Tóm tắt Luận án Nghiên cứu hệ gen của virus cúm A/H5N1 phân lập từ gà nuôi tại Hậu Giang

5 Giải trình tự gen PA Phân ñoạn 3 (gen PA) ñược nhân lên từ nguồn khuôn RNA tổng số bằng các phản ứng RT-PCR sử dụng các cặp mồi thiết kế cho gen PA. Sản phẩm cuối cùng của phản ứng RT-PCR bằng cặp mồi PAF-PAR là phần ñầu của phân ñoạn 3 có ñộ dài khoảng 0,75 kb; với cặp mồi PAF2-PAR2 là phần giữa của phân ñoạn có kích thước khoảng 1,2 kb và với cặp mồi PAF3-PAR3 là phần sau của phân ñoạn có ñộ dài khoảng 0,73 kb; tổng ñộ dài của toàn bộ phân ñoạn 3 thu nhận ñược là khoảng 2,23 kb. DNA plasmid tái tổ hợp của các clone ñược giải trình tự và thu ñược chuỗi DNA của gen PA gồm 2151 nucleotide. 3.1.6 Giải trình tự gen NP Phân ñoạn 5 chứa gen NP của virus cúm A/H5N1 chủng CkHG4 ñược nhân lên từ nguồn khuôn RNA tổng số bằng phản ứng RT-PCR sử dụng cặp mồi NPF-NPR. DNA plasmid tái tổ hợp của clone tương ứng ñược giải trình tự và chúng tôi thu ñược chuỗi DNA của phân ñoạn 5 chủng CkHG4 chứa toàn bộ gen NP gồm 1497 nucleotide. 3.1.7 Giải trình tự gen M DNA plasmid chứa gen M1 và M2 sau khi giải trình tự, chúng tôi thu ñược chuỗi DNA của phân ñoạn 7 gồm 2 gen M1 (759 bp) và M2 (294 bp). 8 3.1.8 Giải trình tự gen NS Phân ñoạn 8 chứa gen NS của virus cúm A/H5N1 chủng CkHG4 ñược nhân lên bằng phản ứng RT-PCR từ nguồn khuôn RNA tổng số sử dụng cặp mồi NSF1-NSR1. DNA plasmid tái tổ hợp sau ñó ñược giải trình tự và thu nhận ñược chuỗi DNA của phân ñoạn 8 chứa 2 gen NS1 gồm 678 bp và NS2 gồm 366 bp. 3.2 PHÂN TÍCH SO SÁNH THÀNH PHẦN GEN, MỐI QUAN HỆ NGUỒN GỐC PHẢ HỆ CỦA CHỦNG CkHG4 VỚI CÁC CHỦNG CỦA VIỆT NAM VÀ THẾ GIỚI 3.2.1 Phân tích gen H5 3.2.1.1 Phân tích thành phần nucleotide và amino acid Trình tự nucleotide và amino acid gen H5 của chủng CkHG4 ñược so sánh với 26 chủng cúm A/H5N1 thuộc phân dòng Quảng ðông và phân dòng Phúc Kiến của Việt Nam và thế giới phân lập trong các năm 2003- 2009. Kết quả so sánh, phân tích cho thấy: - Gen H5 của virus cúm A/H5N1 chủng CkHG4 có kích thước 1707 bp, mã hóa cho 568 amino acid, khởi ñầu bằng bộ mã ATG (methionine) và kết thúc bằng bộ mã TAA. - Chuỗi nucleotide và polypeptide gen H5 chủng CkHG4 có cùng kích thước với gen tương ứng của các chủng thuộc phân dòng Quảng ðông là 1707 bp và 568 amino acid so với 1704 bp (thiếu hụt 3 nucleotide) và 567 amino acid (thiếu hụt 1 amino acid) của các chủng phân dòng Phúc Kiến. - Chủng CkHG4 có tổng cộng 363 vị trí sai khác nucleotide với các chủng so sánh, chủ yếu là ñột biến ñồng hoán (transition) (ñột biến xảy ra giữa các base trong cùng nhóm purine hay pyrimidine với nhau, giữa A và G hoặc C và T). - Gen H5 của chủng CkHG4 có 15 vị trí sai khác nucleotide với hầu hết các chủng so sánh và 10 nucleotide sai khác so với các chủng cùng phân lập ở vùng Hậu Giang (thứ tự 2-5) tại các vị trí 159, 415, 445, 582, 676, 677, 933, 945, 1170 và 1494. Trong tổng số 363 sai khác về nucleotide của chủng CkHG4 với các chủng so sánh có một số sai khác không làm thay ñổi amino acid, nhưng một số sai khác ñã làm