Tóm tắt Luận án Nghiên cứu hóa học và hoạt tính sinh học hai loài sao biển anthenea sibogae và anthenea aspera của Việt Nam

ế bào T-47D). 2.2.3.2. Phương pháp đánh giá hoạt tính chống tăng sinh tế bào Các chất thử nghiệm được thêm vào môi trường nuôi tế bào ở nồng độ nồng độ 50 μM sau đó được ủ thêm 24, 48 và 72 giờ ở 37 0C trong tủ ấm CO2 5%. Các khối u hình thành được đo bằng độ hấp thụ quang tại 490/630 nm bằng máy µQuant microplate. 2.2.3.3. Phương pháp khảo sát sự hình thành khối tế bào ung thư Các chất thử nghiệm được thêm vào môi trường nuôi tế bào ở nồng độ nồng độ 50 μM. Môi trường nuôi cấy được giữ ở 37 0C trong tủ ấm chứa CO2 khoảng 2 tuần các khối tế bào ung thư thu được và được đếm trên kính hiển vi sử dụng phần mềm máy tính ImageJ. CHƢƠNG 3. THỰC NGHIỆM 3.1. Chiết tách, phân lập các hợp chất từ sao biển Anthenea sibogae Phần này trình bày cách thức phân lập các hợp chất từ mẫu sao biển A. sibogae. Việc phân tách các hợp chất được nêu tóm tắt trong sơ đồ hình 3.1. 3.1.1. Xử lý mẫu sao biển A. sibogae 3.1.2. Hằng số vật lý và dữ liệu phổ của các chất phân lập được từ loài sao biển A. sibogae 5 Anthenea sibogae (2 Kg) 80 g chất không tan F6.3.1 (6,9 mg) 100 g cặn tổng 10,5 g cặn EtOH Cặn CH2Cl2 ASB1 (7 mg) ASB2 (5 mg) ASB3 (6 mg) ASB4 (7 mg) CH2Cl2/MeOH (9/11:5) MeOH/H2O (15/15:1) F1. F8 F6 F6.1, F6.2, F6.5 CHCl3/EtOH (3:1Ò2:1) E/Me 30/1, 10/1 H/E 40/1, 5/1 Chiết 4 lần MeOH (t = 45 0C) F6.3.3 (3,2 mg), F6.3.4 (5,8 mg), F6.4.1 (13,5 mg), CH2Cl2 (3x500 ml) Nước cất (1L) Rửa giải AgNO3 , EtOH F6.3 (87 mg) F6.4 (25 mg) F6.3.2 (2,3 mg) MeOH/H2O 80%; 0,5 ml/phút ASB5 (2,4 mg; tR = 35 phút ) ASB6 (2,1 mg; tR = 39,8 phút )ASB8 (1,2mg; tR = 30,4 phút ) ASB9 (0,6 mg; tR = 27,6 phút ) ASB10 (1,0 mg; tR = 27,5 phút ) ASB11 (1,9 mg; tR = 58,2 phút ) ASB7 (0,3 mg; tR = 31,7 phút ) MeOH/H2O 80%,; 0,5 ml/phút EtOH/H2O 75%,; 25 ml/phút MeOH/ H2O 85/15; 0,5 ml/phút Hình 3.1. Sơ đồ chiết và phân lập các hợp chất từ mẫu sao biển A. sibogae 3.2. Chiết tách, phân lập các hợp chất từ sao biển A. aspera Phần này trình bày cách thức phân lập các hợp chất từ mẫu sao biển A. aspera. Việc phân tách các hợp chất được nêu tóm tắt trong sơ đồ hình 3.2. 3.2.1. Xử lý mẫu sao biển A. aspera. 3.2.2. Hằng số vật lý và dữ liệu phổ của các chất phân lập được từ loài sao biển A. aspera. CHƢƠNG 4 - KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 6 Chương này trình bày kết quả nghiên cứu về phân lập và làm sáng tỏ cấu trúc của các hợp chất phân lập từ 2 loài sao biển A. aspera và A. sibogae, hoạt tính gây độc tế bào, hoạt tính ức chế khối u trên thạch mềm và hoạt tính chống tăng sinh của một số hợp chất phân lập được. 4.1. Xác định cấu trúc các hợp chất từ loài sao biển Anthenea sibogae Từ loài sao biển Anthenea sibogae đã phân lập 11 hợp chất trong đó có 6 chất steroid glycoside mới, các chất còn lại lần đầu tiên phân lập từ chi Anthenea. ASB1. Cholesterol