Tóm tắt Luận án Nghiên cứu chế tạo và đánh giá hiệu quả tác động của hệ nano đa chức năng (polymer - Drug - Fe3O4 - folate) lên tế bào ung thư

hơn hẳn (dƣới 20 mV). Do đó, để đảm bảo hệ đa chức năng mang đƣợc nhiều thuốc nhất và vẫn giữ đƣợc các tính chất từ và độ bền tốt, chúng tôi sử dụng khối lƣợng curcumin khi chế tạo là 60 mg. Khối lƣợng này cũng đƣợc dùng để chế tạo hệ Fe3O4/OCMCS/Cur/Fol. Hàm lƣợng curcumin thực tế đi vào trong hệ đƣợc định lƣợng theo phƣơng pháp phân tích nhiệt (mục 3.3.4). 3.3. Hệ nano mang curcumin FOC và mang curcumin gắn folate FOCF 3.3.1. Phổ hồng ngoại Phổ hồng ngoại của FOC và FOCF đƣợc so sánh với phổ hồng ngoại của từng thành phần: Fe3O4, OCMCS, Curcumin và axit folic. Sự chuyển dịch các pic đặc trƣng chứng tỏ hệ đã đƣợc tổng hợp thành công. 3.3.2. Phổ huỳnh quang Curcumin là hợp chất có khả năng phát huỳnh quang. Sau khi nhận kích thích bởi bức xạ có bƣớc sóng 442nm, dung dịch FOC phát xạ phổ huỳnh quang với bƣớc sóng cực đại ở 515 nm. So với phổ huỳnh quang của curcumin trong dung môi etanol/nƣớc (tỉ lệ 1:1) với cực đại tại 542 nm, trên phổ của FOC có sự chuyển dịch xanh (chuyển dịch 27nm về phía bƣớc sóng ngắn) có thể giải thích là do có tƣơng tác của phân tử curcumin với Fe3O4/OCMCS. Về cƣờng độ, dung dịch FOC phát huỳnh quang yếu hơn hẳn so với curcumin tự do. Nguyên nhân là do sự có mặt Fe3O4 trong mẫu làm giảm khả năng phát huỳnh quang của curcumin [132]. 3.3.3. Ảnh hiển vi điện tử quét (FeSEM) Hình thái học bề mặt của hệ FOC và FOCF đƣợc xác định trên ảnh SEM cho thấy kích thƣớc của các hạt này vào khoảng 30 nm, lớn hơn kích thƣớc của hạt Fe3O4 ban đầu (khoảng 20 nm) chứng tỏ rằng curcumin và axit folic đã hấp phụ lên bề mặt của hạt nano Fe3O4. 3.3.4. Phân tích nhiệt Trên đƣờng TGA của FOC và FOCF xuất hiện tƣơng ứng 2 và 3 khoảng Hình 3.11: Phổ huỳnh quang của FOC và curcumin 7 mất khối lƣợng khi tăng nhiệt độ. Giai đoạn mất khối lƣợng trong dải nhiệt độ từ 360 đến 430 o C xuất hiện ở giản đồ phân tích nhiệt của cả 2 mẫu tƣơng ứng với sự phân hủy của OCMCS và curcumin, và do đó, giai đoạn mất khối lƣợng thứ hai tại 299 o C của mẫu FOCF là do axit folic bị chuyển hóa. Từ các thông số trên giản đồ phân tính nhiệt có thể xác định đƣợc hàm lƣợng của curcumin và Fe3O4 trong FOC là 45% và 48%, hàm lƣợng axit folic, curcumin và Fe3O4 trong mẫu FOCF lần lƣợt là 26%, 25% và 46%. Nhƣ vậy, dung lƣợng hấp phụ curcumin tƣơng ứng là 0,95 mg và 0,54 mg/mg Fe3O4 trong 2 mẫu FOC, FOCF. Dung lƣợng hấp phụ curcumin của FOCF giảm đi so với FOC. Mặc dù vậy, FOCF vẫn mang đƣợc lƣợng curcumin nhiều hơn so với các nghiên cứu khác [134, 176, 177]. Hình 3.14 mô tả cấu trúc của FOC và FOCF, trong đó curcumin đƣợc hấp phụ trên bề mặt của hạt Fe3O4. Hình 3.1: Mô hình cấu trúc hệ FOC và FOCF 3.3.5. Giản đồ nhiễu xạ tia X và tính chất từ 30 40 50 60 70 2theta ( o ) (a)Fe3O4 (b) Fe3O4/OCMCS/Cur (c) Fe3O4/OCMCS/Cur/Fol (a) (b) (c) (200) (311) (400) (422) (511) (440) -15000 -10000 -5000 0 5000 10000 15000 -80 -60 -40 -20 0 20 40 60 80 -25 -20 -15 -10 -5 0 0.0 0.5 1.0 1.5 (c) Fe 3 O 4 /OCMCS/Cur/folic (b) Fe 3 O 4 /OCMCS/Cur (a) Fe 3 O 4 M s ( e m u /g ) H (Oe) (a) (b) (c) Hình 3.15: Giản đồ nhiễu xạ tia X của (a) Fe3O4, (b) FOC và (c) Fe3O4/OCMCS/Cur/Fol Hình 3.16: Đƣờng cong từ trễ của (a) Fe3O4,(b) FOC và (c) FOC /Fol tại nhiệt độ phòng Giản đồ nhiễu xạ tia X của FOC và FOCF (hình 3.15) xuất hiện các pic tƣơng ứng với 6 mặt phẳng mạng đặc trƣng của Fe3O4 là (200), (311), (400), 8 (422), (511) và (440), chứng tỏ cấu trúc spinel của Fe3O4 không thay đổi trong quá trình dẫn thuốc. Các phép đo từ cũng chứng minh hệ nano mang thuốc giữ nguyên đƣợc cấu trúc tinh thể (hình 3.10). Từ độ bão hòa của FOC và FOCF NPs vào khoảng 50 emu/g, thấp hơn 20 emu/g so với Fe3O4 tự do do sự hấp phụ của curcumin hoặc axit folic lên bề mặt của Fe3O4. Ngoài ra, giá trị từ dƣ Mr và lực kháng từ Hc của cả 2 hệ đều gần bằng 0 chứng minh tính chất siêu thuận từ của hạt Fe3O4 kích thƣớc dƣới 30 nm [169]. 3.3.6. Kết quả đốt nóng cảm ứng từ Kết quả đốt nóng cảm ứng đƣợc trình bày trong bảng 3.4. Khi nồng độ oxit sắt từ giảm, cả nhiệt độ bão hòa Ts và tốc độ tăng nhiệt ban đầu dT/dt (xác định tại t=0) đều giảm. Nồng độ hạt từ từ 0,3 mg/ml trở lên đều cho nhiệt độ bão hòa lên tới hơn 42 o C và cao hơn sau 10 phút. Bảng 3.4: Thông số đốt nóng cảm ứng của các mẫu mang curcumin Nồng độ (mg/ml) FOC FOCF Ts (1500 s) dT/dt Ts (1500 s) dT/dt 0,1 45,5 0,02 38,6 0,01 0,3 50,0 0,03 44,2 0,02 0,5 54,6 0,04 54,7 0,03 0,7 58,6 0,06 58,9 0,04 1 64,3 0,09 67,5 0,06 Thời gian lƣu 10 phút và có thể kéo dài hơn có thể thiết lập đƣợc khi duy trì điều kiện từ trƣờng đốt. Vì tế bào ung thƣ có thể trải qua quá trình apoptosis (chết theo chƣơng trình) trong khoảng nhiệt độ từ 42–46◦C [73], hệ FOCF hoàn toàn có thể ứng dụng trong điều trị ung thƣ bằng phƣơng pháp nhiệt trị. 3.3.9. Độc tính tế bào Các ảnh chụp huỳnh quang cho thấy sự xâm nhập của curcumin vào bên trong tế bào HT29 (tín hiệu màu xanh) khi ủ với FOC (hình 3.21). Nguyên nhân của tín hiệu màu xanh lục ở đây là do curcumin có khả năng tự phát huỳnh quang khi kích thích bằng laze Agon. Ở mẫu đối chứng không xuất hiện tín hiệu này. Kết quả này đồng thời chứng tỏ rằng kết hợp curcumin lên hệ mang nano không ảnh hƣởng tới khả năng nhập bào của curcumin, hệ nano vẫn đảm bảo đƣa đƣợc curcumin vào trong tế bào. 9 Curcumin Kết hợp: Đỏ - actine; xanh lam – nhân; xanh lục – curcumin Hình 3.21: Ảnh huỳnh quang của tế bào HT29 trong điều kiện bình thƣờng (control) và trong điều kiện ủ 15 giờ với hệ FOC 3.3.10. Phân bố sinh học Phân bố của FOC và FOCF trong các cơ quan trên chuột mang khối u Sarcoma 180 đƣợc xác định dựa trên hình ảnh giải phẫu các mô này (hình 3.23). Các chấm màu nâu đậm trên ảnh giải phẫu mô là các đám hạt nano oxit sắt từ bị kết tụ lại với nhau. Các nghiên cứu in vivo theo dõi phân bố sinh học của các mẫu nano Fe3O4 (đƣợc chức năng hóa bề mặt khác nhau) trên chuột khỏe mạnh đã chỉ ra rằng các hạt nano từ này sẽ phân bố chủ yếu