Tóm tắt Luận án Nghiên cứu chiết tách, chuyển hóa hóa học và thăm dò hoạt tính sinh học của các triterpenoid từ cây rau má [centella asiatica (l.) urban] họ hoa tán (apiaceae )

ng imidazole tương ứng ở δ (ppm): 7,03 (1H, s, H-2’), 7,54 (1H, s, H-1’), 8,26 (1H, s, H-3’). Phổ 13C-NMR có chứa các tín hiệu của mạch nhánh ở δ (ppm): 137,08 (C-3’), 129,74 (C-1’), 117,94 (C-2’). Amide 154: quan sát trên phổ 1H-NMR của hợp chất 154 có xuất hiện thêm các tín hiệu tại H (ppm): 4,12 (0,5H, q, J = 7,0 Hz, -NH-CH3), 4,36 (0,5H, q, J = 7,0 Hz, -NH-CH3). Amide 155: quan sát trên phổ khối ESI-MS ion dương có xuất hiện ion giả phân tử tại m/z 672 [M+ H]+ phù hợp với CTPT C39H61NO8 của hợp chất này. Phổ 1 H-NMR của hợp chất 155 có xuất hiện thêm các tín hiệu tại H (ppm): 3,92 (1H, hept, J = 7,0 Hz, H-1’) cùng với tín hiệu của 2 nhóm methyl bậc 2 xuất hiện chồng lấp với các nhóm methyl của khung asiatic acid từ 1,12-1,05 ppm. Phổ 13C-NMR có chứa các tín hiệu của nhóm isopropyl trong mạch nhánh ở vùng trường cao chồng lấp với các tín hiệu khác của khung. Như vậy cấu trúc của hợp chất 155 đã được khẳng định như trong sơ đồ phản ứng (Sơ đồ 4. 1). Phổ 1H và 13C-NMR của hợp chất 156 xuất hiện thêm tín hiệu tại H (ppm): 3,72 (4H, br s, 2H-2’) và C (ppm): 60,87 (C-2’). Các hợp chất 147-156 đã được chứng minh qua các số liệu phổ 1H-NMR, 13C- NMR, ESI-MS. Kết quả hoàn toàn phù hợp với công thức như trong sơ đồ phản ứng (Sơ đồ 4. 1). Các phản ứng acetyl hóa mạch nhánh Các nhóm chức -NH2 và -OH mạch nhánh của các hợp chất 147-150, 156 được acetyl hóa bằng phản ứng với acetyl chloride (CH3COCl) với sự xúc tác của DMAP trong dung môi dichloromethane (DMC) ở nhiệt độ phòng trong thời gian 2 giờ. Xử lý hỗn hợp sau phản ứng như trong phần thực nghiệm 3.3.1 cho các sản phẩm tương ứng 157-161 với hiệu suất từ 75-80%. Trên phổ 1H-NMR của hợp chất 157 cho các tín hiệu tại H (ppm): 6,05 (1H, t, J = 5,0 Hz, -NH-amide), 4,10 (2H, t, J = 6,0 Hz, H-3’), 3,09 (1H, m, H-1’a), 3,39 (1H, m, H-1’b) cùng với một tín hiệu methyl singlet mới tại H (ppm): 2,1 bên cạnh nhóm methylene còn lại của mạch nhánh chồng lấp với các tín hiệu của nhóm -CH2- khác trong khung cho thấy mạch nhánh đã được gắn vào vị trí C-28. Tín hiệu H-3' trong hợp chất 157 xuất hiện ở dạng một triplet ở δH 4,10 ppm (J = 6,0 Hz) so với tín hiệu hợp chất gốc 150 là multiplet ở δH 3,53 -3,63 ppm, chồng 10 lấp với H-23a, H-2'a. Các tín hiệu -NH của 157 cũng dịch chuyển về phía trường cao tại δH 6,05 (t, J = 5,0 Hz) so với δH 6,18 (t, J = 5,5 Hz) trong hợp chất 150. Điều này được chứng minh thêm qua phổ 13C-NMR với sự xuất hiện tín hiệu tại C (ppm): 62,05 (C-3’) (CH2OAc) so với tín hiệu tại C 59,26 ppm (C-3’) của hợp chất 150. Các kết quả trên cho thấy phản ứng acetyl hóa đã được thực hiện như trong Sơ đồ 4. 