Tóm tắt Luận án Nghiên cứu một số đặc điểm sinh học của vi khuẩn streptococcus suis gây bệnh ở lợn tại tỉnh thái nguyên và chế tạo autovaccine phòng bệnh

giá kháng thể ở lợn đã được tiêm Autovaccine bằng phản ứng ngưng kết hồng cầu gián tiếp (IHA) theo quy trình đánh giá vaccine của OIE (2018). 2.4.4. Phương pháp xử lý số liệu Các số liệu thu được trong quá trình thực hiện đề tài được xử lý theo phương pháp thống kê sinh học trong chăn nuôi của Nguyễn Văn Thiện (2002), phần mềm Minitab (Version 14.0), Excel 2013. Chương 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 3.1. Tình hình lợn mắc và chết do viêm phổi, viêm khớp từ năm 2015 - 2017 tại tỉnh Thái Nguyên 3.1.1. Tỷ lệ lợn mắc và chết do viêm phổi, viêm khớp từ năm 2015-2017 Bảng 3.1: Tỷ lệ lợn mắc và chết do viêm phổi, viêm khớp từ năm 2015-2017 Năm Số lợn điều tra (con) Viêm phổi Viêm khớp Viêm phổi và viêm khớp Lợn mắc Lợn chết Lợn mắc Lợn chết Lợn mắc Lợn chết Số con Tỷ lệ (%) Số con Tỷ lệ (%) Số con Tỷ lệ (%) Số con Tỷ lệ (%) Số con Tỷ lệ (%) Số con Tỷ lệ (%) 2015 3.850 496 12,88 56 11,29 366 9,50 21 5,73 153 3,97 4 2,61 2016 4.120 565 13,71 68 12,03 434 10,53 28 6,45 207 5,02 6 2,89 2017 3.170 518 16,34 80 15,44 440 13,88 36 8,18 218 6,87 8 3,66 Tính chung 11.140 1.579 14,17 204 12,91 1.240 11,13 85 6,85 578 5,18 18 3,11 Kết quả ở bảng 3.1 cho thấy tỷ lệ đàn lợn mắc viêm phổi và viêm khớp trên địa bàn tỉnh Thái Nguyên là khá cao. Trong đó, lợn mắc viêm phổi có tỷ lệ trung bình là 14,17% và chết là 12,91%; lợn mắc viêm khớp trung bình là 11,13% và chết là 6,85%. Lợn mắc và chết do hai bệnh trên có tỷ lệ khác nhau giữa các năm điều tra. Với viêm phổi, năm 2017 đàn lợn có tỷ lệ mắc và chết là cao nhất (tương ứng là 16,34% và 15,44%), tiếp đến là năm 2016 (tỷ lệ là 13,71% và 12,03%) và thấp nhất là năm 2015 (tỷ lệ là 12,88% và 11,29%). Đối với viêm khớp, tỷ lệ lợn mắc và chết cao nhất cũng là ở năm 2017 (tương ứng là 13,88% và 8,18%), tiếp sau ở năm 2016 (10,53% và 6,45%) và thấp nhất là ở năm 2015 (9,50% và 5,73%). Tương tự như trên, số lợn mắc và chết do viêm phổi và viêm khớp cao nhất cũng là ở năm 2017 (tương ứng là 6,87% và 3,66%), tiếp sau ở năm 2016 (5,02% và 2,89%) và thấp nhất là ở năm 2015 (3,97% và 2,61%). Năm 2017, viêm phổi và viêm khớp trên đàn lợn ở Thái Nguyên có số lượng mắc và chết cao hơn các năm trước là do thời điểm này giá lợn thịt xuống thấp nhất trong 10 năm trở lại đây nên đã ảnh hưởng rất lớn đến ngành chăn nuôi lợn. Lợn thương phẩm không tiêu thụ được dẫn đến các trang trại và gia trại thua lỗ nặng, người chăn nuôi hầu như không chú ý đến công tác chăm sóc, nuôi dưỡng, vệ sinh, phòng trị bệnh nên bệnh tật phát sinh nhiều. 