Tóm tắt Luận án Nghiên cứu hóa học và hoạt tính sinh học của một số hợp chất từ vi nấm biển phân lập tại miền trung Việt Nam

yến tiền liệt) và MDA-MB-231 (ung thư biểu mô tuyến vú) do Viện KH&CN Hải dương Hàn Quốc cung cấp. - Dòng tế bào thần kinh Neuro2a (ATCC® CCL-131™) do Viện Hóa sinh hữu cơ Thái Bình Dương, Viện Hàn lâm Khoa học Nga cung cấp. 5 2.1.2. Môi trường nghiên cứu - Môi trường phân lập: môi trường thạch Sabouraud có bổ sung kháng sinh gồm 10 g pepton, 20 g glucose, 18-20 g agar, 1000 mL nước biển tự nhiên, 1,5 g penicillin, 1,5 g streptomycin, pH 6,0-7,0. - Môi trường lên men rắn (RYE): môi trường được chuẩn bị trong bình Erlenmeyer 500 mL gồm 20 g gạo, 20 mg dịch chiết nấm men, 10 mg KH2PO4 và 40 mL nước biển. 2.2. Phương pháp nghiên cứu 2.2.1. Phân lập vi nấm biển Vi nấm biển được phân lập trên môi trường Sabouraud ở 28°C. 2.2.2. Đánh giá hoạt tính kháng VSV kiểm định của vi nấm biển Xác định theo phương pháp khuếch tán trên đĩa thạch của Becerro và cộng sự (1994). 2.2.3. Phân tích cặn chiết của các chủng vi nấm có hoạt tính kháng sinh cao Cặn chiết thô của các chủng vi nấm có hoạt tính kháng sinh cao được phân tích trên sắc ký bản mỏng (TLC Silica gel 60 F254) với hệ dung môi toluen : isopropanol (6:1, v/v) và phổ 1H-NMR. 2.2.4. Xác định đặc điểm hình thái và phân loại vi nấm biển Đặc điểm hình thái và tên vi nấm được xác định theo sách phân loại của Raper và Thom (1949), Samson và cộng sự (2011), Crous và Groenewald (2015), Stolk và Samson (1972). Ngoài ra, vi nấm còn được phân loại dựa trên phân tích trình tự vùng ITS/28S rDNA và so sánh với các trình tự gen tương ứng trên Ngân hàng Gen NCBI. 2.2.5. Xác định điều kiện lên men rắn thích hợp cho sinh tổng hợp chất kháng sinh của vi nấm biển Các yếu tố lên men gồm thời gian, nồng độ muối và pH môi trường được khảo sát để đánh giá ảnh hưởng của điều kiện lên men trên môi trường RYE 6 đến khả năng sinh tổng hợp chất kháng sinh của chủng vi nấm tuyển chọn. 2.2.6. Phân tách các hợp chất chuyển hóa thứ cấp từ vi nấm biển Sinh khối vi nấm và môi trường lên men được ngâm chiết với ethyl acetate ở nhiệt độ phòng ở trạng thái tĩnh trong 48 giờ và tiến hành cô quay ở 40oC để thu cặn chiết ethyl acetate thô. Cặn chiết được tiếp tục phân tách dựa trên các phương pháp sắc ký gồm sắc ký lớp mỏng (TLC), sắc ký cột (CC) và sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) để thu nhận các hợp chất sạch. 2.2.7. Xác định cấu trúc hóa học của hợp chất chuyển hóa thứ cấp từ vi nấm biển Cấu trúc hóa học của các hợp chất được xác định dựa trên sự kết hợp giữa các phương pháp phổ hiện đại như phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) và phổ khối lượng (ESI-MS hoặc HR-ESI-MS). 2.2.8. Xác định hoạt tính sinh học của các hợp chất chuyển hóa thứ cấp từ vi nấm biển 2.2.8.1. Xác định hoạt tính kháng VSV kiểm định Đánh giá theo phương pháp xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC). 2.2.8.2. Xác định hoạt tính gây độc tế bào Xác định theo phương pháp nhuộm SRB (sulforhodamine B). 