Tóm tắt Luận án Nghiên cứu chế tạo tấm tế bào sụn từ tế bào gốc mô mỡ và màng chân bì ứng dụng điều trị tổn thương bề mặt sụn khớp trên mô hình thỏ

Thư viện Khoa học Tổng hợp TP. HCM - Thư viện Đại học Y Dược TP. HCM 1 1. GIỚI THIỆU LUẬN ÁN a. Lý do và tính cần thiết của nghiên cứu: Tỷ lệ mắc các bệnh lý về khớp đang ngày càng tăng. Trên thế giới có khoảng 263 triệu người gặp tình trạng thoái hóa khớp và khoảng 20% người trưởng thành từ 45 tuổi ở Mỹ được chẩn đoán bằng X-quang. Tại Việt Nam, tỷ lệ lưu hành bệnh thoái hóa khớp gối trên X- quang là 44,6% ở người trên 40 tuổi. Các phương pháp điều trị bệnh hiện nay chủ yếu là điều trị triệu chứng, trong những trường hợp tổn thương nặng thì phẫu thuật thay khớp thường được lựa chọn. Tuy nhiên các phương pháp hiện tại không giúp tái tạo, phục hồi lớp mô sụn bề mặt khớp bị tổn thương. Vì vậy nhóm nghiên cứu quyết định thực hiện đề tài “Nghiên cứu chế tạo tấm tế bào sụn từ tế bào gốc mô mỡ và màng chân bì ứng dụng điều trị tổn thương bề mặt sụn khớp trên mô hình thỏ”. b. Mục tiêu nghiên cứu: Mục tiêu tổng quát: Đánh giá tiềm năng tái tạo mô sụn của tấm tế bào sụn trên mô hình thỏ. Mục tiêu chuyên biệt:  Thiết lập quy trình phân lập, nuôi cấy và định danh tế bào gốc trung mô từ mô mỡ thỏ.  Thiết lập quy trình tạo tấm tế bào sụn từ tế bào gốc trung mô từ mỡ thỏ và màng chân bì.  Xây dựng mô hình đánh giá hiệu quả phục hồi tổn thương bề mặt sụn khớp in vivo của tấm tế bào sụn trên mô hình thỏ. 2 c. Đối tượng và phương pháp nghiên cứu: Đây là nghiên cứu thực nghiệm mô tả (mỗi thí nghiệm được lập lại 3 lần). Đối tượng nghiên cứu là màng chân bì da được thu nhận từ da người hiến và tế bào gốc trung mô (TBGTM) thu nhận từ mô mỡ thỏ. d. Những đóng góp mới của nghiên cứu về mặt lý luận và thực tiễn: Ở Việt Nam đã có những công trình nghiên cứu liên quan đến TBGTM thu nhận từ mô mỡ chuột, mô mỡ người. Những nghiên cứu ban đầu về điều trị tổn thương bề mặt sụn khớp chủ yếu sử dụng các phương pháp ghép mô tự thân. Sau đó là ứng dụng tế bào gốc như tiêm tế bào gốc trực tiếp tại vùng bề mặt sụn bị tổn thương. Tuy nhiên, việc sử dụng đơn thuần tế bào gốc để điều trị tổn thương bề mặt sụn khớp chưa cho thấy hiệu quả như mong đợi vì tế bào gốc không thể lắp đầy vùng tổn thương hoặc tái tạo vùng sụn bị tổn thương. Đã có những nghiên cứu tiến hành thu nhận TBGTM từ mô mỡ người, thu nhận giá thể màng chân bì da người và tạo được tấm tế bào sụn công nghệ in vitro. Đây là công trình nghiên cứu in vivo đầu tiên đánh giá hiệu quả tái tạo mô sụn bề mặt khớp bị tổn thương của tấm tế bào sụn trên mô hình động vật. Kết quả thu được từ nghiên cứu là tiền đề để tạo ra một hướng điều trị tổn thương bề mặt sụn khớp trên người nhằm giúp tái tạo và phục hồi lớp mô sụn bị tổn thương. e. Bố cục của luận án: Luận án có 92 trang, gồm các phần: Mở đầu (3 trang), Tổng quan tài liệu (29 trang), Đối tượng và phương pháp nghiên cứu (15 trang), Kết quả (27 trang), Bàn 3 luận (15 trang), Kết luận (3 trang), Kiến nghị (1 trang). Luận án có 27 hình, 10 bảng và 182 tài liệu tham khảo bao gồm tài liệu tiếng Việt và tiếng Anh. 