3.1.2. Tỷ lệ lợn mắc và chết do viêm phổi, viêm khớp theo mùa vụ Bảng 3.2: Tỷ lệ lợn mắc và chết do viêm phổi, viêm khớp theo mùa vụ Mùa vụ Số lợn điều tra (con) Viêm phổi Viêm khớp Lợn ốm Lợn chết Lợn ốm Lợn chết Số con Tỷ lệ (%) Số con Tỷ lệ (%) Số con Tỷ lệ (%) Số con Tỷ lệ (%) Hè -Thu 4.357 395 9,06 32 8,10 415 9,52 24 5,78 Đông - Xuân 6.783 1.184 17,45 172 14,52 825 12,16 61 7,39 Tính chung 11.140 1.579 14,17 204 12,91 1.240 11,13 85 6,85 Kết quả bảng 3.2 cho thấy đàn lợn nuôi tại tỉnh Thái Nguyên có tỷ lệ mắc và chết do viêm phổi và viêm khớp ở vụ Đông - Xuân đều cao hơn vụ Hè - Thu. Đối với viêm phổi có tỷ lệ lợn mắc và chết ở vụ Đông - Xuân tương ứng là 17,45% và 14,52% cao hơn vụ Hè - Thu tỷ lệ 9,06% và 8,10%; với viêm khớp là 12,16% và 7,39% so với 9,52% và 5,78%. Qua kết quả nghiên cứu trên cho thấy viêm phổi và viêm khớp ở lợn trên địa bàn tỉnh Thái Nguyên thường xảy ra quanh năm, nhưng vào những tháng trong vụ Đông-Xuân là thời gian có thời tiết, khí hậu lạnh, mưa phùn ẩm ướt gây bất lợi đối với sức khỏe của vật nuôi, đồng thời là điều kiện cho bệnh phát sinh nên hai bệnh trên xảy ra với tỷ lệ cao hơn. 3.1.3. Tỷ lệ lợn mắc và chết do viêm phổi, viêm khớp theo lứa tuổi Bảng 3.3: Tỷ lệ lợn mắc và chết do viêm phổi, viêm khớp theo lứa tuổi Lứa tuổi lợn (tháng tuổi) Số lợn điều tra (con) Viêm phổi Viêm khớp Lợn ốm Lợn chết Lợn ốm Lợn chết Số con Tỷ lệ (%) Số con Tỷ lệ (%) Số con Tỷ lệ (%) Số con Tỷ lệ (%) Lợn con ( ≤ 1 tháng) 3.425 503 15,47 71 14,11 412 12,02 28 6,79 Lợn sau cai sữa (>1 - 3 tháng) 4.150 697 16,79 107 15,35 665 16,02 52 7,81 Lợn thịt (>3 - 6 tháng) 2.416 285 11,79 21 7,36 128 5,29 4 3,12 Lợn hậu bị, lợn nái (> 6 tháng) 1.149 94 8,18 5 5,31 35 3,04 1 2,85 Tính chung 11.140 1.579 14,17 204 12,91 1.240 11,13 85 6,85 Kết quả ở bảng 3.3 cho thấy đàn lợn nuôi tại tỉnh Thái Nguyên mắc và chết do viêm phổi, viêm khớp có tỷ lệ khác nhau giữa các các lứa tuổi. Với viêm phổi thì lợn ở lứa tuổi sau cai sữa (>1 - 3 tháng tuổi) có tỷ lệ mắc cao nhất (16,79%); tiếp sau là lợn con (dưới 1 tháng tuổi) tỷ lệ 15,47% và thấp nhất là lợn hậu bị, lợn nái sinh sản (8,18%). Tỷ lệ lợn chết do viêm phổi cũng cao nhất là ở lợn sau cai sữa, tiếp sau là lợn con và thấp nhất là ở lợn hậu bị, lợn nái (tương ứng là 15,35; 14,11 và 5,31%). Đối với viêm khớp, tỷ lệ lợn mắc cao nhất ở lợn sau cai sữa (16,02%), tiếp sau là lợn con dưới 1 tháng tuổi (12,02%) và thấp nhất là lợn hậu bị, lợn nái (3,04%). Tỷ lệ lợn chết do viêm khớp cao nhất là ở lợn sau cai sữa, tiếp sau là lợn con và thấp nhất là ở lợn hậu bị, lợn nái (tương ứng là 7,81; 6,79 và 2,85%). Kết quả của chúng tôi cũng tương đồng với nghiên cứu của Dutkiewicz J và cs. (2017) cho thấy trong đàn lợn mắc bệnh liên cầu khuẩn thì đa số lợn bị mắc trong giai đoạn từ 5 đến 10 tuần tuổi, ít lợn bị mắc trên 32 tuần tuổi hoặc sau khi sinh vài giờ. Kết quả khảo sát sự lưu hành của S. suis trên một số địa bàn thuộc tỉnh Thừa Thiên-Huế trong vụ xuân hè năm 2015 của Bùi Thị Hiền và cs. (2016) cũng cho thấy tỷ lệ nhiễm vi khuẩn S. suis ở lợn khỏe là 11,4%. 