tại gan và lá lách và chuyển hóa một phần thành các dạng hợp chất không độc khác nhau của sắt dƣới tác động của các đại thực bào đơn nhân. Sau 14 ngày tiêm nano Fe3O4, dấu vết của các hệ này vẫn còn trong gan nhƣng không gây ảnh hƣởng đến tế bào gan, sau 58 ngày thì các dấu vết này hoàn toàn biến mất [181]. Trong nghiên cứu này, hệ nano FOC và FOCF cũng phân bố đến gan và lách, ngoài ra, trên khối u ghi nhận rõ sự xuất hiện của các hệ này. Hàm lƣợng FOCF trong khối u Sarcoma 180 (đã đƣợc chứng minh có biểu hiện quá mức thụ thể folate [182]) cao hơn nhiều so với FOC sau khi tiêm 2,5 h. Sau 5 h, hàm lƣợng hạt từ có folate vẫn cao hơn hệ không có folate chứng minh tính hƣớng đích của gốc folate. Từ đƣờng cong đốt từ có 10 thể thấy rằng hàm lƣợng Fe3O4 càng cao thì khả năng tăng nhiệt và nhiệt độ bão hòa càng cao, do đó khi tăng nồng độ Fe3O4 nhờ yếu tố hƣớng đích folat, hệ có thể đƣợc dùng hiệu quả hơn trong nhiệt trị ung thƣ. Ngoài ra, khi áp một nam châm vào lƣng chuột điều trị bằng FOCF, sau 5h, lƣợng hạt từ xuất hiện ở thận và lá lách cao hơn chuột điều trị bằng FOC. Điều này cho thấy, gốc folate và từ trƣờng có thể giúp hƣớng đích tới những khối u xuất hiện ở các cơ quan này. CHƢƠNG 4: HẠT NANO Fe3O4 BỌC BẰNG ALGINATE MANG DOXORUBICIN 4.1. Ảnh hƣởng của nồng độ alginate đến khả năng mang Dox và các tính chất của hệ đa chức năng Khác với curcumin, Dox là thuốc tan tốt trong nƣớc. Do đó, Dox khó có thể tƣơng tác với bề mặt kị nƣớc của Fe3O4. Để đƣa Dox lên hệ đa chức năng, cần phải gắn kết Dox với bề mặt hạt bằng liên kết hoá học. Nghiên cứu đã chỉ ra rằng lớp vỏ polime là yếu tố quyết định đến khả năng mang Dox của hạt nano Fe3O4 [143]. 4.1.1. Phổ hồng ngoại và phổ huỳnh quang Liên kết Fe-O của Fe3O4 trong các mẫu FA4, FA10, FA4D đƣợc đặc trƣng bởi các pic trong vùng 570 cm -1 . So với Fe3O4 nguyên chất (575 cm -1 ), số sóng của dao động Fe-O trong các mẫu bọc alginate giảm đi (lần lƣợt là 566, 574 và 563 cm -1 trên phổ của FA4, FA10, FAD) chứng tỏ quá trình bọc polime alginate lên bề mặt hạt từ Fe3O4 đã thực hiện đƣợc. Bên cạnh đó, sự chuyển dịch về số sóng đặc trƣng cho các liên kết hữu cơ chứng tỏ Doxorubicin đã đƣợc mang lên hệ hạt nano. Hình 4.2 là phổ huỳnh quang của FA4D so với Dox tự do. Liên kết hóa học giữa Dox và hạt nano từ có thể đƣợc khẳng định bằng sự thay đổi vị trí đỉnh huỳnh quang của mẫu FA4D (chuyển dịch 17 nm so với Dox tự do) [132]. Hơn nữa, cƣờng độ huỳnh quang của FA4D giảm mạnh có thể là do hiệu ứng dập tắt huỳnh quang của Fe3O4 có mặt trong mẫu [183]. Hình 4.2: Phổ huỳnh quang của Dox và FA4D (cùng nồng độ Dox) 11 4.1.2. Dung lượng thuốc (LC) và hiệu suất mang thuốc (EE) Dung lƣợng mang thuốc của các mẫu đƣợc trình bày trong bảng 4.1. Các dữ kiện cho thấy nồng độ alginate là yếu tố quan trọng tác động tới hiệu suất mang Dox. Nồng độ alginate càng cao, khả năng mang Dox càng lớn. Hiện tƣợng này có thể đƣợc giải thích do sự hình thành liên kết giữa Dox và alginate trên bề mặt của hạt nano Fe3O4. Tuy