Tóm tắt Luận án Nghiên cứu một số đặc tính của virus gây bệnh marek ở gà nuôi công nghiệp tại phía bắc Việt Nam và giải pháp nâng cao hiệu lực vắc xin phòng bệnh

ia cầm nói chung (trong điều kiện thực địa). 3.2. Ý nghĩa thực tiễn của đề tài - Kết quả phân lập và xác định đặc tính sinh học của chủng virus Marek lưu hành ở Việt Nam có thể là nguồn gene phục vụ nghiên cứu mức độ tương đồng của chủng vắc xin và chế tạo vắc xin nội địa phòng bệnh Marek trong tương lai. - Kết quả thử nghiệm xác định chất bổ trợ có tác dụng tăng cường hiệu lực của vắc xin có ý nghĩa trước mắt là có thể ứng dụng kết hợp với vắc xin sẵn có làm tăng hiệu quả phòng bệnh Marek, giảm thiệt hại do bệnh này gây ra và tăng thu nhập cho người chăn nuôi, góp phần thúc đẩy ngành chăn nuôi gia cầm phát triển; kế đó có thể tiếp tục nghiên cứu lựa chọn chất tăng cường đáp ứng miễn dịch hiệu quả nhất, nâng cao hiệu quả của giải pháp phòng bệnh Marek. - Thông tin và tài liệu của đề tài có thể hỗ trợ nguồn thông tin giúp người chăn nuôi và cán bộ thú y, các nhà quản lý và đào tạo cập nhật về bệnh Marek ở gà trong giai đoạn hiện nay ở Việt Nam nhằm hoạch định và thực hiện tốt hơn các biện pháp phòng chống bệnh với hiệu quả cao. 4. Những đóng góp mới của đề tài - Chủng virus MDV 6.13 là chủng virus gây bệnh Marek lần đầu tiên được phân lập và xác định đặc tính gene học, độc lực, gây bệnh cho gà ở Việt Nam. - Lần đầu tiên chúng tôi đánh giá hiệu quả bảo hộ thực tế của một loại vắc xin đa giá nhập ngoại bằng chủng virus phân lập tại Việt Nam. - Bước đầu khám phá khả năng sử dụng các chất bổ trợ tăng cường miễn dịch để nâng cao hiệu quả bảo hộ của vắc xin thương mại, xác định được chất phối hợp nâng cao hiệu quả sử dụng vắc xin phòng bệnh Marek trên gà tại Việt Nam. 5. Bố cục của luận án Luận án gồm 102 trang (không kể phần tài liệu tham khảo và phụ lục). Phần mở đầu 3 trang, tổng quan tài liệu 26 trang, nội dung và phương pháp nghiên cứu 11 trang, kết quả nghiên cứu và thảo luận 60 trang, kết luận và đề nghị 2 trang. Luận án có 21 bảng thể hiện kết quả nghiên cứu, 35 hình ảnh và biểu đồ, 131 tài liệu tham khảo (trong đó có 11 tài liệu tiếng việt và 120 tài liệu tiếng nước ngoài). Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU Chương 2 NỘI DUNG, ĐỐI TƯỢNG, NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Nội dung nghiên cứu 2.1.1. Phân lập virus gây bệnh Marek ở gà nuôi công nghiệp tại một số tỉnh phía Bắc Việt Nam 2.1.2. Nghiên cứu xác định độc lực và kết quả gây bệnh thực nghiệm của virus phân lập được trên các giống và lứa tuổi gà 2.1.3. Nghiên cứu các đặc trưng gây bệnh lý của virus phân lập được đối với gà thí nghiệm 2.1.4. Nghiên cứu thử nghiệm phối hợp chất bổ trợ tăng cường miễn dịch với vắc xin để tăng cường hiệu quả của vắc xin phòng bệnh Marek 2.2. Đối tượng, nguyên liệu nghiên cứu 2.2.1. Đối tượng nghiên cứu - Virus gây bệnh Marek phân lập được ở mẫu bệnh phẩm của gà nuôi công nghiệp nghi mắc bệnh Marek tại một số địa phương phía Bắc Việt Nam. - Đáp ứng miễn dịch ở gà nuôi công nghiệp sau khi được tiêm phòng