Tóm tắt Luận án Nghiên cứu phân lập, chuyển hóa và đánh giá tác dụng sinh học của steroid từ loài sao biển acanthaster planci

ác khối u hình thành được đo bằng kính hiển vi và phần mềm ảnh theo phương pháp của Colburn. Thực hiện tại PIBOC – Viện Hàn lâm Khoa học LB Nga. 2.2.3.3. Phương pháp thử nghiệm hoạt tính ức chế sự di căn của tế bào ung thư biểu mô tuyến vú bằng xét nghiệm chữa lành vết thương (wound-healing assay) Các chất thử nghiệm (10 μM) được đưa vào môi trường đã được tạo một vết thương trên khối tế bào ung thư biểu mô tuyến vú MDA-MB-231 đã phát triển và để trong 48 giờ. Độ đóng vùng tổn thương được đo và xác định phần trăm khoảng cách di chuyển của tế bào. Thực hiện tại PIBOC – Viện Hàn lâm Khoa học LB Nga. CHƯƠNG 3. THỰC NGHIỆM 3.1. Phân lập các hợp chất từ loài sao biển Acanthaster planci Phần này trình bày cách thức phân lập các hợp chất từ mẫu sao biển A. planci. Việc phân tách các hợp chất được nêu tóm tắt trong sơ đồ hình 3.1. Hình 3.1. Sơ đồ phân lập các hợp chất từ sao biển A.planci 5 3.2. Hằng số vật lý và dữ kiện phổ của các hợp chất phân lập được 3.3. Tổng hợp các dẫn xuất của cholesterol Hợp chất AP7 được xác định là cholesterol, được lựa chọn là chất đầu để chuyển hóa thành các dẫn xuất polyhydroxysteroid và hydroximinosteroid. 3.3.1. Tổng hợp các dẫn xuất polyhydroxyl của cholesterol 3.3.2. Tổng hợp các dẫn xuất hydroximinosteroid từ cholesterol 3.4. Hoạt tính sinh học của các chất phân lập và các dẫn xuất tổng hợp được 3.4.1. Hoạt tính sinh học của các hợp chất steroid phân cực phân lập từ sao biển Acanthaster planci 3.4.2. Hoạt tính gây độc tế bào của các dẫn xuất tổng hợp từ cholesterol Các hydroxysteroid (15c-21c), hydroximinosteroid (23c, 25c, 29c, 31c) và các chất trung gian (22c, 24c, 26c-28c, 30c) được đánh giá hoạt tính gây độc tế bào trên ba dòng tế bào Hep G2, HeLa và T98G. CHƯƠNG 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Chương này trình bày các kết quả nghiên cứu phân lập, chuyển hóa và xác định cấu trúc của các hợp chất, kết quả hoạt tính sinh học của các hợp chất được thử nghiệm. 4.1. Nghiên cứu thành phần hóa học loài sao biển Acanthaster planci Phần này trình bày chi tiết kết quả phân tích phổ và xác định cấu trúc hóa học của 14 hợp chất phân lập từ loài sao biển A.planci. Trong đó có 4 hợp chất mới và 8 hợp chất đã biết. Bảng 4.21: Bảng tổng hợp các chất phân lập từ sao biển A. planci AP1. Planciside A (chất mới) AP2. Planciside B (chất mới) 6 AP3. Planciside C (chất mới) AP4. Planciside D AP5. 3-O-sulfothornasterol A AP6. 5-ergost-7-en-3-ol AP7. Cholesterol AP8. Astaxanthin AP9. Thymin AP10. Uracil AP11. Acanthasglycoside G (chất mới) AP12. Pentareguloside G AP13. Acanthasglycoside A AP14. Maculoside 7 * Dưới đây trình bày các phân tích phổ và xác định cấu trúc hóa học của 1 steroid glycoside mới đại diện là Acanthaglycoside G (AP11): • Hợp chất AP11: Acanthaglycoside G (hợp chất mới) Hợp chất AP11 được phân lập dưới dạng chất rắn, vô định hình. Công thức phân tử của AP11 được xác định là