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1. Công nghệ mô sụn: Các thành phần cơ bản để tạo ra tấm tế bào sụn dựa trên nền tảng công nghệ mô gồm có 3 yếu tố là tế bào, giá thể và các yếu tố hoạt hóa sinh học để hỗ trợ quá trình tạo sụn. Trong đó, giá thể kết hợp với yếu tố hoạt hóa sinh học sẽ tạo một môi trường thuận lợi giúp cho sự tăng trưởng và biệt hóa của tế bào, đồng thời giá thể còn giúp tạo sự toàn vẹn cơ học khi cấy ghép in vivo. Sự tăng sinh, hoạt động biến dưỡng và biệt hóa của tế bào sẽ được định hướng thông qua tác động của các yếu tố tăng trưởng. Nguồn tế bào được sử dụng trong công nghệ mô sụn được nghiên cứu ứng dụng nhiều hiện nay là TBGTM, đây được cho là sự lựa chọn phù hợp thay thế cho tế bào sụn trong việc tái tạo mô. Không những khắc phục được những nhược điểm khi cấy ghép tế bào sụn, TBGTM còn có khả năng điều biến miễn dịch giúp hạn chế quá trình viêm khi cấy ghép và khả năng biệt hóa thành tế bào sụn. 2.2. Tế bào gốc trung mô từ mô mỡ: TBGTM từ mô mỡ là nguồn thay thế tế bào gốc trưởng thành tự thân, có thể thu nhận nhiều lần với số lượng lớn mà không hoặc rất ít ảnh hưởng đến sức khỏe của bệnh nhân. Khi phân tích so sánh TBGTM từ tủy xương, từ mô mỡ và cuống rốn, ghi nhận TBGTM từ mô mỡ không có nhiều sự khác biệt về mặt hình thái, kiểu hình miễn 4 dịch và tiềm năng biệt hóa. Đồng thời tỉ lệ TBGTM trong mô mỡ cao hơn trong tủy xương, so với TBGTM từ tủy xương thì TBGTM từ mô mỡ được nuôi cấy dễ dàng hơn với tốc độ tăng trưởng nhanh hơn và thời gian nuôi cấy lâu hơn trước khi trở nên già cỗi. Bên cạnh đó, khả năng biệt hóa của các TBGTM từ mô mỡ ít chịu ảnh hưởng của tuổi người hiến mô. 2.3. Giá thể sử dụng trong công nghệ mô sụn: Giá thể sinh học được sử dụng để sửa chữa sụn không chỉ cung cấp hỗ trợ cơ học cho các khiếm khuyết của sụn mà còn cung cấp chất nền hỗ trợ cho sự phát triển, khuếch tán và biệt hóa của tế bào gốc. Giá thể màng chân bì da người ghép đồng loại là phần chân bì được thu nhận từ da người hiến và được xử lý để loại bỏ phần thượng bì và hạ bì, chỉ giữ lại phần chân bì. Các tế bào thuộc mô liên kết ở phần chân bì cũng như các tế bào còn sót trong phần thượng bì và hạ bì đều được loại bỏ dưới tác dụng của tia gamma. Giá thể thu được sẽ không còn sự hiện diện của các thành phần gây ra đáp ứng miễn dịch gây thải loại ghép. Sự liên kết và sắp xếp các sợi collagen bên trong giá thể giúp tế bào có thể thấm nhập và bám dính vào giá thể. 2.4. Mô hình động vật trong đánh giá vật liệu ghép: Lựa chọn một mô hình động vật ngoài việc tuân thủ các tiêu chuẩn chung thì cần phải xem xét đến các tiêu chí có liên quan đến tế bào cần cấy ghép, giá thể ghép và các yếu tố hoạt hóa sinh học hỗ trợ sử dụng để nuôi cấy tế bào. Chuột và thỏ có sẵn nên được sử dụng nhiều cho nghiên cứu thực nghiệm in vivo để đánh giá 5 tiềm năng sửa chữa sụn của tế bào và mô người. Các mô hình động vật lớn với sụn khớp cứng hơn cho phép nghiên cứu cả độ dày từng phần và sửa chữa toàn bộ bề dày của sụn cũng