Tóm tắt Luận án Nghiên cứu công nghệ thu nhận một số hợp chất có hoạt tính sinh học từ hai loài nấm thượng hoàng (Phellinus Igniarius và Phellinus Nilgheriensis) ở Việt Nam, ứng dụng trong thực phẩm - Nguyễn Tân Thành

igniarius và P. nilgheriensis) - Nghiên cứu ứng dụng sản xuất một số sản phẩm thực phẩm bổ sung nấm thượng hoàng. 4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của luận án 4.1. Ý nghĩa khoa học - Kết quả nghiên cứu về thành phần dinh dưỡng và thành phần hóa học trong hai loài nấm thượng hoàng (P. igniarius và P. nilgheriensis) là đóng góp khoa học có độ tin cậy cao, góp phần làm 3 phong phú thêm về cơ sở dữ liệu về chất lượng nguyên liệu, thành phần hóa học của các loài nấm lớn ở Việt Nam - Đã phân lập và xác định cấu trúc của 9 hợp chất trong nấm thượng hoàng (P. igniarius) trong đó đã tìm ra một chất mới thuộc nhóm chất triterpenoid. Đã thử hoạt tính gây độc tế bào trên các dòng tế bào ung thư HepG2, MCF7, Lu và hoạt tính chống oxy hóa của dịch chiết và hợp chất sạch, kết quả cho thấy các hợp chất sạch có khả năng kháng các dùng tế bào ung thư trên. - Đã đề xuất được công nghệ (chiết xuất và sấy phun) thu nhận một số hợp chất từ hai loài nấm thượng hoàng (P. igniarius và P. nilgheriensis) ở Việt Nam. 4.2. Ý nghĩa thực tiễn: - Các kết quả nghiên cứu của đề tài về công nghệ thu nhận một số hợp chất sinh học từ nấm thượng hoàng sẽ tạo nên các sản phẩm có giá trị kinh tế cao, có tác dụng chống oxy hóa, có khả năng ngăn chặn và chữa bệnh. Đây là việc làm cần thiết, phù hợp với xu thế của thời đại, đóng góp cho sự phát triển của kinh tế - xã hội và bảo vệ sức khỏe cộng đồng. - Kết quả nghiên cứu của đề tài là tài liệu tham khảo khoa học đáng tin cậy và có giá trị; là tài liệu phục vụ cho giảng dạy, nghiên cứu khoa học và cho cả sản xuất sau này. 5. Những điểm mới của luận án - Đây là nghiên cứu đầy đủ về thành phần dinh dưỡng (acid amin; vitamin E, D2, B3; kim loại) từ hai loài nấm thượng hoàng (P. igniarius và P. nilgheriensis) thu hái ở Việt Nam. - Luận án đã phân lập và xác định cấu trúc của 9 hợp chất trong nấm thượng hoàng (Phellinus igniarius) là: igniarine (PIE-1), meshimakobnol B (PIE-3), inoscavin A (PIE-6), daidzin (PIE-7), ergosterol (PIE-4), pterocarpin (PIE-8), ergosterol peroxit (PIE-5), meshimakobnol A (PIE-2) và 5-hydroxy-7methoxy-flavon (PIE-9). Trong đó hợp chất igniarine (PIE-1) là hợp chất mới. Đã thử hoạt tính gây độc tế bào trên các dòng tế bào ung thư HepG2, MCF7, Lu và hoạt tính chống oxy hóa của dịch chiết và hợp chất sạch. - Tối ưu hóa quy trình công nghệ chiết xuất và sấy phun dịch nấm thượng hoàng (P. igniarius và P. nilgheriensis). Đề xuất quy trình chế biến một số sản phẩm thực phẩm bổ sung nấm thượng hoàng như: bánh 4 quy, trà nấm và cà phê hòa tan có tính chất cảm quan hấp dẫn người dùng. 6. Cấu trúc của luận án Luận án bao gồm 127 trang với 51 bảng số liệu, 50 hình và 06 sơ đồ với 155 tài liệu tham khảo. Kết cấu của luận án gồm: mở đầu (03 trang), tổng quan (30 trang), nguyên vật liệu và phương pháp