1. Hợp chất 158 cho thấy xuất hiện thêm các tín hiệu cộng hưởng sau đây so với hợp chất 147 H (ppm): 5,61 (1H, br s, 1’-NH-amide), 5,85 (1H, t, J = 5,0 Hz, 7’- NH-), 3,00 (1H, m, H-1’a), 3,30 (1H, m, H-1’b), 3,23 (2H, q, J = 6,5 Hz, H-7’) bên cạnh các tín hiệu của những nhóm methylene còn lại của mạch nhánh trùng lặp với các nhóm methylene trong khung xuất hiện ở dạng multiplet trong vùng từ 1,98-1,38 (ppm), phù hợp với phổ 1H-NMR. Đặc biệt ở đây tín hiệu H-7’ có dạng quartet do tương tác với 2H-6’ và –NH-Ac tương đương về từ. Phổ 13C-NMR cũng cho thêm một tín hiệu của nhóm acetate tại C (ppm): 170,82 và các tín hiệu của nhóm –CH2 mạch nhánh trong vùng từ 44,0-21,0 ppm trùng lặp với các nhóm methylene trong khung. Điều này được khẳng định qua phổ qua phổ ESI-MS với pic ion giả phân tử tại m/z 769 [M+H]+ phù hợp với CTPT C45H72N2O8 của hợp chất 158. Hợp chất 159: Tương tự như vậy phổ 1H-NMR của hợp chất 159 có xuất hiện thêm các tín hiệu tại H (ppm): 5,88 (t, J = 5,0 Hz, 1’-NH-amide), 5,96 (1H, br s, 9’-NH-amide) bên cạnh các tín hiệu tại H (ppm): 3,01 (1H, m, H-1’a), 3,29 (1H, m, H-1’b), 3,22 (2H, m, H-9’), 1,99 (3H, s) cùng với các tín hiệu của nhóm methylene khác trong mạch nhánh chồng lấp với các nhóm methylene khác của khung. Phổ 13C-NMR có thêm một tín hiệu của nhóm acetyl tại 170,68 ppm cùng với các nhóm methylene trong mạch nhánh chồng lấp với các nhóm methylene trong khung. Điều này được khẳng định thêm qua phổ khối ESI-MS ion âm với pic ion giả phân tử tại m/z 795 [M-H]- tương ứng với CTPT C47H76N2O8 của hợp chất 159 như trong sơ đồ phản ứng (Sơ đồ 4. 1). Hợp chất 160: Tương tự như hợp chất 158, 159 cấu trúc của hợp chất 160 được chứng minh qua việc xuất hiện các tín hiệu của mạch nhánh trong phổ 1H-NMR, 13 C-NMR và khẳng định thêm qua phổ khối ESI-MS với pic ion giả phân tử tại m/z 811 [M+H] + với CTPT C48H78N2O8. Hợp chất 161: Phổ 1H-NMR của hợp chất 161 xuất hiện thêm 2 tín hiệu methyl singlet của nhóm acetyl tại H (ppm): 2,07 và 2,08. Bên cạnh đó, các nhóm methylene mang oxy (-CH2OAc) tại H (ppm): 4,25 (4H, br s, 2H-2’) và các tín hiệu của nhóm methylene khác trong mạch nhánh trùng lặp với nhóm methylene của hợp chất ban đầu. Trong hợp chất 161, tín hiệu của H-2' ở δH 4,25 (4H, br s) thay vì δH 3,72 (4H, br s) trong hợp chất 156. Phổ khối của hợp chất 161 cho pic ion giả phân tử tại m/z 786 [M+H] + phù hợp với CTPT C44H67NO11 của hợp chất 161. 11 Tương tự như trên cấu trúc của các hợp chất 157-161 cũng được khẳng định bằng phổ 1H-NMR, 13C-NMR, ESI-MS đúng như các công thức ở sơ đồ (Sơ đồ 4.1).  Phản ứng thủy phân nhóm acetyl ở vòng A Để so sánh hoạt tính giữa các sản phẩm amide có nhóm OH vòng A bị khóa bởi nhóm aceyl và các nhóm OH tự do, một số sản phẩm 147-156 được lựa chọn để loại bỏ nhóm Acetyl bằng phản ứng thủy phân trong dung dịch KOH ở nhiệt độ phòng, khuấy trong 16 giờ. Xử lý hỗn hợp sau phản ứng như thường quy (phần thực nghiệm 3.3.1) thu được các sản phẩm tương ứng với hiệu suất cao từ 72- 80%. Cấu trúc của các sản phẩm dãy 162-166 được khẳng định thông qua phân tích phổ ESI-MS và 1H-NMR, 13C-NMR. Hợp chất 162: Trong phổ 1H-NMR của hợp chất 162 đã không còn các tín hiệu của các nhóm acetyl. Ngoài ra, thấy có sự chuyển dịch hóa học của các nhóm methyl gắn dị tố oxy về phía trường cao tạiH (ppm): 3,29 (1H, d, J = 10,0 Hz, H- 23a), 3,38 (1H, d, J = 10,0 Hz, H-23b), 3,53 (1H, d, J = 10,0 Hz, H-3), 3,72 (1H, dt, J = 5,0, 10,0 Hz, H-2), 5,36 (1H, t, J = 5,0 Hz, H-12) và H (ppm): 2,86 (2H, t, J = 10,0 Hz, H-1’), 3,14 (2H, m, H-7’). Kết quả này cũng được khẳng định thêm qua phổ 13C-NMR với sự vắng mặt của tín hiệu của các nhóm acetyl carbonyl ở vùng 170 ppm và các nhóm methyl của acetyl ở vùng trường cao. Phổ khối ESI- MS ion dương của hợp chất này cho pic ion giả phân tử tại m/z 601 [M+H]+ phù hợp với CTPT C39H64N2O5 của hợp chất 162 như trong Sơ đồ 4. 1. Hợp chất 163: Tương tự như hợp chất 162, trong phổ 1H-NMR của hợp chất 163 đã không còn các tín hiệu cộng hưởng của các nhóm acetyl tại vị trí C-2, C-3, C-23. Đồng thời các tín hiệu của nhóm oxy-methine cũng bị đẩy về phía trường cao hơn và xuất hiện tại H (ppm): 3,29 (1H, d, J = 9,5 Hz, H-23a), 3,38 (1H, d, J = 9,5 Hz, H-23b), 3,53 (1H, d, J = 11,0 Hz, H-3), 3,72 (1H, dt, J = 4,5, 11,0 Hz, H-2) và 2,66 (2H, t, J = 7,0 Hz, H-1’), 3,13 (2H, t, J = 6,5 Hz, H-9’) của mạch nhánh. Phù hợp với số liệu này phổ 13C-NMR cũng thấy vắng mặt các tín hiệu của nhóm acetyl carbonyl ở vùng C (ppm): 170 và acetyl methyl ở vùng trường cao. Các kết quả này được minh chứng thêm bởi phổ ESI-MS ion dương của hợp chất 163 với pic ion giả phân tử tại m/z 629 [M+H]+ phù hợp với CTPT C39H68N2O4 của 163 như trong Sơ đồ 4. 1. Hợp chất 164: Cũng tương tự như hợp chất 162, 163 trong phổ 1H-NMR của hợp chất 164 cũng không còn các tín hiệu cộng hưởng của các nhóm methyl acetyl. Đồng thời các tín hiệu của các nhóm oxy methyl cũng dịch chuyển về phía trường cao hơn, xuất hiện tại H (ppm): 3,29 (1H, d, J = 11,0 Hz, H-23a), 3,80 (1H, d, J = 11,0 Hz, H-23b), 3,53 (1H, d, J = 11,0 Hz, H-3), 3,73 (1H, dt, J = 4,5, 11,0 Hz, H-2) và 2,74 (2H, t, J = 7,0 Hz, H-1’), 3,13 (2H, t, J = 7,0 Hz, H-10’) của mạch nhánh. Phổ 13C-NMR cũng vắng mặt các tín hiệu cộng hưởng của nhóm acetyl ở vùng khoảng 170 ppm và vùng trường cao. Phổ khối ESI-MS ion dương 12 của hợp chất này cũng cho kết quả phù hợp với pic ion giả phân tử tại m/z 643 [M+H] + tương ứng với CTPT C40H70N2O4 của 164 như trong Sơ đồ 4. 1. Cấu trúc của các hợp chất 165, 166 cũng được chứng minh tương tự như trên thông qua phân tích phổ ESI-MS, 1H-NMR, 13C-NMR của chúng. Hợp chất 167 Nhằm tạo ra dẫn xuất amide bậc 1 của asiatic acid, hợp chất 146 đã được phản ứng với dung dịch amoniac đặc ở nhiệt độ phòng trong 20 giờ. Xử lý phản ứng như trong phần thực nghiệm 3.3.1 thu được hợp chất 167 với hiệu suất 88%. Cấu trúc của hợp chất 167 được khẳng định như sau: Phổ 1H-NMR của hợp chất 167 có mặt nhóm –NH2-amide tại H (ppm): 5,48 (1H, br s, -NH2) and 5,83 (1H, br s, -NH2). Các dữ liệu phổ 1 H và 13 C-NMR của hợp chất 167 phù hợp với tài liệu [97]. Phổ 13C-NMR có tín hiệu của nhóm chức – CONH2 tại C (ppm): 181,01. Trong phổ khối ESI-MS ion dương của hợp chất 167 có pic ion giả phân tử tại m/z 615 [M+2H]2+ phù hợp với CTPT C36H55NO7. Tương tự như với dãy hợp chất 162-166, hợp chất 167 được loại bỏ nhóm acetyl bằng phản ứng với dung dịch KOH trong MeOH và khuấy ở nhiệt độ phòng 16 giờ. Xử lý