biến ñổi bộ mã của amino acid dẫn ñến thay ñổi amino acid tại 104 vị trí. Do ñó có thể ảnh hưởng ñến tính kháng nguyên - miễn dịch và tính gây bệnh của các chủng ñó. - Chuỗi polypeptide H5 của chủng CkHG4 có 5 vị trí sai khác về amino acid với tất cả các chủng so sánh tại các vị trí: F11V, I242M, 9 R275K, T325N và V512A (Bảng 3.1). - Thành phần chuỗi polypeptide nối giữa HA1 và HA2 của chủng CkHG4 bao gồm các amino acid RRRKK, và motif này không biến ñổi qua các năm 2003–2009 ở hầu hết các chủng thuộc phân dòng Quảng ðông. Ở các chủng thuộc phân dòng Phúc Kiến chuỗi nối này bị xóa 1 amino acid (K) do ñột biến mất ñi 3 nucleotide (AAG) trong trình tự chuỗi nối của gen H5. Bảng 3.1: So sánh vị trí sai khác amino acid của chuỗi polypeptide H5 giữa 27 chủng virus cúm Vị trí sai khác về amino acid Chủng 8 11 102 110 140 156 171 191 228 242 243 275 279 285 298 325 326 512 529 1 F F V D S K S M R I E R T L I T R V I 2 F V V D S K S M R M E K T L M N R A I 3 F V V D S K S M R M E K T L M N R A I 4 F V V D S K S M R M E K T L M N R A I 5 F V V D S K S M R M E K T L M N R A I 6 F V V D S K S L R M E K T L M N R A I 7 L V A D N R S L K M E K A L M N R A T 8 F V V D S K S L R M E K T L M N R A I 9 F V V D S K S M R M E K T L M N R A I 10 F V V D S K S M R M E K T L M N R A I 11 F V V D S K S M R M E K T L M N R A I 12 F V V D S K S M R M E K T L M N R A I 13 F V V D S K S M R M E K T L M N R A I 14 F V V V S K S I R M E K T L M N R A I 15 F V V V S K S M R M E K T L V N R A I 16 L I A N N N N L K M D K A L I N R A T 17 L T A N E R D L K M E K T L M N K S T 18 L T A N D R D L K M E K T L V N R S T 19 L V A N D T N L K M D K A V I N K A T 20 L V A N D T N L K M D K A V I N K A T 21 I V A N D S N L K M D K A V M N K A T 22 L I A D D V N L K M D K A V I N K A T 23 L I A N D V N L K M D K A V I N K A T 24 L V A N D S N L K M D K A V M N K A T 25 F V A N D N N L K I D K T V M N K A T 26 L V A N D T N L K M D K A V M N K A T 27 L V A N D T N L K M D E A V M N K A T Ghi chú: Các chủng ñược ñánh số thứ tự từ 1 ñến 5 là các chủng phân lập ở vùng Hậu Giang, 1-18 là các chủng thuộc phân dòng Quảng ðông, 19-27 là các chủng thuộc phân dòng Phúc Kiến. - Chuỗi polypeptide H5 của chủng CkHG4 và các chủng so sánh có 7 vị trí glycosyl hóa, bao gồm 5 vị trí trên HA1 và 2 vị trí trên HA2. Không có sự khác biệt về các vị trí liên quan ñến khả năng glycosyl hóa của C hủ n g 10 chuỗi protein H5 giữa hầu hết các chủng thuộc phân dòng Quảng ðông. Protein H5 của các chủng phân dòng Phúc Kiến chỉ có 6 vị trí glycosyl hóa tương ứng với các chủng phân dòng Quảng ðông. ðã có sự thay thế amino acid S (vị trí 171) thành N ở các chủng phân dòng Phúc Kiến tại vị trí thứ III (170 -172) ñể chuyển từ motif NST ở các chủng phân dòng Quảng ðông tạo thành motif NNT ở các chủng phân dòng Phúc Kiến. 3.2.1.2 Phân tích sự ñồng nhất về nucleotide và tương ñồng về amino acid Trình tự nucleotide gen H5 của 27 chủng cúm A/H5N1 so sánh ñược ñưa vào chương trình GeneDoc2.5 ñể phân tích sự ñồng nhất (identity) về