Tóm tắt Luận án Nghiên cứu đột biến, mức độ biểu hiện gen egfr và tình trạng methyl hóa một số gen liên quan trên bệnh nhân ung thư biểu mô tuyến ở phổi

n tích biến đổi phân tử trong UTP 1.6.1. Phương pháp phân tích đột biến gen trong UTP Đột biến gen trong UTP được phát hiện thông qua nhiều phương pháp như: Giải trình tự gen, Realtime PCR, lai DNA tại chỗ, . 1.6.2. Phương pháp phân tích methyl hóa DNA trong UTP Hiện nay, ba phương pháp được sử dụng để phân tích methyl hóa DNA: Kết tủa miễn dịch; sử dụng enzyme nhạy cảm methyl và dựa trên DNA đã xử lý bisulfite. 1.7. Nghiên cứu các dấu ấn phân tử trong UTP ở Việt Nam Nhằm định hướng điều trị đích bằng đã có một số nghiên cứu xác định tỷ lệ đột biến gen EGFR trong UTPKTBN tại Việt Nam, Vu A.H. và cs., Nguyễn Minh Hà và cs., Mai Trọng Khoa và cs. trên 332, 120 và 511 mẫu UTPKTBN nhận thấy tỷ lệ đột biến EGFR lần lượt là 40,7; 35,7 và 40,1%. Cũng như một số luận án tiến về đột biến gen EGFR trong UTP. Tuy nhiên, chưa có công bố đánh giá đồng thời tương quan các biến đổi phân tử EGFR bao gồm đột biến gen, methyl hóa DNA và biểu hiện quá mức protein tương ứng cùng với thay đổi methyl hóa trên các gen ức chế khối u phổ biến như MGMT, MLH1, BRCA1, RASSF1Atrong UTP. Đây được xem là lĩnh vực nghiên cứu mới đối với ung thư. Chƣơng 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 2.1. Vật liệu 139 mẫu UTBMT của phổi, 5 mẫu phổi liền kề, mẫu máu người khỏe mạnh được cung cấp bởi Bệnh viện K. Việc sử dụng các mẫu bệnh phẩm được sự cho phép của Bệnh viện K. Các hóa chất và bộ kit dùng trong nghiên cứu đều đạt tiêu chuẩn dùng cho phân tích sinh hoc phân tử. 6 2.2. Thiết bị chính Các thiết bị chuyên dụng cho nghiên cứu sinh học phân tử. 2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu Luận án được thực hiện tại PTN trọng điểm công nghệ gen, Viện CHSH và Phòng Sinh học phân tử, Trung tâm GPB&SHPT, BV K. Đề tài được thực hiện theo phương pháp mô tả cắt ngang, sử dụng những kỹ thuật bao gồm: Tách chiết DNA tổng số, xác định nồng độ DNA; xử lý bisulfite DNA tổng số; PCR; MS-PCR; điện di; xác định đột biến EGFR; nhuộm hóa mô miễn dịch; xử lý kết quả bằng thống kê sinh học. Chƣơng 3. KẾT QUẢ 3.1. Đặc điểm bệnh nhân nghiên cứu. Trong 139 bệnh nhân nghiên cứu, độ tuổi trung bình của nhóm bệnh nhân là 57,4. Trong đó 94 là nam, 45 trường hợp là nữ giới. 79 bệnh nhân hút thuốc trong đó 76/79 trường hợp là nam. Bệnh nhân trong nghiên cứu thuộc 3 phân típ mô bệnh học chủ yếu: Tuyến chùm nang (56,8%), tuyến nhú (15,8%) và tuyến đặc (24,5%). 104 mẫu từ khối u nguyên phát và 35 mẫu di căn. Hầu hết bệnh nhân ở giai đoạn II&IV (127/139) và chỉ có 12 trường hợp ở giai đoạn I&II . 3.2. Đặc điểm phân tử EGFR ở bệnh nhân UTBMT ở phổi 3.2.1. Đột biến EGFR và sự tương quan với đặc điểm bệnh nhân Đột biến EGFR phát hiện ở 35,3% (49/139) bệnh nhân, với 12 dạng đột biến khác nhau. Đột biến mất đoạn ở exon 19 và đột biến L858R (exon 21) chiếm 85,5%. Bên cạnh đó, 6 trường hợp phát hiện 2 đột biến xảy ra đồng thời. Đột biến thay thế G719X thường xảy ra đồng thời với những đột biến khác (4/5 trường hợp) như S768I, L861Q, L858R và mất đoạn ở exon 19 Đột biến EGFR xảy ra với tần suất cao hơn ở nhóm bệnh nhân trẻ tuổi, nữ giới và không hút thuốc lá. Đồng 7 thời, bệnh nhân thuộc phân típ đặc có tỷ lệ đột biến thấp hơn so với những phân típ còn lại (Bảng 3.3). 