C51H81O26SNa (M = 1164) từ pic ion giả phân tử [M+Na]+ tại m/z 1187,4533 (tính toán lý thuyết cho CTPT C51H81Na2O26S = 1187,4532) trong phổ (+) HR-ESI-MS và pic ion giả phân tử [M–Na]− tại m/z 1141,4735 (tính toán lý thuyết cho CTPT C51H81O26S = 1141,4737) trong phổ (-) HR-ESI-MS, trong đó M là khối lượng phân tử của AP11. Ngoài ra, trên phổ (–) HR-ESI-MS/MS của pic ion [M–Na]− ở m/z 1141 xuất hiện tín hiệu của các pic ion tại m/z 995 [(M–Na)–C6H10O4]−, 849 [(M–Na)–2xC6H10O4]−, 703 [(M–Na)–3xC6H10O4]−, 557 [(M–Na)– 4xC6H10O4]−, 411 [(M–Na)–5xC6H10O4]−, tương ứng với các tín hiệu này là sự mất lần lượt của 1, 2, 3, 4, và 5 đơn vị đường 6-deoxyhexose, và pic ion tại m/z 393 [(M–Na)–4 x C6H10O4 –C6H12O5]− tương ứng với sự mất của 1 chuỗi oligosaccharide trong AP11. Từ dữ liệu phân tích phổ MS có thể dự đoán AP11 có chứa 5 đơn vị đường 6-deoxyhexose trong chuỗi carbohydrate. 437.1941 1+ 526.3922 1+ 605.2223 2+ 774.6342 1187.4533 3+ 1269.4566 1+ 1367.4546 +MS, 0.8-1.4min #44-83 0 1 2 3 4 5x10 Intens. 400 500 600 700 800 900 1000 1100 1200 1300 m/z 424.1754 497.2043 570.2335 2- 849.3573 995.4151 1141.4735 1- 1163.4545 1127.4573 977.4046 -MS, 1.3-1.8min #76-100 0 1 2 3 4 6x10 Intens. 400 500 600 700 800 900 1000 1100 1200 m/z Hình 4.21: Phổ (+) HR-ESI-MS của AP11 Hình 4.22: Phổ (-) HR-ESI-MS của AP11 Phổ 1H-NMR của AP11 xuất hiện tín hiệu của 3 nhóm –CH3 đặc trưng của khung steroid bao gồm 2 nhóm methyl góc CH3-18 (s, 0,58 ppm) và CH3-19 (s, 0,94 ppm); 1 tín hiệu ở vùng trường yếu hơn của CH3-21 (s, 2,08 ppm). Ngoài ra còn có tín hiệu của 1 proton olefin ở δH 8 5,24 (brt, J 4,2 Hz); 1 nhóm oxymetin liên kết với một nhóm sulfate ở δH 4,87 (m) ppm; một nhóm oxymetin liên kết trực tiếp với một chuỗi carbohydrate ở vị trí CH-6 với δH 3,78 (m). Ở vùng trường yếu quan sát thấy 5 tín hiệu doublet của 5 proton anome của 5 đơn vị monosaccharide ở δH 4,82 (1H, d, J = 7,6 Hz), 4,84 (1H, d, J = 7,9 Hz), 4,97 (1H, d, J = 6,8 Hz), 5,03 (1H, d, J = 7,7 Hz), 5,27 (1H, d, J = 7,7 Hz). Hình 4.23: Phổ 1H-NMR của AP11 Hình 4.24: Phổ 13C-NMR của AP11 Phổ 13C-NMR của AP11 cho thấy sự có mặt của 51 nguyên tử carbon, trong đó có 8 nhóm CH3, 7 nhóm CH2, 32 nhóm CH và 4 carbon bậc 4. Sự có mặt của nối đôi bị thế ba lần trong phân tử được xác định tại δC 116,4/145,8 ppm. 5 tín hiệu carbon nhóm CH tại δC 102,3; 103,6; 104,9; 104,9; 106,9 ppm được xác định là các carbon anome của 5 gốc đường. Ngoài ra, trong vùng từ 60 – 90 ppm có các tín hiệu cộng hưởng của 23 nguyên tử carbon liên kết trực tiếp với nguyên tử oxy, bao gồm 22 carbon oximetin trong đó có 2 carbon của phần aglycon tại δC 77,4 (C-3) liên kết với nhóm sulfate; δC 80,1 (C-6) liên kết với chuỗi carbohydrate; và 20 carbon thuộc các phân tử đường tại δC 73,8; 91,0; 74,4; 71,7; 82,3; 75,1; 85,7; 71,4; 84,3; 77,5; 75,7; 72,8; 73,7; 74,9; 72,3; 71,8; 76,2; 77,5; 75,5; 73,4 ppm; và 1 carbon bậc 4 của nhóm C=O tại δC 208,0 ppm. Độ chuyển dịch hóa học trong phổ 1H và 13C chỉ ra rằng phần aglycon của AP11 có dạng đã biết là 