Tóm tắt Luận án Nghiên cứu phân lập và khảo sát hoạt tính kháng sinh, gây độc tế bào của các hợp chất thứ cấp từ ba chủng xạ khuẩn streptomyces g246, g261, g248 thu thập tại vùng biển miền trung - Việt Nam

p được từ chủng Streptomyces sp. G261 3.7.3 Thông số vật lý và dữ liệu phổ của các hợp chất thứ cấp từ chủng xạ khuẩn Streptomyces sp. G261 3.8. Tách chiết và xác định cấu trúc hóa học các hợp chất thứ cấp từ các chủng xạ khuẩn Streptomyces sp. G248 3.8.1. Xử lý mẫu, tạo cặn chiết 3.8.2. Phân lập các hợp chất từ các cặn chiết 6 Hình 3. 2. Sơ đồ phân lập các hợp chất từ cặn chiết của chủng Streptomyces sp. G261 Hình 3. 3. Sơ đồ phân lập các hợp chất từ chủng Streptomyces sp. G248 7 3.8.3. Thông số vật lý và dữ liệu phổ của các hợp chất phân lập được từ chủng xạ khuẩn Streptomyces sp. G248 3.9. Kết quả thử hoạt tính sinh học của các hợp chất phân lập đƣợc từ các chủng xạ khuẩn 3.9.1. Kết quả thử hoạt tính đối với VSVKĐ của một số hợp chất phân lập được Trong số 26 chất được phân lập, chúng tôi đã tiến hành thử hoạt tính kháng VSVKĐ. Kết quả có 13 chất có hoạt tính kháng VSV kiểm định, trong đó có nhiều chất có hoạt tính rất mạnh như G246-2, G248-11, G248-12, G248-9 và nhiều chất có hoạt tính kháng nấm tốt như G246-6, G261-11, G248-11 (xem chi tiết bảng 3.5). 3.9.2. Kết quả thử hoạt tính kháng lao của một số hợp chất phân lập được Kết quả thử hoạt tính kháng lao được thực hiện tại trường Đại học UIC. Một số chất được thử nghiệm hoạt tính kháng lao với Mycobacterium tuberculosis H37Rv, trong đó G246-1 thể hiện hoạt tính tốt nhất với giá trị MIC = 6,00 µg/ml, G248-10 thể hiện hoạt tính tốt với giá trị MIC = 11,17 µg/ml, còn G248-9 thể hiện hoạt tính yếu với giá trị MIC = 48,02 µg/ml Các chất còn lại không thể hiện hoạt tính tại nồng độ nghiên cứu (50 µg/ml) (xem chi tiết bảng 3.6). 3.9.3. Kết quả thử hoạt tính gây độc tế bào của một số hợp chất phân lập được 14 hợp chất có hoạt tính kháng VSVKĐ, kháng lao từ 03 chủng nghiên cứu (G246, G261 và G248) được thử hoạt tính gây độc tế bào với bốn dòng tế bào ung thư ở người: KB - ung thư biểu mô (CCL – 17TM); Hep G2 - ung thư gan (HB – 8065TM); MCF-7 - ung thư vú (HTB – 22TM) và LU-1 - ung thư phổi (HTB-57TM) . Kết quả được trình bày chi tiết trong bảng 3.5. Kết quả có 5 hợp chất có hoạt tính gây độc tế bào, trong đó có 4 chất có hoạt tính với dòng tế bào KB, 5 hợp chất có hoạt tính với dòng tế bào ung thư gan Hep- G2, 4 hợp chất có hoạt tính với dòng tế bào Lu-1, 4 hợp chất có hoạt tính với dòng tế bào MCF7 (xem chi tiết bảng 3.7) CHƢƠNG 4. THẢO LUẬN KẾT QUẢ 4.1. Kết quả thu mẫu Tổng số 25 mẫu bao gồm có: 12 mẫu ở vùng biển Thanh Hóa, Quảng Bình và Quảng Trị; 13 mẫu ở vùng biển Đà Nẵng và Quảng Nam. Cụ thể có 10 mẫu trầm tích, 4 mẫu rong, 4 mẫu hải miên, 1 mẫu san hô mềm, 2 mẫu da gai và 4 mẫu khác. 4.2. Kết quả phân lập các chủng xạ khuẩn Từ 25 mẫu thu được đã phân lập được 32 chủng xạ khuẩn có hình thái và màu sắc khuẩn lạc khác nhau từ mẫu thu thập được (chi tiết được mô tả tại phụ lục PL III.1.2). 