bằng vắc xin Marek kết hợp với các chất bổ trợ tăng cường miễn dịch. 2.2.2. Nguyên vật liệu - Trứng gà sạch được mua từ Công ty Vắc xin và Sinh phẩm số I được ấp nở trong điều kiện sạch bệnh. Gà sau khi nở 1 ngày tuổi được sử dụng trong các thí nghiệm của nghiên cứu. - Bệnh phẩm được lấy từ gà có biểu hiện mắc bệnh Marek ở thành phố Hà Nội, tỉnh Vĩnh Phúc và Phú Thọ. - Vắc xin đa giá MD - Vac CFL chủng Rispens và HVT do hãng Zoetis Inc của Mỹ sản xuất, được nhập khẩu bởi công ty TNHH TM & DP Sang, thành phố Hồ Chí Minh. - Các chất tăng cường miễn dịch CPG ODN, Poly I:C, Interferon - g là các chất sinh tổng hợp nhập ngoại được sử dụng trong thí nghiệm. 2.2.3. Môi trường, hóa chất, thiết bị dùng trong nghiên cứu - Các Kit ELISA (ELISA Kit, code: Catalog No. CSB - E10071Ch, Flarebio Biotech LLC). - Real - time PCR kit (Cat No./ID: 218073, Qiagen). - Các loại môi trường Thông dụng dùng trong nghiên cứu - Thiết bị và dụng cụ thí nghiệm: Các máy móc dụng cụ thí nghiệm thông dụng; máy ly tâm, tủ cấy tế bào, máy chạy phản ứng PCR, máy đọc kết quả ELISA, nồi hấp tiệt trùng, kính hiển vi điện tử, tủ lạnh có tại phòng thí nghiệm trường Đại học Nông lâm Thái Nguyên và khoa Công nghệ sinh học Viện Đại học Mở Hà Nội. 2.3. Địa điểm và thời gian nghiên cứu 2.3.1. Địa điểm nghiên cứu Trường Đại học Nông lâm Thái Nguyên, Khoa Công nghệ sinh học - Viện Đại học Mở Hà Nội. 3.3.2. Thời gian nghiên cứu Từ tháng 1/2013 - 7/2016. 2.4. Phương pháp nghiên cứu 2.4.1. Phương pháp thu thập và xử lý mẫu Các mẫu máu chống đông, lách, thận, gan, lông vũ được thu từ gà khoảng 60 - 100 ngày tuổi có biểu hiện điển hình của bệnh Marek được thu từ các trại gà nuôi tại các tỉnh Vĩnh Phúc, Phú Thọ và thành phố Hà Nội. Các đàn gà này đã được sử dụng vắc xin lúc 1 ngày tuổi. Các mẫu sau khi lấy được cho vào ống nghiệm và túi nylon vô trùng bảo quản lạnh và nhanh chóng đưa về phòng thí nghiệm. 2.4.2. Các phương pháp nghiên cứu và bố trí thí nghiệm - Phân lập virus Marek bằng phương pháp nuôi cấy trên tế bào sơ phôi vịt. - Phương pháp tiêm truyền qua phôi trứng để xác định độc lực của virus gây bệnh Marek. - Phản ứng PCR xác định gen Meq gây hình thành khối u của virus gây bệnh Marek. - Phương pháp giải trình tự gen bằng máy giải trình tự gen tự động: Gen Meq trên gel được tinh sạch và xác định trình tự bằng máy giải trình tự gen tự động ABI 3100. - Xác định mức độ hình thành các Cytokine bằng phương pháp ELISA phát hiện các hiệu giá của IFN - α, IFN - β, IFN - g, IL - 12, IL - 4, IL - 10. - Phản ứng trung hòa invitro để theo dõi mức độ hình thành kháng thể trung hòa. - Bố trí thí nghiệm xác định khả năng gây bệnh và mức độ gây bệnh tích của MDV trên các giống gà và các độ tuổi gà. - Bố trí thí nghiệm đánh giá ảnh hưởng của các chất tăng cường miễn dịch đến hiệu lực của vắc xin phòng bệnh Marek. 