3.2. Kết quả nghiên cứu một số đặc điểm sinh học của các chủng S. suis phân lập được 3.2.1. Phân lập vi khuẩn S. suis từ lợn mắc viêm phổi và viêm khớp tại Thái Nguyên Bảng 3.4: Kết quả phân lập vi khuẩn S. suis từ lợn mắc viêm phổi và viêm khớp ở các lứa tuổi khác nhau TT Lứa tuổi lợn (tháng tuổi) Mẫu bệnh phẩm Số mẫu kiểm tra Số mẫu (+) Tỷ lệ (%) Tính chung (%) 1 Lợn con ( ≤ 1 tháng) Dịch họng 37 16 43,24 45,79 Phổi 35 18 51,42 Dịch ổ khớp 35 15 42,85 2 Lợn sau cai sữa (> 1 - 3 tháng) Dịch họng 44 25 56,81 58,91 Phổi 43 31 72,09 Dịch ổ khớp 42 20 47,61 3 Lợn thịt (> 3 - 6 tháng) Dịch họng 37 18 48,64 52,77 Phổi 36 25 69,44 Dịch ổ khớp 35 14 40,00 4 Lợn hậu bị, lợn nái (≥ 7 tháng) Dịch họng 23 11 47,82 50,84 Phổi 20 13 65,00 Dịch ổ khớp 16 6 37,50 Tính chung 403 212 52,60 Kết quả ở bảng 3.4 cho thấy trong 403 mẫu bệnh phẩm từ lợn mắc viêm phổi và viêm khớp ở các lứa tuổi đã có 212 mẫu phân lập được vi khuẩn S. suis với tỷ lệ là 52,60%; trong đó cao nhất là ở lợn sau cai sữa > 1 - 3 tháng tuổi (58,91%) và thấp nhất là ở lợn con dưới 1 tháng tuổi (45,79%). Kết quả của chúng tôi tương đồng với kết quả phân lập S. suis từ mẫu bệnh phẩm của lợn mắc PRRS tại Bắc Giang của Trương Quang Hải và cs. (2012) là 51,67%; của Lê Văn Dương và cs. (2013) là 55,10%, nhưng cao hơn với kết quả nghiên cứu của Nguyễn Thị Kim Lan và cs. (2016, 2017) khi phân lập vi khuẩn gây viêm phổi ở lợn tại tỉnh Bắc Ninh từ phổi và hạch cuống họng của lợn thấy tỷ lệ phân lập được S. suis là 38,67% và ở lợn nuôi tại tỉnh Tuyên Quang là 13,0%. Qua kết quả phân lập vi khuẩn S. suis ở lợn tại Thái Nguyên như trên cho thấy vi khuẩn này đã có vai trò quan trọng gây viêm phổi và viêm khớp ở lợn những năm qua trên địa bàn. 3.2.2. Kết quả giám định một số đặc tính sinh vật, hóa học của các chủng vi khuẩn Streptococcus suis phân lập được Kết quả giám định một số đặc tính sinh vật, hóa học của vi khuẩn S. suis phân lập từ các mẫu bệnh phẩm lợn mắc viêm phổi và viêm khớp tại tỉnh Thái Nguyên thấy tất cả các chủng đều có những đặc tính sinh vật, hóa học đặc trưng của vi khuẩn S. suis như mô tả của các tài liệu trong và ngoài nước. 3.2.3. Kết quả giám định một số đặc tính sinh vật, hoá học của các chủng vi khuẩn S. suis phân lập được bằng bộ Kit sinh hóa API 20 Strep Kết quả giám định một số đặc tính sinh vật, hoá học của các chủng vi khuẩn S. suis phân lập được bằng bộ Kit sinh hóa API 20 Strep, gồm 20 phản ứng được chế sẵn trong khay nhựa do hãng BioMérieux sản xuất, bao gồm: VP, HIP. ESC, PYRA, aGAL, bGUR, bGAL, PAL, LAP, ADH, RIB, ARA, MAN, SOR, LAC, TRE, INU, RAF, AMD, GLYG. Kết quả cho thấy các chủng S. suis phân lập được từ lợn tại Thái Nguyên đều có đầy đủ các đặc tính sinh vật, hóa học đặc trưng của giống vi khuẩn S. suis. 3.2.4. Kết quả xác định tính mẫn cảm kháng sinh của các chủng S. suis phân lập được Bảng 3.5: Kết quả xác định tính mẫn cảm kháng sinh của các chủng S. suis phân lập được TT Kháng sinh Số chủng thử Đánh giá mức độ mẫn cảm Mạnh Trung bình Kháng thuốc (+) (%) (+) (%) (+) (%) 1 Ceftiofur 168 142 84,52 15 8,92 11 6,54 2 Florfenicol 168 137 81,54 17 10,11 14 8,33 3 Amoxicillin 168 135 80,35 15 8,92 18 10,71 4 Ampicillin 168 122 72,61 13 7,73 33 19,64 5 Ofloxaxin 168 90 53,57 18 10,71 60 35,71 6 Tetracyclin 168 71 42,26 25 14,88 72 42,85 7 Gentamicin 168 43 25,59 49 29,16 76 45,23 8 Lincomycin 168 21 12,50 59 35,11 88 52,38 9 