vậy, do hàm lƣợng alginate tăng từ FA2D đến FA10D, khối lƣợng cả hệ tăng nên dung lƣợng thuốc không tăng một cách liên tục. Dung lƣợng thuốc trong hệ đạt giá trị cực đại ở mẫu FA4D, do đó chúng tôi lựa chọn mẫu này cho thử nghiệm sinh học. Bảng 4.1: Giá trị EE và LC Mẫu FA2D FA4D FA6D FA8D FA10D EE (%) 61,2±0,5 78,5±0,3 85,0±0,9 87,2±0,8 90,8±0,7 LC (%) 17,9±0,2 19,0±0,1 17,5±0,2 15,6±0,1 14,4±0,1 4.1.3. Phân bố kích thước và ảnh TEM của hệ Dải phân bố kích thƣớc hạt của hệ nano xác định bằng phổ DLS phụ thuộc rất nhiều vào nồng độ alginate. Trƣớc khi mang thuốc Dox, hạt Fe3O4 bọc bằng alginate FA4 và FA8 có kích thƣớc thuỷ động là 18 nm và 91 nm. Nồng độ cao của alginate ở mẫu FA8 tạo ra lớp vỏ bọc dày hơn và mở rộng kích thƣớc thuỷ động của hạt do tính ƣa nƣớc của alginate. Mang Dox trong hệ mẫu FA4D và FA8D làm tăng rõ rệt kích thƣớc hạt trong dung dịch (tƣơng ứng là 255 và 480 nm), đồng thời dải phân bố kích thƣớc cũng trở nên rộng hơn so với FA4 và FA8. Tƣơng ứng với lƣợng thuốc Dox, FA8D chứa nhiều Dox hơn FA4D nên sự tăng kích thƣớc cũng nhiều hơn so với FA4D. Hệ FA4D có kích thƣớc thích hợp hơn so với FA8D cho các ứng dụng y sinh. Ảnh TEM cho thấy kích thƣớc hạt thay đổi từ 6 đến 13 nm, kích thƣớc trung bình vào khoảng 9,3 nm tƣơng ứng với kích thƣớc tính đƣợc từ phƣơng pháp nhiễu xạ tia X (Hình 4.5) theo phƣơng trình Scherrer (D=K/(cos)8 nm [161]. 4.1.4. Giản đồ nhiễu xạ tia X (XRD) và tính chất từ 12 30 40 50 60 70 L in ( c p s ) 2theta ( o ) Fe3O4 FA4D (220) (311) (400) (422) (511) (440) -10000 -5000 0 5000 10000 -60 -40 -20 0 20 40 60 -40 -20 0 0 1 2 3 4 M s ( e m u g -1 ) H (Oe) M s ( e m u g -1 ) H (Oe) FA2 FA4 FA6 FA8 FA10 FA4D FA8D Các pic đặc trƣng của tinh thể Fe3O4 trong mẫu FA4D xuất hiện đầy đủ trên giản đồ XRD của FA4D (hình 4.5). Các pic này có cƣờng độ tƣơng đối thấp so với Fe3O4 tự do do sự có mặt của các thành phần hữu cơ (alginate và Dox) trong hệ. Trên hình 4.6 có thể nhận thấy cả từ dƣ và hệ số kháng từ của các mẫu đều xấp xỉ bằng 0, chứng minh rằng các hệ hạt đều là siêu thuận từ. Thêm vào đó, giá trị Hc và Mr của FA4D và FA8D lớn hơn nhiều so với các mẫu không mang thuốc. Điều này có thể là do Dox làm thay đổi tính chất dị hƣớng từ của vật liệu [186]. Từ độ giảm khi tăng nồng độ alginate (từ FA4 đến FA10). Giá trị từ độ của mẫu FA4 là cao nhất trong dãy mẫu này. Nguyên nhân của hiện tƣợng này là do hàm lƣợng alginate, một chất phi từ, tăng dần trong các mẫu. Riêng đối với FA2, từ độ bão hoà thấp nhất trong dãy của mẫu này có thể đƣợc giải thích là do ở nồng độ alginate nhỏ, polime này không đủ bao phủ bề mặt hạt từ, do đó chúng có thể bị oxi hoá một phần bởi không khí trong quá trình sấy mẫu, trở thành Fe2O3 có từ độ thấp hơn [164]. Từ độ bão hoà của FA4D và FA8D, 2 mẫu mang Dox giảm mạnh so với các mẫu không mang thuốc (tƣơng ứng là 51,6 và 33,9 emu/g) chứng tỏ Dox đã đƣợc mang lên hệ với lƣợng đáng kể. Sự giảm sâu hơn của từ độ mẫu Hình 4.5: Giản đồ XRD của FA4D Hình 4.6: Tính chất từ của các hệ hạt Bảng 4.2: Các thông số từ của các mẫu bọc bằng alginate Mẫu FA2 FA4 FA6 FA8 FA10 FA4D FA8D Fe3O4 [176] Fe3O4 [177] Ms (emu/g) 61,2 69,5 65,3 65,8 63,9 51,6 33,9 43 25 Hc (Oe) 18 14 12 13 17 50 52 45 108 Mr (emu/g) 1,5 1,4 1,0 1,1 1,6 4,1 3,2 2 6 13 FA8D so với FA4D là kết quả của việc mang lƣợng Dox lớn hơn trong hệ này. Tuy giảm, các giá trị từ độ bão hoà của FA4D và FA8D vẫn đủ lớn để tách khỏi hệ phản ứng dễ dàng, nhanh chóng bằng từ trƣờng ngoài. 4.1.5. Kết quả đốt nóng cảm ứng từ Kết quả đốt nóng cảm ứng từ mẫu FA4 và FA4D với các nồng độ khác nhau (từ 0,5 đến 3,0 mg/ml), và các mẫu Fe3O4 tự do, FA4, FA8, FA4D cùng nồng độ 3,0 mg/ml xác định tại cùng điều kiện từ trƣờng tần số 178 kHz và cƣờng độ 80 Oe đƣợc trình bày trên hình 4.7 và bảng 4.3. Các đặc trƣng đốt nóng cảm ứng từ hình 4.7a và 4.7b cho thấy giá trị nhiệt độ bão hoà Ts (xác định ở thời gian đốt 1500 s) phụ thuộc vào nồng độ. Khi nồng độ hạt từ giảm (bằng cách pha loãng với nƣớc), cả nhiệt độ bão hoà Ts và tốc độ tăng nhiệt ban đầu dT/dt đều giảm. Tất cả các mẫu đều đạt nhiệt độ 42°C và cao hơn trong 20 phút. Hệ có khả năng duy trì đƣợc khoảng nhiệt độ này nếu tiếp tục chiếu từ. Do tế bào ung thƣ có thể bị tiêu diệt trong vùng nhiệt độ 42–46 o C [73], các hệ nano từ đã chế tạo (cả hệ không mang thuốc FA4 và hệ mang thuốc FA4D) đều có khả năng làm hạt nhân tạo nhiệt tốt cho ứng dụng nhiệt trị. Mặc dù từ độ bão hoà có chênh lệch lớn (hình 4.6), nhƣng khả năng đốt nóng của các mẫu này không khác nhau nhiều. Do đó, FA4D có thể trở thành tác nhân điều trị ung thƣ kết hợp: vừa có khả năng hoá trị liệu, vừa có khả năng nhiệt trị. Bảng 4.3: Số liệu đốt nóng cảm ứng từ của các mẫu FA4, FA4D, FA8 và Fe3O4 Mẫu Nồng độ (mg/ml) T1500s ( o C) dT/dt SAR (W/g) ILP (nHm 2 .kg -1 ) FA4 0,5 49,7 0,03 225,7 1 52,1 0,03 129,6 2 62,1 0,04 85,7 3 68,4 0,06 85,0 11,6 FA4D 0,5 48,1 0,02 150,5 14 1 50,5 0,03 112,9 2 59,2 0,04 73,2 3 65,1 0,05 66,9 9,2 FA8 3 62,1 0,05 64,1 8,8 Fe3O4 3 60,1 0,07 103,1 14,1 Công suất toả nhiệt (SAR) của FA4 và FA4D giảm theo nồng độ của chất lỏng từ. Hiện tƣợng này có thể đƣợc giải thích là do khi nồng độ tăng, khoảng cách giữa các hạt từ giảm, tạo ra tƣơng tác lƣỡng cực từ mạnh hơn giữa chúng. Ở nồng độ thấp, các hạt đủ xa nhau để sinh nhiệt hiệu quả ra môi trƣờng. Hiện tƣợng tƣơng tự cũng quan sát đƣợc đối với hạt nano Fe3O4 bọc PAA [189] hoặc nano ferrit tổ hợp [15]. 4.1.6. Phân tích nhiệt Cả 2 mẫu đều mất khối lƣợng ở khoảng nhiệt độ từ 80-550 o C. Giai đoạn mất khối lƣợng thứ hai của 2 mẫu rất khác nhau, FA4 xuất hiện 2 pic toả nhiệt nhƣng chỉ mất 12% khối lƣợng trong suốt quá trình đốt nóng. Sự mất khối lƣợng này là do quá trình phân huỷ alginate trong mẫu, Ngƣợc lại, FA4D chỉ có 1 pic mất 24% khối lƣợng (gấp đôi so với FA4) ở 380 o C. Sự mất khối lƣợng này là do thành phần hữu cơ trong hệ bị phân huỷ. Pic năng lƣợng duy nhất chứng minh sự tạo phức giữa Dox với lớp vỏ alginate trong hệ. a) 100 200 300 400 500 600 700 800 -20 -15 -10 -5 0 5 10 TG