở mức vi khuẩn tối thiểu mà KIT vẫn xuất hiện 2 bĕng có thể quan sát được (Ju et al., 2010). b. Thí nghiệm xác định phản ứng chéo của KIT chẩn đoán nhanh Phản ứng chéo của KIT được xác định bằng cách cho vào đệm mẫu của KIT chẩn đoán 100 µl dung dịch chứa 5x107 các loại vi khuẩn khác như E. coli ATCC 25922, Pseudomonas aeruginosa ATCC 27835, Staphylococcus aureus ATCC 25923 (Viện Công nghệ sinh học-Đại học Huế) và một số chủng vi khuẩn S. suis không phải là type 2 (Bùi Thị Hiền và cs., 2016). Quan sát sự xuất hiện của các bĕng màu trên KIT trong 5-10 phút. c. Thí nghiệm xác định độ nhạy và độ đặc hiệu của KIT chẩn đoán nhanh Độ nhạy và độ đặc hiệu của KIT được xác định bằng các so sánh với kết quả của phương pháp PCR trong việc xác định mẫu dương tính và âm tính. Bảng 3.2. Xác định độ nhạy và độ đặc hiệu của KIT chẩn đoán nhanh Kit phát hiện nhanh PCR Dương tính Âm tính Dương tính a c Âm tính b d Ghi chú: a: Kết quả dương tính khi được xác định bằng KIT và PCR b: Kết quả dương tính khi được xác định bằng PCR nhưng âm tính khi xác định bằng KIT c: Kết quả âm tính khi được xác định bằng PCR nhưng dương tính khi xác định bằng KIT d: Kết quả âm tính khi được xác định bằng PCR và bằng KIT 3.3.5. Phương pháp phân tích số liệu Số liệu thu thập được trong thí nghiệm xác định tính sinh miễn dịch của kháng nguyên; thí nghiệm xác định lượng kháng nguyên thích hợp và chất bổ trợ thích hợp để gây tối miễn dịch cho chuột được tính toán bằng phần mềm Excel 2003. Sai khác có ý nghĩa (với α=0,05) được xác định bằng T-test; Độ đặc hiệu và độ nhạy của KIT được xác định bằng phần mềm MedCalc 15.4 dựa theo kết quả chuẩn được xác định bằng phương pháp PCR. 13 PHẦN 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1. NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT KHÁNG NGUYÊN STREPTOCOCCUS SUIS TYPE 2 4.1.1. Tình hình nhiễm Streptococcus suis type 2 ở lợn giết mổ Với kết quả PCR, nhận thấy tỷ lệ nhiễm liên cầu lợn type 2 của lợn phân lập tại lò mổ Bạch Yến là 13,33%, lò mổ Bãi Dâu là 7,50% và lò mổ Xuân Phú là 6,67%. Như vậy, tính tổng tỷ lệ nhiễm S. suis type 2 trên địa bàn Thừa Thiên Huế là 9,00. 4.1.2. Phân lập và xác định đặc tính sinh học phân tử của vi khuẩn S. suis type 2 4.1.2.1. Phân lập vi khuẩn S. suis type 2 Từ 9 mẫu dương tính với S. suis type 2, chọn 1 mẫu và tiến hành ria cấy để phân lập vi khuẩn trên môi trường thạch máu cừu. Chọn một khuẩn lạc đơn có hình dạng đặc trưng của vi khuẩn liên cầu lợn. Chủng vi khuẩn phân lập này được đặt tên là TTHSS2. Kết quả nhuộm gram cho thấy vi khuẩn có hình hơi giống trực khuẩn, liên kết với nhau tạo thành chuỗi, trong tiêu bản có thể thấy vi khuẩn có những độ dài khác nhau bắt màu gram (+). Làn 1: Marker 1kb (Bioline), làn 2 đến 10: các mẫu dương tính, làn 11: chứng âm Hình 4.1. Kết quả PCR kiểm tra mẫu dương tính với S. suis type 2 Để chế tạo KIT chẩn đoán nhanh, việc phân lập và chọn được chủng vi khuẩn thích hợp, có đủ đặc tính sinh hóa và đặc tính sinh học đặc trưng của vi khuẩn