2.2.8.3. Xác định hoạt tính chống oxy hóa Xác định theo khả năng khử gốc tự do DPPH (2,2-diphenyl-1- picrylhydrazyl) và ABTS (2,2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6- sulphonic acid). 2.2.8.4. Xác định hoạt tính bảo vệ tế bào thần kinh Xác định theo phương pháp MTT (3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl) -2,5- diphenyltetrazolium bromide). 2.2.9. Xử lý số liệu nghiên cứu Các thí nghiệm được lặp lại 3 lần và dữ liệu được biểu thị bằng trung bình ± độ lệch chuẩn được tính toán qua Microsoft Excel 2010. 7 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 3.1. Phân lập và sàng lọc hoạt tính kháng VSV kiểm định của vi nấm biển Từ 29 mẫu hải miên, 28 mẫu san hô mềm, 33 mẫu rong biển và 21 mẫu trầm tích biển thu nhận từ các vùng biển Đà Nẵng, Nha Trang và Ninh Thuận đã phân lập và thuần khiết được 273 chủng vi nấm biển (Hình 3.1). Phân tích đặc điểm hình thái khuẩn lạc của 273 chủng vi nấm thu được cho thấy hầu hết các chủng có hình dạng khuẩn lạc tròn (81,6%, n=235), bề mặt trơn, mịn (54,2%, n=148). Khuẩn lạc phẳng và có viền/mép liền cũng được ghi nhận với tỷ lệ cao lần lượt 55,3% (n=151) và 74,7% (n=204). Các chủng vi nấm có bề mặt khuẩn lạc thuộc nhiều nhóm màu khác nhau, trong đó khuẩn lạc màu xanh rêu/xanh lá cây chiếm tỷ lệ cao nhất (31,9%, n=87). Kết quả sàng lọc hoạt tính kháng sinh cho thấy có 54,2% (n=148) chủng thể hiện hoạt tính kháng sinh đối với ít nhất một chủng VSV kiểm định. Nghiên cứu cũng cho thấy có 43,9% (n=109) chủng kháng B. cereus, 34,4% (n=94) kháng S. faecalis, 42,1% (n=115) kháng S. aureus và 29,7% (n=81) kháng L. monocytogenes. Khả năng kháng vi khuẩn Gram âm gồm E. coli, P. aeruginosa và nấm men C. albicans được ghi Hình 3.1. Số lượng các chủng vi nấm biển được phân lập từ Ninh Thuận, Nha Trang và Đà Nẵng 8 nhận với tỷ lệ thấp hơn, lần lượt 4,4% (n=12), 2,2% (n=6) và 4,8% (n=13). Số lượng chủng vi nấm phân lập từ vùng biển Nha Trang thể hiện hoạt tính kháng sinh chiếm tỉ lệ cao hơn so với Đà Nẵng và Ninh Thuận. Cụ thể, hoạt tính kháng S. aureus của các chủng vi nấm thu nhận từ 3 vùng biển Nha Trang, Ninh Thuận và Đà Nẵng chiếm tỷ lệ lần lượt 57, 42 và 21%. Kết quả khảo sát cũng được ghi nhận tương tự đối với B. cereus, S. faecalis và L. monocytogenes. Điều này được dự đoán hệ sinh thái khác nhau ở các vùng biển đã tác động đến đặc tính sinh học của các chủng vi nấm nghiên cứu. Nghiên cứu của Zhou và các cộng sự (2016) đã chứng minh rằng địa điểm và nguồn phân lập không chỉ có liên quan đến sự đa dạng loài vi nấm mà còn cả khả năng sinh tổng hợp các hoạt chất sinh học từ chúng. Trong số 273 chủng vi nấm khảo sát, có 8 chủng thể hiện hoạt tính kháng sinh mạnh và kháng phổ rộng đối với hầu hết các chủng VSV kiểm định gồm 01NT.1.1.5, 01NT.1.5.4, 01NT.1.9.4, 01NT.1.12.3, 045-357-2, 168ST.16.1, 168ST.35.2 và 168ST.51.1 nên được lựa chọn cho các nghiên cứu tiếp theo về phân tích cặn chiết thô trên TLC và phổ NMR đồng thời xác định đặc điểm hình thái và phân loại. 3.2. Phân tích cặn chiết thô và xác định đặc điểm phân loại của 8 chủng vi