ASB2. Thymine ASB3. L-tyrosine ASB4. Tryptophan ASB5. Anthenoside S1 (chất mới) ASB6. Anthenoside S2 (Chất mới) ASB7. Anthenoside S3 (chất mới) ASB8. Anthenoside S4 (chất mới) ASB9. Anthenoside S5 (chất mới) ASB10. Anthenoside S6 (chất mới) ASB11. Hỗn hợp Anthenoside J và Anthenoside K 4.1.5. Hợp chất ASB5: (20R,22E)-7-O-(6-O-methyl--D-galactofuranosyl)-16-O-(3-O-methyl--D- glucopyranosyl)-24-nor-5-cholesta-8(14),22(23)-diene-3,6, 7,16-tetraol (anthenoside S1, hợp chất mới). 7 Công thức phân tử của ASB5 được xác định là C40H66O14 từ kết quả phổ khối phân giải cao (+)-HR- ESI-MS với pic [M + Na]+ m/z 793,4346. Các dữ liệu phổ 1H- và 13C-NMR khung steroid của ASB5 có các tín hiệu của hai nhóm Me góc H3-C(18) [δ(H) 0,91 (s), δ(C) 20,3] và H3-C(19) [δ(H) 0,84 (s); δ(C) 15,5], 1 liên kết đôi 8(14) (δ(C) 126,6; 147,6), hai nhóm HC-O, bao gồm H -C(3) [δ(H) 4,07 - 4,08 (m, W = 11,8); δ(C) 67,5] và H-C(6) [δ(H) 3,64 (t, J = 2,8); δ(C) 75,2], cũng như hai nhóm HC-O mang gốc O- monosaccharide, bao gồm H-C(7) [δ(H) 4,23 (d, J = 2,8); δ(C) 78,5] và H-C(16) [δ(H) 4,63 (td, J = 9,0; 5,0); δ(C) 79,2]. Độ rộng của tín hiệu multiple được dự đoán là của H-3 vào khoảng 12 Hz tương ứng tốt với cấu hình 3α-OH. Độ dịch chuyển hóa học proton và carbon của các nhóm H3-C(18), H3-C(19), H-C(3), H-C(6), H-C(7) và H-C(16) của ASB5 có giá trị gần tương tự với dữ liệu công bố của các nhóm tương ứng trong phân tử anthenoside R và với cấu trúc aglycon Δ8(14)-3α,6β,7β,16α-tetrahydroxysteroid bị glycosyl hóa tại C(7) và C (16). Phổ NMR của mạch nhánh aglycon xuất hiện tín hiệu của ba nhóm Me thứ cấp H3-C(21) [δ(H) 1,10 (d, J = 7,0); δ(C) 23,8], H3-C (26) [δ(H) 0,98 (d, J = 6,7); δ(C) 23,2], và H3-C(27) [δ(H) 0,97 (d, J = 6,7); δ(C) 23,1], H3-C(27) [δ(H) 0,97 (d, J = 6,7); δ(C) 23,1], và 1 liên kết đôi 22(23) [δ(H) 5,74 (ddd, J = 15,3; 8,8; 1,2), 5,30 (dd, J = 15,3; 6,8); δ(C) 133,9; 137,2]. Dựa vào những dữ liệu trên có thể xác định aglycon của ASB5 (22E)-Δ22-24-nor-cholestan (Bảng 4.6 và 4.7, Hình 4.1.27). Các tương tác chìa khóa trên phổ COSY, HSQC của phần aglycon cho phép xác định các hệ spin giữa các proton: H-C(1)H-C(7), H-C(9)H-C(12) thông qua H-C(11), H-C(15)H-C(17), H-C(17)H- C(20), H-C(20)H-C(22), H-C(23)H3-C(27). Cấu trúc khung steroid aglycon của ASB5 dựa phổ HMBC xuất hiện tương tác giữa H-C(6)/C(8), C(10); H-C(15)/C(8), C(14), C(17); H3-C(18)/C(12), C(13), C(14), C(17); H3-C(19)/С(1), С(9), С(10); H3-C(21)/C(17), C(20), C(22); H-C(22)/C(25) và H-C(23)/C(20), C(25), C(26), C(27). Phổ ROESY xuất hiện tương tác C(19)/Hβ-C(2), Hβ-C(4), Hβ-C(11); H3-C(18)/Hβ-C(12), Hβ- C(15), H-C(16); H-C(5)/Hα-C(1), Hα-C(9); Hα-C(4)/Hα-C(6); Hβ-C(4)/H-C(19) và Hα-C(7)/Hα-C(15) cùng với các giá trị của hằng số tương tác của H6, H-7 và H-16, cho phép khẳng định cấu hình tương đối 3,6,7,16 của các nhóm OH và cấu hình 5/9/10/13 của nhân steroid. Tổng hợp tất cả các dữ liệu phổ đã phân tích, có