Penicillin G 168 17 10,11 52 30,95 98 58,33 10 Neomycin 168 9 5,35 38 22,61 121 72,02 11 Colistin 168 4 2,38 32 19,04 132 78,57 12 Erythromycin 168 3 1,78 26 15,47 139 82,73 Kết quả bảng 3.5 cho thấy các chủng S. suis mẫn cảm cao với ceftiofur (84,52%), florfenicol (81,54%), amoxicillin (80,35%), ampicillin (72,61%) và kháng lại một số kháng sinh như erythromycin (82,73%), colistin (78,57%), neomycin (72,02%) và penicillin G (58,33%). Kết quả của chúng tôi tương đồng với nghiên cứu Nguyễn Thị Kim Lan và cs. (2017) khi kiểm tra mức độ mẫn cảm với một số kháng sinh của các chủng S. suis phân lập ở lợn tại tỉnh Bắc Ninh cho thấy chúng mẫn cảm mạnh với ceftiofur (81,82%), amoxicillin (79,55%), florfenicol (75,00%) và ampicillin (70,45%). Kết quả trên là cơ sở để chúng tôi lựa chọn kháng sinh điều trị bệnh liên cầu S. suis cho lợn đạt hiệu quả cao tại Thái Nguyên. 3.2.5. Xác định serotype các chủng S. suis phân lập được bằng kỹ thuật PCR Bảng 3.6: Kết quả xác định serotype của các chủng vi khuẩn S. suis phân lập được Loại lợn lấy mẫu (tháng tuổi) Tổng số chủng VK Kết quả xác định serotype Serotype 2 Serotype 7 Serotype 9 Serotype 21 Serotype 29 Không xác định Số chủng (+) Tỷ lệ (%) Số chủng (+) Tỷ lệ (%) Số chủng (+) Tỷ lệ (%) Số chủng (+) Tỷ lệ (%) Số chủng (+) Tỷ lệ (%) Số chủng (+) Tỷ lệ (%) Lợn con ( ≤ 1 tháng) 39 23 58,97 2 5,13 6 15,39 0 0 1 2,56 7 17,94 Lợn sau cai sữa (>1- 3 tháng) 50 32 64,00 3 6,00 7 14,00 1 2,00 1 2,00 6 12,00 Lợn thịt (>3 - 6 tháng) 41 21 51,21 3 7,32 9 21,96 1 2,44 1 2,44 6 14,64 Lợn hậu bị, nái ( ≥ 6 tháng) 23 13 56,52 2 8,69 3 13,02 1 4,34 1 4,34 2 8,69 Cộng 153 89 58,17 11 7,19 25 16,34 3 1,96 4 2,61 21 13,72 Kết quả ở bảng 3.6 cho thấy số chủng vi khuẩn S. suis thuộc serotype 2 chiếm tỷ lệ cao nhất (58,17%), tiếp đến là serotype 9 (16,34%), serotype 7 (7,19%), thấp nhất là serotype 21 và 29 (tỷ lệ tương ứng là 1,96 và 2,61%); còn lại 21 chủng chưa xác định được serotype , chiếm tỷ lệ 13,72%. Đối với serotype 2, cao nhất là ở lợn sau cai sữa (64,00%), tiếp đến là ở lợn con < 1 tháng tuổi (58,97%) và thấp nhất là lợn thịt (51,21%). Còn các serotype khác của vi khuẩn S. suis thì đều có kết quả âm tính trong số các chủng S. suis phân lập được ở lợn tại Thái Nguyên đã được triển khai nghiên cứu xác định. Kết quả nghiên cứu của chúng tôi tương đồng với kết quả nghiên của một số tác giả như Cù Hữu Phú (2011) xác định được các chủng vi khuẩn S. suis thuộc serotype 2 ở lợn mắc tai xanh với tỷ lệ là 58,33% và Lê Văn Dương và cs. (2013) khi xác định serotype của các chủng vi khuẩn S. suis phân lập từ các mẫu bệnh phẩm của lợn mắc PRRS tại Bắc Giang cho thấy serotype 2 chiếm tỷ lệ cao nhất (56,29%), tiếp đến là serotype 9 (17,03%) và thấp nhất là serotype 7 (5,18%). 