2.4.3. Phương pháp xử lý số liệu Số liệu thu được trong các thí nghiệm được xử lý theo phương pháp toán học thông dụng và phương pháp thống kê sinh vật học (Nguyễn Văn Thiện 2008), với sự hỗ trợ của phần mềm Excel 2013. Chương 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Kết quả phân lập MDV 3.1.1. Kết quả mổ khám gà nghi mắc bệnh Marek ở một số địa phương Bảng 3.1. Kết quả mổ khám gà nghi mắc bệnh Marek ở một số địa phương Địa phương lấy mẫu Số mẫu thu thập Số gà có khối u ở các tổ chức Tỷ lệ (%) Vĩnh Phúc 47 41 87,23 Hà Nội 51 38 74,51 Phú Thọ 28 11 39,29 Tính chung 126 90 71,43 Kết quả bảng 3.1 cho thấy tỷ lệ gà có khối u ở các tổ chức bên trong cơ thể là 71,43%, dao động tùy địa phương thu thập mẫu. Những đàn gà này đã được sử dụng vắc xin phòng bệnh Marek Sự khác nhau về tỷ lệ gà có bệnh tích (cùng có triệu chứng bệnh Marek) phản ánh sự biến động về tình trạng sức khỏe của đàn tại thời điểm nhiễm bệnh hơn là đánh giá hiệu quả vắc xin. Mặt khác, cũng có thể do các chủng virus gây bệnh có độc lực khác nhau. 3.1.2. Phản ứng PCR xác định gen đặc hiệu của virus Marek Hình 3.2. Hình ảnh điện di sản phẩm PCR phát hiện gen Meq (M: thang chuẩn; 1 - 8: các mẫu có sản phẩm PCR có gen Meq; 9 - 12: sản phẩm PCR không có gen Meq) Phản ứng PCR đã phát hiện được 8 mẫu lách có gen Meq, điều đó có nghĩa là có 8/126 cá thể gà nhiễm bệnh Marek (6,34%). Điều đáng lưu ý là các tỉnh Vĩnh Phúc, Hà Nội, Phú Thọ có quy mô chăn nuôi gà công nghiệp lớn và các trang trại lấy mẫu đều thực hiện phòng ngừa bệnh Marek bằng vắc xin đúng theo quy trình. Như vậy, hiện tượng gà nhiễm bệnh sau khi đã sử dụng vắc xin là vấn đề cần được đánh giá, xem xét về các khía cạnh, bao gồm: sự biến chủng của virus, sự thay đổi độc lực của chủng gây bệnh, sự suy giảm hiệu lực của vắc xin. 3.1.3. Nuôi cấy phân lập virus Marek Mẫu lách và lông vũ của 8 cá thể gà có bệnh tích điển hình và có gen mã hóa kháng nguyên đặc hiệu của MDV được tiến hành nuôi cấy trên đĩa tế bào xơ phôi vịt một lớp. Kết quả đã phân lập được 01 chủng virus phát triển ổn định đến đời tiếp truyền thứ 3, hiệu ứng hủy hoại tế bào (Cytopathic Effect - CPE) xuất hiện ổn định sau 5 ngày nuôi cấy ở điều kiện 37°C, 5% CO2. Chủng virus này ký hiệu là MDV 6.13 được giữ trong tế bào xơ phôi vịt và bảo quản ở - 196°C trong dung dịch 10% dimethyl sulphoxide. 3.1.4. Kết quả xác định trình tự gen Meq Tham khảo nghiên cứu của Laurent et al (2001) [79], bằng cặp mồi Meq đã khuếch đại được đoạn gen có kích thước khoảng 1081 bp. Kết quả thu được ở hình 3.5 cho thấy một sản phẩm PCR với duy nhất một băng ADN sáng, rõ nét và không có sản phẩm phụ. Kích thước này phù hợp theo tính toán lý thuyết và tương ứng với kích thước của đoạn mã hoá của gen Meq của virus gây bệnh Marek ở gà. Tuy nhiên, để khẳng định chính xác sản phẩm thu được là gen Meq chúng tôi đã tiến hành tách dòng, xác định trình tự nucleotide và so sánh với trình tự gen này trên Gene bank. Hình 3.6. Kết quả tách plasmid từ khuẩn lạc trắng Vạch điện di tương ứng với kích thước của gen Meq được tinh sạch và xác định trình tự bằng máy giải trình tự gen tự động ABI 3100. Sử dụng phần mềm Blast để xác định mức độ tương đồng của trình tự gen Meq thu được với các trình tự của GenBank. Kết quả cho thấy trình tự gen Meq của chủng MDV 6.13 tương đồng 