thể xác định phần cấu trúc aglycon của ASB5 là (20R,22E)-24-nor-5-cholesta- 8(14),22(23)-diene-3,6,7,16-tetraol. Các tín hiệu cộng hưởng của 2 proton anomer (δH 4,33 và 5,02) có tương tác trên phổ HSQC tương ứng với 2 carbon lần lượt tại δC 102,9 và 108,4. Phổ (+)-ESI-MS/MS của pic ion [M+Na] + tại m/z 793 cho các mảnh pic ion tại m/z 599 ([(M+Na)-C7H14O6] + ) và 217 ([C7H14O6+Na] + ). Phổ (-)-ESI-MS/MS của pic ion [M-H] - tại m/z 769 cho các mảnh pic ion tại 575 ([(M-H)-C7H14O6] - và 193 ([C7H13O6] -). Các pic này tương ứng với việc mất một gốc O-methyl-hexose. Độ dịch chuyển hóa học và hằng số tương tác của H-1 đến H-6 của 2 đơn vị đường O-methyl-hexose được xác định bằng cách chiếu xạ các proton anomer trong thí nghiệm TOCSY 1D. Ngoài ra, các tín hiệu proton và cacbon của các đơn vị monosaccharide của ASB5 được xác định nhờ các phổ NMR 2D như COSY, HSQC và HMBC (hình 4.1.27, bảng 4.6). Các giá trị của độ dịch chuyển hóa học và hằng số tương tác của hai đơn vị đường này hoàn toàn trùng khớp với dữ liệu công bố về các chất có hai gốc đường cuối mạch là 3-O-methyl--glucopyranosyl và 6-O-methyl--galactofuranosyl. Phản ứng thủy phân ASB5 bằng TFA 2M, sau đó cho các phân tử đường tác dụng với (R)-(-)-2- octanol và sau đó acetyl hóa, phân tích bằng GC và so sánh với thời gian lưu với các dẫn xuất acetyl (-)-2- octyl glycoside của các monosaccharide chuẩn, cho phép xác định cấu hình D của hai đơn vị đường 3-O- methyl--glucopyranose và 6-O-methyl--galactofuranose trong phân tử ASB5. Vị trí gắn hai đơn vị đường nói trên với phần aglycon được xác định nhờ phổ HMBC và ROESY, từ các tương tác giữa H-1’ của 3-OMe-Glcp và C-16 và H-16 của phần aglycon, giữa H-1” của 6-OMe-Galf với C-7 và H-7 của phần aglycon quan sát được trên phổ. Dựa trên tất cả các dữ kiện trên, cấu trúc của ASB5 được xác định là (20R,22E)-7-O-(6-O-methyl--D-galactofuranosyl)-16-O-(3-O-methyl--D- glycopyranosyl)-24-nor-5-cholesta-8(14),22(23)-diene-3,6,7,16-tetraol. 8 Hình 4.1.20. Phổ (+)HR-ESI-MS của ASB5 Hình 4.1.21. Phổ 1H-NMR của ASB5 Hình 4.1.22. Phổ 13C-NMR của ASB5. Hình 4.1.25. Phổ HMBC của ASB5 Hình 4.1.26. Phổ ROESY của ASB5 Hình 4.1.27. Cấu trúc hóa học của ASB5 Bảng 4.6. Số liệu phổ NMR của các hợp chất ASB5-ASB10 Vị trí ASB5 ASB6 ASB7 ASB8 ASB9 ASB10 1 1,51-1,55 (m) 1,29-1,31 (m) 1,51-1,55 (m) 1,28-1,30 (m) 1,50-1,56 (m) 1,28-1,31 (m) 1,51-1,55 (m) 1,28-1,34 (m) 1,52-1,55 (m) 1,29-1,32 (m) 1,50-1,54 (m) 1,28-1,30 (m) 2 1,61-1,63 (m) 1,60-1,64 (m) 1,60-1,64 (m) 1,60-1,62 (m) 1,60-1,63 (m) 1,60-1,63 (m) 3 4,07-4,08 (m) 4,06-4,08 (m) 4,06-4,08 (m) 4,06-4,08 (m) 4,07-4,09 (m) 4,07-4,09 (m) 4 1,96 (td, J = 14,0; 2,8) 1,37 (br d, J = 14,0) 1,96 (td, J = 14,0; 2,8) 1,36 (td, J=14,0) 1,96 (td, J = 14,0, 2,8) 1,36 (br d, J = 14,0) 1,96 (td, J =14,0;2,8) 1,36 (br d, J = 14,0) 1,98 (td, J = 13,7, 2,8) 1,38 (br d, J = 13,7) 1,96 (td, J = 14,0; 2,8) 1,37 (brd, J = 14,0) 5 2,12 (dt, J = 14,0, 2,8) 2,12 (dt, J =14,0; 2,8) 2,12 (dt, J = 14,0; 2,8) 2,13 (dt, J =14,0, 2,8) 2,16 (td, J =13,7; 2,8) 2,13 (dt, J = 14,0, 2,8) 6 3,64 (t, J = 2,8) 3,63 (t, J = 2,8) 3,64(t, J = 2,8) 3,64 (t, J = 2,8) 3,53 (t, J = 2,8) 3,61-3,63 (m) 7 4,23 (d, J = 4,22 (d, J = 4,26 (d, J = 2,8) 4,27 (d, J = 4,25 (d, J = 4,23 (d, J = 186.9952 226.9878 268.9983 301.1409 1+ 385.2349 1+ 441.2974 1+ 617.3659 659.2872 793.4346 1+ +MS, 2.4min #140 0 1 2 3 6x10 Intens. 100 200 300 400 500 600 700 800 m/z 9 2,8) 2,8) 2,8) 2,8) 2,8) 8 - - - - - - 9 2,25-2,28 (m) 2,25-2,28 (m) 2,26-2,28 (m) 2,25-2,29 (m) 2,24-2,26 (m) 2,25-2,28 (m) 10 - - - - - - 11 1,63-1,67 (m) 1,52-1,55 (m) 1,63-1,66 (m) 1,51-1,55 (m) 1,62-1,66 (m) 1,50-1,56 (m) 1,62-1,66 (m) 1,51-1,56 (m) 1,65-1,68 (m) 1,50-1,56 (m) 1,63-1,67 (m) 1,51-1,57 (m) 12 1,82 (dt, J = 12,5;3,3) 1,23-1,27 (m) 1,81 (dt, J = 12,4; 3,4) 1,23-1,27 (m) 1,85 (dt, J = 12,0; 3,3) 1,28-1,32 (m) 1,87-1,89 (m) 1,30-1,34 (m) 1,80 (dt, J = 12,0; 3,4) 1,19-1,22 (m) 1,82 (dt, J = 12,3; 3,5) 1,24 ‒ 1,28 (m) 13 - - - - - - 14 - - - - - - 15 2,86 (ddd, J = 17,0; 9,0, 2,8) 2,64(ddd, J = 17,0; 5,0, 2,1) 2,85 (ddd, J = 17,0; 9,0, 2,8) 2,64 (ddd, J = 17,0; 5,0, 2,1) 2,84 (ddd, J = 17,0; 8,7; 3,0) 2,68 (ddd, J = 17,0; 4,1; 1,8) 2,85 (ddd, J = 17,0; 8,6; 2,9) 2,62-2,69 (m) 2,93 (ddd, J = 16,8; 9,0; 3,0) 2,38-2,41 (m) 2,87 (ddd, J = 17,0; 9,0, 3,1) 2,60 (ddd, J = 17,0; 5,2, 1,8) 16 4,63(td, J = 9,0; 5,0) 4,62 (td, J = 9,0; 5,0) 4,55 (td, J = 8,7; 4,1) 4,57 (td, J = 8,6, 4,2) 4,47 (ddd, J = 9,8, 9,0; 6,0) 4,46 (td, J = 9,0; 5,2) 17 1,53 (dd, J = 9,0; 4,0) 1,54 (dd, J = 9,0; 4,0) 1,49-1,51 (m) 1,51 (dd, J = 8,6, 6,7) 1,46 (dd, J = 9,8; 2,7) 1,48 (dd, J = 9,0; 4,6) 18 0,91 (s) 0,91 (s) 0,94 (s) 0,95 (s) 0,89 (s) 0,93 (s) 19 0,84 (s) 0,84 (s) 0,85 (s) 0,85 (s) 0,83 (s) 0,85 (s) 20 2,38-2,42 (m) 2,38-2,42 (m) 1,67-1,74 (m) 1,69-1,75 (m) 2,37-2,42 (m) 1,66-1,71 (m) 21 1,10 (d, J = 7,0) 1,10 (d, J = 7,1) 1,03 (d, J = 6,8) 1,03 (d, J = 6,8) 1,09 (d, J = 7,3) 1,06 (d, J = 6,8) 22 5,74 (ddd, J = 15,3; 8,8, 1,2) 5,76 (d, J = 15,3; 8,8, 1,2) 1,71-1,76 (m) 1,43-1,47 (m) 1,85-1,89 (m) 1,52-1,56 (m) 5,65 (dd, J = 15,4, 7,3) 1,79-1,86 (m) 1,43-1,47 (m) 23 5,30 (dd, J = 15,3, 6,8) 5,31(dd, J = 15,3; 6,8) 2,07-2,12 (m) 1,88-1,93 (m) 2,19-2,23 (m) 1,87-1,91 (m) 5,37 (dd, J = 15,4, 7,3) 2,21-2,24 (m) 1,92-1,97 (m) 24 - - 5,14 (br t, J =7,5) - 1,92(br td, J =7,3, 3,3) - 25 2,22-2,30 (m) 2,26-2,29 (m) - 2,24-2,31 (m) 1,56-1,62 (m) 2,24-2,30 (m) 26 0,98 (d, J = 6,7) 0,98 (d, J = 6,6) 1,67 (s) 1,03 (d, J = 6,9) 0,89 (d, J = 6,5) 1,04 (d, J = 6,9) 27 0,97 (d, J = 6,7) 0,97 (d, J = 6,6) 1,60 (s) 1,03 (d, J = 6,9) 0,89 (d, J = 6,5) 1,04 (d, J = 6,9) 28 4,72 (d, J = 1,3) 4,75 (br s) 4,72 (br d, J 10 4,70 (br s) =1,3) 3-OMe-β- D-Glcp 4-OMe-β-D- Glcp 3-OMe-β-D- Glcp 3-OMe-β-D- Glcp 3-OMe-β-D- Galf β-D-Galf 1’ 4,33 (d, J = 7,7) 4,29 (d, J =7,8) 4,32 (d, J = 7,7) 4,32 (d, J = 7,8) 4,97 (br s) 4,95 (d, J = 2,4) 2’ 3,23 (dd, J = 9,3; 7,7) 3,17 (dd, J =9,3; 7,8) 3,21(dd, J = 9,1, 7,7) 3,22 (dd, J =9,1, 7,8) 4,00 (dd, J = 2,5; 1,1) 3,96 (dd, J = 4,8; 2,4) 3’ 3,09 (t, J = 9,3) 3,46 (t, J = 9,3) 3,08 (t, J = 9,1) 3,08 (t, J = 9,1) 3,74 (dd, J = 5,6; 2,5) 4,04 (dd, J = 7,2; 4,8) 4’ 3,36 (t, J = 9,3) 3,10 (t, J = 9,3) 3,32 (t, J = 9,1) 3,27-3,29 (m) 4.08 (dd, J = 5.6, 3.5) 3,88 (dd, J = 7,2; 2,4) 5’ 3,27 (ddd, J = 9,3;5,5, 2,5) 3,26 (ddd, J = 9,3; 5,1, 2,2) 3,25 (ddd, J = 9,1; 5,7; 2,5) 3,26 (m) 3.73-3.75 (m) 3,70-3,73 (m) 6’ 3,88(dd, J=11,6; 2,5) 3,70(dd, J=11,6; 5,5) 3,86(dd, J=11,6; 2,2) 3,71(dd, J=11,6; 5,1) 3,86(dd, J=11,6, 2,5) 3,65(dd,J=11,6, 5,7) 3,86(dd, J=11,6, 2,5) 3,63(dd, J=11,6, 5,6) 3,65(br d, J=6,1) 3,62 (dd, J = 11,2; 7,2) 3,59 (dd, J = 11,2, 4,5) OMe 3,63 (s) 3,56 (s) 3,62 (s) 3,62 (s) 3,41 (s) 6-OMe-β- D-Galf 6-OMe-β-D- Galf 6-OMe-β-D- Galf 6-OMe-β-D- Galf 6-OMe-β-D- Galf 1’’ 5,02 (d, J = 2,0) 5,01 (d, J = 2,0) 5,05 (d, J = 2,0) 5.04 (d, J = 2.0) 4.99 (d, J = 2.3) 2’’ 3,90 (dd, J = 3,7; 2,0) 3,89-3,91 (m) 3,90 (dd, J = 4,3, 2,0) 3.90 (dd, J =3.6, 2.0) 3.91 (dd, J = 3.8, 2.3) 3’’ 3,94 (dd, J = 6,2; 3,7) 3,94 (dd, J = 6,1; 3,6) 3,90-3,96 (m) 3.93 (dd, J = 6.8, 3.6) 3.95 (dd, J = 6.2, 3.8) 4’’ 3,90- 3,91(m) 3,89-3,91 (m) 3,91(dd, J = 5,8, 3,4) 3.92 (dd, J = 6.8, 3.5) 3.88 (dd, J = 6.2, 3.9) 5’’ 3,82 (ddd, J = 7,0; 5.2; 3,4) 3,82 (ddd, J = 7,0; 5,2, 3,3) 3,82 (ddd, J = 7.2, 4.8, 3.4) 3.82 (ddd, J = 7.1, 4.8, 3.5) 3.82 ‒ 3.85 (m) 6’’ 3,53 (dd, J = 10,3; 5,2) 3,52 (dd, J = 10,3;7,0) 3,53 (dd, J = 10,1; 5,2) 3,52 (dd, J = 10,1; 7,0) 3,53(dd, J = 10,1, 4,8) 3,52 (dd, J = 10,1; 7,2) 3,54 (dd, J = 10.1, 4.8) 3,52 (dd, J = 10.1, 7,1) 3,53 (d, J = 6,0) OMe 3,38 (s) 3,38 (s) 3,38 (s) 3,38(s) 3,39(s) a CD3OD, b 176 MHz, c 700 MHz, #δC số liệu của anthenoside R Bảng 4.7. Số liệu phổ 13C-NMR của các hợp chất của các chất ASB5-ASB10 C ASB5 ASB6 ASB8 ASB9 ASB10 1 34,6 34,5 34,6 34,5 34,5 2 29,6 29,6 29,6 29,5 29,6 3 67,5 67,5 67,3 67,4 67,5 4 33,3 33,3 33,2 33,4 33,3 5 38,0 38,0 37,9 37,7 38,0 6 75,2 75,5 75,5 77,4 75,2 7 78,5 78,7 78,7 72,1 78,4 11 8 126,6 126,6 126,6 128,4 127,0 9 45,9 45,9 45,6 45,8 45,8 10 38,8 38,8 38,9 38,7 38,9 11 19,5 19,5 19,6 19,4 19,5 12 37,2 37,1 37,6 36,9 37,3 13 45,4 45,4 45,4 44,9 45,1 14 147,6 147,6 148,0 146,8 147,4 15 34,3 34,5 34,2 33,5 33,8 16 79,2 79,4 80,1 76,9 77,7 17 62,8 62,8 62,7 62,6 62,7 18 20,3 20,3 19,7 20,5 20,1 19 15,5 15,4 15,5 15,3 15,4 20 37,2 37,1 34,1 37,1 32,9 21 23,8 23,8 20,8 24,6 21,4 22 133,9 133,8 34,6 137,7 33,8 23 137,2 137,4 33,0 129,5 33,3 24 - - 158,4 43,2 157,7 25 32,3 32,3 34,9 29,9 34,9 26 23,2 23,2 22,6 22,8 22,5 27 23,1 23,1 22,4 22,3 28 108,6 107,2 3-OMe-β-D-Glcp 4-OMe-β-D-Glcp 3-OMe-β-D-Glcp 3-OMe-β-D- Galf β-D-Galf 1’ 102,9 103,0 102,6 108,2 107,6 2’ 75,2 75,2 75,1 80,9 83,7 3’ 87,9 78,2 87,8 88,9 78,3 4’ 71,5 81,2 71,7 84,3 84,4 5’ 77,8 77,2 77,9 