3β,6α-dihydroxy-5α-pregn-9(11)-en-20- 9 one (asterone) đã bị sulfate hóa ở vị trí C-3 và có liên kết glycoside ở vị trí C-6 trong nhân steroid. Các tương tác nhận được trên phổ COSY và HSQC cho phép ghép nối các mảnh cấu trúc từ C-1 đến C-8, C-11 đến C-12, và C-8 đến C-17 của phần aglycon. Trên cơ sở kết quả phổ COSY, cùng các tương tác HMBC giữa các proton với các carbon cho phép khẳng định vị trí của các nhóm H- 18, H-19, H-21 và một liên kết đôi ở vị trí 9(11) của phần khung steroid cũng như chứng minh cho toàn bộ cấu trúc của phần aglycon. Phổ ROESY cho thấy các tương tác chìa khóa giữa H-5 với H-3α, H-7α; H-14 với H-12α, H-17; H3-18 với H-8, H-15β, H-16β; và H3-19 với H-2β, H-4β, H-6β, H-8. Điều này chứng minh cấu hình khung steroid ở các vị trí được xác định là 5α/8β/10β/13β/14α/17α và cấu hình tương đối của các nhóm thế ở C-3 và C- 6 là 3β và 6α. Trên phổ HMBC có xuất hiện tương tác của proton anome H- 1 của đơn vị đường Qui1 ở δH 4,82 ppm với C-6 ở δC 80,1 ppm của aglycon và trong phổ ROESY có xuất hiện tương tác của proton anome H-1 của Qui1 ở δH 4,82 ppm với H-6 ở δH 3,78 ppm của aglycon. Điều này chứng tỏ vị trí liên kết của chuỗi oligosaccharide với phần aglycon là vị trí C-6. Hình 4.25: Phổ 1D TOCSY của hợp chất AP11 Phổ 1D TOCSY cho thấy sự có mặt của 4 đơn vị đường Qui và 1 đơn vị đường Fuc do có các tín hiệu cộng hưởng của H-1 – H-6 của 4 đơn vị quinovose và H-1 – H-4 của 1 đơn vị fucose, chiếu xạ 1 nhóm methyl tương ứng dẫn đến tín hiệu H-5 của đơn vị fucose. Thứ tự liên kết giữa các phân tử đường và phần aglycon được khẳng định dựa trên 10 các tương tác trong phổ HMBC. Từ các tương tác chìa khóa giữa H-1 của Quip1 và H-6 (C-6) của aglycon, H-1 của Quip2 và H-3 (C-3) của Quip1, H-1 của Quip3 và H-4 (C-4) của Quip2, H-1 của Fucp và H-2 (C-2) của Quip3, H-1 của Quip4 và H-2 (C-2) của Quip2 có thể suy ra vị trí liên kết giữa các phân tử đường với nhau và giữa phần đường với phần aglycon của hợp chất steroid là Fuc(1→2)-Qui3(1→4)-[Qui4(1→2)]- Qui2(1→3)-Qui1-Aglycon. Dựa vào các tín hiệu trên phổ 1D-, 2D-NMR ta xác định được các giá trị carbon và proton của phần đường (bảng 4.9). Hình 4.26: Cấu trúc hóa học của AP11 Hình 4.27: Các tương tác chính trong phổ HMBC và ROESY của AP11 Cấu hình của các đơn vị đường trong AP11 được chứng minh bằng phương pháp của Leontein và cs, kết quả phân tích phổ GC thu được chứng minh các đơn vị đường của AP11 đều có cấu hình D. Từ các kết quả phân tích dữ liệu phổ AP11 được xác định là: muối natri 6α-O-{β-D-fucopyranosyl-(1→2)-β-D-quinovopyranosyl-(1→4)-[β-D- quinovo-pyranosyl-(1→2)]-β-D-quinovopyranosyl-(1→3)-β-D-quinovo- 11 pyranosyl}-6α-hydroxy-5α-pregn-9(11)-en-20-one-3β-yl sulfate. Đây là asterosaponin hiếm với chuỗi carbohydrate gồm duy nhất hai dạng đơn vị đường β-D-fucopyranosyl và β-D-quinovopyranosyl. Như vậy, AP11 là chất mới và lần đầu tiên được phân lập từ tự nhiên và được đặt tên là acanthaglycoside G. Bảng 4.8: Dữ liệu phổ phần aglycon của hợp chất AP11 C Cac Hab (JHz) ROESY (H→H) HMBC (H→C) 1β 1α 35,8 