95% với trình tự gen Meq của Gallid herpesvirus. Với mức độ tương đồng thấp như vậy chứng tỏ MDV đã có sự biến chủng có độc lực cao và có khả năng gây bệnh cả khi gà đã được tiêm vắc xin phòng bệnh. 3.2. Khả năng gây bệnh của MDV phân lập 3.2.1. Khả năng gây bệnh của MDV phân lập trên các giống gà thí nghiệm Bảng 3.2. Mức độ gây bệnh của chủng MDV phân lập trên các giống gà thí nghiệm Giống gà Số gà có biểu hiện bệnh Marek (n) Tỷ lệ có biểu hiện bệnh Marek (%) Triệu chứng của gà mắc bệnh Tỷ lệ các triệu chứng bệnh Marek Số gà chết do bệnh Marek (n) Tỷ lệ chết do bệnh Marek (%) Gà Ri (n=120) 85 70,83 Gầy ốm, mào tái 70,83 40 33,33 Đi loạng choạng 54,17 Liệt, sệ cánh 39,17 Liệt chân 9,17 Viêm mống mắt, mù 0,83 Gà Lương Phượng (n=120) 102 85 Gầy ốm, mào tái 85 52 43,33 Đi loạng choạng 56,67 Liệt, sệ cánh 40 Liệt chân 15,83 Viêm mống mắt, mù 1,67 Gà Ross 308 (n=120) 107 89,17 Gầy ốm, mào tái 89,17 69 57,5 Đi loạng choạng 60 Liệt, sệ cánh 45,83 Liệt chân 33,33 Viêm mống mắt, mù 4,17 Đối chứng (n=40) 0 0 Gầy ốm, mào tái 0 0 0 Đi loạng choạng 0 Liệt, sệ cánh 0 Liệt chân 0 Viêm mống mắt, mù 0 Kết quả thí nghiệm ở bảng 3.2 cho thấy, chủng MDV 6.13 có độc cao, với liều gây nhiễm là 2000 PFU/con sau ba tháng theo dõi, gà đã mắc bệnh với các triệu chứng điển hình với tỷ lệ là 70,83%, 85% và 89,17% cho ba giống gà tương ứng là gà Ri, Lương Phượng, Ross 308. 3.2.2. Khả năng gây bệnh của MDV phân lập trên các giống gà thí nghiệm ở các độ tuổi khác nhau Kết quả ở bảng 3.4 cho thấy, tỷ lệ mắc bệnh của gà thí nghiệm ở các độ tuổi có sự sai khác rõ rệt giữa gà 1 ngày tuổi, 1 tuần tuổi, 1 tháng tuổi và 3 tháng tuổi. Cụ thể: Ở gà Ri tỷ lệ gà có biểu hiện mắc bệnh tương ứng là 100%; 90%; 66,67% và 26,67%. Tỷ lệ chết là 53,33%; 43,33%; 33,33% và 3,33%. Ở gà Lương Phượng tỷ lệ gà có biểu hiện mắc bệnh tương ứng là 100%; 100%; 83,33% và 56,67%. Tỷ lệ chết tương ứng là 73,33%; 50%; 43,33% và 6,67%. Ở gà Ross 308 tỷ lệ gà có biểu hiện mắc bệnh tương ứng là 100%; 100%; 96,67% và 60%. Tỷ lệ chết tương ứng là 86,67%; 63,33%; 53,33và 26,67%. Kết quả này cho thấy tỷ lệ gà mắc bệnh và gà chết giảm dần theo sự tăng lên ngày tuổi của gà. Mặt khác, các giống gà nhập ngoại mẫn cảm với virus gây bệnh Marek hơn so với gà nội địa ở tất cả các độ tuổi. Bảng 3.4. Mức độ gây bệnh của chủng MDV phân lập được trên các giống gà ở các độ tuổi khác nhau Giống gà Gà ri Gà Lương Phượng Gà Ross 308 Ngày buổi Số gà có biểu hiện bệnh Marek (n) tỷ lệ có biểu hiện bệnh Marek (%) Triệu chứng của gà mắc bệnh Tỷ lệ các triệu chứng bệnh Marek (%) Số gà chết do bệnh Marek (n) Tỷ lệ chết do bệnh Marek (%) Số gà có biểu hiện bệnh Marek (n) tỷ lệ có biểu hiện bệnh Marek (%) Triệu chứng của gà mắc bệnh Tỷ lệ các triệu chứng bệnh Marek (%) Số gà chết do bệnh Marek (n) Tỷ lệ chết do bệnh Marek (%) Số gà có biểu hiện bệnh Marek (n) tỷ lệ có biểu hiện bệnh Marek (%) Triệu chứng của gà mắc bệnh Tỷ lệ các triệu chứng bệnh Marek (%) Số gà chết do bệnh Marek (n) Tỷ lệ chết do bệnh Marek (%) Một ngày tuổi (n=30) 30 100,00 Gầy ốm mào tái 100,00 30 100 Gầy