73,2 72,4 6’ 63,2 62,7 63,4 65,1 65,4 OMe 61,0 60,8 61,0 58,1 6 -OMe-β-D- Galf 6 -OMe - β-D- Galf 6 -OMe - β- D- Galf 6 -OMe -β-D- Galf 1’’ 108,4 108,4 108,5 108,4 2’’ 83,4 83,4 83,4 83,5 3’’ 78,7 78,7 78,7 78,7 4’’ 85,0 85,0 85,0 85,0 5’’ 70,8 70,8 70,8 70,8 6’’ 75,5 75,5 75,5 75,5 OMe 59,4 59,4 59,4 59,4 Đo trong CD3OD, 176 MHz 4.2. Xác định cấu trúc các hợp chất từ loài sao biển Anthenea aspera 4 hợp chất sterol và 7 hợp chất chứa N lần đầu tiên phân lập từ cặn chiết hexane, ethyl acetat và metanol của loài sao biển Anthenea aspera thu thập tại vùng biển Đông Bắc Việt Nam. 12 AA1. Cholesterol AA2. Lathosterol AA3. Cholest-4-ene-3β,6β-diol AA4.Cholestan-3β,5α,6β,15α,16β-26-hexol AA5. Cyclo(L-glycine-L-proline) AA6. L-glycine-L-propyl AA7.Cyclo(L-alanine-4-hydroxyl-L-prolyl AA8. L-Phenylalanine AA9. Tyramine AA10. Thymine AA11. Uracil 4.2.1. Hợp chất AA1: cholesterol Hợp chất AA1 có điểm nóng chảy, Rf và phổ NMR trùng với hợp chất ASB1 nên xác định là cholesterol. 4.2.2. Hợp chất AA2: Lathosterol (Cholest-7,8-ene-3-ol) Hình. 4.2.8. Cấu trúc hóa học của AA2 Bảng 4.14. Số liệu phổ NMR của AA2 và hợp chất tham khảo Vị trí #C C a,c H a,b (mult., J, Hz) 1 37,1 37,1 1,82 m/ 1,07 m 2 31,3 31,4 1,80 m/ 1,61 m 3 70,7 71,1 3,60 m 4 37,8 38,0 1,27 m/ 1,72 m 5 40,2 40,3 1,40 m 6 29,6 29,7 1,76 m 7 117,2 117,4 5,15 m 8 139,3 139,6 - 9 49,4 49,5 1,61 m 13 10 34,1 34,2 11 21,5 21,6 1,57 m, 1,45 m 12 39,5 39,5 1,20; 2,02 m 13 43,2 43,4 14 54,9 55,0 1,80 overlap 15 22,9 23,0 1,40m; 1,52 m 16 27,9 27,9 1,88 m; 1,26 m 17 56,1 56,1 1,20 m 18 11,8 11,8 0,53 s 19 12,9 13,0 0,79 s 20 36,1 36,0 1,36 m 21 18,8 18,8 0,92 d (6,5) 22 36,1 36.2 0,99 m; 1;34 m 23 23,9 23,9 1,14 m, 1,34 m 24 39,4 39,6 1,13-1,10 m 25 27,9 28,0 1,52 m 26 22,5 22,6 0,86 d (7,0) 27 22,7 22,8 0,87 d (7,0) a CD3OD, b 500 MHz, c 125 MHz, #δC số liệu của TLTK [58] 4.2.3. Hợp chất AA3: cholest-4-ene-3,6-diol Hình 4.2.13. Cấu trúc hóa học của AA3 Bảng 4.15. Số liệu phổ NMR của AA3 và hợp chất tham khảo C C a,c H a,b (mult., J, Hz) C δC a,c H a,b (mult., J, Hz) 1 37,4 1,76 (m); 1,32 (m) 15 25,2 1,64 (m); 1,40 (m) 2 29,6 1.91 (m); 1,49 (m) 16 29,2 1,88 ( m), 1,32 (m) 3 69,2 4,11-4,16 (trùng H-6) 17 57,6 1,14 (m) 4 121,4 5,67 (d, J 1,5 Hz) 18 12,4 0,75 (s) 5 149,5 - 19 19,2 1,08 (s) 6 68,6 4,11-4,16 (trùng H-3) 20 37,1 1,43 (m) 7 43,7 0,87 (m) 21 19,2 0,95 (d, J 6,5) 8 35,8 1,58 (m) 22 37,3 1,39 (m); 1,05 (m) 9 55,9 0,75 (m) 23 24,9 1,14-1,22 (m) 10 38,9 - 24 40,7 1,10-1,21 (m) 11 22,1 1,39; 1,53 (m) 25 29,1 1,55 (m) 12 41,1 2,04-2,06 (m) 26 23,2 0,89 (d, 6,5) 13 43,2 - 27 22,9 0,86 (d, 6,5) 14 57,4 1,07 (m) a CD3OD, b 500 MHz, c 125 MHz, #δC số liệu của TLTK [77] 14 4.2.4. Hợp chất AA4: cholestane 3,5,6,15,16,26-hexol Hình 4.2.21. Cấu trúc hóa học của AA4 Bảng 4.16. Số liệu phổ NMR của AA4 và hợp chất tham khảo C #C C ac H ab , mult (J = Hz) HMBC (HC) NOESY 1 31,7 31,7 1,79 m; 1,51 m C-5, C-19 2 