sản phẩm phản ứng như trong phần thực nghiệm thu được hợp chất 168 với hiệu suất 72%. Trong phổ 1H-NMR của hợp chất 168 không còn xuất hiện tín hiệu của 3 nhóm methyl singlet của các nhóm acetyl, đồng thời các tín hiệu của các nhóm oxymethine và oxymethylene đã dịch chuyển về phía trường cao hơn và xuất hiện tại H (ppm): 3,29 (1H, d, J = 11,0 Hz, H-23a), 3,37 (1H, d, J = 11,0 Hz, H-23b), 3,52 (1H, d, J = 11,0 Hz, H-3), 3,72 (1H, dt, J = 4,5, 11,0 Hz, H-2). Phù hợp với phổ 1H-NMR, phổ 13C-NMR cũng cho thấy sự mất đi của tín hiệu các nhóm acetyl (CH3CO-). Phổ khối ion âm ESI-MS của hợp chất này cho pic ion giả phân tử tại m/z 523 [M+HCl]- phù hợp với CTPT C30H49NO4 của hợp chất 168. Các dữ liệu phổ 1H và 13C-NMR của hợp chất 168 phù hợp với tài liệu [97]. Điều đó chứng tỏ rằng phản ứng amide hóa triacetate của asiatic acid và thủy phân dẫn xuất amide để thu được dẫn xuất 28-amide đã được thực hiện như trong sơ đồ phản ứng. Trong một hướng nghiên cứu khác để đánh giá hoạt tính của nhóm COOH (C- 28), amide 167 được dehydrat hóa thành nitrile 169 trong sự có mặt của acetyl chloride, và DMAP trong DCM ở nhiệt độ phòng. Acetyl chloride đóng vai trò loại nước. Sản phẩm của phản ứng là acetic acid và HCl. DMAP có vai trò bắt acid HCl tạo thành trong phản ứng này (vai trò xúc tác). Sau khi xử lý hỗn hợp phản ứng và tinh chế sản phẩm đã thu được dẫn xuất nitrile 169. Trên phổ hồng ngoại của 169 thấy xuất hiện tín hiệu ở 2228,9 cm-1 đặc trưng cho nhóm -CN. Phổ 1 H-NMR trong cùng dung môi CDCl3 không thấy xuất hiện tín hiệu của các proton amide bậc 1 ở 5,83 và 5,47 ppm như trong chất 168. Đặc biệt, phổ 13C- NMR xuất hiện tín hiệu ở 122,95 ppm đặc trưng cho nhóm -CN. Điều đó chứng tỏ, phản ứng dehydrat hóa xẩy ra khá dễ dàng với hiệu suất cao. 13 Hợp chất 169 cũng được thủy phân nhóm acetyl trong KOH và MeOH ở nhiệt độ phòng trong 16 giờ thu được hợp chất 170 với hiệu suất 74%. Phổ 1H-NMR của hợp chất 170 không thấy xuất hiện các tín hiệu methyl singlet của các nhóm acetyl, đồng thời các tín hiệu của các proton gắn với cacbon mang oxi cũng xuất hiện về phía trường thấp hơn so với hợp chất 169 ở H (ppm): 3,30 (1H, d, J = 11,0 Hz, H-23a), 3,38 (1H, d, J = 11,0 Hz, H-23b), 3,54 (1H, d, J = 11,0 Hz, H-3), 3,74 (1H, dt, J = 4,5, 11,0 Hz, H-2). Phù hợp với kết quả trên, phổ 13C-NMR của hợp chất 170 cũng không còn các tín hiệu của các carbon trong nhóm acetyl tại vùng khoảng 170 ppm và vùng trường cao của nhóm methyl. Tín hiệu của nhóm – CN trong phổ 13C-NMR của chất 170 xuất hiện tại C: 126,41 ppm. Phổ khối ESI- MS ion âm có pic ion giả phân tử tại m/z 505 [M+HCl]- phù hợp với CTPT C30H47NO3. 4.3.1.2. Chuyển hóa hóa học vòng A của asiatic acid Sơ đồ 4.2: Tổng hợp các dẫn xuất của asiatic acid Các tác nhân và điều kiện phản ứng: a) 2,2-dimethoxypropane, TsOH.H2O, rt., 7 h, 88%, b) succinic anhydride, DMAP, TEA, rt. 12 h, 74%, c) (CH3CO)2O, pyridine, rt. 12 h, 82%, d) 5% HCl, rt. 4h, 90%. Để nghiên cứu ảnh hưởng của các nhóm chức 2-, 3-, 23-hydroxyl đến hoạt tính sinh học của asiatic acid, một số phản ứng hóa học nhằm tạo ra các dẫn xuất có sự thay đổi ở vòng A đã được thực hiện như Sơ đồ 4. 