nấm tuyển chọn Kết quả cho thấy cặn chiết thô của 8 chủng vi nấm thể hiện các vệt chất với màu sắc và hệ số di chuyển khác nhau trên bản TLC (Hình 3.9). Ba chủng vi nấm 01NT.1.1.5, 01NT.1.12.3 và 045-357-2 được dự đoán có sự đa dạng các lớp chất chứa trong cặn chiết, tiếp đến là các chủng 01NT.1.5.4 và 168ST.16.1. Ba chủng còn lại gồm 01NT.1.9.4, 168ST.35.2 và 168ST.51.1 thể hiện các vệt chất không rõ ràng trên bản sắc ký. Vì vậy, năm chủng 01NT.1.1.5, 01NT.1.12.3, 045-357-2, 01NT.1.5.4 và 168ST.16.1 được lựa chọn để phân tích cặn chiết thô trên phổ 1H NMR. 9 Phổ 1H NMR của các cặn chiết từ 3 chủng vi nấm 01NT.1.1.5, 01NT.1.12.3 và 045-357-2 thể hiện rõ các tín hiệu proton ở vùng trường thấp (5-8 ppm) nên được dự đoán có chứa các hợp chất có cấu trúc vòng thơm trong cặn chiết thu nhận. Cặn chiết từ 2 chủng 168ST.16.1 và 01NT.1.5.4 được ghi nhận rất ít các tín hiệu proton ở vùng trường thấp đồng thời phổ 1H NMR thể hiện các tín hiệu đơn giản hơn so với 3 chủng 01NT.1.1.5, 01NT.1.12.3 và 045-357-2 (Hình 3.10). Hình 3.9. Phân tích cặn chiết thô của 8 chủng vi nấm tuyển chọn trên TLC (hệ dung môi toluen : isopropanol, 6:1 v/v) 01NT.1.1.5 01NT.1.12.3 10 Hình 3.10. Phổ 1H-NMR của cặn chiết thô từ 5 chủng vi nấm 01NT.1.1.5, 01NT.1.12.3, 045-357-2, 168ST.16.1 và 01NT.1.5.4 Đặc điểm hình thái của 8 chủng vi nấm biển tuyển chọn được xác định sau nuôi cấy 5-10 ngày trên môi trường thạch đĩa Sabouraud ở 28oC và được mô tả ở Bảng 3.4. Bảng 3.4. Đặc điểm hình thái của 08 chủng vi nấm biển tuyển chọn T T Chủng vi nấm Hình ảnh khuẩn lạc Đặc điểm hình thái khuẩn lạc 1 01NT.1.1.5 - Màu vàng kem, tròn, đường kính 22-25 mm - Bề mặt dạng sợi bông, có nhiều hạt bào tử màu vàng kem, mọc vòng tròn đồng tâm - Sắc tố hòa tan màu vàng nhạt - Viền dạng sợi ngắn mịn 2 01NT.1.5.4 - Màu vàng pha xám, tròn, đường kính 22-25 mm - Bề mặt dạng sợi bông, có nhiều hạt bào tử màu vàng kem sau chuyển màu đen - Sắc tố hòa tan màu nâu nhạt - Viền dạng sợi 168ST.16.1 01NT.1.5.4 045-357-2 11 3 01NT.1.12. 3 - Màu trắng xám, tròn, đường kính 18-22 mm - Bề mặt dạng sợi bông mịn, có nhiều hạt bào tử màu vàng úa ở giữa - Sắc tố hòa tan màu vàng - Mép dạng sợi bông dày mịn 4 168ST.16.1 - Màu vàng kem, tròn, đường kính 18-25 mm - Có hệ sợi nấm khí sinh trên thạch mọc dạng vòng tròn đồng tâm - Tạo giọt tiết trên bề mặt khuẩn lạc, có sắc tố hòa tan màu vàng nâu - Viền liền 5 01NT.1.9.4 - Màu nâu xám, tròn, đường kính 15-18 mm - Bề mặt dạng sợi bông mịn, mọc lồi cao - Sắc tố hòa tan màu xám đen - Viền cuộn tròn 6 045-357-2 - Màu xanh rêu pha xám nhạt, tròn, đường kính 20- 25 mm - Mọc dạng vòng tròn đồng tâm, bề mặt mịn, có vách chia ở giữa - Có tạo giọt tiết trên bề mặt khuẩn lạc - Viền liền 7 168ST.35.2 - Màu xanh rêu, tròn, đường kính 20-24 mm - Bề mặt mịn, có sợi bông ở giữa - Không tiết sắc tố hòa tan - Viền liền 8 168ST.51.1 - Màu trắng, tròn, đường kính 22-26 mm - Bề mặt dạng sợi bông xốp mịn - Không có giọt tiết trên bề mặt khuẩn lạc, có sắc tố hòa tan màu nâu - Viền liền Dựa trên đặc điểm hình thái quan sát dưới kính