3.2.3. Biểu hiện EGFR và sự tương quan với đặc điểm bệnh nhân Biểu hiện protetin EGFR được đánh giá bằng phương pháp hóa mô miễn dịch. Kết quả cho thấy 57 (41,0%) mẫu âm tính (IHC: 0, 1+) và 82 (59,0%) mẫu dương tính (IHC: 2+, 3+) với sự biểu hiện EGFR. Không có sự tương quan giữa biểu hiện EGFR với đặc điểm bệnh nhân bao gồm: Tuổi, giới tính, tình trạng hút thuốc, phân típ mô bệnh học, tình trạng u và giai đoạn bệnh (p>0,05) (Bảng 3.6). Bảng 3.3: Tương quan giữa đột biến EGFR với đặc điểm bệnh nhân Đột biến EGFR p Có Không Số lƣợng 139 49 90 Tuổi (57,4 ±10,8) 0,023 ≤57,4 67 30 37 ˃ 57,4 72 19 53 Giới tính <0,001 Nam 94 23 71 Nữ 45 26 19 Hút thuốc 0,005 Có 79 20 59 Không 60 29 31 Phân típ mô học Chùm nang 79 32 47 0,155 Nhú 22 7 15 0,811 Vi nhú 3 2 1 0,284 Đặc 34 7 27 0,042 Hỗn hợp 1 1 0 0,353 Khối u 0,787 Nguyên phát 104 36 68 Di căn 35 13 22 Giai đoạn 0,263 I & II 12 6 6 III & IV 127 43 84 8 3.3. Tình trạng methyl hóa một số gen liên quan đến UTBMT của phổi 3.3.1. Methyl hóa EGFR và sự tương quan với đặc điểm bệnh nhân Phân tích 139 mẫu, kết quả cho thấy 23,7% (33/139) trường hợp có EGFR methyl. Methyl hóa EGFR không có sự khác biệt có ý nghĩa với các yếu tố: Tuổi, giới tính, tình trạng hút thuốc, phân típ mô bệnh học, tình trạng u và giai đoạn bệnh (p>0,05) ở những bệnh nhân trong nghiên cứu. Bảng 3.6: Tương quan giữa biểu hiện EGFR với đặc điểm bệnh nhân Biểu hiện EGFR p Âm Dƣơng Số lƣợng 139 57 82 Tuổi (57,4 ±10,8) 0,599 ≤57,4 67 29 38 >57,4 72 28 44 Giới tính 0,191 Nam 94 35 59 Nữ 45 22 23 Hút thuốc 0,627 Có 79 31 48 Không 60 26 34 Phân típ mô học Chùm nang 79 27 52 0,060 Nhú 22 9 13 0,992 Vi nhú 3 2 1 0,361 Đặc 34 18 16 0,104 Hỗn hợp 1 1 0 0,229 Khối u 0,203 Nguyên phát 104 39 64 Di căn 35 18 18 Giai đoạn 0,572 I & II 12 4 8 III & IV 127 32 95 9 3.3.2. Methyl hóa BRCA1 và sự tương quan với đặc điểm bệnh nhân Phân tích trên 139 bệnh nhân, kết quả cho thấy 41 (29,5%) trường hợp có methyl hóa BRCA1. Methyl BRCA1 xảy ra hoàn toàn ngẫu nhiên với các đặc điểm: Tuổi, giới tính, tình trạng hút thuốc, phân típ mô bệnh học, tình trạng u và giai đoạn bệnh (p>0,05). Bảng 3.11: Tương quan giữa methyl RASSF1A với đặc điểm bệnh nhân Methyl RASSF1A p M U Số lƣợng 139 41 98 Tuổi (57,4 ±10,8) ≤57,4 67 20 47 0,93 >57,4 72 21 51 Giới tính Nam 94 29 65 0,613 Nữ 45 12 33 Hút thuốc Có 79 29 50 0,032 Không 60 12 48 Phân típ mô học Chùm nang 79 22 57 0,625 Nhú 22 7 15 0,795 Vi nhú 3 1 2 0,883 Đặc 34 11 23 0,674 Hỗn hợp 1 0 1 0,521 Khối u Nguyên phát 104 26 78 0,045 Di căn 35 15 20 Giai đoạn I & II 12 4 8 0,760 III & IV 127 37 90 3.3.3. Methyl hóa MGMT và sự tương quan với đặc điểm bệnh nhân Tần suất methyl hóa MGMT trên 139 mẫu bệnh phẩm trong nghiên cứu là 33,1%. Methyl MGMT có khác biệt có ý nghĩa với tình trạng khối u, trong khi đó không có tương quan với các đặc điểm: Tuổi, giới tính, hút thuốc, mô bệnh học và giai đoạn bệnh. 10 3.3.4. Methyl hóa MLH1 và sự tương quan với đặc điểm bệnh nhân Kết quả cho thấy 28/139 (20,1%) bệnh phẩm có methyl hóa MLH1. Methyl hóa MLH1 hoàn toàn ngẫu nhiên với các đặc điểm của bệnh nhân (p>0,05). 