2. Asiatic acid (1) được phản ứng đóng vòng với 2,2-dimethoxypropane có sự xúc tác của p-toluensulphonic acid (PTSA) ở nhiệt độ phòng trong 7 giờ. Sau khi xử lý hỗn hợp phản ứng (xem phần thực nghiệm 3.3.1) thu được hợp chất 3,23-dioxo 171 với hiệu suất cao (88%). Hợp chất 171 khi tác dụng với succinic anhydride trong triethylamine (TEA) và dimethylaminopyridine (DMAP) ở nhiệt độ phòng trong 12 giờ thì cho hợp chất 172 có nhóm chức succinate ở vị trí C-2 với hiệu suất 74% sau khi tinh chế. Mặt khác, khi cho hợp chất 171 tác dụng với acetic anhydride trong pyridine ở nhiệt độ phòng trong 12 giờ sẽ thu được hợp chất 3,23-dioxo-2-acetate 173 với 14 hiệu suất 82%. Thủy phân hợp chất 173 trong acid hydrochloric ở nhiệt độ phòng trong 4 giờ sẽ cho dẫn xuất 2-O-acetyl-3,23-dihydroxyasiatic acid (174) với hiệu suất cao (90%). Cấu trúc của các hợp chất 171-174 được khẳng định thông qua phân tích phổ MS và NMR của chúng. Hợp chất 171: Hợp chất này cho phổ 1H-NMR và 13C-NMR tương tự như phổ của asiatic acid (1) ngoại trừ việc trong phổ 1H-NMR của hợp chất 171 có thêm 2 tín hiệu methyl singlet của nhóm dimethyldioxo mới tạo thành xuất hiện tại H (ppm): 1,42 (3H, s), 1,48 (3H, s), đồng thời tín hiệu cộng hưởng của H-23a, H-23b được dịch chuyển về phía trường thấp hơn so với 1 và xuất hiện tại 3,50 ppm (1H, d, J = 10,5 Hz, H-23a), 3,56 (1H, d, J = 10,5 Hz, H-23b), so với 3,29 (1H, d, J = 11,0 Hz, H-23a), 3,52 (1H, d, J = 11,0 Hz, H-23b) do ảnh hưởng của nhóm dioxo mới tạo thành. Đối với proton H-3α sự dịch chuyển về phía trường thấp hơn là 0,04 ppm so với asiatic acid và xuất hiện tại H : 3,56 ppm. Trong phổ 13 C-NMR của hợp chất 171 xuất hiện thêm tín hiêu của nguyên tử carbon bậc 4 của nhóm dioxo tại C : 100,72 ppm (C-31). Thông qua sự hình thành ketal, tín hiệu C-3, C- 23 được chuyển sang trường thấp hơn và xuất hiện ở δC 83,03 và 73,66 ppm thay vì ở δC 69,68 và 66,31 trong asiatic acid (1) trong khi tín hiệu C-2 được chuyển sang trường cao hơn và xuất hiện ở δC 66,15 so với δC 78,17 ppm trong hợp chất 1. Phổ NMR của hợp chất 171 tương tự như tài liệu tham khảo [94]. Phù hợp với kết quả từ phổ 1H-NMR và 13C-NMR, phổ khối ESI-MS ion âm của hợp chất 171 cho pic ion giả phân tử tại m/z 527 [M-H]- ứng với CTPT C35H52O5 như trong sơ đồ phản ứng. Như vậy phản ứng đã thực hiện như dự đoán. Để có được một dẫn xuất succinate, được cho là có hoạt tính sinh học, hợp chất 171 đã phản ứng với anhydrit succinic trong DMAP và TEA ở nhiệt độ phòng để tạo ra succinat 172. Hợp chất 172: Phổ 1H-NMR của hợp chất 172 tương tự như phổ của hợp chất 171 và có xuất hiện thêm các tín hiệu cộng hưởng phù hợp với nhóm succinate mới được gắn vào, thể hiện ở tín hiệu tại H (ppm): 2,57 - 2,71 (4H, m, H-35, H- 36). Trên phổ 13C-NMR của hợp chất 172 có sự xuất hiện thêm 2 tín hiệu carbon cacboxylic tại C (ppm): 178,04 (C-37) và 171,71 (C-34) của nhóm succinat cùng với tín hiệu của 2 nhóm methylene ở vùng trường cao trùng lặp với các tín hiệu trong khung. Phổ ESI-MS ion âm của hợp chất 172 cho pic ion giả phân tử tại m/z 627 [M-H] - phù hợp với CTPT C37H56O8 như trong Sơ đồ 4. 