như sửa chữa xương dưới sụn. Thỏ là một trong những loài động vật thường được sử dụng cho nhiều nghiên cứu y học đặc biệt là trong lĩnh vực xương khớp. Do thỏ có khớp lớn hơn và có kích thước tốt để dễ dàng tiến hành phẫu thuật và xử lý mẫu. Thỏ có độ dày sụn khớp từ 0,25 mm-0,75 mm, và có kích thước cơ thể thuận tiện cho việc phẫu thuật ghép và chăm sóc sau ghép. Ngoài ra, cơ thể thỏ đạt đến sự trưởng thành của mô sụn xương trong thời gian ngắn vào khoảng 6 tháng tuổi, điều này rất phù hợp để triển khai các nghiên cứu liên quan về xương khớp do không phải chờ đợi lâu để thu thập kết quả. 2.5. Các phương pháp đánh giá quá trình lành thương của mô sụn: Sụn tồn tại trong nhiều hình dạng và kích cỡ khác nhau, hiện tại chưa có tiêu chuẩn nào được thiết lập để đánh giá quá trình phục hồi của mô sụn. Trong các nghiên cứu trên mô hình động vật thì chụp X quang không có giá trị trong theo dõi và đánh giá phục hồi mô sụn mà chủ yếu dựa vào quan sát hình ảnh đại thể và kết quả phân tích đánh giá mô học. 2.6. Các nghiên cứu liên quan: Các nghiên cứu trên thế giới: Tháng 7/2012, Penny Hogg cùng các cộng sự của mình đã phát triển quy trình tạo màng chân bì da cũng như là các phương pháp đánh giá màng chân bì 6 da và thử nghiệm in vitro, in vivo. Santos Martinez-Diaz và cộng sự (2010) đã tiến hành những đánh giá in vivo trên mô hình thỏ. Năm 2016, nhóm nghiên cứu của tác giả Ken Ye và cộng sự đã công bố kết quả chứng minh khả năng tạo mô ghép sụn ứng dụng trong tái tạo sụn bằng sự kết hợp giữa TBGTM từ mỡ dưới xương bánh chè người với màng chân bì chuột trên mô hình in vitro. Năm 2018, tác giả Ken Ye và cộng sự đã thực hiện ghép màng chân bì vào khuyết sụn ở thỏ cho thấy màng chân bì là giá thể có tiềm năng sử dụng trong sửa chữa sụn. Các nghiên cứu tại Việt Nam: Năm 2013, tác giả Huỳnh Duy Thảo đã tiến hành thu nhận thu nhận TBGTM từ mô mỡ người, kết quả cho thấy quần thể tế bào thu nhận được mang đặc tính của TBGTM theo tiêu chuẩn của Hiệp hội tế bào gốc Hoa Kỳ. Cũng trong năm 2016 tác giả đã thử nghiệm thành công nuôi cấy TBGTM từ mỡ người trên giá thể sinh học Gelatin-Alginate và khung Fibrin. Năm 2014, tác giả Hoàng Kc Hương đã thiết lập thành công quy trình thu nhận giá thể collagen từ màng chân bì da người. Năm 2017, tác giả Đào Thị Thanh Thủy đã phân lập thành công TBGTM từ tủy xương thỏ và biệt hóa thành tế bào sụn, kết hợp với giá thể polycaprolactone tạo nên tấm mô sụn công nghệ mô in vitro. Nhóm nghiên cứu của tác giả Đặng Thị Hà Thanh cũng đã tạo thành công tấm tế bào sụn từ giá thể collagen thu nhận từ da người kết hợp với TBGTM từ mô mỡ người. Cả 2 tấm mô sụn được tạo từ công nghệ mô trong 2 nghiên cứu trên đều có hiện diện tế bào sụn và chất nền sụn đặc trưng, cho thấy tiềm năng ứng dụng trên lâm sàng rất cao. Hiện 7 tại, chưa có một nghiên cứu in vivo nào đánh giá hiệu quả của tấm tế bào sụn từ TBGTM từ mô mỡ và màng chân bì da. 3. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1. Thiết kế nghiên cứu: Thực nghiệm mô tả (mỗi thí nghiệm được lập lại 3 lần) 3.2. Đối tượng nghiên cứu: - Màng chân bì da được thu nhận từ da người hiến tại Bệnh viện EMCAS TP. Hồ Chí Minh Tiêu chuẩn chọn mẫu: Mẫu da được thu nhận theo sự đồng ý của người hiến: • Âm tính với các xét nghiệm: HIV, HBV, HCV, VDRL. • Mẫu da còn nguyên vẹn, không bị dập nát. Tiêu chuẩn loại trừ: • Không được sự cho phép của người hiến. • Để quá lâu (trên 6 tiếng ở nhiệt độ bình thường). - Thỏ giống New Zealands được cung cấp bởi Đại học Quốc gia TP. Hồ Chí Minh. 3.3. Quy trình nghiên cứu: 3.3.1. Quy trình phân lập, nuôi cấy và định danh TBGTM từ mô mỡ thỏ Mẫu mô mỡ được cắt thành những mảnh nhỏ và ủ trong dung dịch enzyme Collagenase-Dispase ở nhiệt độ 37oC. Dịch tế bào 8 được thu nhận và quay ly tâm 3000 vòng/phút trong 5 phút. Thu phần cặn tế bào, bổ sung 5ml môi trường nuôi DMEM/F12 có bổ sung 10% FBS, huyền phù và lọc qua phễu lọc có đường kính 70 µM. Dịch tế bào sau thu nhận được mang đi quay ly tâm 3000 vòng/phút trong 5 phút. Thu nhận cặn tế bào và chuyển vào chai nuôi 25 cm2 nuôi ủ trong tủ ấm 37oC, 5% CO2. Môi trường nuôi cấy được thay mỗi 2 ngày. Định danh TBGTM bằng 2 phương pháp kết hợp theo như thông lệ quốc tế (ISCT) là: - Quan sát đặc tính bám dính của TBGTM (nhuộm Giemsa để quan sát hình thái tế bào). - Đánh giá khả năng biệt hóa thành tế bào sụn, tế bào xương và tế bào mỡ trong điều kiện in vitro: Quần thể tế bào sau 14 ngày cảm ứng biệt hóa được nhuộm đặc hiệu lần lượt với Acian blue, Alizarin red và Oil red O. - Đánh giá các dấu ấn chuyên biệt của TBGTM: Chúng tôi sử dụng RT-PCR để khuếch đại các DNA mục tiêu với các đoạn mồi đặc hiệu cho các gien như CD14, CD34, CD45, CD44, CD73, CD90, CD105, CD106 và glyceraldehyde 3- phosphate dehydrogenase (GADPH). 3.3.2. Quy trình tạo tấm tế bào sụn từ TBGTM mỡ thỏ và màng chân bì Khảo sát sự biểu hiện của các gien tạo sụn: TBGTM sau khi cảm ứng tạo sụn 7, 14, 21 ngày được đánh giá sự biểu hiện của các gien sox9, col2a1, col1a2, col X, acan, runx2 bằng phương 9 pháp qRT-PCR. Sự thay đổi biểu hiện các gien tạo sụn của TBGTM sau khi cảm ứng biệt hóa 7, 14, 21 ngày so với TBGTM không được cảm ứng theo công thức Livak. Các số liệu được xử lí thống kê bằng phần mềm GraphPad Prism 6.0. P-value <0,05 được xem sự khác biệt có ý nghĩa thống kê. Thu nhận giá thể màng chân bì từ da người: Mô da được cắt ra thành các mảnh có kích thước 1x2 cm2. Dùng dao bóc tách phần chân bì và thượng bì. Sau đó xử lý theo quy trình của tác giả Hoàng Kc Hương và cộng sự. Giá thể màng chân bì sau khi thu nhận được bảo quản theo quy trình đông lạnh, rồi đem đông khô và khử trùng bằng tia gamma với liều chiếu 25 kGy theo chuẩn ISO 11137-03. Tạo tấm tế bào sụn từ sự kết hợp của TBGTM và màng chân bì: TBGTM được nuôi trên đĩa 6 giếng, khi mật độ tế bào phủ kín bề mặt đĩa nuôi sẽ bổ sung môi trường biệt hóa sụn (StemPro™ Adipogenesis Differentiation Kit) (thay mỗi 3 ngày). Chuẩn bị 2 đĩa nuôi TBGTM trong môi trường biệt hóa. Ngày 7 và 14 cảm ứng biệt hóa tạo sụn, lớp TBGTM sẽ được bóc tách ra khỏi đĩa nuôi bằng lực cơ học và cuộn quanh mảnh màng chân