nghiên cứu (19 trang), kết quả và thảo luận (60 trang), kết luận và đề xuất nghiên cứu tiếp tục (02 trang), danh mục công trình công bố (01 trang), tài liệu tham khảo (12 trang). CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN 1.1. Nấm Thượng hoàng (Phellinus sp.) Giới thiệu về các đặc điểm thực vật, phân loại đặc điểm hình thái và phân bố của chi Phellinus 1.2. Thành phần hóa học của nấm thượng hoàng Trình bày tổng quan về thành phần dinh dưỡng, thành phần hóa học và hoạt tính sinh học trong nấm thượng hoàng (Phellinus sp.) 1.3. Công nghệ tách chiết các hoạt chất trong nấm dược liệu 1.4. Công nghệ sấy nguyên liệu và dịch chiết từ nấm dược liệu 1.5. Ứng dụng của nấm dược liệu trong sản xuất thực phẩm chức năng CHƯƠNG 2. NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. NGUYÊN VẬT LIỆU 2.1.1. Đối tượng nghiên cứu Đối tượng nghiên cứu của luận án là 2 loài nấm thượng hoàng trong chi Phellinus thu hái tại khu bảo tồn quốc gia Pù Huống và vườn Quốc gia Pù Mát ở Nghệ An. Mẫu được định danh tên khoa học là Phellinus igniarius và Phellinus nilgheriensis bởi PGS. TS Ngô Anh, khoa Sinh, Trường Đại học Khoa học Huế, Đại học Huế. 2.1.2. Hóa chất Các hóa chất sử dụng trong nghiên cứu đảm bảo tiêu chuẩn và chất lượng để chạy trên các thiết bị phân tích hiện đại như HPLC, UPLC, LC/MS 2.1.3. Dụng cụ và thiết bị nghiên cứu 5 Sắc ký lớp mỏng (TLC), Sắc ký cột (CC), Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC), Hệ thống sắc ký lỏng ghép nối khối phổ, Thiết bị phản ứng Reaction, Máy sấy phun Spray Dryer B290 2.2. Phương pháp nghiên cứu 2.2.1. Phương pháp phân tích thành phần dinh dưỡng và thành phần hóa học Phân tích hàm lượng cellulose theo nguyên tắc hòa tan bằng acid và kiềm; sử dụng UPLC, HPLC với đầu dò huỳnh quang để xác định hàm lượng các acid amin, vitamin; hàm lượng nguyên tố kim loại được đo trên thiết bị phổ hấp thụ nguyên tử (AAS), hàm lượng tổng phenolic, tổng flavonoid được xác định bằng phương pháp quang phổ (UV-Vis). 2.2.2. Phương pháp chiết xuất, phân lập các hợp chất Phân lập, xác định cấu trúc của các hợp chất: sử dụng các phương pháp sắc ký như: sắc ký lớp mỏng (TLC); sắc ký cột thường (CC); sắc ký cột nhanh (FC); sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC); Phân lập các hợp chất: Mẫu nấm thượng hoàng (P. igniarius) (4,5kg) sấy khô ở nhiệt độ từ 40-50C trong 48 giờ, nghiền nhỏ và ngâm chiết với metanol (10L x 3) ở nhiệt độ phòng, thu dịch chiết và cất thu hồi dung môi dưới áp suất thấp được cao methanol (154g). Phân bố dịch chiết vào nước (1L) và chiết bằng ethyl acetate (1Lx5) và butanol (1Lx5), sau đó cất thu hồi dung môi thu được cao etyl axetat (42g), cao butanol (67g) và dịch nước. Cao ethyl acetate được phân tách trên cột silicagel, với hệ dung môi rửa giải là chloroform: metanol (100:0, 40:1: 30:1; 20:1; 10:1: 4:1; 2:1), thu được 5 phân đoạn (PI.E1 đến PI.E5). Phân đoạn 3 (PI.E3) phân tách lại bằng sắc ký cột với hệ dung môi rửa giải là chloroform: methanol (30:1; 20:1; 10:1), thu được 3 phân đoạn (PI.E3.1 đến