3.3.5. Methyl RASSF1A và sự tương quan với đặc điểm bệnh nhân Tỷ lệ bệnh nhân methyl RASSF1A trong nghiên cứu là 29,5% (41/139). Methyl hóa RASSF1A có tương quan thuận với tình trạng khối u và tiến sử hút thuốc của bệnh nhân; nhưng không có sự khác biệt có ý nghĩa với độ tuổi, giới tính, phân típ mô bệnh học và giai đoạn bệnh. 3.4. Tƣơng quan giữa đột biến và biểu hiện gen EGFR với methyl hóa một số gen liên quan đến UTBMT của phổi 3.4.1. Tương quan giữa đột biến, biểu hiện và methyl hóa EGFR Kết quả chỉ ra không có tương quan giữa đột biến với methyl hóa và biểu hiện protein EGFR. Tuy nhiên, có mối liên hệ chặt chẽ giữa methyl hóa và biểu hiện protein EGFR. Bảng 3.12: Tương quan giữa đột biến gen, methyl hóa và biểu hiện protein EGFR Methyl EGFR Đột biến EGFR M U p + - p 33 106 49 90 Biểu hiện EGFR - 21 36 0,002 20 37 0,973 + 12 70 29 53 Đột biến EGFR + 15 34 0,160 - 18 72 11 3.4.2. Tương quan giữa đột biến và biểu hiện gen EGFR với methyl hóa các gen BRCA1, MGMT, MLH1 và RASSF1A Kết quả cho thấy mối tương quan ngược giữa đột biến EGFR và methyl hóa BRCA1, MGMT và RASSF1A; và giữa đột biến EGFR với methyl hóa đồng thời của các gen ức chế khối u (Bảng .15). Tương quan giữa biểu hiện EGFR và methyl hóa các gen MGMT, MLH1 và RASSF1A là ngẫu nhiên, không có sự sai khác. Tuy nhiên, có sự tương quan giữa mức độ biểu hiện protein EGFR và methyl BRCA1; cụ thể methyl hóa BRCA1 có xu hướng ức chế biểu hiện EGFR. Bảng 3.15: Tương quan giữa đột biến EGFR với methyl hóa các gen BRCA1, MGMT, MLH1 và RASSF1A ĐỘT BIẾN EGFR Số lƣợng Đột biến Kiểu dại Giá trị p METHYL 139 49 90 BRCA1 M 41 9 32 0,034 U 98 40 58 MGMT M 46 11 35 0,049 U 93 38 55 MLH1 M 28 8 20 0,408 U 111 41 70 RASSF1A M 41 7 34 0,004 U 98 42 56 1 trong 4 M 90 26 64 0,041 U 49 23 26 2 trong 4 M 41 6 35 0,001 U 98 43 55 3 trong 4 M 17 1 16 0,004 U 122 48 74 4 trong 4 M 5 0 5 0,106 U 134 49 85 12 3.4.3. Tương quan về tình trạng methyl các gen liên quan đến UTP Hiện tượng methyl hóa EGFR và các gen BRCA1, MGMT, MLH1 và RASSF1A ở những mẫu UTBMT của phổi trong nghiên cứu xảy ra ngẫu nhiên, không có sự khác biệt. Có tương quan thuận giữa methyl RASSF1A với methyl MLH1 và BRCA1 (p<0,05). Methyl RASSF1A có xu hướng xảy ra đồng thời với methyl hóa MLH1 và BRCA1. Tuy cùng có sự liên quan đối với methyl RASSF1A, nhưng methyl MLH1 và BRCA1 lại xảy ra độc lập. Bảng 3.17. Tương quan về tình trạng methyl các gen liên quan đến ung thư biểu mô tuyển ở phổi EGFR MLH1 RASSF1A MGMT M U p M U p M U p M U p BRCA1 M 11 30 0,580 10 31 0,419 21 20 0,001 15 26 0,571 U 22 76 18 80 20 78 31 67 MGMT M 13 33 0,378 13 33 0,093 17 29 0,175 U 20 73 15 78 24 69 RASSF1 M 10 31 