ốm mào tái 100,00 22 73,33 30 100 Gầy ốm mào tái 100,00 26 86,67 Đi loạng choạng 100,00 Đi loạng choạng 100,00 Đi loạng choạng 100,00 Liệt, sê cánh 73,33 16 53,33 Liệt, sê cánh 76,67 Liệt, sê cánh 83,33 Liệt chân 20,00 Liệt chân 26,67 Liệt chân 53,33 Viêm mống mắt, mù 3,33 Viêm mống mắt, mù 6,67 Viêm mống mắt, mù 13,33 Một tuần tuổi (n=30) 27 90,00 Gầy ốm mào tái 90,00 30 100 Gầy ốm mào tái 90,00 15 50 30 100 Gầy ốm mào tái 96,67 19 63,33 Đi loạng choạng 76,67 Đi loạng choạng 83,33 Đi loạng choạng 90,00 Liệt, sê cánh 43,33 13 43,33 Liệt, sê cánh 50,00 Liệt, sê cánh 53,33 Liệt chân 10,00 Liệt chân 16,67 Liệt chân 36,67 Viêm mống mắt, mù - Viêm mống mắt, mù - Viêm mống mắt, mù 3,33 Một tháng tuổi (n=30) 20 66,67 Gầy ốm mào tái 66,67 25 83,33 Gầy ốm mào tái 66,67 13 43,33 29 96,67 Gầy ốm mào tái 76,67 16 53,33 Đi loạng choạng 26,67 Đi loạng choạng 30,00 Đi loạng choạng 33,33 Liệt, sê cánh 26,67 10 33,33 Liệt, sê cánh 26,67 Liệt, sê cánh 33,33 Liệt chân 3,33 Liệt chân 13,33 Liệt chân 30,00 Viêm mống mắt, mù - Viêm mống mắt, mù - Viêm mống mắt, mù - 3 tháng tuổi (n=30) 8 26,67 Gầy ốm mào tái 26,67 17 56,67 Gầy ốm mào tái 83,33 2 6,67 18 60 Gầy ốm mào tái 83,33 8 26,67 Đi loạng choạng 13,33 Đi loạng choạng 13,33 Đi loạng choạng 16,67 Liệt, sê cánh 13,33 1 3,33 Liệt, sê cánh 6,67 Liệt, sê cánh 13,33 Liệt chân 3,33 Liệt chân 6,67 Liệt chân 13,33 Viêm mống mắt, mù Viêm mống mắt, mù Viêm mống mắt, mù - 3.3. Biểu hiện bệnh tích của gà thí nghiệm do chủng MDV phân lập gây nên 3.3.1. Biểu hiện bệnh tích đại thể ở các tổ chức của gà thí nghiệm Trong nghiên cứu này, biểu hiện bệnh tích do chủng MDV6.13 gây cho gà thí nghiệm được phát hiện dựa trên sự xuất hiện các khối u và hiện tượng viêm, sưng dây thần kinh. Kết quả thu được thể hiện trong bảng 3.6. Bảng 3.6. Biểu hiện bệnh tích do MDV gây cho gà thí nghiệm Giống gà Số gà có bệnh tích điển hình (n) Tỷ lệ gà có bệnh tích điển hình (%) Cơ quan có bệnh tích Tần suất xuất hiện bệnh tích (%) Gà Ri (n=120) 92 76,67 Gan 76,67 Lách 72,50 Thận 42,50 Tim 14,17 Dạ dày tuyến 12,50 Thần kinh 9,17 Gà Lương Phượng (n=120) 109 90,83 Gan 90,83 Lách 85,00 Thận 66,67 Tim 25,83 Dạ dày tuyến 27,50 Thần kinh 32,50 Gà Ross 308 (n=120) 118 98,33 Gan 98,33 Lách 84,17 Thận 80,83 Tim 35,00 Dạ dày tuyến 30,83 Thần kinh 45,83 Đối chứng (n=40) 0 0 Gan - Lách - Thận - Tim - Dạ dày tuyến - Thần kinh - Tỷ lệ gà có biểu hiện bệnh tích chiếm tới 76,67%, 90,83% và 98,33% tương ứng với các lô gà Ri, Lương Phượng và Ross 308. Mặt khác, trong cùng một giống gà thì những biến đổi ở gan trong các trường hợp mổ khám chiếm tỷ lệ cao nhất, chiếm tới 76,67%, 90,83% và 98,33% tương ứng với các lô gà Ri, Lương Phượng và Ross 308 (Hình 3.13). Hình 3.13. Hình ảnh bệnh tích ở các tổ chức của gà gây nhiễm với chủng MDV 6.13 (A. Dây thần kinh đùi sưng to; B. Dây thàn kinh xương chậu sưng to; D. Lách sưng to, có u kết hạt; E F.Gan sưng to, có u kết hạt, u lan tỏa; G; Ống dẫn trứng sưng to, u lan tỏa) 3.3.2. Biểu hiện bệnh tích vi thể ở các tổ chức của gà thí nghiệm Trong nghiên cứu này, mẫu tổ chức vi