dong nhiet Nhiet do ( o C) T G ( /% ) 0 2 4 6 8 10 12 14 16 D o n g n h ie t ( V ) b) 100 200 300 400 500 600 700 800 -30 -25 -20 -15 -10 -5 0 5 TG dong nhiet Nhiet do ( o C) T G ( /% ) 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 D o n g n h ie t ( V ) Hình 4.9: Giản đồ phân tích nhiệt của FA4 (a) và FA4D(b) Hình 4.10 mô tả cấu trúc chung của các hạt nano Fe3O4 bọc bằng alginate mang doxorubicin (FA4D hoặc FAD) và hạt tƣơng ứng gắn thêm folate (FADF). Trong đó, Dox đƣợc mang trên lớp vỏ alginate nhờ tƣơng tác hóa học 15 Hình 4.1: Sơ đồ cấu trúc của FAD và FADF 4.1.7. Quá trình giải phóng thuốc in vitro Trong 12 h đầu tiên, tốc độ nhả thuốc là lớn nhất (đƣờng biểu diễn có độ dốc lớn) và lƣợng thuốc tách ra đạt 21,0% và 29,5 % sau 12 h tại pH=7,4 và pH=5 tƣơng ứng. Nói chung, lƣợng Dox tách ra ở môi trƣờng trung tính ít hơn so với môi trƣờng axit. Sau 120 h, khoảng 61% tổng lƣợng Dox trong FA4D tách khỏi hệ ở pH=5 và 42% ở pH=7,4. Quá trình giải phóng Dox khỏi hệ nano đƣợc thực hiện bởi sự thuỷ phân phức chất tạo thành giữa Dox và alginate hoặc sự phân huỷ lớp vỏ alginate bởi quá trình thuỷ phân. Cả 2 quá trình thuỷ phân này đều đƣợc tăng tốc trong môi trƣờng axit. Do môi trƣờng khối u ung thƣ là môi trƣờng axit, hiện tƣợng này cho thấy hệ dẫn thuốc nano FA4D phù hợp để điều trị ung thƣ. 0 20 40 60 80 100 120 0 10 20 30 40 50 60 70 % D o x g ia i p h o n g Thoi gian (h) pH=7.4 pH=5 Hình 4.11: Quá trình nhả thuốc của FA4D ở pH 7,4 và pH 5 4.1.8. Độc tính tế bào Doxorubicin là hợp chất có độc tính cao với tế bào thƣờng [140] và có giá trị IC50 rất thấp với một số dòng tế bào ung thƣ (thấp hơn 1 g/ml) [147]. Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng 5 dòng tế bào Hep-G2, LU-1, RD, FL và Vero (hình 4.12). Kết quả nghiên cứu cũng cho thấy hệ nano mang 16 Dox có độc tính cao trên các dòng tế bào này (giá trị IC50 từ 0,60 đến 1,41g/ml). Các giá trị này đều cao hơn so với của Dox tự do. Điều này đƣợc lí giải bởi quá trình nhả chậm của Dox từ hệ nano [147]. Bên cạnh đó, giá trị IC50 đối với các dòng tế bào ung thƣ Hep-G2, LU-1, RD và FL thấp hơn so với dòng tế bào thƣờng (Vero) chứng tỏ rằng hệ nano biểu hiện độc tính đối với tế bào ung thƣ cao hơn so với tế bào lành. Do đó, hệ dẫn thuốc này cho phép hoá trị liệu an toàn hơn cho điều trị ung thƣ do giảm đƣợc độc tính với tế bào thƣờng. a) 0.2 01 05 25 0 20 40 60 80 100 T i le t e b a o c o n s o n g ( % ) Nong do (g/ml) Hep-G2 LU-1 RD FL Vero b) Hep-G2 LU-1 RD FL Vero 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 IC 5 0 (  g /m l) Dong te bao FA4D DOX 0.72 0.21 0.96 0.39 0.60 0.11 1.20 0.16 1.41 1.30 Hình 4.12: Đƣờng cong đáp ứng liều và tƣơng quan giá trị IC50 của hệ FA4D 4.2. Ảnh hƣởng của lõi Fe3O4 tổng hợp vi sóng tới tính chất hệ nano Kĩ thuật vi sóng đƣợc sử dụng để tổng hợp nano Fe3O4 với nhiều ƣu điểm, đáng kể nhất là kĩ thuật này cho phép rút ngắn thời gian phản ứng và tổng hợp đƣợc lƣợng lớn. Trong phần này, chúng tôi khảo sát các điều kiện tổng