hiển vi, bốn chủng vi nấm nghiên cứu gồm 01NT.1.1.5, 01NT.1.5.4, 01NT.1.12.3 và 168ST.16.1 được xác định thuộc chi Aspergillus. Chủng 045-357-2 được xác định thuộc chi Penicillium (Bảng 3.5). Từ sự kết hợp giữa đặc điểm hình thái và phân tích trình tự gen vùng ITS/28S rDNA đã đưa đến kết quả phân loại 8 chủng vi nấm tuyển chọn đều thuộc ngành 12 Ascomycota. Trong đó, có 7 chủng thuộc bộ Eurotiales gồm A. flocculosus 01NT.1.1.5 (MG972941), A. niger 01NT.1.5.4 (MH095994), Aspergillus sp. 01NT.1.12.3 (MH101466), Aspergillus sp. 168ST.16.1 (MG920345), P. chrysogenum 045-357-2 (MH753592), Talaromyces sp. 168ST.35.2 (MK080561) và Talaromyces sp. 168ST.51.1 (MK072976). Một chủng vi nấm thuộc bộ Dothideales là Biatriospora sp. 01NT.1.9.4 (MK072974). Các báo cáo cho thấy vi nấm thuộc chi Aspergillus và Penicillium có khả năng sản sinh phần lớn các hợp chất tự nhiên có hoạt tính sinh học. Bảng 3.5. Đặc điểm hình thái của 08 chủng vi nấm biển quan sát dưới kính hiển vi T T Chủng vi nấm Hình thái vi nấm Đặc điểm hình thái 1 01NT.1.1.5 - Bào tử hình cầu, có kích thước 2,5-3 µm, mọc dạng tỏa tròn - Thể bình có hai tầng - Bọng hình cầu, có chiều rộng 35-45 µm - Cuống sinh bào tử có thành xù xì, không bị thóp lại chỗ dưới bọng 2 01NT.1.5.4 - Bào tử hình cầu, kích thước 3,5-4,5 µm, bề mặt gồ ghề, mọc tỏa tròn - Bọng hình cầu, có chiều rộng 30-75 µm - Cuống sinh bào tử có thành mịn 3 01NT.1.12.3 - Bào tử hình cầu, có kích thước 2-2,5 µm, mọc dạng tỏa tròn - Bọng hình cầu, có chiều rộng 25-35 µm - Cuống sinh bào tử có thành xù xì 4 168ST.16.1 - Bào tử hình cầu, nhẵn, mịn, kích thước 2- 2,5 µm, mọc đính tròn - Bọng hình cầu, có chiều rộng 25-35 µm - Cuống sinh bào tử trong suốt 13 5 01NT.1.9.4 - Sợi nấm màu xám, rộng 2,5–3,9 µm, phân cành thưa thớt. - Các sợi nấm có thành mịn và trong suốt. 6 045-357-2 - Bào tử nhẵn, ban đầu hình elip, kích thước 2-2,5 x 2,5-3 µm, khi già có hình cầu - Cuống sinh bào tử nhẵn, có nhiều vách ngăn, phân nhánh điển hình, kích thước đạt đến 100 µm 7 168ST.35.2 - Bào tử đính kiểu hình kim, đính từ một đến ba bào tử. - Bào tử nhẵn, có hình elip, kích thước 2-3 x 1,5-2,5 µm. - Cuống sinh bào tử có thành dày. - Sợi nấm có vách ngăn 8 168ST.51.1 - Cuống sinh bào tử dạng ống, có thành mịn, thon ở phần đỉnh. - Cuống sinh bào tử được sinh trực tiếp từ sợi nấm và có kích thước 12-20 x 1,5-2,0 µm. - Sợi nấm phân nhánh Năm chủng vi nấm nghiên cứu gồm A. flocculosus 01NT.1.1.5, A. niger 01NT.1.5.4, Aspergillus sp. 01NT.1.12.3, P. chrysogenum 045- 357-2, Aspergillus sp. 168ST.16.1 thể hiện các vệt chất khá đa dạng khi phân tích trên bản TLC. Tuy nhiên, chỉ có 3 chủng A. flocculosus 01NT.1.1.5, Aspergillus sp. 01NT.1.12.3 và P. chrysogenum 045-357-2 xuất hiện rõ các tín hiệu proton ở vùng trường thấp trên phổ 1H NMR dự đoán hiện diện các hợp chất có cấu trúc vòng thơm trong cặn chiết thu nhận. Vì vậy, ba chủng vi nấm trên được lựa chọn cho các nghiên cứu tiếp theo về khảo sát điều kiện lên men thích hợp và phân tách các hợp chất tự nhiên. Đây là công trình nghiên cứu mới về