PI.E3.3). Phân đoạn PI.E3.1 tiếp tục phân tách bằng sắc ký cột với hệ dung môi chloroform: methanol (30:1) thu được chất hợp chất mới PIE- 1 (igniarine) (38mg) và hợp chất PIE-3 (meshimakobnol B) (23mg). Phân đoạn PI.E3.2 phân tách bằng sắc ký cột với hệ dung môi chloroform: methanol (30:1) thu được chất hợp chất PIE-6 (Inoscavin A) (18mg) và hợp chất PIE-7 (daidzin) (21,5mg). Phân đoạn PI.E1 sắc ký cột với silica gel hệ dung môi rửa giải hexane: axeton (15:1 và 9:1) thu được chất PIE-4 (ergosterol) (123mg). Phân đoạn PI.E4 được tiến 6 hành sắc ký cột với hexane: axeton (15:1, 9:1) thu được hợp chất chất PIE-8 (pterocarpin) (18 mg) và PIE-5 (ergosterol peroxit) (31mg). Phân đoạn PI.E5 được tiến hành sắc ký cột (200 g, 60 × 3 cm) với chloroform/methanol (10:1) và kết tinh phân đoạn thu được hợp chất PIE-2 (meshimakobnol A) (30mg) và PIE-9 (5-hydroxy-7methoxy- flavon) (27mg). (Sơ đồ 2.2) 2.2.3. Phương pháp khảo sát cấu trúc các hợp chất Cấu trúc các hợp chất được khảo sát nhờ sự kết hợp các phương pháp phổ: phổ tử ngoại (UV); phổ hồng ngoại (IR); phổ khối lượng (EI- MS), (ESI-MS), (HR-ESI-MS); phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-NMR; phổ cộng hưởng từ hạt nhân 13C-NMR; phổ cộng hưởng từ hạt nhân DEPT, HMBC, HSQC; cấu trúc lập thể tương đối của các hợp chất này được xác định các phương pháp phổ NMR. - Hợp chất PIE-1 (igniarine): chất bột trắng vô định hình, nhiệt độ nóng chảy 205-206ᵒC; HR-ESI-MS m/z: 453,0446 [M+Na]+; UV (MeOH) λmax: 257nm, 414nm; IR(KBr) νmax(cm-1):1690, 3400; 1H và 13C-NMR: bảng 3.13. - Hợp chất PIE-2 (meshimakobnol A): chất bột màu vàng, nhiệt độ nóng chảy 181-182ᵒC; HR-ESI-MS m/z: 403,3346 [M+H]+; UV (MeOH) λmax: 290nm, 258nm; IR(KBr) νmax(cm-1):1706, 3542; 1H và 13C-NMR: bảng 3.14. - Hợp chất PIE-3 (meshimakobnol B): chất bột màu vàng, nhiệt độ nóng chảy 175-176ᵒC; HR-ESI-MS m/z: 387,0485 [M+H]+; UV (MeOH) λmax: 409nm, 250nm; IR(KBr) νmax(cm-1):1685, 3369; 1H và 13C-NMR: bảng 3.14. - Hợp chất PIE-4 (ergosterol): chất bột màu trắng, nhiệt độ nóng chảy 165-167ᵒC; EI-MS m/z: 369 [M]+; UV (MeOH) λmax: 211nm, 285nm; IR(KBr) νmax(cm-1): 3433, 2959, 1726, 1090; 1H và 13C-NMR: bảng 3.15. - Hợp chất PIE-5 (ergosterol peroxit): dạng thể hình kim không màu, nhiệt độ nóng chảy 176-178ᵒC; EI-MS m/z: 428 [M]+; 1H và 13C- NMR (CDCl3) (δ ppm): bảng 3.16. - Hợp chất PIE-6 (inoscavin A): chất bột màu vàng, nhiệt độ nóng chảy 268-269ᵒC; HR-ESI-MS m/z: 463,1045 [M+H]+; 1H-NMR (500 MHz, DMSO –d6) và 13C-NMR (125 MHz, DMSO –d6) (δ ppm): bảng 3.17. 7 - Hợp chất PIE-7 (daidzin): chất bột màu vàng nâu, nhiệt độ nóng chảy 246-247ᵒC; EI-MS m/z: 416 [M]+; 1H-NMR (500 MHz, DMSO –d6) và 13C-NMR (125 MHz, DMSO –d6) (δ ppm): bảng 3.18. - Hợp chất PIE-8 (pterocarpin): Tinh thể màu trắng, có điểm nóng chảy ở 154,5-156ᵒC; 1H-NMR (500 MHz, CDCl3-d6) và 13C-NMR (125 MHz, CDCl3-d6)  (ppm): bảng 3.19. - Hợp chất PIE-9 (5-hydroxy-7-methoxyflavone): Chất rắn màu vàng, có điểm nóng chảy: 195o-196oC; UV (MeOH) max: 216, 278 và 322; ESI-MS m/z: 331 [M+H]+; 1H-NMR (500 MHz, CDCl3-d6) và 13C-NMR (125 MHz, CDCl3-d6)  (ppm): bảng 3.20. 