33,5 33,5 1,62 m; 1,35 m C-10 3 68,4 68,3 4,03 m (5,5) 4 41,6 41,5 2,08 dd (11,5; 13,0) C-3, C-5 5 76,6 76,6 - 6 76,6 76,4 3,49 dd (2,5; 3,0) C-4, C-5, C-8, C-10 H-4, H-7 7 35,4 35,2 1,89 m C-6, C-8, C-9, C-14 8 32,2 31,1 2,01 m C-7, C-9, C-14 9 46,7 46,6 1,41 m 10 39,5 39,3 - 11 22,0 21,9 1,38 m C-13 12 42,1 42,0 1,98 m; 1,20 m C-9, C-14 13 44,9 44,7 - 14 61,2 60,9 0,98 m C-13, C-16, C-18 15 85,0 85,1 3,76 dd (2,5; 10,0) C-8, C-14, C-16 H-18 16 83,2 83,0 3,99 dd (2,5; 7,5) C-13, C-15 H-17 17 60,1 59,9 1,27 m C-13, C-18, C-20 18 15,2 15,1 0,93 s C-12, C-13, C-14, C-17 19 17,2 17,3 1,20 s C-1, C-5, C-9, C-10 20 31,0 31,0 1,89 m C-17 21 18,6 18,6 0,98 d (5,5) C-17, C-20, C-22 22 37,5 37,4 1,08 m C-21 23 24,8 24,8 1,46 m; 1,23 m C-24 24 35,0 34,9 1,43 m; 1,06 m C-27 25 37,0 37,0 1,58 m 26 68,6 68,4 3,45 dd (6,0; 10,5); 3,34 overlapped C-24, C-25, C-27 27 17,3 17,4 0,93 d (6,5) C-24, C-25, C-26 a CD3OD, b 500 MHz, c 125 MHz, #δC số liệu của TLTK [78] 4.2.5. Hợp chất AA5: cyclo(L-glycine-L-proline) 15 Hình 4.2.27. Cấu trúc hóa học AA5 Bảng 4.17. Số liệu phổ NMR của AA5 và hợp chất tham khảo Vị trí , H a cδ (mult, J, Hz) cyclo(L- Gly-L-Pro) [79] , H a cδ (mult, J, Hz) (AA5) ,b C aδ (AA5) HMBC (H→C) (AA5) ,d e C δ L-Gly-L- Pro [80] Gly 1 - 163,6 175,6 2 4,10 3,87 (dd) 4,10 * 3,90 (dd, 4,5; 16,5) 46,5 C-1, C-1′ 46,2 NH 7,15 7,35 (br s) C-1, C-2′ Pro 1′ 170,1 169,3 2′ 4,11 4,10* 58,5 C-3’, C-4’ 59,6 3′ 1,75-2,55 2,38 (m)/2,06 * (2,34-2,41) 28,4 C-1′, C-2′, C-4′, C- 5′ 29,2 4′ 1,75-2,55 1,92 (m)/2,06 * (1,86-2,11) 22,3 C-2′, C-3′, C-5′ 23,6 5′ 3,58 (m) 3,64 (m)/3,56 (m) (3,58, m) 45,2 C-1, C-2′, C-3′, C- 4′ 43,0 Đo trong aCDCl3, , b 125 MHz, c 500 MHz, *Tín hiệu trùng, dD2O, e CD3OD. 4.2.6. Hợp chất AA6: L-glycine-L-prolin Hình 4.2.31. Cấu trúc hóa học của AA6 Bảng 4.18. Số liệu phổ NMR của AA6 và hợp chất tham khảo Vị trí #δC [80] L-Gly-L-Pro ,a b C δ (AA6) , a c H δ (mult, J.,Hz) (AA6) HMBC (H→C) (AA6) Gly 1 175,6 172,0 2 46,2 47,0 4,12 (ddd, 17,0; 2,0; 1,0) 3,76 (d, 17,0) C-1, C-1’ NH Pro 1′ 169,3 166,5 2′ 59,6 59,9 4,25 (m) C-3’ 16 3′ 29,2 29,3 2,35 (m) 1,99 (m) 4′ 23,6 23,3 2,04 (m) 1,96 (m) C-5’ 5′ 46,3 46,3 3,52-3,60 (m) C-4’ a MeOD–d4, # D2O, b 125 MHz, c 500 MHz. 4.2.7. Hợp chất AA7: cyclo(L-alanyl-4-hydroxyl-L-prolyl) Hình 4.2.37. Cấu trúc hóa học của AA7 Bảng 4.19. Số liệu phổ NMR của AA7 và hợp chất tham khảo C #C C ac H ab , mult (J = Hz) HMBC (HC) 1 163,6 169,1 - 2 46,5 52,1 4,26 C-1 3 15,7 - C-1 1’ 170,1 172,8 - 2’ 58,5 58,9 4,54 C-1’ 3’ 28,4 38,2 2,30 (dd, dd, 6,5; 13,5) C-1’ 4’ 22,3 69,1 4,49 2,11 (ddd, 4,0 ; 11,0; 13,5) - 5’ 45,2 55,2 3,69 (dd,4,5; 13,0) 3,45 (d,13,0) C-1 N-H - - 4,63 - a CD3OD, b 500 MHz, c 125 MHz, #δC số liệu của TLTK [81]. 