2 cho hợp chất 172. Điều đó chứng tỏ phản ứng tạo succinat đã thành công. Hợp chất 173: Phổ 1H-NMR của hợp chất 173 có thêm một tín hiệu methyl singlet của nhóm 2-O-acetyl xuất hiện tại H (ppm): 2,01 so với phổ 1 H-NMR của hợp chất 171. Phổ 13C-NMR thêm một tín hiệu cộng hưởng của nhóm carbonyl ở C 170,62 ppm (CH3COO-) đồng thời xuất hiện thêm một tín hiệu –CH3 tại vùng 15 trường cao C (ppm): 21,15. Phổ khối ESI-MS ion âm m/z 569 [M-H] - phù hợp với CTPT C35H54O6 như trong sơ đồ phản ứng 4.2. Hợp chất 174: Phổ 1H-NMR của hợp chất 174 có thêm 1 tín hiệu methyl singlet của nhóm 2α-O-acetyl tại H (ppm): 2,07 (3H, s, CH3-CO) so với phổ 1 H-NMR của asiatic acid (1), đồng thời tín hiệu cộng hưởng của H-2β cũng bị dịch chuyển về phía trường thấp hơn và xuất hiện tại H (ppm): 5,03 (1H, dt, J = 4,5, 11,5 Hz, H-2β) trong khi ở asiatic acid ghi trong cùng dung môi thì H-2β xuất hiện tại H (ppm): 3,71 (1H, dt, J = 4,5, 9,5 Hz, H-2), ΔH = 5,03-3,71= 1,32 ppm. Phù hợp với dẫn xuất acetate tại C-2, phổ 13 C-NMR có xuất hiện thêm 2 tín hiệu thuộc nhóm acetyl tại C (ppm): 78,89 (C-2), 170,62 (CH3COO-). Phổ khối ESI-MS ion âm của hợp chất 174 có chứa pic ion giả phân tử tại m/z 531 [M-H]- phù hợp với CTPT C32H50O6. Như vậy cấu trúc của hợp chất 174 đã được khẳng định. 4.3.2. Các dẫn xuất của madecassic acid Sơ đồ 4.3: Tổng hợp các dẫn xuất của madecassic acid Các tác nhân và điều kiện phản ứng: a) (CH3CO)2O, pyridine, rt., 12 h, 80%; b) oxalyl chloride, DCM, rt., 24 h, c) R1NH2, DCM, rt, 24 h; d) AcCl, DMAP, DCM, 2h, 75-80%; e) KOH, MeOH, rt, 16 h. Madecassic acid (10) được acetyl hóa với acetic anhydride trong pyridine ở nhiệt độ phòng trong 12 giờ, xử lý hỗn hợp sau phản ứng như thường quy (xem phần thực nghiệm 3.2.2) sẽ cho madecassic acid 2,3,23-triacetate (175), hiệu suất 85%. Trong phản ứng này nhóm α-hydroxy ở vị trí C-6 không bị acetyl hóa do sự che chắn không gian của các nhóm C-24, C-25, C-26. Điều đó được chứng minh như sau: Trong phổ 1H-NMR của hợp chất 175 ta thấy xuất hiện tín hiệu của 3 nhóm acetyl methyl đồng thời các methyl proton ở C-2, C-3, C-23 đã được dịch chuyển nhiều về phía trường thấp và xuất hiện tại H (ppm): 3,72 (1H, d, J = 12,0 Hz, H-23a), 3,93 (1H, d, J = 12,0 Hz, H-23b), 5,01 (1H, d, J = 10,5 Hz, H-3), 5,24 (1H, dt, J = 5,0, 10,5 Hz, H-2). So với phổ của madecassic acid (10) các tín hiệu tương ứng xuất hiện tại 3,45 (1H, d, J = 11,0 Hz, H-23a), 3,60 (1H, d, J = 11,0 Hz, H-23b), 3,76 (1H, dt, J = 4,5, 11,5 Hz, H-2), và H-23b bị chồng lấp với tín 16 hiệu dung môi methanol. Trong khi tín hiệu của H-6α trong hợp chất 175 hầu như không thay đổi và xuất hiện tại H (ppm): 4,34 (s), và ở 10 tín hiệu này là 4,40 (br s). Điều đó chứng tỏ nhóm 6-β-OH không bị acetyl hóa. Phù hợp với kết quả này phổ hồng ngoại của hợp chất 175 vẫn cho các đỉnh hấp thụ của nhóm hydroxy ở 3534 cm-1 bên cạnh 2 đỉnh hấp thụ mạnh ở 1734 cm-1 và 1245 cm-1 của nhóm acetate. Phổ khối ion âm ESI-MS của 175 cho