hoạt chất sinh học từ các chủng vi nấm thuộc loài A. flocculosus và P. chrysogenum được phân lập ở vùng biển miền Trung Việt Nam. 14 3.3. Xác định điều kiện lên men rắn thích hợp cho sinh tổng hợp chất kháng sinh của 03 chủng vi nấm biển tuyển chọn - Chủng A. flocculosus 01NT.1.1.5 sản sinh 363 mg cặn chiết thô/ 40 g gạo trong môi trường có nồng độ muối 35 g/L, pH môi trường ban đầu 6,0 và sau thời gian lên men 20 ngày. - Chủng Aspergillus sp. 01NT.1.12.3 sản sinh 564 mg cặn chiết thô/40 g gạo trong môi trường có nồng độ muối 25 g/L, pH môi trường ban đầu 6,0 và sau thời gian lên men 22 ngày. - Chủng P. chrysogenum 045-357-2 sản sinh 264 mg cặn chiết thô/40 g gạo trong môt trường có nồng độ muối 35 g/L, pH môi trường ban đầu 7,0 và sau thời gian lên men 14 ngày. 3.4. Tách chiết, tinh sạch và xác định cấu trúc các hợp chất chuyển hóa thứ cấp từ chủng vi nấm biển tuyển chọn 3.4.1. Tách chiết, tinh sạch và xác định cấu trúc các hợp chất từ chủng vi nấm A. flocculosus 01NT.1.1.5 Cặn chiết của chủng vi nấm A. flocculosus 01NT.1.1.5 được phân tách trên sắc ký cột gel C18 và tinh chế bằng HPLC thu nhận được 8 hợp chất sạch 1-8 (Hình 3.15). Dựa trên phân tích phổ ESI-MS, HR- ESI-MS kết hợp với dữ liệu phổ NMR và các tài liệu công bố đã xác định tên của 8 hợp chất lần lượt phomaligol A2 (1), wasabidienone E (2), aspertetranone D (3), mactanamide (4), cycloechinulin (5), asteltoxin (6), ochraceopone F (7) và asterriquinone C1 (8). Trong đó 2 hợp chất 1 và 7 được xác định là hợp chất mới. Hợp chất 1: Phomaligol A2 (Hợp chất mới) Chất dầu màu vàng, phổ ESI-MS (m/z 300,88 [M+H]+), công thức phân tử (CTPT) C14H20O7. Phổ 1H NMR của hợp chất 1 có tín hiệu của 4 nhóm methyl, 2 nhóm methine, 1 nhóm methoxy (δH 3,89/H-12) và 1 proton vòng thơm ở δH 5,62 (H-4). Hai carbon olefinic, 3 ketone carbon, 15 2 carbon có liên kết trực tiếp với oxy, và 1 carbon methoxy được quan sát thấy ở phổ 13C NMR. Sáu tín hiệu carbon còn lại được cho là một sec-butyl (δC 20,2/C-10, 12,1/C-11, 68,4/C-9, và 46,5/C-8) và hai nhóm methyl (δC 22,7/C-14 , 20,7/C-13). Số liệu phổ 1H và 13C NMR của hợp chất 1 tương tự với hợp chất phomaligol A được phân lập từ vi nấm Paecilomyces lilacinus F-9, ngoại trừ nhóm -OH tại C-9. Hợp chất 1 là một hợp chất mới và được đặt tên là phomaligol A2. 1 2 3 4 5 8 6 7 Hình 3.15. Cấu trúc hóa học của các hợp chất 1-8 phân lập từ chủng vi nấm A. flocculosus 01NT.1.1.5 Hợp chất 7: Ochraceopone F (Hợp chất mới) Chất dầu màu nâu, phổ HR-ESI-MS (m/z 397,1987 [M+Na]+), CTPT C22H30O5. Dữ liệu phổ 1H và 13C-NMR cùng với phổ COSY, HSQC cho thấy sự xuất hiện của 1 nhóm methine tại δH 2,47 (H-7), 5 nhóm methylene tại vị trí H-16, H-10, H-9, H-6, H-15, 6 nhóm methyl, 10 tín hiệu carbon bậc bốn, 1 ketone carbonyl tại δC 218,0 (C-14), 1 ester carbonyl tại δC 165,7 (C-1), 2 carbon được oxy hóa liên hợp tại δC 97,6 (C-2), 107,5 (C-4), 2 carbon bậc bốn có gắn với oxy tại δC 80,4 (C-8), 16 78,2 (C-11), hai carbon bậc bốn aliphatic tại δC 53,1 (C-13), 40,4 (C-12). Dữ liệu phổ cũng cho thấy vòng tetracyclic