thể của các mô gan, thận, lách, tim, dạ dày tuyến, dây thần kinh được sử dụng để theo dõi những biến đổi sau khi gà được gây nhiễm với chủng MDV 6.13. Kết quả trình bày trong bảng 3.7. Bảng 3.7. Tần suất xuất hiện các tổn thương vi thể trong các tổ chức của gà thí nghiệm (Đơn vị tính: %) Loài gà Gan Lách Thận Tim Dạ dày tuyến Thần kinh đùi Gà ri 93,33 86,67 33,33 20,00 20,00 26,67 Gà Lương Phượng 93,33 93,33 53,33 33,33 40,00 46,67 Bà Ross 308 100,00 100,00 53,33 40,00 53,33 53,33 Kết quả ở bảng 3.7 cho thấy: các tế bào lympho xâm nhiễm mạnh nhất ở hai cơ quan gan và lách, tỷ lệ xuất hiện ở gan là 93,33%, 93,33% và 100%; ở lách là 86,67%, 93,33% và 100% tương ứng với các giống gà Ri, Lương Phượng, Ross 308. Theo dõi từng giống gà chúng tôi nhận thấy 100% gà Ross 308 đều có biểu hiện xâm nhiễm lympho trong gan và lách, điều này chứng tỏ giống gà này mẫn cảm với virus gây bệnh Marek hơn hai giống gà còn lại. Hình 3.25. Các biến đổi bệnh tích vi thể trong các tổ chức ở gà thí nghiệm: Gan (A), lách (B), thận (C), dây thần kinh (D) 3.3.3. Kết quả xác định khả năng gây bệnh trên phôi gà của MDV phân lập Thí nghiệm trên phôi gà 11 ngày tuổi cho thấy, 100% phôi bị gây nhiễm với MDV 6.13 bị chết sau 24 - 72 giờ gây nhiễm (Bảng 3.8). Bên cạnh sự xuất hiện các nốt u màu trắng điển hình của MDV, các phôi đều có biểu hiện xuất huyết trên toàn thân. Bảng 3.8. Biểu hiện bệnh tích do MDV trên phôi gà 11 ngày tuổi Thí nghiệm Tỷ lệ phôi chết có bệnh tích (%) Thời gian bắt đầu gây chết phôi (gi ờ) Thời gian phôi chết hoàn toàn (gi ờ) Trung bình số nốt u trên màng CAM MDV 6.13 (1000PFU/ml) (n=10) 100 24 giờ 72h 24,88 ± 1,27 Đối chứng âm (n=5) 0 (*) 0 Hình 3.22. Bệnh tích trên màng CAM phôi gà 14 tuổi do MDV gây nên (A: Màng CAM bình thường, B: Màng CAM với các nốt u trắng do MDV gây nên) 3.4. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của các yếu tố tăng cường miễn dịch đến hiệu quả bảo hộ của vắc xin phòng bệnh Marek Sau 3 tháng theo dõi các lô gà thí nghiệm với các công thức kết hợp tiêm vắc xin với các chất tăng cường miễn dịch, bao gồm: IFN, poly I:C, CpG ODN ở 1 ngày tuổi và sau đó gà được công cường độc với chủng MDV 6.13 với liều 2000 PFU/con ở 21 ngày tuổi chúng tôi đã thu được các kết quả về ảnh hưởng của các yếu tố tăng cường miễn dịch đến hiệu quả bảo hộ của vắc xin phòng bệnh Marek trong bảng 3.10. Bảng 3.10. Ảnh hưởng các yếu tố tăng cường miễn dịch đến hiệu quả bảo hộ của vắc xin phòng bệnh Marek Bố trí thí nghiệm Tỷ lệ gà chết sau khi công cường độc (%) Tỷ lệ gà có biểu hiện lâm sàng sau khi công cường độc (%) Gà Ri Gà lương phượng Gà Ross 308 Gà Ri Gà lương phượng Gà Ross 308 HVT/Rispens + IFN 500 UI/con 3,33 3,33 16,67 3,33 3,33 20,00 HVT/Rispens + poly I:C 400 µg/con 3,33 6,67 16,67 3,33 10,00 20,00 HVT/Rispens + CpG OND 10 µg/con 0,00 3,33 6,67 0,00 3,33 6,67 HVT/Rispens + poly I:C 200 µg/con+CpG OND 5 µg/con 0,00 3,33 10,00 0,00 3,33 10,00 Vắc xin đa giá HVT/Rispens 10,00 30,00 40,00 20,00 40,00 50,00 Không sử dụng vắc xin 70,00 80,00 80,00 100,00 100,00 100,00 Qua bảng 3.10 