pic ion giả phân tử tại m/z: 629 [M-H]-. Hợp chất 175 được cho tác dụng với oxalyl chloride trong DCM ở nhiệt độ phòng để tạo thành acid chloride 176. Hợp chất 176 không cần tách và tinh chế được cho phản ứng luôn với các amin tương ứng ở nhiệt độ phòng. Sau khi xử lý hỗn hợp phản ứng như trong phần thực nghiệm 3.3.2 thu được các amide tương ứng 177-185. Cấu trúc hóa học của các hợp chất 177-185 được khẳng định thông qua phổ khối, phổ 1H- và 13C-NMR của chúng. Hợp chất 177: Phổ 1H-NMR của hợp chất 177 có chứa thêm các tín hiệu của mạch nhánh amide thông qua các tín hiệu cộng hưởng của 4 proton trong nhóm – CH2-OH tại H (ppm): 3,73 (4H, br s, H-2', -OH) và tín hiệu của 4 proton của nhóm –NCH2 tại 3,53-3,56 (2H, br s, H-2'); các tín hiệu khác trùng hợp với phổ của 175. Ở phổ 13C-NMR của hợp chất 177 có xuất hiện thêm tín hiệu của nhóm – CH2OH ở mạch nhánh tại C ppm = 61,53 (C-2'), 60,91 (C-2'). Hợp chất 178: Trong phổ 1H-NMR của hợp chất này xuất hiện tín hiệu của nhóm –NH-CH2- tại H: (7,31 (t, J = 5,5 Hz, –NH) và 7,39 (t, J = 5,5 Hz, –NH) đồng phân) bên cạnh các tín hiệu tại 3,61 (2H, t, J = 6,0 Hz, H-3', -CH2-OH), 3,27-3,36 (1H, m, H-1', -CH2-NH-), 3,18-3,22 (1H, m, H-1', -CH2-NH-). Tín hiệu của nhóm –CH2 còn lại của mạch nhánh xuất hiện trùng với các tín hiệu của khung trong vùng trường cao hơn. Phổ 13C-NMR của hợp chất này xuất hiện các tín hiệu của nhóm methylene xen lẫn với các tín hiệu khác của khung madecassic acid trong vùng trường cao và tín hiệu của -CH2-OH tại C: 61,52 (C-3'). Phổ hồng ngoại của hợp chất này có chứa cụm tín hiệu mạnh của nhóm –OH liên kết cầu hydro tại 3500 và 3379 cm-1 cùng với đỉnh hấp thụ tại 1584 cm-1. Điều đó chứng tỏ hợp chất 178 đã được tạo thành như trong sơ đồ phản ứng. Hợp chất 179: So với phổ 1H-NMR của hợp chất 175 thì trong phổ 1H-NMR của hợp chất 179 xuất hiện thêm các tín hiệu của hai methyl doublet của nhóm isopropyl chồng lấp với các tín hiệu của khung madecassic acid triacetate trong vùng H: 1,02 (3H, d, J = 6,0 Hz), 1,07 (3H, s) cùng với các tín hiệu khác của mạch nhánh tại H: 5,59 (1H, d, J = 7,0 Hz, -NH), 3,84-3,88 (1H, m, H-1', -NH- CH-(CH3)2). Phù hợp với phổ 1 H-NMR, ở phổ 13C-NMR của hợp chất 179 có chứa các tín hiệu cộng hưởng của carbon tương ứng trong mạch nhánh. Hợp chất 180: Phổ 1H-NMR của hợp chất 180 thấy xuất hiện thêm tín hiệu của nhóm –NH2 amide tại H (ppm): 5,83 (1H, br s, -NH2) và 6,34 (1H, br s, -NH2) so với hợp chất 175. Phổ hồng ngoại của hợp chất 180 có đỉnh hấp thụ mạnh tại 3478 cm-1 (- NH2) cùng với đỉnh hấp thụ tại 1660 cm -1 (-CN). Trong phổ khối ESI-MS ion dương 17 của hợp chất 180 có pic m/z 652 [M+Na]+ phù hợp với CTPT của hợp chất 180 là C36H55NO8. Như vậy phản ứng đã xảy ra như dự kiến ở Sơ đồ 4. 