3.2.6. Kết quả xác định gen mã hóa yếu tố độc lực của các chủng vi khuẩn S. suis phân lập được Kết quả nghiên cứu cho thấy trong số các gen mã hóa các yếu tố độc lực các chủng S. suis mang gen arcA chiếm tỷ lệ cao nhất (75,5%), tiếp sau là gen mrp (71,1%), gen sly (62,2%) và gen epf (57,7%). Có 5 kiểu tổ hợp gen mã hóa các yếu tố độc lực được xác định là: arcA/sly, arcA/mrp, arcA/epf, arcA/mrp/sly và arcA/mrp/sly/epf trong số 45 chủng S. suis nghiên cứu. Kết quả nghiên cứu của chúng tôi tương đồng với nghiên cứu của một số tác giả như Đỗ Ngọc Thúy và cs. (2009) từ những lợn khỏe và lợn có triệu chứng viêm phổi, tai xanh hoặc viêm khớp, viêm não đã phân lập được vi khuẩn S. suis với các tỷ lệ khác nhau. Trong 211 chủng S. suis được nghiên cứu đã xác định được 18 loại serotype, phổ biến là serotype 2, 7, 9 và có 7 kiểu tổ hợp gen độc lực. Nghiên cứu của Cù Hữu Phú và cs. (2013) cho thấy các chủng thuộc serotype 2 có nhiều kiểu tổ hợp gen nhất, được phân bố rải rác trong 5 kiểu tổ hợp gen là arcA, arcA/sly; arcA/mrp; arcA/mrp/sly; arcA/mrp/sly/epf. Kết quả phản ứng PCR xác định gen mã hóa độc lực của các chủng S. suis phân lập được được trình bày ở hình 3.2. Ghi chú: M: 100 bp maker Giếng 1: Gen arcA Giếng 2: Gen mrp Giếng 3: Gen sly Giếng 4: Gen epf Hình 1: Kết quả phản ứng PCR xác định gen mã hóa độc lực của các chủng S. suis phân lập được 3.2.7. Kết quả kiểm tra một số đặc tính sinh vật, hóa học của các chủng S. suis lựa chọn sau các đời cấy truyền Từ các đối tượng lợn như lợn con theo mẹ, lợn con sau cai sữa, lợn thịt, lợn nái hậu bị và nái nuôi con chúng tôi đã lựa chọn ra được 9 chủng S. suis đại diện cho các serotype gây bệnh ở lợn, gồm: 3 chủng thuộc serotype 2 (S.TN2-1, S.TN2-2, S.TN2-3); 3 chủng thuộc serotype 7 (S.TN7-4, S.TN7-5, S.TN7-6) và 3 chủng thuộc serotype 9 (S.TN9-7, S.TN9-8, S.TN9-9) được phân bố ở 8 huyện/thành trong tỉnh Thái Nguyên. Các chủng S. suis lựa chọn, sau 5 đời cấy truyền được kiểm tra đều thấy ổn định về đặc tính sinh vật, hóa học và phù hợp với các tiêu chí đánh giá theo Quy trình chẩn đoán bệnh do vi khuẩn S. suis gây ra trên lợn (TCVN 8400-2:2010). Đây là những đặc tính quan trọng của một giống cấp I trong quá trình nhân giống cấp III để sản xuất vaccine, bởi có thể đảm bảo và giữ nguyên được các đặc tính sinh vật học của chúng qua các lô giống khác nhau. 3.2.8. Kết quả kiểm tra độc lực của một số chủng vi khuẩn S. suis lựa chọn sau các đời cấy truyền Qua bảng 3.7 cho thấy sau 5 đời cấy truyền các chủng vi khuẩn S. suis thuộc serotype 2 đều gây chết 100% số chuột thí nghiệm trong thời gian sau tiêm 24 giờ, trong đó có 66,67% chủng gây chết chuột từ 12-24 giờ và 33,33% chủng từ 18-24 giờ. Các chủng S. suis serotype 9 cũng gây chết 100% số chuột thí nghiệm trong khoảng thời từ 12-24 giờ, trong đó có 33,33% chủng gây chết chuột từ 12-24 giờ và 66,67% chủng từ 18-24 giờ. Trong khi đó, chỉ có 33,33% chủng thuộc serotype 7 được kiểm tra gây chết 100% số chuột thí nghiệm sau tiêm từ 24-36 giờ và 66,67% chủng gây chết 50% chuột trong vòng trước 36-48 giờ sau khi tiêm. Bảng 3.7: Kết quả kiểm tra độc lực của một số chủng S. suis trên chuột bạch sau 5 đời cấy truyền Ký hiệu chủng Thuộc serotype Số chuột tiêm (con) Liều tiêm (ml/ con) Kết quả Phân lập lại VK Số chuột chết (con) Thời gian chết (giờ) Tỷ lệ (%) S-TN2-1 2 2 0,5 2/2 18 - 24 