cho thấy các lô gà có sử dụng phối hợp các chất tăng cường miễn dịch có tỷ lệ gà được bảo hộ cao hơn so với lô gà chỉ tiêm vắc-xin, làm giảm tỷ lệ chết và tỷ lệ có biểu hiện lâm sàng. Nhìn chung các chất này đều có khả năng làm tăng hiệu quả bảo hộ của vắc xin đối với virus Marek có độc lực cao. Trong đó, vắc xin kết hợp với CpG ODN giúp lô gà Ri không có con gà nào có biểu hiện lâm sàng và cũng không có con nào bị chết; tỷ lệ này tương ứng là 3,33% và 3,33% ở gà Lương Phượng; 6,67% và 6,67% ở gà Ross 308. 3.4.1. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của các yếu tố tăng cường miễn dịch sự hình thành đáp ứng miễn dịch của gà thí nghiệm với vắc xin phòng bệnh Marek 3.4.1.1. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của các yếu tố tăng cường miễn dịch sự hình thành kháng thể bảo hộ của vắc xin phòng bệnh Marek Qua bảng 3.11 cho thấy, ở các lô gà được tiêm vắc xin bổ sung CpG ODN và phức hợp poly I:C - CpG ODN cho hiệu giá kháng thể trung hòa cao nhất trong ở tháng thứ hai của cả ba giống gà, đạt 1280, ngưỡng hiệu giá này tiếp tục duy trì đến tháng thứ 3 đối với gà Lương Phượng và Ross 308. Bảng 3.11. Ảnh hưởng của các yếu tố tăng cường miễn dịch đến sự hình thành kháng thể bảo hộ của vắc xin phòng bệnh Marek Công thức thí nghiệm Gà Ri Gà Lương Phượng Gà Ross 308 Tháng thứ nhất Tháng thứ hai Tháng thứ ba Tháng thứ nhất Tháng thứ hai Tháng thứ ba Tháng thứ nhất Tháng thứ hai Tháng thứ ba HVT/Rispens + IFN - ϒ 500 UI/con 640 320 320 640 640 320 640 320 320 HVT/Rispens + poly I:C 400 µg/con 320 640 320 640 640 640 640 640 640 HVT/Rispens + CpG OND 10 µg/con 640 1280 640 640 1280 640 1280 1280 640 HVT/Rispens + poly I:C 200 µg/con +CpG OND 5 µg/con 640 1280 640 640 1280 1280 640 1280 1280 Vắc xin đa giá HVT/Rispens 230 320 320 320 640 320 640 320 320 Không sử dụng vắc xin 0 0 - 0 0 - 0 0 - 3.4.2. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của các yếu tố tăng cường miễn dịch đến sự hình thành khối u trong các tổ chức của gà thí nghiệm công cường độc Sau 3 tháng theo dõi thí nghiệm, toàn bộ gà thí nghiệm được mổ khám để xác định tần suất hình thành khối u. Kết quả thí nghiệm được trình bày trong hình bảng 3.18. Bảng 3.18. Ảnh hưởng của các yếu tố tăng cường miễn dịch đến sự hình thành khối u ở gà sau công cường độc (Tỷ lệ % gà có khối u) Giống gà thí nghiệm Vắc xin đa giá HVT/Rispens HVT/Rispens + IFN - ϒ 500 UI/con HVT/Rispens + poly I:C 400 µg/con HVT/Rispens + CpG ODN 10 µg/con HVT/Rispens + poly I:C 200 µg/con + CpG ODN 5 µg/con Đối chứng không tiêm vắc xin Gà Ri 26,67 20,00 20,00 13,33 13,33 73,33 Gà Lương Phượng 30,00 20,00 20,00 13,33 16,67 86,67 Gà Ross 308 36,67 23,33 23,33 16,67 16,67 96,67 Qua bảng 3.18 chúng tôi nhận thấy: Ở gà được tiêm vắc xin kết hợp chất bổ trợ đã giúp giảm mạnh tỷ lệ gà có bệnh tích hình thành khối u sau khi công cường độc với chủng MDV 6.13, cụ thể: - Các lô gà sử dụng bổ sung IFN - γ 500 UI/con và poly I:C 400 µg/con có mức độ giảm tần suất xuất hiện khối u tương đương nhau, cụ thể: ở 3 giống gà Ri, Lương Phượng, Ross 308 là: 