2.2.4. Các phương pháp xác định hoạt tính sinh học Các phương pháp xác định hoạt tính sinh học: xác định hoạt tính chống oxy hóa bằng phương pháp DPPH (1,1-diphenyl-2- picrylhydrazyl); hoạt tính gây độc tế bào theo phương pháp môi trường thạch (MTT) 2.2.5. Quy hoạch thực nghiệm - Sử dụng phương pháp quy hoạch thực nghiệm, các thí nghiệm được bố trí theo quy hoạch thực nghiệm trực giao cấp 2 và được xử lý bằng phần mềm tối ưu hóa Design - Expert phiên bản 7.1 để tối ưu hóa quá trình chiết và sấy phun dịch nấm thượng hoàng. - Trong thí nghiệm phân tích thị hiếu, đánh giá cảm quan chất lượng sản phẩm bổ sung bột nấm thượng hoàng sử dụng phần mềm thống kê SPSS. 8 S ơ đ ồ 2 .2 . S ơ đ ồ p h ân l ập c ác h ợ p c h ất t ừ n ấm t h ư ợ n g h o àn g ( P . ig n ia ri u s) 9 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Kết quả nghiên cứu thành phần dinh dưỡng và thành phần hóa học của nấm thượng hoàng 3.1.1. Hàm lượng cellulose trong nguyên liệu Hàm lượng cellulose trong nấm thượng hoàng (P. igniarius và P. nilgheriensis) được xác định theo nguyên tắc hòa tan bằng acid và kiềm. Hàm lượng cellulose trong nấm thượng hoàng P. igniarius (26,5±0,6 %) và P. nilgheriensis (38,4 ± 0,9). 3.1.2. Hàm lượng acid amin Nghiên cứu hàm lượng các acid amin của nguyên liệu và chế phẩm nấm thượng hoàng sau khi chiết và sấy (sấy đông khô và sấy chân không) cho kết quả như sau: Bảng 3.2. Hàm lượng acid amin trong nấm thượng hoàng (P. igniarius và P. nilgheriensis) (µg/g nguyên liệu khô) TT Acid amin P. igniarius P. nilgheriensis 1 Threonine 7,32 23,02 2 Valine KPH 527,47 3 Methionine 51,90 88,31 4 Isoleucine 108,66 37,39 5 Leucine 537,61 419,96 6 Phenylalanine 747,98 741,48 7 Lysine 207,77 289,27 8 Histidine 1037,40 1048,46 Tổng acid amin thiết yếu (EAA) 2698,64 3175,40 9 Aspartic 882,97 1351,15 10 Glutamic KPH KPH 11 Serine 0 326,85 12 Glycine KPH 220,58 13 Cysteine 1890,87 454,07 14 Alanine 270,37 469,01 15 Arginine KPH KPH 16 Tyrosine 83,64 52,76 17 Proline 556,47 472,21 10 Tổng acid amin không thiết yếu 3774,32 3346,65 Tổng acid amin (TAA) 6472,96 6522,06 EAA/TAA 41,69% 48,68% KPH-Không phát hiện 3.1.3. Hàm lượng các loại vitamin trong nấm thượng hoàng 3.1.3.1. Hàm lượng vitamin E Tiến hành xác định hàm lượng vitamin E trên 2 mẫu nấm thượng hoàng P. igniarius và P. nilgheriensis. Kết quả phân tích cho thấy, hàm lượng vitamin E trong loài P. igniarius (0,49207mg/kg) cao hơn so với loài P. nilgheriensis (0,26734mg/kg). 3.1.3.2. Hàm lượng vitamin D2 Trong 4 mẫu nghiên cứu thì mẫu nguyên liệu nấm P. igniarius (M1) hầu như không thể hiện hàm lượng vitamin D2, hàm lượng vitamin D2 trong loài P. nilgheriensis có giá trị 0,0399 mg/kg (3,99 µg/100g) nguyên liệu. Đối với 2 mẫu nấm sau khi chiết xuất và sấy đông khô thì hàm lượng vitamin D2 trong bột nấm P. nilgheriensis (25,6754 mg/kg bột sấy đông khô) cao hơn trong bột nấm P. igniarius (9,7375 mg/kg). 