hợp nano Fe3O4 với kĩ thuật vi sóng và so sánh hiệu quả diệt tế bào của hệ đa chức năng với lõi là hạt Fe3O4 tổng hợp vi sóng với hạt Fe3O4 đồng kết tủa đơn thuần. Để đánh giá khả năng đốt nóng cảm ứng và tƣơng tác với các hệ sinh học của vật liệu, chúng tôi tiến hành tạo mẫu FA và FAD với các thành phần và phƣơng pháp nhƣ FA4 và FA4D từ hạt Fe3O4 M5 chế tạo bằng kĩ thuật vi sóng. 4.2.1. Một số đặc trưng vật liệu và kết quả đốt nóng cảm ứng Các mẫu FA và FAD đều có độ bền cao, thể hiện ở giá trị thế Zeta âm lớn. Đƣờng cong đốt nhiệt thể hiện xu hƣớng tƣơng tự so với mẫu tổng hợp trong điều kiện đồng kết tủa thông thƣờng. So sánh nhiệt độ bão hoà (xác định ở thời điểm 1500 s) của FA và FAD (bảng 4.6) với kết quả tƣơng ứng của FA4 và FA4D (bảng 4.3) nhận thấy không có khác biệt đáng kể về hiệu ứng đốt nóng của các mẫu tổng hợp nhờ vi sóng so với điều kiện tổng hợp thông thƣờng. 17 4.2.2. Độc tính tế bào Kết quả so sánh giá trị IC50 của các mẫu chế tạo vi sóng và chế tạo đồng kết tủa thông thƣờng đƣợc trình bày trên bảng 4.7. Bảng 4.7: IC50 của hệ mẫu vi sóng so với mẫu đồng kết tủa thông thường Dòng tế bào Hep- G2 LU-1 RD FL Vero HeLa Dox 1 Dox 2 0,21 0,18 0,39 0,35 0,11 - 0,16 - 1,30 1,34 - 0,25 FA4D 0,72 0,96 0,60 1,20 1,41 - FAD 0,67 1,02 - - 1,43 0,81 FADF 0,44 0,87 - - 1,39 0,68 1 Mẫu đối chứng trong thí nghiệm xác định IC50 của FA4D 2 Mẫu đối chứng trong thí nghiệm xác định IC50 của FAD và FADF Kết quả trên bảng 4.7 cho thấy mẫu FAD gây tác động lên các dòng tế bào Hep-G2, LU-1 và Vero không khác biệt đáng kể so với mẫu FA4D. Điều này cho thấy việc sử dụng kĩ thuật vi sóng để chế tạo Fe3O4 không chỉ đáp ứng về mặt vật liệu mà còn đảm bảo về mặt tƣơng tác với hệ sinh học. Sự bảo toàn tính chất về vật liệu hoặc tƣơng tác sinh học này của hệ FAD so với FA4D có thể là do bản chất phƣơng pháp của kĩ thuật vi sóng chúng tôi sử dụng vẫn là phƣơng pháp đồng kết tủa. Ƣu điểm của kĩ thuật này là thao tác đơn giản, thời gian phản ứng đƣợc rút ngắn. Đặc biệt, kĩ thuật này cho phép tổng hợp đƣợc lƣợng lớn hạt nano Fe3O4. Do đó, trong các nghiên cứu tiếp theo để tổng hợp hệ mang Dox gắn folat hoặc quantum dots và mẫu thực hiện thử nghiệm điều trị in vivo, chúng tôi đều sử dụng hạt Fe3O4 điều chế bằng kĩ thuật vi sóng. 4.3. Hệ nano mang Dox gắn folate (FADF) hoặc CdTe (FADQ) 4.3.1. Phổ hồng ngoại Phổ hồng ngoại chứng minh sự tồn tại của axit folic trong hệ FADF. 4.3.2. Phổ huỳnh quang Phổ huỳnh quang của FADF so với axit folic đã có sự chuyển dịch rõ ràng về đỉnh phát xạ (từ 420 nm thành 428 nm). Đỉnh phổ tại 428 nm cách xa rất nhiều so với đỉnh phổ của Dox chứng tỏ trong 2 thành phần huỳnh quang, axit folic chiếm ƣu thế hơn trong mẫu FADF. Kết quả này một lần nữa khẳng định sự có mặt của axit folic trong hệ. Mặt khác, phổ huỳnh quang của mẫu FAD có cƣờng độ thấp hơn rất nhiều so với Dox, trong khi đó huỳnh quang 18 của Dox bị dập tắt hoàn toàn trong mẫu FADF (không có đỉnh phổ trong vùng 612 nm). Trong trƣờng hợp FADF, cƣờng độ huỳnh quang