thành phần nucleotide và tương ñồng (homology) về amino acid. Kết quả phân tích cho thấy: - So sánh giữa các chủng vùng Hậu Giang với nhau, tỷ lệ ñồng nhất nucleotide và tương ñồng amino acid biến ñộng ít (96-98%). Mức ñộ ñồng nhất và tương ñồng cao nhất là 98%, thấp nhất là 96%. - So sánh các chủng phân dòng Quảng ðông với nhau, tỷ lệ ñồng nhất và tương ñồng biến ñộng rất lớn, 91-99% về nucleotide và 87-100% về amino acid, chủ yếu là do có sự biến ñộng lớn giữa các chủng phân lập năm 2003-2007 với 3 chủng phân lập năm 2008-2009. - So sánh các chủng phân dòng Phúc Kiến với nhau, tỷ lệ ñồng nhất nucleotide biến ñộng rất lớn (94-99%); tương tự, tỷ lệ tương ñồng amino acid cũng phản ánh ñúng mức ñộ biến ñổi lớn (94-100%). - Tỷ lệ ñồng nhất nucleotide và tương ñồng amino acid của các chủng phân dòng Quảng ðông so với các chủng phân dòng Phúc Kiến là rất thấp, 90-96% về nucleotide và 88-96% về amino acid. 3.2.1.3 Phân tích mối quan hệ nguồn gốc phả hệ Gen hemagglutinin HA (H5) thu nhận từ chủng CkHG4 ñược ñưa vào phân tích phả hệ cùng với 54 chủng cúm A/H5N1 của Việt Nam và thế giới phân lập qua các năm 1996-2011 (Hình 3.1). Hình 3.1 cho thấy, chủng CkHG4 tập hợp trong cùng một nhóm với các chủng cúm A/H5N1 phân lập ở phía Nam của Việt Nam giai ñoạn 2004-2007, ñó là: Ck-VN-DT-171-04 (DQ099759), Ck-VN-TG-023-04 (DQ099758), Dk-VN-HG680F-05 (ISDN230184), Ck-VN-LA636-05 (ISDN230180), Dk-VN-1231-05 (CY029519), Dk-VN-1771-05 (CY029551), Ck-VN-29-07 (CY029631); và một số chủng phân lập từ Thái Lan là Ck-TL-NIAH7618-04 (AB450562), Ck-Uthaithani-05 (FJ265572), Ck-TL-CU-354-08 (CY047457). ðiều này cho phép nhận xét, có thể các chủng cúm A/H5N1 từ gia cầm Hậu Giang, ðồng Tháp, Tiền Giang, Long An, Sóc Trăng là có cùng nguồn gốc và thuộc nhóm di 11 truyền 1 (clade 1). ðây là các chủng thuộc phân dòng Quảng ðông, genotype Z. Hình 3.1 cũng cho thấy, các chủng phân lập ở phía Nam của Việt Nam giai ñoạn 2008-2011, bao gồm Dk-VN-VL-NCVD080162-08, Dk- VN-CT-NCVD-361-09, Ck-VN-ST-R6-2-10, Ck-VN-TG-R6-2819-11 cũng tạo thành một nhóm kháng nguyên phụ khác, ñược xác ñịnh thuộc nhóm di truyền 1.1. Hình 3.1: Mối quan hệ nguồn gốc phả hệ giữa chủng CkHG4 với các chủng cúm A/H5N1 của Việt Nam và thế giới trên cơ sở gen kháng nguyên H5 về thành phần nucleotide và amino acid MDk-VN-OIE-559-11 Ck-VN-TG-R6-2819-11 Dk-VN-VL-NCVD080162-08 Dk-VN-CT-NCVD-361-09 Ck-VN-ST-R6-2-10 Dk-VN-CaMau498-06 Dk-VN-BL-07-09-07 Ck-VN-15-07 Ck-VN-29-07 Dk-HG-07-12-07 Dk-VN-1771-05 Ck-VN-LA636-05 Dk-VN-HG680F-05 Dk-VN-1231-05 VN-CL2009-05 Ck-VN-NCVD12-05 Ck-VN-TG-023-04 Ck-VN-36-04 Ck-VN-HG4-05 Ck-VN-DT-171-04 Ck-TL-NIAH7618-04 Ck-Uthaithani-05 Ck-VN-5-03 Ck-TL-CU-354-08 Ck-VN-27-03 Ck-India-NIV96526-09 Ck-Bangladesh-418-09 Ck-HK-YU324-03 Ck-Indo-BL-03 Ck-Hunan-8-08 Ck-VN-20346-09 A-Hubei-1-10 Dk-VN-QT801-11 Ck-VN-10-05 Ck-Guangxi-3154-05 MDk-VN-1455-06 Ck-Guangxi604-05 Dk-HN-101-04 Ck-GY-3570-05 Dk-TL-KU-56-07 Dk-VN-37-07 Dk-VN-HaiPhong-208-06 Ck-Laos-1-08 Ck-Fujian-584-06 Dk-VN-50-07 VN-HN31242-07 