bì. Sau đó tấm tế bào sụn tiếp tục nuôi trong môi trường biệt hóa sụn đến ngày thứ 21. Đánh giá một số đặc điểm của tấm tế bào sụn được tạo bằng mô học và SEM: Nhuộm mô học (H&E và Trichrome) để đánh giá cấu trúc tấm tế bào sụn, sự phân bố của tế bào bên trong tấm tế bào. Chụp SEM đánh giá cấu trúc bề mặt và sự hiện diện và 10 bám dính của tế bào trên bề mặt giá thể. Nhuộm Safranin-O để đánh giá sự hiện diện của nguyên bào sụn bên trong tấm tế bào. 3.3.3. Xây dựng mô hình đánh giá hiệu quả phục hồi tổn thương bề mặt sụn khớp in vivo của tấm tế bào sụn trên mô hình thỏ: Tiến hành ghép đồng loại tấm tế bào sụn trên mô hình thỏ. Chọn các thỏ đực khoảng 6 tháng tuổi, cân nặng từ 2,0–2,5 kg, nuôi trong cùng điều kiện dinh dưỡng và chăm sóc. Thỏ được tạo tổn thương bề mặt sụn bằng mũi khoan lõi có đường kính 5 mm khoan vào vùng đầu gối xương cẳng chân. Lõi xương sụn được lấy ra và loại bỏ phần bề mặt sụn khớp, phần xương dưới sụn được đặt trở lại lỗ khoan. Gối trái sẽ để nguyên tổn thương bề mặt sụn không ghép, đây là nhóm đối chứng. Gối phải sẽ chia làm 2 nhóm thí nghiệm: nhóm 1 sẽ ghép giá thể màng chân bì không có mang tế bào và nhóm 2 sẽ ghép tấm tế bào sụn. Tất cả thỏ được ghép và theo dõi ở 3 mốc thời gian 1 tháng, 2 tháng và 3 tháng, tại các mốc thời gian số thí nghiệm được lặp lại 3 lần. Mỗi giai đoạn 1, 2 và 3 tháng tiến hành thu nhận mảnh ghép để làm mô học (nhuộm H&E, Trichrome và Safranin O) nhằm đánh giá kết quả ghép. 3.4. Đạo đức nghiên cứu: Nghiên cứu được chấp thuận của Hội đồng đạo đức trong nghiên cứu y sinh học, trường Đại học Y khoa Phạm Ngọc Thạch. Số: 93/ HĐĐĐ-TĐHYKPNT. 11 4. KẾT QUẢ 4.1. Kết quả phân lập, nuôi cấy và định danh tế bào gốc trung mô từ mô mỡ thỏ 4.1.1. Kết quả phân lập, nuôi cấy TBGTM từ mô mỡ thỏ: Trong suốt quá trình nghiên cứu, 6 mẫu mô mỡ đã được thu nhận. Số lượng tế bào thu được trên 1 gam mô mỡ lấy trung bình từ 6 mẫu mô đã thu nhận là vào khoảng 4,6 x 105 tế bào. Đánh giá sự tăng trưởng của TBGTM từ mô mỡ sau lần cấy chuyền thứ ba cho thấy sau khi được cấy chuyền, từ ngày 2 đến ngày 6 tế bào bắt đầu tăng sinh nhanh và đạt cao nhất vào ngày 6, sau đó thì giảm dần cho đến ngày thứ 14 (Hình 3.2). Hình 3.2. Đồ thị sự tăng trưởng của TBGTM từ mô mỡ sau lần cấy chuyền thứ ba 4.1.2. Kết quả định danh TBGTM từ mô mỡ thỏ: Quan sát dưới kính hiển vi đảo ngược ghi nhận quần thể tế bào thu nhận 0.00 2.00 4.00 6.00 8.00 10.00 12.00 Ngày 0 Ngày 2 Ngày 4 Ngày 6 Ngày 8 Ngày 10 Ngày 12 Ngày 14 M ậ t đ ộ t ế b à o ( x 1 0 ^ 4 t ế b à o /m l) Ngày Sự tăng trưởng của tế bào thu nhận từ mô mỡ Trung bình 12 từ mô mỡ thỏ bám dính trên bề mặt chai nuôi, có hình thái rất giống với nguyên bào sợi (Hình 3.3). Kết quả nghiên cứu cho thấy quần thể TBGTM thu nhận có có khả năng biệt hóa được thành nguyên bào xương, nguyên bào sụn và tế bào mỡ (Hình 3.4). Kết quả khảo sát biểu hiện dấu ấn bề mặt cho thấy quần thể tế bào thu nhận được có biểu hiện dương tính với CD14, CD44, CD73, CD105 và CD106. Biểu hiện âm tính với CD34, CD45 và CD90 (Hình 3.5). Hình 3.3. Tế bào gốc bám dính trên bề mặt chai nuôi Tế bào được nhuộm Giemsa và quan sát dưới kính hiển vi đảo ngược ở các độ phóng đại x40 (A), x100 (B) và x400 (C). (D) Kết quả thu nhận TBGTM từ mỡ thỏ của tác giả Tirpáková. 