S. suis type 2 rất quan trọng. Kết quả thực hiện phản ứng sinh hóa vi khuẩn liên cầu lợn thu được như sau: 14 Bảng 4.1. Kết quả sinh hóa vi khuẩn S. suis TT Chỉ tiêu Kết quả 1 Gram + 2 Bile esculin + 3 Catalase - 4 Lên men đường glucose + 5 Lên men đường lactose + 6 Indol - 7 Di động - Sau khi xác định hình thái vi khuẩn và xác định một số chỉ tiêu sinh hóa, khuẩn lạc Streptococus suis tách ADN để làm khuôn cho phương pháp PCR xác định S. suis type 2 với cặp mồi đặc hiệu. 4.1.2.2. Xác định đặc tính sinh học phân tử của chủng vi khuẩn TTHSS2 Kết quả điện di cho thấy sản phẩm PCR của S. suis type 2 có kích thước khoảng 1428 bp (hình 4.2), tương ứng với chiều dài lý thuyết đoạn ADN của gen 6PGDvới cặp mồi 6PGD.F và 6PGD.R. Làn 1: marker 1kb (biobasic), làn 2 và 3: mẫu Hình 4.2. Kết quả PCR nhân đoạn gen 6PGD 4.1.2.3. Kết quả giải trình tự gene của vi khuẩn chủng TTHSS2 Phân tích trình tự nucleoctit của gene 6GPD thuộc chủng S. suis type 2 phân lập tại Thừa Thiên Huế nhận thấy có sự sai khác tại 14 vị trí nucleoctit so với gene 6GPD của chủng S. suis type 2 do Tan et al. (2008b) phân lập được tại Trung Quốc đã được công bố trên ngân hàng gene (bảng 4.2). Sự sai khác này có thể là do đặc tính sinh học, thích nghi của từng chủng S. suis type 2 tại mỗi quốc gia khác nhau. Bảng 4.2. Sự sai khác của gene 6PGD của vi khuẩn S. Suis type 2 phân lập được với gene 6PGD của vi khuẩn S. Suis type 2 trên ngân hàng gene Vị trí Sai khác Vị trí Sai khác Vị trí Sai khác 486 A - — 1074 C - T 1119 C – G 574 C - T 1093 C - G 1123 T – C 632 T - — 1095 G - T 1132 A - G 1034 C - G 1112 — - G 1134 C - T 1039 A - G 1115 C - — 15 4.1.3. Chế tạo kháng nguyên thô từ vi khuẩn S. suis type 2 Trong nghiên cứu này, chủng vi khuẩn TTHSS2 thuần được nuôi trong môi trường THB trong vòng 7 giờ, tiến hànhly tâm thu cặnvi khuẩn. Cặn vi khuẩn được tái huyền phù với nước cất vô trùng và cấy trãi lên đĩa thạch máu để đếm số khuẩn lạc. Phần vi khuẩn còn lại được bất hoạt trong 1% formaldehyde ở 37oC trong 7 ngày. Kết quả trên vi khuẩn TTHSS2 sau khi được xử lý bằng dung dịch formaldehyde 1% không mọc được trên môi trường thạch máu. Như vậy, chúng tôi đã chế tạo thành công kháng nguyên thô vi khuẩn chủng TTHSS2 để phục vụ cho quá trình chế tạo kháng thể kháng vi khuẩn liên cầu lợn type 2. 4.2. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT KHÁNG THỂ ĐA DÒNG KHÁNG S. SUIS TYPE 2 4.2.1. Kết quả xác định tính sinh miễn dịch của kháng nguyên Nghiên cứu cho thấy giá trị OD492 ở nhóm được tiêm kháng nguyên cao hơn rất nhiều lần so với giá trị tới hạn (Cut off = 0,180) (bảng 4.3), trong khi các mẫu huyết thanh của nhóm đối chứng có giá trị OD492 rất thấp. Bảng 4.3. Hiệu giá kháng thể của chuột sau tiêm vắc xin Chuột thí nghiệm Giá trị OD Mean±SD Nhóm được tiêm kháng nguyên 1 2,321 2,391±0,087 2 2,333 3 2,256 4 2,455 5 2,232 Nhóm đối chứng 6 0,135 0,138 ± 0,014 7 0,159 8 0,143 9 0,122 10 0,132 Giá trị Cut off : 0,180 Trong quá trình nghiên cứu, chuột ở nhóm thí nghiệm được