Dk-PhuTho-07-92-07 Dk-VN-53-07 Ck-VN-Ncvd8-03 Dk-GD-07-2000 Gs-GD-1-96 A-HK-156-97 Ck-VN-NCVD-093-08 Ck-VN-NCVD-135-08 Ck-VN-NCVD-016-0896 100 100 100 100 97 55 100 88 100 99 54 61 100 68 71 98 99 90 99 70 39 35 30 41 98 39 47 95 72 71 90 77 42 47 86 95 85 58 96 97 39 37 39 35 43 99 20 32 32 0.01 H5 Nucleotide 7 0 5 2.3.4 2.3.3 2.3.1 2.3.2 2.3.2.1 2.1 2.2 1 1.1 Dk-VN-CT-NCVD-361-09 Ck-VN-ST-R6-2-10 Dk-VN-VL-NCVD080162-08 MDk-VN-OIE-559-11 Ck-VN-TG-R6-2819-11 Dk-VN-BL-07-09-07 Ck-VN-15-07 Dk-VN-CaMau498-06 Ck-VN-29-07 Dk-HG-07-12-07 Dk-VN-1771-05 Ck-VN-LA636-05 Dk-VN-HG680F-05 Dk-VN-1231-05 VN-CL2009-05 Ck-VN-NCVD12-05 Ck-VN-HG4-05 Ck-VN-TG-023-04 Ck-VN-DT-171-04 Ck-VN-36-04 Ck-Uthaithani-05 Ck-TL-NIAH7618-04 Ck-VN-5-03 Ck-TL-CU-354-08 Ck-VN-27-03 Ck-HK-YU324-03 Ck-Indo-BL-03 Ck-India-NIV96526-09 Ck-Bangladesh-418-09 Dk-VN-HaiPhong-208-06 Ck-Laos-1-08 Ck-Fujian-584-06 Dk-TL-KU-56-07 Dk-PhuTho-07-92-07 Dk-VN-50-07 Dk-VN-53-07 VN-HN31242-07 Dk-VN-37-07 Dk-HN-101-04 Ck-GY-3570-05 MDk-VN-1455-06 Ck-Guangxi-3154-05 Ck-Guangxi604-05 Ck-VN-10-05 Ck-Hunan-8-08 Ck-VN-20346-09 A-Hubei-1-10 Dk-VN-QT801-11 Ck-VN-Ncvd8-03 Dk-GD-07-2000 Gs-GD-1-96 A-HK-156-97 Ck-VN-NCVD-093-08 Ck-VN-NCVD-135-08 Ck-VN-NCVD-016-0893 100 91 72 99 66 98 82 51 27 48 40 23 39 88 65 50 32 80 58 43 61 81 65 57 21 24 31 62 74 21 79 28 31 59 60 76 61 46 35 57 23 18 15 56 99 17 21 0.02 H5 Amino acid 1.1 2.2 1 2.1 2.3.2.1 2.3.2 2.3.1 2.3.3 2.3.4 5 0 7 12 3.2.2 Phân tích gen N1 3.2.2.1 Phân tích thành phần nucleotide và amino acid Gen N1 thu nhận từ chủng CkHG4 có ñộ dài 1350 nucleotide, mã hóa cho 449 amino acid, khởi ñầu bằng bộ mã ATG và kết thúc bằng bộ mã TAG. Trình tự nucleotide và amino acid của gen N1 chủng CkHG4 ñược so sánh với các chuỗi gen N1 tương ứng của 26 chủng Việt Nam và thế giới phân lập qua các năm 2003-2009. Bảng 3.2: So sánh vị trí sai khác amino acid của chuỗi polypeptide N1 giữa 27 chủng virus cúm Vị trí sai khác về amino acid Chủng 17 26 39 56 64 75 80 233 250 320 434 1 T V H N K N Y H N S G 2 T V H T K N Y H D S G 3 T V H N K N Y H D S G 4 T V H T K N Y H D S G 5 T V H T K N Y H D S G 6 T V H T K N Y H N S G 7 T L H T K N Y H D S G 8 T V H T K N Y H D S G 9 T I H T K N Y H D S G 10 T I H T K N Y H D S G 11 T V H T K N Y H D S G 12 T V N T K N Y H D S G 13 I I Q T T R H Y D P S 14 I I Q T T R H Y N P S 15 I I Q T T R H Y D H S 16 T V H T K N Y H D S G 17 T V H T K N Y H D S G 18 I I Q T T S H Y D P G 19 I I Q T T R H Y D P S 20 T I H T K N Y H D S G 21 T I H T K N Y H D S G 22 I I Q T T R H Y N P S 23 V I Q T T R H Y N P S 24 I V Q T T R H Y D P S 25 I I Q T T R H Y N P S 26 I I Q T T S H Y D L G 27 I I Q A T S Y Y D L S Ghi chú: Các chủng ñược ñánh số thứ tự từ 1 ñến 5 là các chủng phân lập ở vùng Hậu Giang, 1-18 là các chủng phân lập tại Việt Nam, 19-27 là các chủng của thế giới. Kết quả so sánh cho thấy, chủng CkHG4 có tổng cộng 262 vị trí sai khác về nucleotide với các chủng so sánh. Các ñột biến chủ yếu xảy ra ở vùng 5’ của gen N1 và hầu hết là các ñột biến ñồng