100 + S-TN2-2 2 2 0,5 2/2 12 - 24 100 + S-TN2-3 2 2 0,5 2/2 12 - 24 100 + S-TN7-4 7 2 0,5 1/2 < 48 50 + S-TN7-5 7 2 0,5 2/2 24 - 36 100 + S-TN7-6 7 2 0,5 1/2 < 36 50 + S-TN9-7 9 2 0,5 2/2 12 - 24 100 + S-TN9-8 9 2 0,5 2/2 18 - 24 100 + S-TN9-9 9 2 0,5 2/2 18 - 24 100 + Tất cả các chuột thí nghiệm chết được mổ khám đều cho thấy có bệnh tích tương đối giống nhau như chỗ tiêm đôi khi có hiện tượng áp xe, phổi viêm và sung huyết; tim xưng, mềm, tích nước ở xoang bao tim. Khi tiến hành phân lập lại vi khuẩn thì đều thu được S. suis thuần khiết từ máu tim. Như vậy, có thể thấy các chủng thuộc serotype 2, 7 và 9 là ba loại serotype chiếm ưu thế trong số các chủng vi khuẩn S. suis phân lập được từ lợn viêm phổi và viêm khớp tại Thái Nguyên là những chủng có độc lực cao và có thể gây chết chuột trong thời gian ngắn sau 5 đời cấy truyền. Đây là một đặc tính rất quan trọng cho việc sàng lọc và lựa chọn các chủng vi khuẩn để chế tạo Autovaccine. Dựa vào công thức tính LD50 của Reed L.J. & Muench H. (1938) chúng tôi xác định liều LD50 của các chủng S. suis phân lập cho kết quả S. suis serotype 2 là LD50 = 4,5 x 107; serotype 7 là LD50 = 4,9 x 107 và serotype 9 là LD50 = 4,8 x 107. 3.3. Kết quả nghiên cứu chế tạo thử nghiệm Autovaccine từ các chủng S. suis phân lập được 3.3.1. Chọn chủng vi khuẩn S. suis để chế tạo Autovaccine thử nghiệm Từ các kết quả nghiên cứu về đặc tính sinh vật, hóa học, xác định serotype và độc lực của các chủng S. suis phân lập được ở lợn tại Thái Nguyên, chúng tôi đã lựa chọn 3 serotype là 2, 7 và 9 để chế tạo thử nghiệm Autovaccine vô hoạt có bổ trợ keo phèn. Các serotype đã lựa chọn đều chiếm tỷ lệ cao trong số các serotype phân lập được và mang đầy đủ gen mã hóa các yếu tố độc lực là yếu tố ngoại bào (EF-epf), protein giải phóng muramidase (MRP-mrp), yếu tố gây dung huyết suilysin (SLY-sly) và enzym arginine deiminase (ARC-arcA) là các gen tạo nên các độc tố đóng vai trò quan trọng trong gây bệnh ở lợn. Ngoài ra, các serotype trên đều có độc lực cao, gây chết chuột thí nghiệm trong vòng 12-36 giờ. 3.3.2. Chế tạo Autovaccine thử nghiệm phòng bệnh S. suis ở lợn 3.3.2.1. Kết quả nuôi cấy canh trùng để chế tạo Autovaccine thử nghiệm Các serotype 2, 7 và 9 được nuôi cấy lắc (300 - 500 lần/phút) riêng rẽ trong vòng 24 giờ, đạt độ đậm tối thiểu là 1,64 x 108 vi khuẩn trong 1 ml canh trùng. Sau đó được vô hoạt bằng formalin với tỷ lệ 0,3% và bổ sung keo phèn với tỷ lệ 1/5 (20%) theo quy trình chế tạo vaccine vô hoạt keo phèn của Viện Thú y. Để kiểm nghiệm Autovaccine thử nghiệm, sử dụng quy trình kiểm nghiệm vắc xin chết có bổ trợ keo phèn theo TCVN 8684:2011và QCVN 01:187-2018. Bảng 3.8: Kết quả đếm số lượng vi khuẩn có trong canh trùng S. suis dùng chế tạo Autovaccine thử nghiệm Lô Autovaccine Số vi khuẩn/1 ml canh trùng Tính chung Số lượng VKTB/1ml CT CT2 Số lượng VKTB/1ml CT CT7 Số lượng VKTB/1ml CT CT9 Số lượng VKTB/1ml CT Lô I (1,5 lít) 1,65 x 108 1,63 x 108 1,64 x 108 1,64 x 108 Lô II (1,5 lít) 1,71 x 108 1,68 x 108 1,69 x 108 1,69 x 108 Lô III (1,5 lít) 