20%, 20% và 23,33%; - Các lô gà sử dụng bổ sung CpG ODN 10 µg/con riêng lẻ hoặc kết hợp với poly I:C 400 µg/con cho mức độ giảm tần suất xuất hiện khối u tương đương nhau: ở 3 giống gà Ri, Lương Phượng, Ross 308 là: 13,33% và 16,67%. Như vậy, CpG ODN có hiệu quả hỗ trợ vắc xin ức chế sự hình thành khối u tốt hơn so với poly I:C và IFN. Kết quả này hoàn toàn logic với các nghiên cứu của các nội dung trước về mức độ bảo hộ, hiệu giá kháng thể trung hòa và mức độ tổng hợp các Cytokine liên quan đến đáp ứng miễn dịch tự nhiên chống lại MDV. 3.4.3. Tỷ lệ giảm số bản copy của gen Meq trong cơ quan có chức năng miễn dịch của gà thí nghiệm công cường độc sau khi sử dụng vắc xin và các chất tăng cường miễn dịch * Tỷ lệ giảm số bản copy của gen Meq trong túi Fabricius Trong thí nghiệm này cho thấy, ở túi Fabricius, mức độ giảm các bản copy của gen Meq cũng phụ thuộc vào việc có hay không sử dụng chất tăng cường miễn dịch cũng như sử dụng bổ sung loại nào, kết quả thí nghiệm được thể hiện ở bảng 3.20. Bảng 3.20. Mức độ giảm các bản copy của gen Meq trong túi Fabricius Tháng theo dõi Giống gà Vắc xin đa giá HVT/Rispens HVT/Rispens + IFN - ϒ 500UI/con HVT/Rispens + poly I:C 400 µg/con HVT/Rispens + CpG ODN 10 µg/con HVT/Rispens + poly I:C 200 µg/con + CpG ODN 5 µg/con Đối chứng âm Số bản copy Số lần giảm Số bản copy Số lần giảm Số bản copy Số lần giảm Số bản copy Số lần giảm Số bản copy Số lần giảm Tháng thứ nhất Gà Ri 18.267.016 69,95 15.978.214 79,97 13.941.929 91,65 12.836.827 99,54 12.854.907 99,40 1.277.777.778 Gà Lương Phượng 24.174.603 54,18 17.569.148 74,55 15.369.397 85,22 13.183.493 99,35 13.341.958 98,17 1.309.780.000 Gà Ross 308 21.747.766 50,35 14.967.195 73,16 13.309.833 82,27 11.038.306 99,20 11.493.650 95,27 1.095.000.000 Tháng thứ hai Gà Ri 24.912.535 83,93 23.417.058 89,29 21.885.169 95,54 20.961.495 99,75 21.193.078 98,66 2.090.909.091 Gà Lương Phượng 14.788.003 71,30 13.529.894 77,93 11.381.527 92,64 10.586.191 99,60 10.814.201 97,50 1.054.384.615 Gà Ross 308 12.939.408 64,11 12.059.100 68,79 9.515.318 87,18 8.343.849 99,42 8.589.205 96,58 829.545.455 Tháng thứ ba Gà Ri 17.527.816 87,48 17.040.824 89,98 15.886.172 96,52 15.362.522 99,81 15.494.476 98,96 1.533.333.333 Gà Lương Phượng 9.874.222 77,12 9.789.176 77,79 8.089.876 94,13 7.639.446 99,68 8.147.871 93,46 761.500.000 Gà Ross 308 9.474.334 64,93 8.851.346 69,50 7.032.909 87,47 6.433.471 95,62 6.922.117 88,87 615.168.539 Từ kết quả ở bảng 3.20 cho thấy, ở các lô gà chỉ sử dụng vắc xin, tỷ lệ giảm số bản copy của gen Meq trong túi Fabricius trong 3 tháng thí nghiệm ở gà Ri là 69,95%, 83,93%, 87,48%; gà Lương Phượng là: 54,18%, 71,30%, 77,12%; gà Ross 308 là 50,35%, 64,11%, 64,93%. Các lô gà sử dụng kết hợp vắc xin và CpG ODN 5 µg/con cho tỷ lệ giảm trong ba tháng theo dõi số bản copy gen Meq trong túi Fabricius đạt cao nhất, cụ thể: ở các lô gà Ri đạt 99,54 - 99,81%, gà Lương Phượng đạt 99,35 - 99,68% và gà Ross 308 đạt 99,2 - 99,42%. Các lô gà sử dụng bổ sung IFN - γ 500 UI/con không làm giảm số bản copy ở túi Fabricius của g