hoán (A↔G hoặc C↔T). Chủng 13 CkHG4 chỉ có 4 nucleotide sai khác với phần lớn các chủng Việt Nam và thế giới ở các vị trí: 30, 167, 748 và 867. Trong ñó, sai khác ở 2 vị trí 167 và 748 là có dẫn ñến sai khác amino acid. Các sai khác về nucleotide ñã làm biến ñổi tổng cộng 91 amino acid giữa chủng CkHG4 với các chủng so sánh. Các biến ñổi lớn chủ yếu tập trung ở vùng tận cùng N của 80 amino acid ñầu tiên. Mười một vị trí có biến ñổi lớn về amino acid giữa các chủng so sánh ñược trình bày ở Bảng 3.2. Chuỗi polypeptide N1 của chủng CkHG4 chỉ có 2 amino acid sai khác với phần lớn các chủng so sánh ở 2 vị trí N56T và N250D (tương ứng với 2 vị trí sai khác về nucleotide 167 và 784 trong gen N1). Phân tích ñặc tính glycosyl hoá của protein N1 ở các chủng cúm A/H5N1 Kết quả phân tích ñặc tính glycosyl hóa cho thấy, chuỗi polypeptide N1 của chủng CkHG4 và 26 chủng so sánh cùng có 3 vị trí glycosyl hóa. Vị trí I có motif là NSS (amino acid 68-70), vị trí II là NGT (amino acid 126-128) và vị trí thứ III là NGS (amino acid 214-216). ðiều này chứng tỏ, không có sự biến ñổi vị trí có tiềm năng glycosyl hóa trong protein N1 ở các chủng cúm A/H5N1 phân lập trong các năm 2003-2009. 3.2.2.2 Phân tích ñột biến “trượt–xoá” gen N1 qua thời gian tiến hóa 41 chủng virus cúm A/H5N1 phân lập trong 50 năm qua, trong ñó có chủng CkHG4 do chúng tôi giải trình tự gen N1, ñược ñối chiếu so sánh về thành phần nucleotide và amino acid của gen N1. Các chủng so sánh ñược phân thành 3 nhóm chính: (i) nhóm các chủng phân lập từ 1959 ñến trước 2003; (ii) nhóm các chủng phân lập từ gia cầm và người ở Hồng Kông năm 1997; và (iii) nhóm các chủng phân lập giai ñoạn 2003-2009 từ các vật chủ khác nhau, trong ñó có chủng CkHG4 do chúng tôi phân lập. Kết quả phân tích cho thấy, ñã có ñột biến xoá gen xảy ra trong các chủng thuộc nhóm (ii) và (iii), nhưng bản chất của ñột biến có khác nhau. Biến ñộng ñột biến xoá nucleotide xảy ra ở vùng nucleotide có vị trí 145- 213. Cụ thể: - Các chủng cúm A/H5N1 thuộc nhóm (i) có gen N1 có ñộ dài 1410 nucleotide. - Các chủng thuộc nhóm (ii) (phân lập ở Hồng Kông năm 1997) ñã có ñột biến xoá ñi 57 nucleotide vị trí 157-213 từ các chủng nhóm (i). - Các chủng thuộc nhóm (iii) có chuỗi gen N1 ngắn nhất, chỉ còn 1350 14 nucleotide do ñã có ñột biến xoá ñi 60 nucleotide ở các vị trí 145-204. 3.2.2.3 Phân tích sự ñồng nhất về nucleotide và tương ñồng về amino acid Kết quả phân tích về thành phần nucleotide và tương ñồng (homology) về amino acid cho thấy: - Chủng CkHG4 có tỷ lệ ñồng nhất và tương ñồng rất cao so với các chủng phân lập từ vùng Hậu Giang qua các năm 2004-2005, 99% về thành phần nucleotide và amino acid. - So sánh giữa chủng CkHG4 với các chủng của Việt Nam, tỷ lệ ñồng nhất và tương ñồng có biến ñộng lớn hơn. Tỷ lệ ñồng nhất về nucleotide là 95-99% và tương ñồng về amino acid là 94-99%. 