13 Hình 3.4. Kết quả biệt hóa TBGTM từ mô mỡ thỏ in vitro (A) TBGTM được biệt hóa tạo nguyên bào xương nhuộm Alizarin Red (x20). (B) TBGTM được biệt hóa tạo tế bào mỡ nhuộm Oil Red O (x20). (C) TBGTM được biệt hóa tạo nguyên bào sụn nhuộm Alcian Blue (x20). (E), (F) và (G) lần lượt là các TBGTM ở mẫu chứng tương ứng không biệt hóa (×20). Hình 3.5. Đánh giá biểu hiện dấu ấn bề mặt của tế bào gốc từ mô mỡ thỏ 14 4.2. Kết quả tạo tấm tế bào sụn từ tế bào gốc trung mô mỡ thỏ và màng chân bì 4.2.1. Kết quả khảo sát biểu hiện của các gien tạo sụn bằng qRT-PCR: Trong suốt quá trình cảm ứng biệt hóa tạo sụn, TBGTM có sự thay đổi sự biểu hiện các gien sox9, col2a1, col1a2, colX, acan, runx2 sau 7, 14 và 21 ngày cảm ứng biệt hóa (Hình 3.6). Hình 3.6. Sự biểu hiện các gien sox9, col2a1, col1a2, colX, acan, runx2 khi cảm ứng biệt hóa tạo sụn 15 4.2.2. Kết quả thu nhận giá thể màng chân bì da người: Quan sát trên hình ảnh mô học ghi nhận giá thể màng chân bì hoàn toàn không còn sự hiện diện các lớp tế bào ở phần thượng bì. Bên cạnh đó phần chất nền ở chân bì có nhiều khoảng trống, giữa cấu trúc collagen có nhiều lỗ hổng hơn tạo cấu trúc dạng xốp (Hình 3.7). Sau khi đưa giá thể vào chai nuôi có chứa TBGTM, quan sát trên hình ảnh mô học ghi nhận TBGTM bám dính và tăng trưởng trong giá thể (Hình 3.9). A C E B D 16 Hình 3.7. Kết quả thu nhận giá thể màng chân bì da người (A). Mẫu da người được nhuộm H-SG (×10), trước khi được xử lý để thu nhận giá thể màng chân bì. (B) và (C). Kết quả loại bỏ phần thượng bì, thu nhận phần chân bì, được nhuộm H-SG, chụp lần lượt ở các vật kính (×10) và (×20). (D) và (E). Giá thể màng chân bì sau khi hoàn tất quy trình, được nhuộm H-SG, chụp lần lượt ở các vật kính (×10) và (×20). Hình 3.9. Kết quả nuôi cấy TBGTM trên màng chân bì. (A) và (B). Kết quả nuôi cấy TBGTM trên màng chân bì được nhuộm H-SG quan sát ở độ phóng đại ×100 và ×200. (C). Ở độ phóng đại ×400 quan sát thấy ác TBGTM hiện diện trong màng chân bì bắt màu hồng đậm (mũi tên đỏ). A B C B C 17 4.2.3. Kết quả tạo tấm tế bào sụn từ sự kết hợp của TBGTM và màng chân bì: Kết quả nghiên cứu cho thấy, các tế bào sụn đã bám dính và tăng trưởng khá tốt trên màng chân bì. Quan sát trên kính hiển vi đảo ngược thấy tế bào hiện diện ở xung quanh và xâm nhập vào bên trong kết cấu collagen của màng chân bì (Hình 3.11). Hình 3.11. Kết quả chuyển TBGTM lên màng chân bì mốc ngày thứ 14 sau biệt hóa tạo sụn (A). Màng chân bì sau khi được cuộn 2 lần bởi lớp TBGTM biệt hóa sụn ngày thứ 14 (độ phóng đại x100), (B). Lớp TBGTM hiện diện ở xung quanh và xâm nhập vào bên trong kết cấu collagen của màng chân bì (độ phóng đại x100), (C). Lớp TBGTM bám phía ngoài rìa màng chân bì (độ phóng đại x400). 