1,72 x 108 1,70 x 108 1,71 x 108 1,71 x 108 Ghi chú: CT: Canh trùng, CT2: Canh trùng S. suis serotype 2; CT7: Canh trùng S. suis serotype 7; CT9: Canh trùng S. suis serotype 9; VKTB: Vi khuẩn trung bình. Kết quả ở bảng 3.8 cho thấy sau thời gian nuôi cấy các lô canh trùng của ba lô Autovaccine thử nghiệm chế tạo thử từ các chủng vi khuẩn S. suis phân lập được đều có độ đậm vi khuẩn trung bình đạt từ 1,64 x 108 đến 1,71 x 108 vi khuẩn/ml. Theo QCVN-01-187:2018 số lượng vi khuẩn phải có trong 1 ml canh trùng để chế vaccine phải đạt thấp nhất là 1,5 x 108 vi khuẩn/ml thì các lô canh trùng trên đều đủ tiêu chuẩn. Dựa vào kết quả nghiên cứu của Torremorell M. (1997) chúng tôi tính liều tiêm Autovaccine cho lợn là 2,5 ml/con, tương đương với độ đậm vi khuẩn trung bình khoảng: 4,2 x 108 CFU/ml. 3.3.2.2. Kết quả kiểm tra thuần khiết canh trùng S. suis dùng chế tạo Autovaccine Việc kiểm tra thuần khiết được tiến hành đồng thời với các bước nuôi cấy canh trùng riêng rẽ của từng chủng S. suis từ giống nhỏ đến giống lớn. Kết quả cho thấy, canh trùng dùng để chế tạo ba lô Autovaccine đều đạt các chỉ tiêu về thuần khiết. Trên các môi trường như nước thịt thường, nước thịt gan yếm khí, thạch máu, thạch MacConkey nuôi cấy với 3 chủng S. suis khác nhau (S-TN2-2, S-TN7-5 và S-TN9-7) ở cả ba lô Autovaccine thử nghiệm I, II và III đều thấy có duy nhất vi khuẩn S. suis phát triển. 3.3.2.3. Kết quả kiểm tra vô trùng của Autovaccine chế tạo thử nghiệm Kết quả cho thấy các lô Autovaccine thử nghiệm được chế tạo đều đạt các tiêu chí về vô trùng ở tất cả các giai đoạn sau khi vô hoạt bằng formalin 0,3%, sau khi bổ sung keo phèn 20% và sau khi ra chai. 3.3.2.4. Kết quả kiểm tra an toàn của Autovaccine chế tạo thử nghiệm Kết quả cho thấy Autovaccine ở liều tiêm gấp 2 lần sau 21 ngày tất cả lợn thí nghiệm đều sống và không gây ra bất cứ phản ứng cục bộ hay toàn thân nào cho lợn. Lợn thí nghiệm đều khỏe mạnh, ăn uống bình thường, không có con nào có phản ứng cục bộ như viêm, sưng, đỏ tại vị trí tiêm hay có triệu chứng toàn thân như sốt, bỏ ăn... Như vậy, Autovaccine S. suis vô hoạt keo phèn đạt chỉ tiêu về an toàn theo quy định. 3.3.2.5. Kết quả kiểm tra hiệu lực của Autovaccine chế tạo thử nghiệm trên động vật thí nghiệm - Công cường độc với vi khuẩn S. suis serotype 2: Sau 21 ngày tiêm Autovaccine mũi thứ nhất thì tiến hành thử thách công cường độc vi khuẩn S. suis serotype 2 với liều 10LD50 (LD50 = 4,5 x 107 CFU) cho tất cả chuột thí nghiệm và đối chứng. Kết quả cho thấy cả ba lô Autovaccine đều có 10/10 chuột sống sau 10 ngày, đạt tỷ lệ 100% được bảo hộ. Trong khi đó ở lô đối chứng, chuột chết 100% sau khi công cường độc từ 18 - 24 giờ. - Công cường độc với vi khuẩn S. suis serotype 7: Sau 21 ngày tiêm Autovaccine mũi thứ nhất, tiến hành thử thách công cường độc với liều 10LD50 của vi khuẩn S. suis serotype 7 (LD50= 4,9 x 107 CFU) cho tất cả chuột thí nghiệm và đối chứng. Kết quả cho thấy sau 10 ngày 2 lô Autovaccine là lô I và II đều có 9/10 chuột sống, đạt tỷ lệ bảo hộ là 90%, ở lô III có 