3.2.2.4 Phân tích mối quan hệ nguồn gốc phả hệ Gen N1 của chủng CkHG4 do chúng tôi phân lập ñược ñưa vào phân tích phả hệ cùng với 47 chủng cúm A/H5N1 của Việt Nam và thế giới. Kết quả phân tích cho thấy, chủng CkHG4 tập hợp trong cùng một nhóm với các chủng cúm A/H5N1 phân lập ở miền nam Việt Nam: Ck-VN-DT- 171-04 (DQ099759), Ck-VN-TG-023-04 (DQ099758), VN-HG-178-04 (DQ094286), VN-HG-207-05 (DQ094292), Ck-VN-CT-018-04 (DQ094280). ðiều này cho thấy, các chủng cúm A/H5N1 từ người và gia cầm Hậu Giang và các tỉnh vùng ñồng bằng sông Cửu Long là có cùng nguồn gốc, hoàn toàn giống như kết quả phân tích nguồn gốc phả hệ sử dụng gen H5. 3.2.3 Phân tích gen PB2 3.2.3.1 Phân tích thành phần nucleotide và amino acid Gen PB2 thu nhận từ chủng CkHG4 có ñộ dài 2280 bp, mã hóa cho 759 amino acid, khởi ñầu bằng bộ mã ATG và kết thúc bằng bộ mã TAG. Trình tự nucleotide và amino acid của gen PB2 ñược so sánh với 26 chủng cúm A/H5N1 của Việt Nam và thế giới phân lập qua các năm 2004-2009. Kết quả phân tích cho thấy, chủng CkHG4 có tổng cộng 455 nucleotide sai khác với các chủng so sánh. Chủng CkHG4 có 3 nucleotide sai khác với hầu hết các chủng so sánh ở các vị trí: 365, 580, 2080; và cả 3 vị trí sai khác này ñều dẫn ñến thay ñổi amino acid. Sai khác về nucleotide giữa chủng CkHG4 với các chủng so sánh dẫn ñến thay ñổi thành phần amino acid tổng cộng ở 82 vị trí. Trong số ñó, mười ba vị trí sai khác lớn ñược liệt kê ở Bảng 3.3. Chủng CkHG4 có 3 amino acid sai khác với hầu hết các chủng so sánh ở các vị trí A122V, K194Q và L694F (Bảng 3.3), tương ứng với 3 vị trí ñột biến nucleotide 15 như ñã phân tích ở trên. Vị trí amino acid 627 ở protein PB2 ñược cho là có liên quan ñến tính thích nghi nhiệt ñộ cơ thể loài vật chủ và ñộc lực của virus. Ở virus cúm gia cầm vị trí này là glutamic acid (E), còn ở virus thích nghi trên người là lysin (Wasilenko và cs, 2008) [155]. Các chủng virus H5N1 ñộc lực cao ñối với ñộng vật có vú, thành phần amino acid của PB2 có chứa lysin (K) ở vị trí 627 hoặc tổ hợp 627E/701N (Li và cs, 2010) [100]. Vị trí 627 ở protein PB2 của chủng CkHG4 do chúng tôi phân lập là glutamic acid (E) và amino acid ở vị trí 701 là asparatic acid (D). Bảng 3.3: So sánh vị trí sai khác amino acid của chuỗi polypeptide PB2 giữa 27 chủng virus cúm Vị trí có thay ñổi amino acid Chủng 105 108 122 147 194 338 339 357 368 390 430 494 694 1 A A A I K V K H R D T V L 2 A A V V Q I K Y R D T I F 3 A A V V Q I K Y R D T I F 4 A A V I Q I K Y R D T I F 5 A A V I Q V K H R D T V L 6 A A V I Q V K H R D T V F 7 A A V I Q I K Y R D T I F 8 A A V I Q V K H R D T V F 9 A A V I Q V K H R D P V F 10 T T V T Q V T H Q N P V F 11 T T V T Q V T H Q N P V F 12 A A V I Q V K H R D T I F 13 A A V I Q I K Y R D T I F 14 T T V T Q V T H Q N P V F 15 T T V I Q V K H R D P V F 16 A A V I Q I K Y R D T I F 17 A A V I Q I K Y R D T I F 18 T T V T Q V A H Q N P V F 19 T T V V Q V K H R D P V F 20 T A V I Q V T H R D P V F 21 T T V T Q V T H Q N P V F 22 T T V T Q V T H Q N P V F 23 T A V I Q V T H R D P V F 24 T T V T Q V T H Q N P V F 25 T T V T Q V T H Q N P V F 26 T A V I Q V T H Q D P V F 27 T T V V Q V K H R D P V F Ghi chú: Các chủng ñược ñánh số