theo dõi đều an toàn, không có biểu hiện bất thường. Do vậy có thể khẳng định tính an toàn và khả nĕng sinh đáp ứng miễn dịch cao của kháng nguyên S. suis type 2 trong nghiên cứu này. 4.2.2. Kết quả xác định lượng kháng nguyên thích hợp cho khả nĕng đáp ứng miễn dịch ở chuột SA Kết quả ở thí nghiệm kiểm tra tính sinh miễn dịch và tính an toàn của kháng nguyên TTHSS2 cho thấy chất lượng kháng nguyên tốt, không gây bệnh, an toàn cho động thí nghiệm nên có thể sử dụng cho thí nghiệm chế tạo kháng thể kháng TTHSS2. Kết quả trình bày tại bảng 4.4 cho thấy thấy hàm lượng kháng kháng thể của nhóm 1 và 2 cao hơn nhiều so với hàm lượng kháng thể ở nhóm 3. Giá trị 16 OD492 trung bình qua 49 ngày theo dõi ở nhóm được tiêm kháng nguyên với hàm lượng 2x108 CFU/ chuột là 2,113; ở nhóm 2 là 2,111 và nhóm 3 là 1,890. Bảng 4.4. Ảnh hưởng của liều lượng kháng nguyên đến đáp ứng miễn dịch của chuột SA Nhóm Ngày lấy mẫu 0 7 21 28 35 42 49 Trung bình CFU/chuột Giá trịOD492 1 2x108 0,190 1,570 2,628 2,518 2,621 2,629 2,633 2,113a 2 1,5x108 0,192 1,552 2,634 2,514 2,622 2,630 2,632 2,111a 3 1x108 0,187 1,435 2,314 2,139 2,321 2,357 2,375 1,890b a, b: các chữ cái khác nhau trong cùng một cột biểu thị sự khác nhau có ý nghĩa (P<0.05) Kháng thể xuất hiện ngay trong lần tiêm đầu tiên, sau đó tĕng cao vào lần tiêm thứ 2. Sau tiêm 28 ngày, hàm lượng kháng thể giảm so với tuần đầu sau tiêm lần 2, do vậy chuột được gây miễn dịch lần 3 là rất phù hợp. Vào các ngày thứ 35; 42 và 49, hàm lượng kháng thể tĕng cao lại và duy trì ổn định. Hàm lượng kháng thể của nhóm 1 và của nhóm 2 cao hơn của nhóm 3 (|t|>tα/2). Tuy nhiên, không có sự sai khác giữa hàm lượng kháng thể của nhóm 1 và nhóm 2 (|t|<tα/2). Như vậy, hàm lượng kháng nguyên thích hợp được để gây miễn dịch cho chuột nhắt trắng là 1,5x108CFU/chuột. 4.2.3. Kết quả xác định chất bổ trợ thích hợp cho khả nĕng sinh miễn dịch của chuột SA Trong nghiên cứu này, với lượng kháng nguyên thích hợp để gây tối miễn dịch cho chuột SA là 1,5x108 CFU/chuột; để xác định chất bổ trợ thích hợp cho quá trính gây tối miễn dịch, 3 chất bổ trợ được sử dụng cho 3 nhóm thí nghiệm là Freund (hoàn toàn và không hoàn toàn), Montanide ISA 201 VG và Montanide ISA 50V2. Bảng 4.5. Ảnh hưởng của chất bổ trợ đến đáp ứng miễn dịch của chuột SA Nhóm Ngày lấy mẫu 0 7 21 28 35 42 49 Trung bình Chất bổ trợ Giá trịOD492 1 Freund's adjuvant 0,166 1,545 2,665 2,530 2,705 2,723 2,722 2,151a 2 Montanide ISA 201 VG 0,162 1,522 2,596 2,502 2,619 2,647 2,657 2,101b 3 Montanide ISA 50V2 0,162 1,550 2,652 2,517 2,662 2,697 2,713 2,136c a, b, c: các chữ cái khác nhau trong cùng một cột biểu thị sự khác nhau có ý nghĩa (P<0.05) 17 Hàm lượng kháng thể trong 7 ngày đầu sau khi gây đáp ứng miễn dịch lần 1 của các nhóm chuột không có sự sai khác. Tuy nhiên, sau lần tiêm thứ 2, hàm lượng kháng thể của chuột ở các nhóm bắt đầu thay đổi. Vào ngày thứ 21, hàm lượng kháng thể ở nhóm 1 đạt cao nhất (2,665), tiếp theo là nhóm 3 sử dụng chất bổ trợ Montanide ISA 50V2