4.2.8. Hợp chất AA8: L-phenylalanine Hình 4.2.43. Cấu trúc hóa học của AA8 Bảng 4.20. Số liệu phổ NMR của AA8 và hợp chất tham khảo C #C C ac H ab , mult (J = Hz) HMBC (HC) 1 135,3 137,3 - 2 128,7 130,0 7,28-7,38 (m, 5H, H-Ar); 3 129,7 130,4 7,28-7,38 (m, 5H, H-Ar); 4 130,7 128,4 7,28-7,38 (m, 5H, H-Ar); 5 129,7 130,4 7,28-7,38 (m, 5H, H-Ar); 6 128,7 130,0 7,28-7,38 (m, 5H, H-Ar); 7 37,8 38,3 3,33 (dd, 1H, J = 4,5; 14,5 Hz, H-7), 3,02 (dd, 1H, J = 9,0; 14,5 Hz, H-7). C-8, C-2, C-6, C-1, C-9 8 55,5 57,6 3,79 (dd, 1H, J = 4,5; 9,0 Hz, H-8); C-7, C-1, C-9 9 174,2 173,8 - a CD3OD, b 500 MHz, c 125 MHz, #δH dữ liệu của [82] đo trong CD3OD. 17 4.2.9. Hợp chất AA9: tyramine Hình 4.2.46. Cấu trúc hóa học của AA9 18 Bảng 4.21. Số liệu phổ NMR của hợp chất AA9 và hợp chất tham khảo C #C C ac H ab , mult (J = Hz) 1 128,3 128,5 - 2 130,5 130,8 7,11 d (8,5) 3 116,2 116,7 6,79 d (8,5) 4 156,6 157,8 - 5 116,2 116,7 6,79 d (8,5) 6 130,5 130,8 7,11 d (8,5) 7 35,1 34,0 2,88 dd (8,0; 7,0) 8 42,3 42,3 3,13 dd (8,0; 7,0) C=O 177,0 - CH3 10,5 - a CD3OD, b 500 MHz, c 125 MHz, #δC dữ liệu [83] đo trong CD3OD. 4.2.10. Hợp chất AA10: thymine Phổ 1H-NMR cũng như Rf và điểm nóng chảy của AA10 hoàn toàn đồng nhất với các dữ liệu ASB2. 4.2.11. Hợp chất AA11: uracil Hình 4.2.51. Cấu trúc hóa học của AA11 Bảng 4.22. Số liệu phổ NMR của AA11 và hợp chất tham khảo C #C C ac H ab , mult (J = Hz) 1 167,5 164,3 - 2 110,4 100,2 5,44 ppm (J =7,5Hz, H-2) 3 139,2 142,1 7,38 ppm (J =7,5Hz, H-3) 4 150,3 151,5 - 5 12,1 - - N-H 11,8 11,0 a CD3OD, b 500 MHz, c 125 MHz, #δc số liệu của TLTK [84,85] 4.3. Kết quả thử hoạt tính sinh học của một số chất mới phân lập từ sao biển A. sibogae 4.3.1. Hoạt tính gây độc tế bào Các hợp chất ASB5, ASB6, ASB8-ASB11 được thử nghiệm độ gây độc tế bào trên dòng tế bào ung thư vú ở người T-47D theo phương pháp MTS. Chất đối chứng dương được chúng tôi lựa chọn là cisplatin. Kết quả cho thấy các hợp chất được thử nghiệm và cisplatin đều không gây độc tế bào đối với dòng tế bào T- 47D ở nồng độ lên đến 150 μM. 4.3.2. Hoạt tính chống tăng sinh tế bào Các hợp chất ASB5, ASB6và ASB8 không thể hiện hoạt tính ức chế tăng sinh đối với dòng tế bào T- 47D ở nồng độ 50 μM, trong khi hỗn hợp ASB11 ức chế sự tăng sinh của tế bào T-47D sau 24 giờ, 48 giờ và 72 giờ ở cùng nồng độ so với chất đối chứng cisplatin. Sau 24 giờ hỗn hợp ASB11 làm giảm sự tăng sinh của tế bào T-47D 10% trong khi chất đối chứng cisplatin làm giảm sự tăng sinh của tế bào T-47D 20%. Sau 48 giờ hỗn hợp ASB11 làm giảm sự tăng sinh của tế bào T-47D khoảng 20% trong khi chất đối chứng cisplatin làm giảm sự tăng sinh của tế bào T-47D khoảng 50%. Hỗn hợp ASB11 (50 μM) làm giảm sự tăng sinh của tế bào T-47D sau 72 giờ là 47%, chất đối chứng cisplatin (15 μM) làm giảm sự tăng sinh của tế bào T-47D sau 72 giờ là 67% (Hình 4.3.1). 19 Hình 4.3.1. Hoạt tính ức chế sự tăng sinh tế bào T-47 theo thời gian của hỗn hợp ASB11 và cisplatin 4.3.3 Khảo sát hoạt tính ức chế sự hình thành khối tế bào ung thư trên thạch mềm Các tế bào T-47D (8 × 103) được xử lý với các hợp chất ASB5, ASB6, ASB8 và hỗn hợp ASB11 ở