thứ tự từ 1 ñến 18 là các chủng phân lập tại Việt Nam, 19-27 là các chủng của thế giới; 1-5 là các chủng phân lập ở vùng Hậu Giang; 10, 11, 14, 15, 18 là các chủng phân lập ở miền Bắc. 16 3.2.3.2 Phân tích sự ñồng nhất về nucleotide và tương ñồng về amino acid Kết quả phân tích sự ñồng nhất về thành phần nucleotide và tương ñồng về amino acid cho thấy: - Chủng CkHG4 có tỷ lệ ñồng nhất và tương ñồng cao so với các chủng phân lập từ vùng Hậu Giang qua các năm 2004-2007, 97-99% cả 2 thành phần nucleotide và amino acid. - Chủng CkHG4 có tỷ lệ ñồng nhất về nucleotide là 90-99% và tương ñồng về amino acid là 96-99% so với các chủng của Việt Nam; 93-97% về thành phần nucleotide và 97-98% về thành phần amino acid khi so với các chủng của thế giới. 3.2.3.3 Phân tích mối quan hệ nguồn gốc phả hệ Kết quả phân tích phả hệ sử dụng gen PB2 cho thấy, chủng CkHG4 với các chủng cúm A/H5N1 phân lập ở miền Nam: Ck-VN-CT-018-04 (DQ094280), Ck-VN-TG-023-04 (DQ099758) tập hợp trong cùng một nhóm, chứng tỏ các chủng cúm A/H5N1 từ gia cầm Hậu Giang và các tỉnh vùng ñồng bằng sông Cửu Long có thể cùng nguồn gốc, tương tự như kết quả phân tích nguồn gốc phả hệ sử dụng gen H5 và N1 trình bày ở phần trước. 3.2.4 Phân tích gen PB1 và PB1-F2 3.2.4.1 Phân tích thành phần nucleotide và amino acid Toàn bộ gen PB1 thu nhận từ chủng CkHG4 có ñộ dài 2274 bp, mã hoá cho chuỗi polypeptide PB1 gồm 757 amino acid, bộ mã khởi ñầu là ATG và kết thúc bằng bộ mã TAG. Lồng vào trong chuỗi nucleotide của PB1, từ vị trí 95 ñến 367 là PB1-F2, có ñộ dài 273 bp bao gồm 90 amino acid, khởi ñầu bằng bộ ba ATG và kết thúc bằng bộ ba TGA. Trình tự nucleotide và amino acid gen PB1 và PB1-F2 ñược so sánh với 26 chủng A/H5N1 của Việt Nam và thế giới phân lập qua các năm 2003-2009. Kết quả phân tích cho thấy, gen PB1 của chủng CkHG4 có tổng cộng 428 vị trí sai khác về nucleotide với các chủng so sánh. Những thay ñổi về nucleotide dẫn ñến sai khác về amino acid ở 62 vị trí, trong ñó có 8 vị trí sai khác lớn. Chủng CkHG4 có sai khác hoàn toàn 4 amino acid trên protein PB1 so với tất cả các chủng, cụ thể ở các vị trí R206G, S306N, M323T, L631F. Gen PB1-F2 của chủng CkHG4 có tổng cộng 52 nucleotide (trong ñó có 1 nucleotide sai khác với hầu hết các chủng của Việt Nam và thế giới ở vị trí 131) và 41 amino acid sai khác với các chủng so sánh. 17 Chuỗi polypeptide PB1-F2 của chủng CkHG4 chỉ có một amino acid sai khác so với hầu hết các chủng ở vị trí K44R. 3.2.4.2 Phân tích sự ñồng nhất về nucleotide và tương ñồng về amino acid Kết quả phân tích ñồng nhất về nucleotide và tương ñồng về amino acid gen PB1 và PB1-F2 của chủng CkHG4 cho thấy: ðối với gen PB1: Chủng CkHG4 có tỷ lệ ñồng nhất và tương ñồng cao so với các chủng Việt Nam giai ñoạn 2004-2007, 97-99% về nucleotide và 98-99% về amino acid. ðối với các chủng của thế giới, mức ñộ ñồng nhất và tương ñồng dao ñộng lớn hơn, tỷ lệ tương ứng là 91-98% và 97-99%. ðối với gen PB1-F2: Chủng CkHG4 có tỷ lệ ñồng nhất về nucleotide và tương ñồng về amino acid với các