của hợp chất 7 gần giống với hợp chất ochraceopone E, một α-pyrone merosesquiterpenoid từ chủng vi nấm Aspergillus ochraceopetaliformis SCSIO 05702 được phân lập từ Nam Cực. Điểm khác biệt giữa hợp chất 7 và ochraceopone E là hợp chất 7 không có nhóm hydroxyl tại C-9. Vì vậy, cấu trúc của hợp chất 7 được xác định là 9-deoxy ochraceopone E và được đặt tên là ochraceopone F. 3.4.2. Tách chiết, tinh sạch và xác định cấu trúc các hợp chất từ chủng vi nấm Aspergillus sp. 01NT.1.12.3 Từ cặn chiết của chủng vi nấm biển Aspergillus sp. 01NT.1.12.3, tiến hành phân tách trên sắc ký cột silica gel và tinh chế bằng HPLC thu nhận được 4 hợp chất 9-12 (Hình 3.26). Dựa trên phân tích phổ HR-ESI-MS kết hợp với dữ liệu phổ NMR và các tài liệu công bố đã xác định tên của 4 hợp chất lần lượt dihydroaspyrone (9), aspilactonol F (10), 6β,9α,14- trihydroxycinnamolide (11) và 6β,7α,14-trihydroxyconfertifoline (12). Trong đó, hợp chất 11 và 12 được xác định là hợp chất mới. 9 10 11 12 Hình 3.26. Cấu trúc hóa học của các hợp chất 9-12 từ chủng vi nấm A. flocculosus 01NT.1.12.3 Hợp chất 11: 6β,7α,14-trihydroxyconfertifolin (Hợp chất mới) Chất bột màu trắng, HR-ESI-MS (m/z 305,1361 [M + Na]+), CTPT C15H22O5. Dữ liệu phổ cho thấy cấu trúc của hợp chất 11 gần giống với 17 hợp chất 6β,14-dihydroxy-7α-methoxyconfertifoline được thu nhận đầu tiên từ chủng vi nấm A. versicolor CNC 327 phân lập từ rong biển Penicillus capitatus ở đảo Bahamas. Đến năm 2018, hợp chất 6β,14- dihydroxy-7α-methoxyconfertifoline tiếp tục được Tan và cộng sự phân tách từ chủng A. ochraceus Jcma1F17 có nguồn gốc từ mẫu rong Coelarthrum sp. thu nhận ở vùng biển phía Nam Trung Quốc. Điểm khác biệt giữa hợp chất 11 và 6β,14-dihydroxy-7α- methoxyconfertifoline là hợp chất 11 có nhóm hydroxyl tại C-7 thay cho nhóm methoxy. Vì vậy, hợp chất 11 được xác định là hợp chất mới và được đặt tên là 6β,7α,14-trihydroxyconfertifolin. Hợp chất 12: 6β,9α,14-trihydroxycinnamolide (Hợp chất mới) Chất bột màu trắng, HR-ESI-MS (m/z 281,1390 [M-H]-), CTPT C15H22O5. Dữ liệu phổ cho thấy cấu trúc của hợp chất 12 gần giống với hợp chất pereniporin B được phân lập từ chủng vi nấm Perenniporia medullaepanis Aj 8345. Điểm khác biệt giữa hợp chất 12 và pereniporin B là hợp chất 12 có nhóm hydroxyl gắn với nhóm methyl tại C-14. Vì vậy, hợp chất 12 được xác định là hợp chất mới và được đặt tên là 6β,9α,14-trihydroxycinnamolide. 3.4.3. Tách chiết, tinh sạch và xác định cấu trúc các hợp chất từ chủng vi nấm P. chrysogenum 045-357-2 Cặn chiết của chủng vi nấm P. chrysogenum 045-357-2 được phân tách trên sắc ký cột gel C18 và tinh chế bằng HPLC thu nhận được 2 hợp chất 13 và 14 (Hình 3.31). Dựa trên phân tích phổ ESI-MS kết hợp với dữ liệu phổ NMR và các tài liệu công bố đã xác định tên của 2 hợp chất lần lượt andrastin A (13) và citreohybridonol (14). Andrastin A là hợp chất với cấu trúc dạng khung meroterpenoid được mô tả đầu tiên bởi Omura và cộng sự (1996) thu nhận từ chủng vi nấm Penicillium sp. FO-3929. Nghiên cứu cũng cho thấy hợp chất này được 18 sản sinh chủ yếu từ các chủng vi nấm thuộc chi Penicillium khi được lên men trên môi trường rắn và chiết bằng ethyl acetate, cụ thể như P. roqueforti CECT 2905, Penicillium sp. FO-3929, P. albocorenium IBT 16884, và P. crustosum 1088. 