0,907 17 24 0,001 U 23 75 11 87 MLH1 M 10 18 0,096 U 23 88 Chƣơng 4. BÀN LUẬN 4.1. Đặc điểm phân tử gen EGFR ở bệnh nhân UTBMT của phổi 4.1.1. Đột biến vùng hoạt hoá Tyrosine Kinase gen EGFR Phân tích 139 bệnh nhân, chúng tôi nhận thấy 35,3% trường hợp đột biến EGFR, tương tự với công bố trước đây tại một số nước Châu Á như Nhật Bản 32%, Hàn Quốc 36,4%; thấp hơn so với một số quốc gia khác trong khu vực như Thái Lan 57,4%, Đài Loan 55% và cao hơn các nước Châu Mỹ và Châu Âu (10 - 15%). Như vậy, đột biến 13 EGFR xảy ra với tần suất khá cao ở bệnh nhân ung thư phổi dạng tuyến tại Bệnh viện K, thường gặp ở người trẻ tuổi, là phụ nữ và không hút thuốc. Phân típ biểu mô tuyến đặc có tỷ lệ đột biến thấp hơn những nhân típ khác (Bảng 3.3). Midha A. và cs. (2015) tổng hợp và phân tích 139 nghiên cứu về đột biến EGFR trên khắp thế giới cho thấy tuy có khác nhau về tỷ lệ đột biến giữa các nhóm người, các vùng địa lý nhưng tỷ lệ đột biến EGFR luôn cao hơn ở phụ nữ và những người không hút thuốc lá. 4.1.2. Biểu hiện quá mức của protein EGFR Đánh giá biểu hiện EGFR thu được 59,0% (82/139) mẫu dương tính. Mức độ biểu hiện EGFR trong các nghiên cứu có độ tương đồng khá lớn, như báo cáo của Cappuzzo F. và cs. (2005), Hirsch F.R. và cs. (2008). Nghiên cứu 139 bệnh nhân, chúng tôi nhận thấy biểu hiện EGFR không thể hiện mối tương quan với một số đặc điểm của bệnh nhân (Bảng 3.6); tương đồng với nghiên cứu của Cappuzzo F. và cs. (2005) và Liang Z. (2010). Tuy nhiên, trong nghiên cứu này, chúng tôi nhận thấy mức độ biểu hiện quá mức của EGFR (3+) ở bệnh nhân nam giới cao hơn ở nữ giới. Mặc dù vậy, cơ chế của hiện tượng này vẫn chưa được làm sáng tỏ. Thêm vào đó, ở những khối u di căn, mức độ biểu hiện EGFR có xu hướng tăng mạnh so với tại những khối u nguyên phát. Như vậy có thể giả thuyết mức độ ác tính cao hơn ở những khối u di căn là kết quả của biểu hiện quá mức protein EGFR. 4.1.3. Methyl hóa vùng promoter gen EGFR Tần suất methyl EGFR trong nghiên cứu là 23,7%, thấp hơn so với nghiên cứu của Li J. và cs. (2015) (36,8%) và Pan Z.Y. và cs. (2015) (35,7%). Chúng tôi không nhận thấy có sự tương quan giữa methyl EGFR với các đặc điểm như: Tuổi, giới tính, trình trạng hút thuốc, các phân típ mô bệnh học, giai đoạn bệnh và tình trạng khối u; hoàn toàn 14 tương đồng với các công bố trước đó. Tuy nhiên, Li J. và cs. (2015) nhận thấy bệnh nhân ở giai đoạn III có tỷ lệ methyl EGFR thấp hơn so với giai đoạn I và II. 4.1.4. Tương quan giữa các đặc điểm phân tử gen EGFR Đột biến EGFR dẫn đến những biến đổi về trình tự axit amin cũng như hoạt tính của protein qua đó ảnh hưởng đến quá trình sinh trưởng và phát triển của tế bào. Tuy nhiên, mức độ biểu hiện protein được điều khiển bởi nhiều con đường trong tế bào trong đó có hiện tượng methyl hóa vùng promoter của gen. Vì vậy, nghiên cứu mối tương quan của ba hiện tượng đột biến, methyl hóa và biểu hiện protein sẽ góp phần làm sáng tỏ cơ chế hình thành và phát triển của ung thư. Những nghiên cứu về sự tương quan giữa đột biến gen và sự methyl