chủng vùng Hậu Giang theo thứ tự tương ứng là 99-100% và 97-100%, với các chủng Việt Nam khác là 97- 99% và 93-98%. Mức ñộ ñồng nhất và tương ñồng với các chủng thế giới qua các năm 2003-2009 biến ñộng rất lớn: 90-99% về nucleotide và 75- 97% về amino acid. Như vậy, chủng CkHG4 có tỷ lệ ñồng nhất về nucleotide và tương ñồng về amino acid cao so với một số chủng vùng Hậu Giang phân lập qua các năm 2004-2007. Với các chủng phân lập càng về sau, mức ñộ ñồng nhất và tương ñồng càng giảm. 3.2.4.3 Phân tích mối quan hệ phả hệ nguồn gốc Kết quả phân tích phả hệ cho thấy, chủng CkHG4 với các chủng A/H5N1 phân lập ở miền Nam trong các năm 2004-2005: VN-HG-207-05 (DQ138165), Ck-VN-DT-171-04 (DQ138156), VN-HG-178-04 (DQ138160), Ck-VN-TG-023-04 (DQ099758) tập hợp trong cùng một nhóm, chứng tỏ các chủng virus cúm A/H5N1 từ người và gia cầm Hậu Giang và các tỉnh vùng ñồng bằng sông Cửu Long có thể cùng nguồn gốc. 3.2.5 Phân tích gen PA 3.2.5.1 Phân tích thành phần nucleotide và amino acid Toàn bộ gen PA của chủng CkHG4 có ñộ dài 2151 bp, mã hóa cho 716 amino acid, có bộ mã khởi ñầu là ATG, bộ mã kết thúc là TAG. Trình tự nucleotide của gen PA này ñược so sánh với gen PA tương ứng của 26 chủng A/H5N1 phân lập tại Việt Nam và thế giới trong các năm 2003-2009. Kết quả phân tích cho thấy, gen PA của chủng CkHG4 có: - Tổng cộng 425 nucleotide sai khác với các chủng so sánh, trong ñó có 10 nucleotide sai khác hoàn toàn so với hầu hết các chủng so sánh ở 18 các vị trí: 203, 205, 324, 444, 693, 1059, 1105, 1332, 2053, 2060; 11 nucleotide sai khác với 5 chủng miền Bắc và các chủng của thế giới ở các vị trí: 51, 102, 342, 645, 808, 957, 1281, 1296, 1521, 1695, 1878. Những thay ñổi về nucleotide trên ñây dẫn ñến sai khác amino acid ở 76 vị trí, trong ñó có 5 amino acid sai khác hoàn toàn so với hầu hết các chủng so sánh ở các vị trí: L68P, Y69N, T369A, R685G, F687Y. Mặc dù chủng CkHG4 có ñến 11 nucleotide sai khác với các chủng miền Bắc và thế giới, nhưng những sai khác này chỉ làm thay ñổi thành phần amino acid ở một số chủng. Nghiên cứu gần ñây cho thấy, các ñột biến T515A trong PA và Y436H trong PB1 ñã làm mất tính gây bệnh của virus H5N1 (Hulse-Post và cs, 2007) [82], nhưng chỉ ñột biến riêng lẻ ở các amino acid này thì không ảnh hưởng ñến ñộc lực của virus. Trong thành phần amino acid của chủng CkHG4 và tất cả các chủng A/H5N1 lựa chọn so sánh, threonin (T) ở vị trí 515 phát hiện không biến ñổi qua các năm 2003-2009. 3.2.5.2 Phân tích sự ñồng nhất về nucleotide và tương ñồng về amino acid Kết quả phân tích sự ñồng nhất về nucleotide và tương ñồng về amino acid cho thấy: - Chủng CkHG4 có tỷ lệ ñồng nhất và tương ñồng rất cao so với các chủng phân lập từ vùng Hậu Giang qua các năm 2004-2007, 98-99% về thành phần nucleotide và 99% về thành phần amino acid. - Chủng CkHG4 có tỷ lệ ñồng nhất và tương ñồng biến ñộng lớn hơn khi so với các chủng của Việt Nam. Tỷ lệ ñồng nhất về nucleotide là 92- 99% và tương ñồng amino acid là 96-99%; trong ñó với các chủng miền Bắc là 92-97% v