10/10 chuột sống đạt tỷ lệ bảo hộ 100%. Ở các lô đối chứng, chuột đều chết 100% trong thời gian 18 - 24 giờ. - Công cường độc với vi khuẩn S. suis serotype 9: Thí nghiệm được tiến hành giống như với serotype trên, sau 21 ngày tiêm Autovaccine mũi thứ nhất, tiến hành thử thách công cường độc với liều 10LD50 của vi khuẩn S. suis serotype 9 (LD50 = 4,8 x 107 CFU) cho tất cả chuột thí nghiệm và đối chứng. Kết quả cho thấy sau 10 ngày 2 lô Autovaccine thử nghiệm là lô I và III đều có 10/10 chuột sống, đạt tỷ lệ bảo hộ là 100%, còn ở lô II có 9/10 chuột sống đạt tỷ lệ bảo hộ 90%. Ở các lô đối chứng, chuột đều chết 100% trong thời gian 18 - 24 giờ. Như vậy, cả 3 lô Autovaccine chế tạo thử nghiệm đều đảm bảo vô trùng, an toàn và có hiệu lực trên chuột thí nghiệm. 3.3.3. Kết quả xác định đáp ứng miễn dịch của Autovaccine thử nghiệm phòng bệnh liên cầu khuẩn S. suis ở lợn 3.3.3.1. Kết quả xác định hiệu giá kháng thể trong huyết thanh lợn thí nghiệm sau tiêm Autovaccine 30 ngày Bảng 3.9: Kết quả xác định hiệu giá kháng thể của lợn thí nghiệm sau tiêm Autovaccine 30 ngày Kháng nguyên dùng kiểm tra Số lợn kiểm tra (con) Hiệu giá kháng thể 1/16 1/32 1/64 Số mẫu HT kiểm tra Số mẫu (+) Tỷ lệ (%) Số mẫu HT kiểm tra Số mẫu (+) Tỷ lệ (%) Số mẫu HT kiểm tra Số mẫu (+) Tỷ lệ (%) S. suis serotype 2 TN 35 35 35 100 35 27 77,1 35 8 22,8 ĐC 5 5 0 0 5 0 0 5 0 0 S. suis serotype 7 TN 35 35 35 100 35 26 74,2 35 6 17,1 ĐC 5 5 0 0 5 0 0 5 0 0 S. suis serotype 9 TN 35 35 35 100 45 27 77,1 35 7 20,0 ĐC 5 5 0 0 5 0 0 5 0 0 Ghi chú: HT: Huyết thanh; TN: Thí nghiệm; ĐC: Đối chứng Bảng 3.9 cho thấy tất cả lợn được tiêm Autovaccine sau 30 ngày đều có đáp ứng miễn dịch tốt với các kháng nguyên của 3 chủng vi khuẩn dùng chế tạo là S. suis serotype 2, 7 và 9. Trong đó, có 100% số mẫu huyết thanh lợn ngưng kết ở hiệu giá 1/16 và nhiều lợn có mẫu huyết thanh ngưng kết ở hiệu giá 1/32 và 1/64. Cụ thể: Với kháng nguyên serotype 2: Ở hiệu giá 1/16 có 100% lợn đạt hiệu giá kháng thể ngưng kết; ở hiệu giá 1/32 có 77,1% và ở hiệu giá 1/64 có 22,8%. Với kháng nguyên serotype 7: Ở hiệu giá 1/16 có 100% lợn kiểm tra đạt hiệu giá kháng thể ngưng kết; ở hiệu giá 1/32 có 74,2% và ở hiệu giá 1/64 có 17,1%. Với kháng nguyên serotype 9: Ở hiệu giá 1/16 có 100% lợn kiểm tra đạt hiệu giá kháng thể ngưng kết; ở hiệu giá 1/32 có 77,1% và ở hiệu giá 1/64 có 20,0%. 3.3.3.2. Kết quả xác định hiệu giá kháng thể trong huyết thanh lợn thí nghiệm sau tiêm Autovaccine 60 ngày Bảng 3.10: Kết quả xác định hiệu giá kháng thể của lợn thí nghiệm sau tiêm Autovaccine 60 ngày Kháng nguyên dùng kiểm tra Số lợn kiểm tra (con) Hiệu giá kháng thể 1/16 1/32 1/64 Số mẫu HT kiểm tra Số mẫu (+) Tỷ lệ (%) Số mẫu HT kiểm tra Số mẫu (+) Tỷ lệ (%) Số mẫu HT kiểm tra Số mẫu (+) Tỷ lệ (%) S. suis serotype 2 TN 35 35 35 100 35 32 91,4 35 12 34,2 ĐC 5 5 0 0 5 0 0 5 0 0 S. suis serotype 7 TN 35 35 35 100 35 30 85,7 35 9 25,7 ĐC 5 5 0 0 5 0 0 5 0 0 S. suis serotype 9 TN 35 35 35 100 35 31 88,5 35 10 28,5 ĐC 5 5 0 0 5 0 0 5 0 0 Ghi chú: HT: Huyết thanh; TN: Thí ng