1,63 m 1,38 m H-11, H3-19 H-3, H-11 2α 2β 29,3 2,81 (brd, J 13,6 Hz) 1,89 (brq, J 12,5 Hz) H3-19 3 77,4 4,87 m H-1, H-5 4α 4β 30,6 3,45 (brd, J 12,6Hz) 1,70 m H3-19 5 49,1 1,48 m H-3, H-7 6 80,1 3,78 m H3-19 7β 7α 41,3 2,66 m 1,28 m H-5 8 35,4 2,06 m H3-18, H3-19 9 146,0 ‒ 10 35,8 ‒ 11 115,8 5,24 (brt, J 4,2 Hz) H-1 12 40,4 2,14 brs H-14, H-17 13 42,3 ‒ 14 53,5 1,33 m H-12, H-17 15α 15β 25,3 1,76 m 1,20 m H3-18 16β 16α 23,0 2,34 (brq, J 10,9 Hz) 1,61 m H3-18 17 63,2 2,51 (t, J 8,7 Hz) H-12, H-14, H3-21 C-13, C-18 18 12,9 0,58 s H-8, H-15, H-16 C-12, C-13, C-14, C-17 19 19,0 0,94 s H-1, H-2, H-4, H-6, H-8 C-1, C-5, C-9, C-10 20 208,0 ‒ 21 30,8 2,08 s H-17 C-17, C-20 a C5D5N, b 500,13 MHz, c 125,75 MHz 12 Bảng 4.9: Dữ liệu phổ NMR của chuỗi đường của hợp chất AP11 C δCac δHab (JHz) ROESY HMBC (H→C) Qui 1 1 104,9 4,82 (d, J 7,6 Hz) H-6 of aglycon; H-3, H-5 Qui1 C-6 of aglycon 2 73,8d 3,97 (t, J 8,3 Hz) C-1, C-3 Qui1 3 91,0 3,77 (t, J 8,6 Hz) H-1 Qui1, H-1 Qui2 C-1 Qui 2 4 74,4 3,55 (t, J 9,0 Hz) H-6 Qui1 C-3, C-6 Qui1 5 71,7d 3,69 m H-1 Qui1 6 18,2 1,60 (d, J 6,0 Hz) H-4 Qui1 C-4, C-5 Qui1 Qui 2 1 103.6 4,97 (d, J 6,8 Hz) H-3, H-5 Qui2; H-3 Qui1 C-3 Qui1 2 82.3 4,09 (t, J 7,6 Hz) H-1 Qui4 3 75.1 4,12 (t, J 8,7 Hz) H-1 Qui2 C-2 Qui2 4 85.7 3,56 (t, J 8,7 Hz) H-6 Qui2, H-1 Qui3 C-3 Qui2 5 71.4 3,90 m H-1 Qui2 6 18,0 1,73 (d, J 6,1 Hz) H-4 Qui2, H-1 Qui3 C-4, C-5 Qui2 Qui 3 1 102,3 4,84 (d, J 7,9 Hz) H-3, H-5 Qui3; H-4, H- 6 Qui2 C-4 Qui2 2 84,3 4,00 (t, J 8,3 Hz) H-1 Fuc C-3 Qui3, C-1 Fuc 3 77,5 4,13 (t, J 9,3 Hz) H-1, H-5 Qui3 C-2, C-4 Qui3 4 75,7 3,62 (t, J 8,9 Hz) H-6 Qui3 C-5, C-6 Qui3 5 72,8 3,71 m H-1, H-3 Qui3 C-3 Qui3 6 17,7d 1,48 (d, J 6,0 Hz) H-4 Qui3 C-4, C-5 Qui3 Fuc 1 106,9 5,03 (d, J 7,7 Hz) H-3, H-5 Fuc; H-2 Qui3 C-2 Qui3 2 73,7d 4,41 (dd, J 8,6; 9,5 Hz) C-1, C-3 Fuc 3 74,9 4,06 (dd, J 3,6; 9,5 Hz) H-1, H-5 Fuc 4 72,3 3,99 (d, J 4,0 Hz) H-5, H-6 Fuc C-3 Fuc 5 71,8d 3,78 (q, J 6,5 Hz) H-3, H-4 Fuc C-1, C-4 Fuc 6 16,9 1,49 (d, J 6,2 Hz) H-4 Fuc C-4, C-5 Fuc Qui 4 1 104,9 5,27 (d, J 7,7 Hz) H-3, H-5 Qui4; H-2 Qui2 C-2 Qui2 2 76,2 4,04 (t, J 8,8 Hz) 13 3 77,5 4,12 (t, J 8,8 Hz) H-1 Qui4 4 75,5 4,01 (t, J 8,7 Hz) H-6 Qui4 5 73,4 3,70 m H-1 Qui4 6 17,8d 1,79 (d, J 6,1 Hz) H-4 Qui4 C-4, C-5 Qui 4 a C5D5N, b 500,13 MHz, c 125,75 MHz, d các vị trí có thể hoán đổi cho nhau 4.2. Chuyển hóa hóa học của cholesterol Các hợp chất polyhydroxysteroid, hydroximinosteroid có mạch nhánh giống cholesterol được đánh giá là các hợp chất tiềm năng có hoạt tính gây độc trên nhiều dòng tế bào ung thư. Vì vậy, cholesterol (hợp chất AP7) được lựa chọn làm nguyên liệu đầu cho các phản ứng chuyển hóa tạo các sản phẩm hydroxyl và oxime hóa. 4.2.1. Chuyển hóa các dẫn xuất polyhydroxysteroid Cholesterol được hydroxyl hóa để tạo ra nhiều nhóm OH xung quanh vị trí nối đôi C5/C6. Các tác nhân hydroxyl hóa được sử dụng chủ yếu là các tác nhân oxy hóa và có khả năng tạo sản phẩm dạng diol. Bảy hợp chất polyhydroxysteroid (15c-21c) đã được tổng hợp từ cholesterol theo sơ đồ 4.1 