hóa cũng như biểu hiện EGFR cho những kết quả rất khác nhau. Phân tích 139 bệnh nhân, chúng tôi nhận thấy không có tương quan giữa đột biến với methyl hóa và biểu hiện protein EGFR. Tuy nhiên, có mối liên hệ chặt chẽ giữa methyl EGFR và biểu hiện protein EGFR (Bảng 3.12). Cappuzzo F. và cs. (2005) không nhận thấy có mối tương quan giữa sự biểu hiện EGFR với đột biến EGFR; ngược lại, Liang Z. (2010) lại chỉ ra mức độ biểu hiện cao của EGFR ở những bệnh nhân đột biến EGFR. Như vậy, tương quan giữa đột biến với methyl hóa và biểu hiện của EGFR có thể không đồng nhất giữa những nhóm nghiên cứu do sai khác về chủng tộc, lứa tuổi, giới tính và giai đoạn bệnh. Mức độ biểu hiện protein có thể được sử dụng trong đánh giá đáp ứng cũng như tiên tượng trong điều trị ung thư. Li và cs. (2013) chỉ ra sự tăng mức độ biểu hiện của EGFR cũng như chết theo chương trình ở những dòng tế bào có EGFR methyl hóa được nuôi cấy trong môi trường có sử dụng chất loại bỏ nhóm methyl 5-aza-CdR và bổ sung TKIs. Do đó, kiểm soát mức độ biểu hiện EGFR thông qua sự methyl 15 hóa kết hợp với các thuốc điều trị đích TKIs có thể là một hướng mới trong nghiên cứu cũng như trong điều trị ung thư phổi. 4.2. Methyl hóa gen ức chế khối u BRCA1, MGMT, MLH1 và RASSF1A ở bệnh nhân UTBMT của phổi 4.2.1. Methyl hóa quá mức vùng promoter gen BRCA1 Methyl BRCA1 được nghiên cứu chủ yếu trong ung thư vú và ít được chú ý trong ung thư phổi. Methyl BRCA1 cao bất thường có thể được xem là một con đường hình thành khối u bên cạnh đột biến EGFR hoặc KRAS. Tỷ lệ methyl BRCA1 ở các nghiên cứu khác nhau nằm trong khoảng 4 - 54%. Tần suất methyl BRCA1 trên 139 bệnh nhân nghiên cứu là 29,5%; cao hơn bệnh nhân Hoa kỳ (4%) và thấp hơn người Trung Quốc (30 - 54%). Điều này được lý giải do sự khác biệt về chủng tộc và vùng địa lý. Ở những bệnh nhân Châu Á, sự methyl hóa BRCA1 có xu hướng xảy ra phổ biến hơn so với những bệnh nhân người phương tây. Trong nghiên cứu này, không có sự tương quan giữa methyl BRCA1 với các đặc điểm của bệnh nhân. Các nghiên cứu trước đây, tuy không nghiên cứu đầy đủ các đặc điểm nhưng phần lớn đều chỉ ra không có sự liên hệ giữa các đặc điểm này với methyl hóa BRCA1. Gao W. và cs. (2016) chỉ ra methyl BRCA1 có xu thế tăng cao hơn ở giai đoạn II và III so với giai đoạn I; ở những bệnh nhân di căn hạch lympho so với bệnh nhân không di căn hạch. Từ đó có thể giả thuyết methyl BRCA1 xảy ra song song với quá trình tiến triển của bệnh, bệnh càng tiến triển mức độ methyl hóa càng cao. Trong nghiên cứu này, chúng tôi cũng nhận thấy có tự tăng lên về tình trạng methyl hóa BRCA1 với giai đoạn bệnh tuy nhiên sự sai khác mang tính ngẫu nhiên. Như vậy, methyl BRCA1 có thể được xem là một trong những nguyên nhân dẫn đến sự 16 hình thành, phát triển của ung thư biểu mô tuyến ở phổi và cần được nghiên cứu một cách chi tiết. 4.2.2. Methyl hóa vùng promoter gen MGMT Methyl hóa MGMT được tiến hành nghiên cứu trong nhiều ung thư trong đó có ung thư phổi. Tỷ lệ methyl MGMT trong các nghiên cứu khác nhau thay đổi từ 