của mẫu này giảm ít so với axit folic cho phép dùng FADF làm đầu dò huỳnh quang để quan sát tƣơng tác của hệ nano với các hệ sinh học. a) 400 450 500 550 600 650 700 0 10000 20000 30000 40000 50000 c u o n g d o buoc song (nm) folic FADF FAD DOX 420 428 b) 450 500 550 600 650 700 0 10000 20000 30000 40000 50000 60000 70000 450 500 550 600 650 700 0 10000 20000 S 1 ( C o u n ts ) FAQ 0.05 mg Fe3O4/ml FAQ 0.1 mg Fe3O4/ml FAQ 0.2 mg Fe3O4/ml FAQ 0.4 mg Fe3O4/ml FAQ 0.8 mg Fe3O4/ml Wavelength (nm) FAQD 0.05 mg Fe3O4/ml FAQD 0.1 mg Fe3O4/ml FAQD 0.2 mg Fe3O4/ml FAQD 0.4 mg Fe3O4/ml FAQD 0.8 mg Fe3O4/ml 580 nm 612 nm Hình 4.17: Phổ huỳnh quang của FAD, FADF so với axit folic và Dox (a) và các mẫu chứa chấm lƣợng tử CdTe (b) Các mẫu FAQ và FADQ chứa CdTe đều có pic huỳnh quang tại vị trí 580 nm đặc trƣng của CdTe. Ngoài ra, các mẫu FADQ mang Dox cho huỳnh quang tại vị trí 612 nm, tƣơng tự nhƣ FAD. 4.3.6. Quá trình giải phóng Dox thụ động và chủ động nhờ hiệu ứng đốt nóng cảm ứng Mô hình phóng thích Dox thụ động ở điều kiện 37 o C từ mẫu FADF đƣợc thực hiện và cho kết quả tƣơng tự nhƣ mẫu FAD. Thay đổi pH của dung dịch gần nhƣ không ảnh hƣởng tới khả năng đốt nóng của hệ FADF trong từ trƣờng. Ngay ở nhiệt độ tƣơng đƣơng với nhiệt độ cơ thể (khoảng 37 o C), Dox đƣợc giải phóng từ 4,7 đến 11,2% từ FAD hoặc FADF. Từ trƣờng cƣờng độ 80 Oe cho nhiệt độ đốt nóng cao hơn, quá trình giải phóng thuốc cũng diễn ra nhanh hơn, đồng thời lƣợng Dox đƣợc giải phóng lớn hơn. Khác với quá trình giải phóng thuốc thông thƣờng, quá trình đốt nóng cảm ứng sinh nhiệt từ bên trong hạt đã kích thích quá trình giải phóng thuốc diễn ra nhanh hơn. Nhƣ vậy, có thể điều chỉnh từ trƣờng ngoài để điều khiển tốc độ và lƣợng thuốc phóng thích. Một số nghiên cứu khác cũng chỉ ra rằng có thể giải phóng thuốc một cách chủ động. Bảng 4.9: Thông số giải phóng Dox khi đốt nóng với từ trường khác nhau Thời gian (s) FAD pH 5 FAD pH7.4 FADF pH 5 FADF pH 7.4 Nhiệt độ % Dox giải Nhiệt độ % Dox giải Nhiệt độ % Dox giải Nhiệt độ % Dox giải phóng 19 ( o C) phóng ± SD ( o C) phóng ± SD ( o C) phóng ± SD ( o C) ± SD 0 30 0 30 0 30 0 30 0 70 Oe 750 39,27 11,2±1,3 40,23 6,0±0,7 37,63 10,9±0,4 38,11 4,7±1,0 1500 43,08 28,8±0,8 44,52 25,3±1,3 42,35 29,1±0,6 43,48 24,4±0,7 2250 45,32 49,5±0,9 46,05 37,9±1,8 43,68 46,7±1,7 44,99 37,2±1,3 3000 45,87 56,3±1,5 46,81 41,5±1,2 44,30 51,6±1,0 45,71 39,4±2,0 80 Oe 750 46,13 30,1±1,5 45,56 21,5±0,5 45,87 28,2±2,0 46,22 20,6±0,9 1500 51,25 53,5±0,6 50,78 38,8±2,1 50,19 48,0±1,4 51,74 35,4±0,9 2250 51,98 67,6±0,9 51,43 49,4±1,7 51,16 62,7±0,9 52,10 45,1±1,7 3000 52,16 78,1±1,6 51,83 56,4±1,2 51,24 74,2±1,8 52,31 51,0±1,5 Nhƣ vậy, cả 2 hệ FADF và FADQ đều có các tính chất vật liệu phù hợp để sử dụng đƣợc cho các đối tƣợng sinh học. 4.3.7. Độc tính tế bào 4.3.7.1. Độc tính tế bào của FADF Hep-G2 LU-1 RD Vero 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 IC 5 0 (  g /m l) CdTe FAQ FAQD IC 50 >5 ug/ml Hình 4.26: Độc tính tế bào của các hệ mẫu