4.2.4. Kết quả đánh giá một số đặc điểm của tấm tế bào sụn được tạo bằng mô học và SEM: Trên tiêu bản nhuộm H&E và nhuộm Safranin – O đều cho thấy có sự hiện diện tế bào (Hình 3.14), hình thái tế bào thay đổi từ thon dài chuyển sang đa diện và xung quanh tế bào bắt đầu hình thành các hốc trống giống như hình thái tế bào sụn trong mô sụn. Ngoài ra, sử dụng kỹ thuật chụp SEM để đánh giá kết quả tạo tấm tế bào sụn cho A B C 18 thấy, các tế bào sụn bám dính và lan tỏa rất tốt trên bề mặt màng chân bì (hình 3.15). Hình 3.14. Cấu trúc mô học nhuộm H&E và Safranin O của tấm tế bào sụn sau khi chuyển TBGTM 2 lần. (A), (B) Tấm tế bào sụn nhuộm HE ở độ phóng đại x200 và x400 cho thấy bên trong xuất hiện rất nhiều tế bào sụn (mũi tên màu đen). (C), (D) Tấm tế bào sụn nhuộm Safranin O ở độ phóng đại x200 và x400, kết quả nhuộm cho thấy các tế bào sụn bắt màu đỏ cam sáng màu (mũi tên màu xanh). 4.3. Kết quả đánh giá tiềm năng tái tạo mô sụn in vivo của mảnh ghép tấm tế bào sụn trên mô hình thỏ: Tổng số thỏ được ghép thành công và đạt chỉ tiêu về thời gian nghiên cứu là 18 thỏ. Trong quá trình thực hiện nghiên cứu đã loại bỏ 3 thỏ (chiếm khoảng 14% tổng số thỏ ghép) do vết mổ bị nhiễm A B C D 19 trùng, khớp đầu gối bị sưng phù, cứng bất động. Nguyên nhân dẫn đến kết quả ghép thất bại chủ yếu là khâu kỹ thuật mổ ghép và chăm sóc hậu phẫu sau ghép. Hình 3.15. Tấm tế bào sụn quan sát dưới KHV điện tử quét (SEM) (A). Giá thể màng chân bì (chứng âm), không có nuôi tế bào. (B). Kết quả tạo tấm tế bào sụn, các tế bào sụn phát triển và tăng trưởng rất nhiều bám vào các khung collagen trong giá thể (x200). (C), (D) Kết quả chụp (x500) và (x1000), các tế bào bám dính và tăng trưởng trên bề mặt giá thể (mũi tên). 20 Hình 3.17. Hình ảnh thu nhận mẫu ghép để đánh giá mô học (A) Vùng tổn thương sụn không được ghép mảnh ghép sau 3 tháng; (B) Vùng tổn thương sụn có ghép mảnh ghép sau 3 tháng; (C) Tấm tế bào sụn sau 3 tháng được cố định bằng chỉ phẫu thuật và dính với vùng mô sụn chủ xung quanh; (D) Mảnh ghép được cắt mỏng để xử lý mô học, vị trí mảnh ghép được xác định rõ (mũi tên đỏ) so với vùng mô xung quanh Ở kết quả ghép chúng tôi ghi nhận sau ghép 3 tháng không có sự cải thiện đáng kể nào liên quan đến khả năng tái sinh nội tại ở nhóm đối chứng. Ở nhóm 1 thấy xuất hiện lớp mô mới chứa tế bào giống tế bào trung mô và tế bào sụn ở vị trí tiếp xúc với vùng mô xương dưới lớp sụn. Riêng ở nhóm 2 được ghép tấm tế bào sụn thì thấy lớp mô sụn tân sinh hình thành rõ và có sự gắn kết với mô sụn chủ, cấu trúc mô học và hình thái tế bào tương đồng với vùng mô sụn thỏ xung quanh (Hình 3.20). Kết quả nhuộm Safranin O cho thấy có sự hiện diện của chất nền sụn 21 được hình thành trong mảnh ghép tấm tế bào sụn và tương đồng với vùng sụn thỏ kế cận (Hình 3.21). Hình 3.20. Kết quả khảo sát mô học tấm tế bào sụn trên thỏ sau 3 tháng (A), (B), (C) là kết quả đánh giá mô học nhuộm H&E của vùng tổn thương sụn ở gối trái không ghép (A), nhóm ghép màng chân bì (B) và nhóm ghép tấm tế bào sụn (C). (D), (E), (F) là A D F C B E 22 kết quả đánh giá mô học nhuộm Trichrome của vùng tổn thương sụn ở gối trái không ghép (D), nhóm ghép màng chân bì (E) và nhóm ghép tấm tế bào sụn (F), (phóng đại x100). Hình 3.21. Kết quả nhuộm Safranin O tấm tế bào sụn trên thỏ (A) vùng sụn bình thường ở thỏ (x40), tấm tế bào sụn bắt màu cam nhạt của chất nền sụn quan sát ở độ phóng đại x100 (B) và x200 (C). 5. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 5.1. Kết luận: 1. Đã thiết lập được quy trình phân lập, nuôi cấy và định danh TBGTM từ mô mỡ thỏ một cách hiệu quả.  Tế bào thu được trên 1 gam mô mỡ lấy trung bình từ 6 mẫu mô đã thu nhận là vào khoảng 4,6 x 105 tế bào.  Quần thể tế bào thu nhận được có đường cong tăng trưởng đạt đỉnh vào ngày thứ 6 sau nuôi cấy, sau đó giảm dần đến ngày thứ 14. A B C 23  Nguồn tế bào thu nhận được thỏa các tiêu chí về TBGTM của ISCT: hình thái giống nguyên bào sợi, khả năng bám dính trên bề mặt chai nuôi và có tiềm năng biệt hóa thành nguyên bào xương, nguyên bào sụn và tế bào mỡ.  Đánh giá biểu hiện các dấu ấn bề mặt TBGTM thu nhận từ mỡ thỏ ghi nhận dương tính với CD14, CD73, CD105, CD106, CD44 và âm tính với CD34, CD45, CD90 ở thế hệ thứ 3. 2. Đã thiết lập được quy trình tạo tấm tế bào sụn từ TBGTM mô mỡ thỏ và màng chân bì da người.  Thu nhận thành công giá thể màng chân bì da người, thỏa các điều kiện của 1 giá thể đáp ứng các tiêu chí sinh học về độ vô khuẩn và không gây độc cho tế bào, phù hợp cho tế bào bám dính và tăng sinh.  Quần thể TBGTM thu nhận từ mỡ thỏ sau khi cảm ứng biệt hóa tạo sụn với các mốc thời gian 7, 14 và 21 ngày có sự biểu hiện rõ ràng với các gien sox9, col2a1, col1a2, colX, acan, runx2.  Đã thiết lập được quy trình tạo tấm tế bào sụn từ TBGTM từ mô mỡ thỏ và màng chân bì. Lớp TBGTM được cảm ứng tạo sụn bám dính và phát triển trên giá thể màng chân bì. Đánh giá một số đặc điểm của tấm tế bào sụn được tạo ra bằng mô học (nhuộm H&E và Safranin O) và SEM cho thấy tấm tế bào sụn có các đặc tính và mang tế bào tương đồng với mô sụn, TBGTM tăng trưởng trên cấu trúc màng chân bì và biệt hóa tiết ra chất nền sụn đặc trưng. 24 3. Đã xây dựng thành công mô hình đánh giá hiệu quả của tấm tế bào sụn phục hồi tổn thương bề mặt sụn khớp trên mô hình thỏ và đánh giá được kết quả mảnh ghép với các mốc theo dõi là 1 tháng, 2 tháng và 3 tháng.  Thực hiện ghép thành công 18 con thỏ, trong đó có 9 con thỏ mang mảnh ghép tấm tế bào sụn và 9 con thỏ mang mảnh ghép màng chân bì không có tế bào với thời gian theo dõi 1 tháng, 2 tháng và 3 tháng.  Kết quả đánh giá dựa vào hình ảnh mô học (Nhuộm H&E, Trichrome và Safranin O) cho thấy tấm tế bào sụn được tạo từ TBGTM từ mô mỡ thỏ và màng chân bì da người có hiệu quả tái tạo mô sụn tốt hơn so với nhóm chứng không ghép và nhóm chỉ ghép màng chân bì không mang tế bào. Nhóm ghép tấm tế bào sụn quan sát thấy sự phục hồi của lớp mô sụn bị tổn thương tốt hơn và mảnh ghép gắn kết chặt chẽ và có đặc tính mô học tương đồng với vùng mô sụn chủ. 5.2. Kiến nghị: - Thực hiện thêm các đánh giá về sự biệt hóa in vivo của tấm tế bào sụn như nhuộm hóa mô miễn dịch với các protein chất nền đặc trưng cho mô sụn. - Khảo sát sự biểu hiện gien tạo sụn của tấ