8 - 50%. Tần suất methyl hóa MGMT trên 139 bệnh nhân nghiên cứu là 33,1%; cao hơn báo cáo của Feng Q. và cs. (2008) (8%) và Kim và cs. (2005) (17%); tương đồng với các công bố ở bệnh nhân Trung Quốc (30 - 50%). Methyl hóa MGMT dẫn đễn ức chế biểu hiện và mất chức năng sửa chữa DNA trong tế bào, tăng nguy cơ hình thành đột biến. Kết quả phân tích mối tương quan cho thấy methyl hóa MGMT không bị chi phối bởi các đặc điểm trong nhiên cứu ngoại trừ đặc điểm khối u. Các báo cáo trên bệnh nhân Hàn Quốc và Trung Quốc cũng cho kết quả tương tự. Trong nghiên cứu này, chúng tôi nhận thấy methyl hóa MGMT tăng lên ở những khối u di căn. Tuy cơ chế thúc đẩy sự methyl hóa MGMT ở những tế bào di căn trong ung thư phổi chưa được làm sáng tỏ nhưng có thể thấy methyl MGMT có thể góp phần đẩy nhanh quá trình di căn của khối u, quá trình tiến triển của bệnh, đồng thời sự methyl MGMT cũng có thể được xem là một trong những dấu chuẩn hỗ trợ trong quá trình tiên lượng và điều trị ung thư phổi. 4.2.3. Methyl hóa vùng promoter gen MLH1 Methyl hóa MLH1 trong ung thư phổi được nghiên cứu khá phổ biến, tuy nhiên tỷ lệ methyl hóa rất khác nhau ở các nghiên cứu.Tỷ lệ methyl MLH1 đã được công bố trước đây khoảng từ 0 - 58%. Tần suất methyl MLH1 trên 139 bệnh nhân nghiên cứu là 20,1%; cao hơn báo cáo của Tang M. và cs. (2006) trên người Tây Ban Nha (0%); thấp hơn các công bố ở Châu Á (30 - 50%). Ngoài ra, Seng T.J. và cs. (2008) so 17 sánh tỷ lệ sống sót của bệnh nhân bị methyl hóa và không methyl MLH1, cho thấy những bệnh nhân mang gen MLH1 methyl có tiên lượng xấu và có thời gian sống sót thấp hơn nhóm không methyl. Như vậy, methyl MLH1 là một trong những dấu chuẩn trong đánh giá tiên tượng cho bệnh nhân ung thư phổi cùng với những dấu chuẩn khác. Nhiều nghiên cứu methyl hóa MLH1 trên các nhóm bệnh nhân khác nhau đã được thực hiện và cho thấy không có mối tương quan giữa methyl MLH1 với các đặc điểm như: Tuổi, giới tính, tình trạng hút thuốc lá. Các báo cáo thường không đi sâu vào các phân típ khác nhau trong ung thư biểu mô tuyến mà chỉ tập trung phân tích trên bệnh nhân ung thư biểu mô tuyến nói chung. Tuy nhiên, tình trạng methyl MLH1 ở các giai đoạn bệnh khác nhau lại cho thấy sự không tương đồng giữa các nghiên cứu. Trong công bố của Seng T.J. và cs. (2008), tác giả nhận thấy tỷ lệ methyl MLH1 ở bệnh nhân giai đoạn II cao hơn rất nhiều so với ở giai đoạn I (40/86 so với 46/153). Ngược lại, Wang Y.C. và cs. (2003) chỉ ra sự khác biệt về tình trạng methyl MLH1 ở nhóm bệnh nhân giai đoạn muộn so với bệnh nhân giai đoạn sớm (giai đoạn III và IV so với giai đoạn I và II) là hoàn toàn ngẫu nhiên. Nghiên cứu này, chúng tôi cũng không nhận thấy sự khác nhau về tình trạng methyl MLH1 ở các giai đoạn bệnh khác nhau (bệnh nhân trong nghiên cứu chủ yếu ở giai đoạn muộn) cũng như ở vị trí khối u (nguyên phát hay thứ phát).Với chức năng sửa chữa bắt cặp sai trong quá trình sao chép DNA của MLH1, có thể đưa ra giả thuyết quá trình methyl MLH1 xảy ra chủ yếu trong giai đoạn xâm lấn của khối u khi chuyển