3.1.3.3. Hàm lượng vitamin B3 Hàm lượng viatmin B3 (niacin) trong loài P. igniarius (9,247mg/100g) cao hơn so với loài P. nilgheriensis (68,81 mg/100g). Tiến hành khảo sát nồng độ dung môi tách chiết khác nhau, kết quả cho thấy khi chiết bằng nước thì hàm lượng vitamin B3 đạt giá trị cao nhất, thấp nhất là chiết bằng ethanol 90%. Hàm lượng vitamin B3 trong bột sấy đông khô của loài P. nilgheriensis cao hơn bột sấy đông khô của loài P. igniarius. 3.1.4. Hàm lượng khoáng và kim loại trong nấm thượng hoàng Kết quả cho thấy hàm lượng Na, K, Ca, Mg, Pb của 2 mẫu nấm Thượng hoàng khu vực Bắc trung bộ, Việt Nam có giá trị tương đương với nấm thượng hoàng (P. igniarius) của Trung Quốc (Yang N.C al et., 2016). Hàm lượng Na trong nấm P. igniarius ở Việt Nam là 1,157µg/g. Hàm lượng K, Ca, Mg trong nấm P. igniarius ở Việt Nam là 12,255µg/g, 14,502µg/g và 6,844µg/g. Hàm lượng chì trong 2 mẫu nấm Thượng hoàng có giá trị rất nhỏ là 0,061µg/g và 0,0712µg/g, nằm trong ngưỡng cho phép sử dụng trong thực phẩm của Bộ y tế (<0,3µg/g). 11 3.1.5. Hàm lượng tổng phenolic và flavonoid Hàm lượng tổng phenolic trong nấm thượng hoàng P. igniarius và P. nilgheriensis lần lượt là 65,36 và 41,24 mgGAE/g; hàm lượng tổng flavonoid lần lượt là 6,35mgCE/g và 3,92mgCE/g. 3.1.6. Thành phần hóa học trong nấm thượng hoàng (P. igniarius) Xác định thành phần hóa học của loài P. igniarius trên thiết bị LC-MS, nhận dạng được một số hợp chất trong mẫu nấm như sau: Hình 3.1. Sắc ký đồ LC-MS của dịch chiết ethanol nấm P. igniarius ở Việt Nam Bảng 3.13. Nhận dạng các hợp chất polyphenol từ dịch chiết nấm P. igniarius Hợp chất Thời gian lưu Tên dự kiến Khối lượng phân tử [M+H]+ m/z 1 13.5 Interfungin A 464.43 465.3328 2 15.7 Inonoblin C 462.42 463.0872 3 17.6 Phelligridin C 364.309 365.3093 4 18.4 Inoscavin A 462.410 463.4108 5 20.9 Phelligridin D 380.308 381.3088 6 21.8 Inoscavin E 378.34 379.0163 7 23.0 Inoscavin C 420.373 421.2224 8 25.1 interfungin B 422.389 423.3893 3.2. Phân lập, xác định cấu trúc chất và hoạt tính của một số thành phần hóa học trong dịch chiết nấm thượng hoàng (P. igniarius) 3.2.1. Chiết các phân đoạn Các hợp chất phân lập được từ nấm thượng hoàng (P. Igniarius) thu hái tại Việt Nam được thể hiện ở bảng sau: Hợp chất Ký hiệu Tên hợp chất Công thức phân tử Khối lượng (mg) 1 PIE-1 Igniarine C30H44O3 38 mg 12 2 PIE-2 Meshimakobnol A C20H12O8 30 mg 3 PIE-3 Meshimakobnol B C20H12O7 23 mg 4 PIE-4 Ergosterol C28H44O 123mg 5 PIE-5 Ergosterol peroxit C28H44O3 31mg 6 PIE-6 Inoscavin A C25H18O9 18 mg 7 PIE-7 Daidzin C21H20O9 21.5 mg 8 PIE-8 Pterocarpin C17H14O5 18 mg 9 PIE-9 5-hydroxy-7- methoxyflavone C16H13O4 27 mg 3.2.2. Xác định cấu trúc của các hợp chất Hợp chất lần đầu tiên được công bố (PIE-1) Các tín hiệu proton và carbon khác của hợp chất PIE-1 được quy gán dựa trên phổ 1D- và 2D-NMR xác định được cấu trúc. Đây là hợp chất mới lần đầu tiên được công bố, được gọi tên là igniarine. Igniarine Bảng 3.13 Dữ liệu phổ 1H- và 13C-NMR của hợp chất PIE-1 (400 MHz, DMSO-d6) Cacbon 1H-NMR 13C-NMR δH (ppm, multi., J Hz) δC (ppm) 1 1,25 (1H, m) 1,67 (1H, m) 35,5 2 1,67 (2H, m) 27,9 3 3,24 (1H, dd, 11,6, 4,8) 78,9 4 - 38,9 5 1,06 (1H, dd, 12,6, 2,0) 50,3 6 1,55 (1H, m) 1,72 (1H, m) 18,2 7 1,85 (2H, m) 27,3 8 - 134,4 9 - 134,3 13 10 - 37,0 11 2,05 (2H, m) 20,9 12 1,65 (1H, m) 1,95 (1H, m) 31,0 13 - 49,4 14 - 44,8 15 1,17 (1H, m) 1,60 (1H, m) 30,9 16 2,05 (2H, m) 26,5 17 2,22 (1H, br d, 8,4) 47,0 18 0,79 (3H, s) 16,2 19 1,00 (3H, s) 19,2 20 3,24 (1H, m) 44,5 21 1,18 (3H, d, 6,8) 17,3 22 - 193,8 23 - 152,4 24 7,06 (1H, s) 119,7 25 - 122,6 26 7,37 (3H, s) 143,8 27 2,08 (3H, s) 9,8 28 0,98 (3H, s) 27,8 29 0,81 (3H, s) 15,4 30 0,92 (3H, s) 24,3 3.3. Kết quả thử hoạt tính của cao chiết và hợp chất sạch 3.3.1. Hoạt tính gây độc tế bào của các hợp chất phân lập từ P. iganirius Các hợp chất được phân lập từ quả thể nấm P.iganirius đã được tiến hành thử các hoạt tính gây độc tế bào trên các dòng ung thư (MCF- 7, HepG2, Lu) ở Phòng Sinh học thực nghiệm, Viện Hoá học các hợp chất thiên nhiên, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Bảng 3.21. Kết quả thử hoạt tính gây độc tế bào 3 dòng ung thư của hợp chất phân lập từ loài P. iganirius IC50 (µM)a Hợp chất MCF-7 HepG2 Lu PIE-1 >100 18,4 ± 2,6 29,1 ± 3,6 14 PIE-2 >100 19,2 ± 2,0 35,2 ± 3,4 PIE-3 >100 16,7 ± 1,6 21,7 ± 2,8 PIE-4 43,6 ± 5,1 21,5 ± 5,1 >50 PIE-5 >100 46,9 ± 3,7 >50 Adriamycinb 2,2 ± 0,1 5,4 ± 0,5 2,8 ± 0,4 a Nồng độ ức chế cần thiết (IC50). Kết quả hiện thị ý nghĩa ± SD (n = 3). b Đối chứng dương. 3.3.2. Hoạt tính chống oxy hóa của cao chiết nấm thượng hoàng (P. igniarius và P. nilgheriensis) Các mẫu thử PI cồn 45%, PI cồn, PN cồn 45% và PN cồn có biểu hiện hoạt tính chống oxy hóa trên hệ DPPH ở nồng độ thử nghiệm (200µg/ml). Mẫu thử nghiệm với nồng độ mẫu có khả năng trung hòa 50% gốc tự do (SC50) tương ứng như sau: PI cồn 45% (112,55µg/ml), PI cồn (154,15µg/ml), PN cồn 45% (123,16µg/ml) và PN cồn (114,21µg/ml). Hai mẫu thử PI nước và PN nước không biểu hiện hoạt tính chống oxy hóa trên hệ DPPH ở nồng độ thử nghiệm (200µg/ml). 3.3.3. Hoạt tính gây độc tế bào của cao chiết từ nấm thượng hoàng Các cao chiết được phân lập từ quả thể nấm P. iganirius (PI) và P. nilgheriensis (PN) đã được tiến hành thử các hoạt tính gây độc tế bào ở Phòng Sinh học thực nghiệm, Viện Hoá học các hợp chất thiên nhiên, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Kết quả thử nghiệm cho thấy hoạt tính của các cao chiết từ loài P. iganirius từ cồn 45% đều có khả năng kháng dòng ung thư cả ba dòng u (HepG2, MCF-7 và Lu) lần lượt là 19,498, 11,180 và 19,520. Trong đó, các cao chiết đều cho thấy hoạt tính kháng dòng tế bào HepG2 có chỉ số IC50 đáng chú ý đối với cao chiết PI cồn 45% có giá trị IC50 là 11,180 so với các loại cao chiết khác. 3.4. Xây dựng quy trình trích ly dịch chiết từ nấm thượng hoàng 3.4.2. Khảo sát các phương pháp chiết Qua các thí nghiệm nghiên cứu ở trên ta có thể nhận thấy yếu tố đảo trộn trong quá trình chiết xuất ảnh hưởng lớn đến hàm lượng chất chiết thu hồi, chính vì vậy, chúng tôi lựa chọn phương pháp chiết thường có đảo trộn và hồi lưu dung môi để thực hiện các nghiên cứu tiếp theo 3.4.3. Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chiết xuất dịch nấm thượng hoàng (P. igniarius) 15 3.4.4. Tối ưu hóa quá trình tách chiết một số hợp chất trong nấm thượng hoàng (P. igniarius). 3.4.4.1. Thiết lập mô hình Tiến hành nghiên cứu hàm lượng tổng phenolic, tổng flavonoid và hàm lượng chất chiết thu hồi với 3 yếu tố ảnh hưởng chính là: nhiệt độ chiết (ᵒC), thời gian chiết (h) và nồng độ dung môi (%). Sử dụng phương pháp quy hoạch thực nghiệm Box-Behnken cho 3 yếu tố, mỗi yếu tố được tiến hành tại 3 mức (-1, 0, +1). Bảng 3.29. Mức ảnh hưởng của các yếu tố Biến số Ký hiệu Đơn vị Mức -1 0 1 Nhiệt độ chiết A ᵒC 30 50 70 Thời gian chiết B Giờ 3 5 7 Nồng độ ethanol C % 30 60 90 Bảng 3.30. Kết quả thí nghiệm tối ưu quy trình tách chiết các hợp chất từ loài P. igniarius TN Nhiệt độ A (oC) Thời gian B (h) Nồng độ Ethanol C (%) Hàm lượng tổng phenolic Y1 mgGAE/g Hàm lượng tổng flavonoid Y2 (mgCE/g) Hàm lượng chất khô thu nhận Y3 (%) 1 0 0 0 79,85 7,25 5,26 2 - - 0 66,27 5,52 3,65 3 - 0 + 69,73 5,84 4,23 4 0 + - 75,72 6,82 6,25 5 0 0 0 80,42 7,29 5,18 6 0 - + 70,25 6,21 4,54 7 0 + + 77,32 7,07 5,77 8 - + 0 71,26 6,08 4,92 9 - 0 - 67,38 5,62 4,73 10 + + 0 76,75 6,48 6,64 11 + - 0 71,82 6,12 4,88 12 + 0 - 72,88 6,24 6,35 16 13 0 - - 68,84 6,07 5,09 14 + 0 + 73,85 6,35 5,93 15 0 0 0 79,12 7,21 5,31 Hàm lượng tổng phenolic (Y1), hàm lượng tổng flavonoid (Y2) và hiệu suất chất chiết thu hồi (Y3) được được biểu diễn bằng phương trình hồi quy bậc hai như sau: Y1 = 78,86 + 2,59A + 5,67B + 0,78C – 0,019AB – 0,35AC + 0,059BC – 5,17A2 – 4,84B2 – 3,66C2 Y2 = 7,15 + 0,28A + 0,60B + 0,083C – 0,062AB – 0,028AC + 0,034BC – 0,86A2 – 0,52B2 – 0,37C2 Y3 = 5,08 + 0,75A + 0,89B – 0,25C + 0,15AB + 0,02AC + 0,022BC – 0,16A2 – 0,098B2 + 0,22C2 Bảng 3.31. Bảng phân tích hồi quy của 3 hàm mục tiêu: Hàm lượng tổng phenolic (Y1), hàm lượng tổng flavonoid (Y2) và hiệu suất chất chiết thu nhận(Y3) Nguồn gốc Hàm lượng tổng phenolic (Y1) Hàm lượng tổng flavonoid (Y2) Hiệu suất chất chiết thu nhận (Y3) Giá trị F Giá trị p Giá trị F Giá trị p Giá trị F Giá trị p Mô hình 51,47 0,0002 40,73 0,0004 66,95 0,0001 A 75,66 0,0003 42,32 0,0013 257,15 <0,0001 B 169,64 <0,0001 93,02 0,0002 166,19 <0,0001 C 6,87 0,0470 3,76 0,1101 27,91 0,0032 AB 1,432.10-3 0,9713 0,77 0,4215 3,83 0,1078 AC 0,76 0,4240 0,23 0,6506 0,10 0,7623 BC 0,014 0,9093 0,23 0,6506 0,078 0,7911 A2 157,11 <0,0001 211,62 <0,0001 6,41 0,0524 B2 56,42 0,0007 31,74 0,0024 0,92 0,3816 C2 78,87 0,0003 39,24 0,0015 11,92 0,0182 Lack of Fit 1,80 0,3765 12,93 0,0726 5,41 0,1599 R2 0,9893 0,9865 0,9918 17 3.4.3.2. Tối ưu hóa quy trình chiết xuất nấm thượng hoàng (P. igniarius) Hình 3.29. Mức độ đáp ứng sự mong đợi của quá trình chiết xuất dịch nấm thượng hoàng (P. igniarius) 3.4.4.3. Kiểm tra lại mô hình tối ưu hóa Thực nghiệm được tiến hành lặp lại ba lần với điều kiện thông số tối ưu tại nhiệt độ chiết 57oC, thời gian chiết 6,66 giờ và nồng độ ethanol 60% (làm tròn thông số do điều kiện thiết bị) thì kết quả hàm lượng tổng phenolic đạt 79,02±0,5 mgGAE/g, hàm lượng tổng flavonoid đạt 7,05±0,03 mgCE/g và lượng chất chiết thu hồi đạt 5,85±0,02 %. 