3. Hợp chất 181: Trong phổ 1H-NMR của hợp chất 181 thấy xuất hiện thêm các tín hiệu cộng hưởng của mạch nhánh tại H: 2,69 (2H, t, J = 7,5 Hz, H-1’), 3,12- 3,15 (2H, m, H-7’). Các tín hiệu của các proton còn lại của mạch nhánh trùng lặp với các proton khác trong khung ở vùng trường cao. Phổ 13C-NMR của chất này có xuất hiện các tín hiệu của nhóm –CH2 mạch nhánh chồng lấp với các tín hiệu carbon của khung. Trong phổ khối ESI-MS ion dương thấy xuất hiện mảnh ion tại m/z 743 [M+H] + phù hợp với CTPT C43H70N2O7 của hợp chất 181. Điều đó chứng minh phản ứng xảy ra như dự kiến. Hợp chất 182: Phổ khối ESI-MS ion dương của hợp chất 182 có chứa pic ion giả phân tử tại m/z 771 [M+H]+ phù hợp với CTPT C45H74N2O8 của hợp chất 182. Phù hợp với kết quả này trên phổ 1H-NMR của hợp chất 182 xuất hiện cụm tín hiệu tại H: 2,78 (2H, t, J = 7,5 Hz, H-1’), 3,09-3,20 (2H, m, H-9’). Các tín hiệu khác của nhóm methylene mạch nhánh chồng lấp với các tín hiệu của khung madecassic acid trong vùng trường thấp. Phổ 13C-NMR của chất này có xuất hiện thêm các tín hiệu của nhóm methylene mạch nhánh xen lẫn trong vùng tín hiệu của khung. Như vậy cấu trúc của hợp chất 182 đã được khẳng định. Hợp chất 183: Phổ khối ESI-MS ion dương của hợp chất 183 có chứa pic ion giả phân tử tại m/z 785 [M+H]+ phù hợp với CTPT C46H76N2O8 của hợp chất 183. Phổ 1H-NMR của chất này có các tín hiệu của nhóm –CH2-NH2 tại H: 2,13-2,39 (1H, m, H-1’), 2,55-2,57 (1H, m, H-1’), 3,02-3,09 (2H, m, H-10’). Các tín hiệu proton của các nhóm CH2 khác chồng lấp với các proton của khung trong vùng trường cao. Phổ 13C-NMR cũng phù hợp với cấu trúc trên khi có chứa các tín hiệu của nhóm methylene xuất hiện trùng với các tín hiệu khác của khung. Điều đó chứng tỏ phản ứng tổng hợp 183 đã xảy ra như dự kiến (Sơ đồ 4. 3). Trên phổ 1H-NMR của amide 184 quan sát thấy tín hiệu triplet ở δ (ppm): 5,41 (1H, t-like, -NH) đặc trưng cho liên kết amide. Ngoài các tín hiệu phổ của 175, còn quan sát thấy tín hiệu ở δ (ppm): 3,19-3,20 (1H, m, H-1’a), 3,29-3,30 (1H, m, H- 1’b), 4,12 (2H, q, J = 7,0 Hz, H-1’’) nhóm tín hiệu và hằng số tương tác này đặc trưng cho độ dịch chuyển hóa học nhóm methylene của glycine. Trong phổ 13C-NMR có các tín hiệu của nhóm methylene gắn với -COOCH2CH3 của mạch nhánh xuất hiện tại C : 62,20 ppm (C-1’’). Phổ khối ESI-MS ion dương của hợp chất này cho một pic ion giả phân tử tại m/z 716 [M+H]+ phù hợp với CTPT C40H61NO10. Trên phổ 1H-NMR của amide 185 ngoài các tín hiệu của 175, quan sát thấy sự xuất hiện 3 tín hiệu singlet của các proton vòng imidazole ở δ (ppm): 7,04 (1H, s, H-4’), 7,52 (1H, s, H-2’), 8,24 (1H, s, H-5’). Phổ 13C-NMR có chứa các tín hiệu của mạch nhánh imidazole ở δ (ppm): 138,05 (C-2’), 129,87 (C-5’), 119,37 (C-4’). Hợp chất 186-191: Từ các hợp chất 177-183 được thủy phân trong dung dịch KOH trong MeOH ở nhiệt độ phòng trong 16 giờ. Xử lý hỗn hợp phản ứng như 18 trong phần thực nghiệm 3.3.2. Sau khi tinh chế sản phẩm thu được các hợp chất 186-191 với hiệu suất từ 75-90%. Cấu trúc của các hợp chất 186-191 cũng được khẳng định khi phân tích phổ IR, MS, NMR của chúng. Hợp chất 186: Phổ khối ESI-MS của hợp chất 186 có pic ion giả phân tử tại m/z 592 [M+H] + phù hợp với CTPT C34H57NO7 của hợp chất 186. Phổ 1 H-NMR của hợp chất này không thấy sự có mặt của các nhóm methyl singlet của acetyl quanh vùng H khoảng 2 ppm. Thêm vào đó phổ 1 H-NMR có các pic của proton gắn