13 14 Hình 3.31. Cấu trúc hóa học của hợp chất 13-14 từ chủng vi nấm P. chrysogenum 045-357-2 Tương tự andrastin A, hợp chất citreohybridonol cũng được sản sinh bởi nhiều chủng vi nấm thuộc chi Penicillium. Vào năm 2018, hợp chất citreohybridonol cũng được nhóm nghiên cứu của Özkaya phát hiện từ vi nấm Penicillium atrovenetum có nguồn gốc từ hải miên. Tuy nhiên, Özkaya và các cộng sự không xác định cấu trúc dựa trên phổ NMR mà thực hiện trên cơ sở phân tích nhiễu xạ tia X đơn tinh thể. Từ kết quả nghiên cứu cho thấy cả 14 hợp chất thu nhận từ 3 chủng vi nấm tuyển chọn đều chứa cấu trúc vòng thơm và phù hợp với kết quả sàng lọc chất ban đầu dựa trên phân tích TLC và 1H-NMR. 3.5. Xác định hoạt tính sinh học của 14 hợp chất chuyển hóa thứ cấp từ 03 chủng vi nấm tuyển chọn 3.5.1. Xác định hoạt tính kháng VSV kiểm định Kết quả cho thấy 14 hợp chất thu nhận thể hiện hoạt tính kháng phần lớn các chủng VSV kiểm định với giá trị MIC 8-128 µg/mL (Bảng 3.7). Trong đó, hợp chất mới ochraceopone F (7) từ chủng vi nấm A. flocculosus 01NT.1.1.5 và 4 hợp chất 9-12 từ chủng Aspergillus sp. 01NT.1.12.3 thể hiện hoạt tính ức chế hiệu quả sự phát triển của 6 chủng VSV thử nghiệm (MIC, 8-32 µg/mL). Hoạt tính kháng sinh của hợp chất mới phomaligol A2 19 (1) từ chủng A. flocculosus 01NT.1.1.5 cũng được ghi nhận với giá trị MIC 16-128 μg/mL. Mặc dù cấu trúc của hợp chất 1 có thêm nhóm hydroxyl so với hợp chất phomaligol A, nhưng khả năng kháng S. aureus lại giảm so với hợp chất phomaligol A (MIC, 31,2 µg/mL). Bảng 3.7. Hoạt tính kháng VSV kiểm định của các hợp chất 1-14 Tên hợp chất Hoạt tính kháng VSV kiểm định (MIC, µg/mL) Vi khuẩn Gram (+) Vi khuẩn Gram (-) Nấm men B. cereus ATCC 11778 S. faecalis ATCC 19433 S. aureus ATCC 25923 E. coli ATCC 25922 P. aeruginosa ATCC 27853 C. albicans ATCC 10231 Hợp chất từ chủng A. flocculosus 01NT.1.1.5 Phomaligol A2 (1) 128 32 128 64 16 16 Wasabidienone E (2) 128 32 64 64 16 16 Aspertetranone D (3) 64 32 64 64 16 16 Mactanamide (4) 64 32 64 128 16 32 Cycloechinulin (5) 64 64 > 256 128 64 64 Asteltoxin (6) 64 64 > 256 128 64 64 Ochraceopone F (7) 8 8 8 32 16 16 Asterriquinone C1 (8) 32 32 > 256 > 256 32 64 Hợp chất từ chủng Aspergillus sp. 01NT.1.12.3 Dihydroaspirone (9) 16 32 32 32 32 32 Aspilactonol F (10) 16 32 32 32 32 32 6β,7α,14-trihydroxy- confertifolin (11) 32 32 32 32 32 32 6β,9α,14-trihydroxy- cinnamolide (12) 32 32 32 32 32 32 Hợp chất từ chủng P. chrysogenum 045-357-2 Andrastin A (13) 128 128 64 32 16 32 Citreohybridonol (14) 32 64 16 32 16 32 Đối chứng dương Amoxicillin 256 256 0,25 8 64 > 256 Cefotaxime 128 16 2 0,125 8 > 256 Hợp chất mactanamide (4) có khả năng ức chế sự phát triển của 6 chủng VSV kiểm định, trong đó khả năng kháng C. albicans đã được 20 khẳng định bởi báo cáo trước đây của Lorenz và cộng sự (1998). Kết quả