từ giai đoạn I sang giai đoạn II. Đây cũng là giai đoạn chức năng sửa chữa bắt cặp sai của DNA của tế bào bị suy giảm và phát sinh thêm những đột biến thứ phát trước khi bước vào giai đoạn di căn. 18 4.2.4. Methyl hóa vùng promoter gen RASSF1A RASSF1A tham gia vào điều khiển nhiều quá trình quan trọng trong tế bào trong đó có chu kỳ tế bào cũng như quá trình chết theo chương trình. Methyl hóa RASSF1A có vai trò quyết định dẫn đến ức chế biểu hiện protein này. Vì vậy, methyl RASSF1A đã được nghiên cứu khá rộng rãi và trở thành dấu chuẩn trong chẩn đoán và điều trị ung thư phổi. Tỷ lệ methyl RASSF1A trong các nghiên cứu khác nhau từ 20 - 80%. Tần suất methyl RASSF1A trên 139 bệnh nhân nghiên cứu là 29,5% (Bảng 2.17); cao hơn nghiên cứu của de Fraipont F. và cs. (2012) (21,5%). Theo báo cáo của de Fraipont F. và cs. (2012) về thời gian sống thêm và thời gian sống thêm không bệnh của hai nhóm bệnh nhân sau khi điều trị bằng hóa chất. Kết quả chỉ ra thời gian sống thêm không có bệnh cũng cũng như thời gian sống thêm toàn bộ của nhóm mehthyl RASSF1A thấp hơn so với nhóm không methyl hóa (16,7 so với 61,2 tháng và 32,9 so với 84 tháng). Như vậy có thể thấy việc xác định tình trạng methyl RASSF1A được xem như một trong những yếu tố tiên lượng cho bệnh nhân ung thư phổi. Methyl RASSF1A có liên quan đến tiền sử hút thuốc của bệnh nhân, mối tương quan giữa methyl RASSF1A và tiền sử hút thuốc cũng đã được công bố trong một số nghiên cứu, chẳng hạn Yanagawa N. và cs. (2011) hay Lee S.M. và cs. (2011). Vì vậy, hút thuốc lá có thể là nguyên nhân gây nên sự methyl RASSF1A ở những bệnh nhân ung thư phổi. Bên cạnh sự phát sinh đột biến EGFR, methyl RASSF1A có thể là một cơ chế quan trọng trong quá trình hình thành và phát triển của ung thư phổi. Trước đó, RASSF1A còn được chứng minh có khả năng ức chế sự xâm lấn và di căn của những dòng tế bào ung thư phổi thông qua ức chế protein YAP (Yes-associated protein). Trong nghiên cứu của chúng tôi, tình trạng methyl hóa RASSF1A tại những khối u di căn 19 cao hơn tại những khối u nguyên phát. Điều đó chứng tỏ, methyl RASSF1A không chỉ tham gia vào quá trình hình thành khối u mà còn có vai trò quan trọng trong sự di căn của khối u trong ung thư phổi. Vì vậy, việc xác định tình trạng methyl hóa RASSF1A đang dần trở nên cần thiết cho bệnh nhân, góp phần hỗ trợ chẩn đoán cũng như là tiên lượng bệnh. 4.3. Tƣơng quan giữa những đặc điểm phân tử của gen EGFR với sự methyl hóa BRCA1, MGMT, MLH1 và RASSF1A trong ung thƣ biểu mô tuyến của phổi 4.3.1. Đột biến EGFR với sự methyl hóa các gen ức chế khối u Đột biến gen và methyl DNA hóa là hai con đường chính dẫn đến hình thành và phát triển ung thư. Tác động qua lại của hai con đường này đã được phát hiện trong nhiều loại ung thư. Trong nghiên cứu này, chúng tôi tiến hành phân tích tác động qua lại giữa đột biến EGFR với sự methyl hóa của một số gen ức chế khối u điển hình trong ung thư phổi. Kết quả cho thấy đột biến EGFR và methyl hóa các gen ức chế khối u có xu hướng xảy ra ngược chiều và loại