dưới đây. Sơ đồ 4.1. Tổng hợp các dẫn xuất polyhydroxysteroid từ cholesterol 14 Tác nhân và điều kiện phản ứng: (i): BH3.THF, H2O2, NaOH, 0 oC, 1 giờ (15c: 71%, 16c: 9%); (ii): SeO2, dioxane, H2O, 80 oC, 80 giờ (17c: 50%, 18c: 2,0%, 19c: 3,5%); (iii): 4% OsO4/H2O, NMO, đun hồi lưu, 48 giờ (20c: 74%); (iv): 1. HCOOH 88%, THF/H2O2, 12 giờ, 2. KOH 3% trong MeOH (21c: 75%). Các hợp chất tổng hợp được mặc dù không phải là những chất mới, tuy nhiên nội dung nghiên cứu này nêu ra các phương pháp tổng hợp đơn giản và hiệu quả hơn so với các phương pháp đã biết cho các chất có hoạt tính và chỉ đi qua một bước phản ứng. Các phương pháp này đồng thời có thể áp dụng trên các hợp chất steroid khác từ sao biển để tổng hợp ra các dẫn xuất polyhydroxysteroid. 4.2.2. Chuyển hóa các dẫn xuất hydroximinosteroid Các nghiên cứu gần đây về mối liên hệ hoạt tính - cấu trúc của các hợp chất hydroximinosteroid cho thấy đây là lớp chất tiềm năng thể hiện nhiều hoạt tính sinh học lý thú. Đồng thời, các nghiên cứu cũng chỉ ra rằng vị trí của các nhóm oxime và loại mạch nhánh ở vị trí C-17 của khung steroid giống của cholestane có hoạt tính tốt hơn cả so với các loại mạch nhánh khác như của stigmastane hay sitostane. Vì vậy, cholesterol được lựa chọn làm nguyên liệu đầu để tổng hợp các dẫn xuất hydroximinosteroid. Các sản phẩm được tổng hợp có nhóm oxime ở vị trí C-3; hoặc C-3 và C-6; và vòng epoxy ở vị trí C-4,5. Bốn hydroximinosteroid (23c, 25c, 29c, 31c) trong đó có 2 chất mới (29c, 30c) và 7 chất trung gian (15c, 22c, 24c, 26c, 27c, 28c, 30c) trong đó có 1 chất mới (30c) đã được tổng hợp theo như sơ đồ 4.2 dưới đây. Từ cholesterol thực hiện chuyển hóa theo các hướng khác nhau để tạo các dẫn xuất trung gian có nhóm ketone (C=O) ở vị trí C-3 và C-6; ở vị trí C-4,5 có liên kết đôi (22c), không có liên kết đôi (24c) hoặc có vòng epoxy (27c). Cuối cùng các sản phẩm ketone này được chuyển hóa thành các hydroximinosteroid (>C=N-OH) tương ứng (23c, 25c, 29c, 31c) bằng tác nhân hydroxylamine hydrochloride (NH2OH.HCl) trong pyridine theo phương pháp mô tả bởi Javier. Đặc biệt, khi thực hiện oxime hóa chất 27c (có vòng epoxy ở vị trí C-4,5 và nhóm ketone ở vị trí 15 C-3) thu được 2 sản phẩm trong đó có 1 sản phẩm đã bị oxime hóa (29c) và 1 sản phẩm không bị oxime hóa nhưng bị mở vòng epoxy ở vị trí C- 4,5 (30c). Sơ đồ 4.2. Tổng hợp các dẫn xuất hydroximinosteroid từ cholesterol Tác nhân và điều kiện phản ứng: (i): PCC/CH2Cl2, rt, 48 giờ (22c: 80,0 %, 24c: 82,0 %); (ii): BH3.THF/H2O2, NaOH, 0 oC, 1 giờ (15c: 80,0 %); (iii): CeCl3.7H2O/NaBH4, CH2Cl2&MeOH (1:1), rt, 1 giờ (26c: 89,0 %); (iv): 1. m- CPBA/CH2Cl2, 2. Dess-Martin/CH2Cl2, 0 oC (27c: 12,3 %, 28c: 14,5 %); (v): NH2OH.HCl/Pyridine, 24 giờ (23c: 85,0 %, 25c: 81,0 %, 29c: 19,3 %, 30c: 13,4 %, 31c: 22,5 %). Các sản phẩm được chứng minh oxime hóa thành công do có sự thay đổi rõ ràng sự chuyển dịch hóa học của nhóm cacbonyl trong khoảng δC 195-210 ppm thành nhóm oxime ở δC 155-160 ppm. Kết hợp các phương pháp hóa lý hiện đại và các