nghiên cứu cũng phù hợp với công bố của nhóm tác giả Wang và cộng sự (2015) về hợp chất asteltoxin (6) không thể hiện hoạt tính kháng sinh đối với S. aureus và E. coli khi được thử nghiệm với nồng độ 100 μg/mL. Hợp chất dihydroaspyrone (9) được phân lập từ chủng vi nấm Aspergillus sp. 01NT.1.12.3 có khả năng kháng mạnh các chủng VSV kiểm định. Tuy nhiên, theo công bố của Liu và cộng sự (2015) cho thấy hợp chất này không thể hiện hoạt tính kháng đối với các chủng vi khuẩn gây bệnh cho thủy sản gồm Aeromonas hydrophila, Vibrio anguillarum và V. harveyi. Hai hợp chất andrastin A (13) và citreohybridonol (14) từ chủng P. chrysogenum 045-357-2 có khả năng kháng 2 chủng vi khuẩn Gram âm gồm E. coli và P. aeruginosa và chủng nấm men C. albicans với giá trị MIC 16-32 μg/mL. Đây là nghiên cứu đầu tiên đánh giá hoạt tính kháng VSV kiểm định của các hợp chất wasabidienone E (2), aspertetranone D (3), cycloechinulin (5), asterriquinone C1 (8), aspilactonol F (10) và citreohybridonol (14) phân lập từ vi nấm biển. 3.5.2. Xác định hoạt tính gây độc tế bào Trong số các hợp chất nghiên cứu chỉ có hợp chất asterriquinone C1 (8) thể hiện khả năng ức chế hiệu quả đối với cả 6 dòng tế bào ung thư thử nghiệm với giá trị IC50 30-40 µM. Bên cạnh đó, hợp chất asterriquinone C1 còn được báo cáo ức chế các dòng tế bào ung thư khác ở người gồm ung thư phổi NCI-H460, ung thư vú MCF-7 và tế bào khối u thần kinh đệm với giá trị IC50 lần lượt là 24,2; 4,1 và 25,7 μM. Ở hợp chất mới ochraceopone F (7), mặc dù cấu trúc có thêm nhóm hydroxyl so với hợp chất ochraceopone E nhưng hoạt tính gây độc tế bào hầu như không có sự thay đổi. Wang và cộng sự (2015) đã ghi nhận hợp chất ochraceopone E không thể hiện hoạt tính gây độc đối với cả 7 dòng tế bào ung thư thử nghiệm gồm K-562, MCF-7, A-549, HeLa, DU-145, HL-60 và HT-29 (Bảng 3.8). 21 Bảng 3.8. Hoạt tính gây độc tế bào của các hợp chất 1-14 Tên hợp chất Hoạt tính ức chế sự phát triển tế bào ung thư của các hợp chất ở nồng độ 30 µg/mL (%) HCT-15 NUGC-3 NCI-H23 ACHN PC-3 MDA-MB-231 Hợp chất từ chủng A. flocculosus 01NT.1.1.5 Phomaligol A2 (1) 26,45 ± 2,14 19,77 ± 7,70 28,55 ± 5,74 19,62 ± 1,92 26,94 ± 3,78 19,74 ± 4,26 Wasabidienone E (2) 21,71 ± 3,44 17,91 ± 8,65 22,02 ± 2,12 21,05 ± 6,85 23,22 ± 0,45 23,68 ± 1,77 Aspertetranone D (3) 19,17 ± 2,64 25,82 ± 9,86 23,03 ± 6,92 20,20 ± 6,76 25,89 ± 5,18 37,16 ± 1,37 Mactanamide (4) 22,76 ± 2,09 19,14 ± 7,19 20,78 ± 3,51 22,22 ± 2,62 19,51 ± 0,28 16,51 ± 2,71 Cycloechinulin (5) 28,47 ± 2,49 24,60 ± 7,79 29,12 ± 5,27 25,33 ± 3,31 22,97 ± 3,72 26,66 ± 6,74 Asteltoxin (6) 16,19 ± 1,58 14,57 ± 6,32 19,45 ± 3,78 17,02 ± 2,15 18,59 ± 3,02 15,33 ± 2,19 Ochraceopone F (7) 19,32 ± 3,59 16,97 ± 6,92 21,03 ± 4,25 19,78 ± 5,21 20,67 ± 2,45 17,56 ± 3,22 Asterriquinone C1 (8) 81,58 ± 2,49 77,36 ± 5,52 83,58 ± 2,35 80,3 ± 3,32 88,07 ± 3,24 92,51 ± 2,08 Hợp chất từ chủng Aspergillus sp. 01NT.1.12.3 Dihydroaspirone (9) - - - - - - Aspilactonol F (10) - - 12,25 ± 2,56 - 9,41 ± 3,42 8,62 ± 2,37 6β,7α,14-trihydroxyconfertifolin (11) -