trừ lẫn nhau (Bảng 3.1). Mối tương quan ngược giữa đột biến EGFR với methyl RASSF1A đã được nhắc đến trong một số nghiên cứu trước đây. Yanagawa N. và cs. (2011), Hoque M.O. và cs. (2010) đã chỉ ra mối liên hệ ngược giữa methyl hóa RASSF1A và tiền sử hút thuốc của bệnh nhân với đột biến EGFR. Nghiên cứu này một lần nữa khẳng định lại sự loại trừ lẫn nhau của hai hiện tượng này. Đồng thời, với kết quả phân tích ở trên, đột biến EGFR xảy ra ở những người không hút thuốc lá, ngược lại methyl hóa RASSF1A thường gặp ở những người hút thuốc. Như vậy có giả thuyết ở những người không hút thuốc, ung thư phổi dạng biểu mô tuyến có thể được hình thành do đột biến gen EGFR. Ngược lại, những 20 người hút thuốc ung thư được hình thành thông qua con đường methyl RASSF1A. Bên cạnh đó, trong nghiên cứu chúng tôi cũng đã chỉ ra những mối tương quan ngược giữa đột biến EGFR với methyl hóa BRCA1 và MGMT (Bảng3.15). Nghiên cứu methyl hóa BRCA1 và MGMT ít được chú ý trong ung thư phổi. Tuy nhiên, kết quả nghiên cứu của chúng tôi cho thấy methyl hóa BRCA1 và methyl hóa MGMT xảy ra phổ biến trong ung thư phổi, đồng thời xảy ra chủ yếu ở những bệnh nhân không mang đột biến EGFR. Như vậy, không chỉ có methyl RASSF1A được xem một trong những con đường hình thành ung thư biểu mô tuyến của phổi, sự methyl BRCA1 và MGMT cũng có thể là một bước quan trọng trong quá trình hình thành và phát triển của khối u ở những bệnh nhân không có đột biến EGFR. Giải thuyết này được tiếp tục củng cố bằng kết quả phân tích mối tương quan của methyl đồng thời của 4 gen BRCA1, MGMT, MLH1 và RASSF1A với đột biến EGFR (Bảng 3.15). Sự tương quan ngược của đột biến EGFR với methyl hóa ngẫu nhiên của 1 gen riêng lẻ, của đồng thời 2, 3 hay 4 gen cho thấy cái nhìn rõ ràng hơn về những biến đổi di truyền và di truyền ngoại gen trong ung thư biểu mô tuyến của phổi; đồng thời chỉ ra hai con đường dẫn đến sự hình thành và phát triển của ung thư đó là con đường thông qua đột biến gen và con đường thông qua sự methyl hóa các gen ức chế khối u. Như vậy, có thể xem methyl hóa là một đích cho điều trị ung thư cần được nghiên cứu và thử nghiệm. 4.3.2. Biểu hiện EGFR với methyl hóa các gen ức chế khối u Trong nghiên cứu này, chúng tôi nhận thấy sự biểu hiện của EGFR tăng lên ở những trường hợp bệnh nhân không mang gen BRCA1 bị methyl hóa. Tuy cơ chế về sự tương quan giữa methyl hóa BRCA1 và biểu hiện protein EGFR vẫn chưa được làm sáng tỏ nhưng có thể thấy 21 methyl BRCA1 tham gia ức chế biểu hiện EGFR. Mặc dù vậy, không có nhiều nghiên cứu trên ung thư phổi được tiến hành nhằm làm rõ cơ chế của hiện tượng này. Sự tương quan giữa methyl BRCA1 và biểu hiện EGFR đã được nghiên cứu trên ung buồng trứng, nhưng cho kết quả ngược lại. Da Li và cs. (2013) cho rằng methyl hóa BRCA1 có thể thúc đẩy biểu hiện EGFR ở những dòng tế bào ung thư buồng trứng. Điều này có thể góp phần lý giải vai trò điều khiển các quá trình trong tế bào của các gen khác nhau trong ung thư. Sự methyl hóa ngẫu nhiên của 1 trong 4 gen cũng cho thấy sự tương