phương phổ cộng hưởng từ hạt nhân cấu trúc hóa học của tất cả các sản phẩm đã được chứng minh. 4.3. Kết quả thử nghiệm hoạt tính sinh học 16 4.3.1. Hoạt tính của các hợp chất steroid glycoside phân lập từ sao biển Acanthaster planci a. Hoạt tính sinh học của các hợp chất polyhydroxysteroid glycoside Hợp chất AP1 được thử nghiệm hoạt tính gây độc tế bào trên ba dòng tế bào HCT-116, T-47D và RPMI-7951. Kết quả hợp chất AP1 có khả năng gây độc tế bào trên dòng tế bào HCT-116 và RPMI-7951 với giá trị IC50 tương ứng là 36 và 58 µM, so với đối chứng dương cisplatin. Cả AP1 và cisplatin không gây độc trên dòng tế bào T-47D (bảng 4.23). Bảng 4.23: Hoạt tính gây độc tế bào in vitro của hợp chất AP1 Dòng tế bào (IC50 µM) AP1 Cisplatin HCT-116 36 75 T-47D >150 > 150 RPMI-7951 58 43 A B C Control AP1, 15 μM Cisplatin, 15 μM Hình 4.54: Ảnh hưởng của AP1 đến sự tăng sinh của các dòng tế bào HCT-116, T-47D và RPMI-7951 ở nồng độ 15 μM Chất AP1 ức chế sự tăng sinh của dòng tế bào T-47D sau 72 giờ là 35%, dòng tế bào RPMI-7951 sau 48 giờ là 27% (hình 4.54 B, C). Trong khi cisplatin gần như ức chế hoàn toàn sự phát triển của các dòng tế bào T-47D và RPMI-7951 (hình 4.54 B, C). b. Hoạt tính sinh học của các hợp chất asterosaponin 17 Hợp chất AP13 và AP14 có khả năng gây độc trên các tế bào ung thư trực tràng HT-29; tế bào ung thư biểu mô tuyến vú MDA-MB-231, nhưng không gây độc tế bào ung thư sắc tố ác tính RPMI-7951 ở nồng độ trên 150 µM. Giá trị nồng độ IC50 với từng dòng tế bào xem ở bảng 4.24. Hợp chất AP13 và AP14 ức chế hiệu quả sự hình thành khối u của các dòng tế bào HT-29 và dòng tế bào MDA-MB-231, và ít hiệu quả hơn với dòng tế bào RPMI-7951. Giá trị IF50 tương ứng với các dòng tế bào xem ở bảng 4.24. Bảng 4.24: Hoạt tính gây độc tế bào và ảnh hưởng tới sự hình thành khối u trên thạch mềm của các hợp chất asterosaponin AP11-AP14 Chất RPMI-7951 HT-29 MDA-MB-231 IC50, µM IF50, µM IC50, µM IF50, µM IC50, µM IF50, µM AP11 >150 >15 >150 >15 >150 >15 AP12 >150 >15 >150 >15 >150 >15 AP13 >150 15 109 11 30 13 AP14 >150 14 90 7 24 8 IC50: Nồng độ gây giảm 50% khả năng sống sót của các tế bào IF50: Nồng độ gây giảm 50% sự hình thành khối tế bào của các tế bào Hình 4.55: Ảnh hưởng của các asterosaponin AP11-AP14 đến sự di chuyển của tế bào ung thư biểu mô tuyến vú MDA-MB-231 ở người Hợp chất AP13 và AP14 ở nồng độ 10 µM có thể ngăn chặn sự di chuyển của các tế bào MDA-MB-231 với tỷ lệ tương ứng là 26% và 45% so với đối chứng sau 48 giờ ủ tế bào (hình 4.55). Trong khi, hợp chất AP11 và AP12 không thể ngăn chặn sự di chuyển của các tế bào này. 4.3.2. Hoạt tính sinh học của các dẫn xuất cholesterol 18 a. hoạt tính sinh học của các dẫn xuất polyhydroxysteroid Ba chất 16c, 18c, 21c thể hiện hoạt tính gây độc tế bào Hep G2 với giá trị IC50 tương ứng 11,69; 11,89 và 6,87 μM. Chỉ có chất 21c thể hiện hoạt tính gây độc tế bào T98G với IC50 = 2,28 μM, so với đối chứng dương là Paclitaxel (xem bảng 4.25). Hai cặp chất 15c và 16c; 20c và 21c khác nhau ở cấu hình nhóm OH ở vị trí C-6 (6α-OH ở chất 15c và 20c; 6β-OH ở chất 16c và 21c). Trong khi chất 16c có hoạt tính gây độc trên dòng tế bào Hep G2 và chất 21c có hoạt tính gây độc trên cả hai dòng tế bào Hep G2 và T98G thì chất 15c và 20c lại không thể hiện hoạt tính trên các phép thử này. Như vậy, cấu hình β của nhóm OH ở C-6 của dạng cấu trúc này có thể là một trong những yếu tố quyết định hoạt tính gây độc tế bào của chúng. Bảng 4.25: Hoạt tính gây độc tế bào Hep G2, T98G của các chất 15c-21c Chất IC50 µM Chất IC50 µM Hep G2 T98G Hep G2 T98G 15c >100 >100 19c >100 >100 16c 11,59 >100 20c >100 >100 17c >100 >100 21c 6,87 2,28 18c 11,89 >100 Paclitaxela 0,040 0,023 a đối chứng dương b. Hoạt tính sinh học của các dẫn xuất hydroximinosteroid và các chất trung gian Ba dẫn xuất 3,6-dihydroximino (23c, 25c, 31c) có hoạt tính gây độc tế bào mạnh hơn so với 3-hydroximino-6α-hydroxy (29c) trên 3 dòng tế bào thử nghiệm. Chất 3,6-dihydroximino 25c không có liên kết đôi ở vị trí C4/5 có thể là nguyên nhân gây mất hoạt tính gây độc trên 2 dòng tế bào Hep G2 và HeLa so với chất Δ4-3,6-dihydroximino 23c. Trong khi chất 31c có 2 nhóm oxime ở vị trí C-3, C-6 và vòng epoxy ở vị trí C-4,5 có hoạt tính gây độc tế bào chọn lọc trên dòng tế bào T98G (IC50 = 2,9 μM) thì chất 29c có một nhóm oxime ở vị trí C-3 và vòng epoxy ở vị trí C-4/5 nhưng không có hoạt tính này. 19 Bảng 4.26: Hoạt tính gây độc tế bào Hep G2, HeLa, T98G của các chất 22c-31c Chất IC50 (µM) Chất IC50 (µM) HepG2 HeLa T98G HepG2 HeLa T98G 22c >100 >100 >100 27c 41,8 72,4 >100 23c 42,4 68,6 70,3 28c >100 74,6 >100 24c >100 >100 >100 29c >100 >100 >100 25c >100 >100 69,8 30c >100 >100 18,5 26c >100 >100 >100 31c >100 >100 2,9 Paclitaxel 0,040 0,031 0,023 Paclitaxela 0,040 0,031 0,023 a đối chứng dương Ba chất trung gian (27c, 28c, 30c) có sự xuất hiện của nguyên tố oxy tại C-4 hoặc C-5 có hoạt tính gây độc vừa phải đối với ít nhất một dòng tế bào trong khi các chất còn lại không thể hiện hoạt tính. Như vậy, các steroid dạng này có liên kết đôi ở vị trí C4/5 hoặc có liên kết với nguyên tố oxy ở vị trí C-4, C-5 có thể có tác dụng tích cực đối với hoạt tính gây độc tế bào trên các dòng tế bào ung thư được thử nghiệm. KẾT LUẬN 1. Đã phân lập được 14 hợp chất từ loài sao biển Acanthaster planci. Cấu trúc của các hợp chất này được xác định bằng các phương pháp phổ khối lượng, phổ cộng hưởng từ hạt nhân và các phương pháp hóa lý khác. Các hợp chất phân lập và xác định được cấu trúc bao gồm: planciside A (AP1); planciside B (AP2); planciside C (AP3); planciside D (AP4); (3-O- sulfothornasterol A (AP5); 5-ergost-7-en-3-ol (AP6); cholesterol (AP7); astaxanthin (AP8); thymin (AP9); uracil (AP10); acanthaglycoside G (AP11); pentareguloside G (AP12); acanthaglycoside A (AP13); maculoside (AP14). Trong đó có 4 hợp chất steroid glycoside AP1, AP2, AP3 và AP11 là các chất mới. Ngoài ra, hợp chất pentareguloside G (AP12) lần đầu tiên được tìm thấy ở loài Acanthaster planci của Việt Nam. 2. Từ cholesterol đã tổng hợp được 17 dẫn xuất, trong đó có 7 dẫn