3.4.5. Tối ưu hóa quy trình tách chiết một số hợp chất trong nấm thượng hoàng (P. nilgheriensis). Thực nghiệm được tiến hành lặp lại ba lần với điều kiện thông số tối ưu tại nhiệt độ chiết 65oC, thời gian chiết 6,9 giờ và nồng độ ethanol 89% (làm tròn thông số do điều kiện thiết bị) thì kết quả hàm lượng tổng phenolic đạt 48,54±0,3mgGAE/g, hàm lượng tổng flavonoid đạt 5,32±0,15mgCE/g và lượng chất chiết thu hồi đạt 8,07±0,02%. 3.5. Xây dựng quy trình sấy phun dịch chiết dịch chiết từ nấm thượng hoàng (P. igniarius) 3.5.1. Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sấy dịch nấm thượng hoàng 18 3.5.2. Tối ưu hóa quá trình sấy phun dịch chiết từ nấm thượng hoàng (P. gniarius) Bảng 3.35. Mã hóa của các biến độc lập Các biến độc lập Kí hiệu Các mức mã hóa -1 0 +1 Tỷ lệ Maltodextrin (%) A 6 9 12 Nhiệt độ sấy (oC) B 140 150 160 Tốc độ bơm dịch (mL/phút) C 20 25 30 Bảng 3.36. Thiết kế thí nghiệm và kết quả TN Tỷ lệ Maltodextrin A (%) Nhiệt độ sấy đầu vào B (oC) Tốc độ bơm dịch C (mL/phút) Hàm lượng tổng phenolic Y1 (mgGAE/g) Độ ẩm sản phẩm Y2 (%) 1 0 - + 24,84 7,45 2 - - 0 28,17 6,19 3 0 - - 25,83 7,25 4 0 0 0 24,42 6,88 5 0 + - 22,25 5,36 6 - + 0 27,15 5,23 7 + 0 + 19,96 7,65 8 + - 0 22,19 7,98 9 0 0 0 24,48 6,85 10 + 0 - 18,82 7,35 11 0 0 0 24,54 6,82 12 - 0 - 27,82 6,54 13 0 + + 22,58 5,69 14 0 0 0 24,46 6,91 15 0 0 0 24,51 6,86 16 + + 0 17,75 5,41 17 - 0 + 26,36 6,72 19 Hình 3.35. Mức độ đáp ứng sự mong đợi của quá trình sấy phun dịch chiết từ nấm thượng hoàng (P. igniarius) Để phù hợp các thông số công nghệ của thiết bị, chúng tôi tiến hành thực nghiệm lại mô hình tối ưu tại các giá trị: tỷ lệ maltodextrin 6%, nhiệt độ sấy 160oC và tốc độ bơm dịch 23 mL/phút, kết quả thu được như sau: Hàm lượng tổng phenolic của bột sấy là 27,05±0,2 mgGAE/g bột khô và độ ẩm của sản phẩm là 5,25±0,1%. 20 Sơ đồ 3.2. Sơ đồ quy trình sản xuất bột nấm thượng hoàng (P. igniarius) Mẫu nguyên liệu nấm thượng hoàng (Phellinus igniarius) Bột nấm thượng hoàng khô (Độ ẩm khoảng 6-8%) Cô đặc Chiết xuất Bã Sấy phun Bột sản phẩm - Sấy chân không 50ᵒC, thời gian 24h - Nghiền nhỏ kích thước 1mm - Nhiệt độ 57oC - Thời gian 6,66 giờ - Nồng độ ethanol 60% - Tỷ lệ maltodextrin 6% - Nhiệt độ sấy 160oC - Tốc độ bơm dịch 23mL/phút - Hàm lượng chất khô cao chiết 20-25% 21 3.6. Ứng dụng nấm thượng hoàng trong sản xuất thực phẩm 3.6.1. Quy trình sản xuất bánh quy Bảng 3.40. Công thức sản xuất bánh quy bổ sung nấm thượng hoàng TT Nguyên liệu và phụ gia Hàm lượng (%) 1 Bột mỳ 51 2 Bơ lạc 15 3 Đường 12 4 Sữa tươi 6 5 Trứng gà 5 6 Bột nấm thượng hoàng 4 7 Nước 5 8 Vanilla 2 Sơ đồ 3.3. Quy trình sản xuất bánh quy bổ sung nấm thượng hoàng 22 3.6.2. Quy trình sản xuất cà phê hòa tan Bảng 3.44. Công thức sản xuất cà phê hòa tan bổ sung nấm thượng hoàng TT Nguyên liệu và phụ gia Hàm lượng (%) 1 Bột cà phê hòa tan (tinh chất cà phê) 10