xuất polyhydroxysteroid (15c-21c), 4 dẫn xuất hydroximinosteroid (23c, 25c, 29c, 20 31c) và 6 dẫn xuất trung gian (22c, 24c, 26c, 27c, 28c, 30c). Các hợp chất bao gồm: cholestane-3β,6α-diol (15c); cholestane-3β,6β-diol (16c); cholestan-5- ene-3β,4β-diol (17c); cholestan-5-ene-3β,7β-diol (18c); cholestan-5-ene- 3β,4β,7β-triol (19c); cholestane-3β,5α,6α-triol (20c); cholestane-3β,5α,6β-triol (21c); cholest-4-ene-3,6-dione (22c); (3E,6E)-dihydroximinocholest-4-ene (23c); cholestane-3,6-dione (24c); (3E,6E)-dihydroximinocholestane (25c); cholest-4-ene-3β,6α-diol (26c); 6-hydroxy-4,5-epoxycholestane-3-one (27c); 4α,5α-epoxycholestane-3,6-dione (28c); 4α,5α-epoxy-6-hydroxycholestane-3- oxime (29c); 4α,5α,6α-trihydroxy-cholestane-3-one (30c); 4α,5α- epoxycholestane-3,6-dioxime (31c). Trong đó 29c, 30c, 31c là các chất mới. 3. Đã khảo sát hoạt tính gây độc tế bào và đánh giá ảnh hưởng của các hợp chất AP1, AP11, AP12, AP13, AP14 đến sự hình thành khối u trên thạch mềm của các dòng tế bào ung thư ở người. Kết quả cho thấy: - Hợp chất AP1 có hoạt tính gây độc tế bào trên dòng tế bào ung thư ruột kết (HCT-116) và ung thư sắc tố ác tính (RPMI-7951) với giá trị IC50 tương ứng là 36 µM và 58 µM. Hợp chất AP1 có hoạt tính ức chế sự tăng sinh tế bào HCT-116, T-47D và RPMI-7951 nhưng không có ảnh hưởng đến sự hình thành khối tế bào của các dòng tế bào này. - Hợp chất AP13 và AP14 có hoạt tính gây độc nhẹ trên dòng tế bào ung thư đại trực tràng HT-29 với giá trị IC50 tương ứng là 109 µM và 90 µM; và dòng tế bào ung thư biểu mô tuyến vú MDA-MB-231 với giá trị IC50 tương ứng là 30 µM và 24 µM. Hợp chất AP13 và AP14 ức chế hiệu quả sự hình thành khối u trên thạch mềm của hai dòng tế bào HT-29 (với giá trị IF50 tương ứng là 11 µM và 7 µM) và MDA-MB-231 (với giá trị IF50 tương ứng là 13 µM và 8 µM); ít hiệu quả hơn trên dòng RPMI-7951 (với giá trị IF50 tương ứng là 15 µM và 14 µM). 4. Đã khảo sát khả năng ức chế sự di căn của tế bào ung thư biểu mô tuyến vú MDA-MB-231 bằng phương pháp đánh giá khả năng chữa lành vết thương trong ống nghiệm của các hợp chất asterosaponin (AP11-AP14). Kết 21 quả cho thấy: hợp chất AP13 và AP14 ở nồng độ 10 µM có thể ngăn chặn sự di chuyển của các tế bào ung thư biểu mô tuyến vú MDA-MB-231 với tỷ lệ tương ứng là 26% và 45% so với đối chứng sau 48 giờ ủ tế bào. 5. Đã khảo sát hoạt tính gây độc tế bào của 07 dẫn xuất polyhydroxysteroid (15c-21c), 04 dẫn xuất hydroximinosteroid (23c, 25c, 29c, 31c) và 06 dẫn xuất trung gian của chúng (22c, 24c, 26c, 27c, 28c, 30c) tổng hợp được từ cholesterol trên các dòng tế bào ung thư gan (Hep G2), ung thư cổ tử cung (Hela) và ung thư não (T98G). Kết quả cho thấy: - Năm hợp chất (16c, 18c, 21c, 23c, 27c) có hoạt tính gây độc tế bào trên dòng tế bào ung thư gan (Hep G2) với các giá trị IC50 tương ứng là 11,59; 11,89; 6,87; 42,40; 41,80 µM. - Ba hợp chất (23c, 27c, 28c) có hoạt tính yếu gây độc tế bào ung thư cổ tử cung (HeLa) với các giá trị IC50 tương ứng là 68,6; 72,4 và 74,6 µM. - Năm hợp chất (21c, 23c, 25c