8 4.3. Kết quả thử hoạt tính sinh học của các chủng thu đƣợc. - Kết quả thử hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định với cặn thô thu được cho thấy 29/32 chủng phân lập có tính kháng các chủng VSVKĐ. - Kết quả cho thấy 21/32 chủng thể hiện hoạt tính kháng lao. - Kết quả có 20 chủng có hoạt tính gây độc tế bào ung thư biểu mô KB (IC50 < 128 µg/ml). Từ các kết quả sàng lọc hoạt tính kháng VSVKĐ, hoạt tính kháng lao cũng như hoạt tính gây độc tế bào (với dòng KB) trong luận án này tôi lựa chọn 3 chủng phân lập có hoạt tính tốt nhất để thực hiện cho các nghiên cứu tiếp theo (gồm các chủng xạ khuẩn G246, G261, G248). 4.4. Kết quả định danh các chủng xạ khuẩn có hoạt tính sinh học 4.4.1. Quan sát đặc điểm hình thái các chủng nghiên cứu 4.4.2. Nhân gen 16S ARN riboxom 4.4.3. Giải trình tự gen xác định tên các chủng xạ khuẩn Đã xác định được các chủng G246, G261, G248 đều thuộc chi Streptomyces sp. (Xem chi tiết tại PLIII.1.4) 4.5. Kết quả sinh khối lƣợng lớn các chủng có hoạt tính sinh học tốt. Đã lên men thành công lượng lớn 50 lít cho các chủng G246, G261, G248 để tiếp tục các nghiên cứu tiếp theo. 4.6. Xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất phân lập đƣợc từ chủng xạ khuẩn Streptomyces sp. G246 Từ dịch nuôi cấy của chủng vi sinh vật Streptomyces sp. G246, chúng tôi đã phân lập và xác định cấu trúc hóa học của 10 hợp chất, trong đó có 2 hợp chất mới là G246-1 và G246-2. Cấu trúc của các hợp chất được xác định bằng các phương pháp phổ NMR, MS và so sánh với tài liệu tham khảo, các hợp chất được xác định là (2S,2″S)-6-lavandulyl-7-methoxy-5,2′,4′-trihydroxylflavanone (G246-1), (2″S)-5′- lavandulyl-4′-methoxy-2,4,2′,6′-tetrahydroxylchalcone (G246-2), cyclo-(Pro-Gly) (G246-3), cyclo-(L-Pro-L-Tyr) (G246-4), cyclo-(D-Pro-L-Tyr) (G246-5), cyclo-(Pro- Ala) (G246-6), norharman (G246-7), tryptophan (G246-8), 3-indol carboxylic acid (G246-9), phenyl alanin (G246-10), trong đó có 2 chất mới là G246-1 và G246-2. Cấu hình tuyệt đối của 2 hợp chất mới G246-1 và G246-2 được xác định dựa vào phương pháp tính toán lượng tử hóa học điện tử lưỡng sắc tròn (ECD - Electronic Circular Dichroism) dựa trên phần mềm Gaussian 09. 9 Hình 4.28. Cấu trúc hóa học của hợp chất G246-1 đến G246-10 Dưới đây trình bày chi tiết phương pháp xác định cấu trúc của các hợp chất mới. 4.6.1. Hợp chất G246-1: (2S,2″S)-6-lavandulyl-7-methoxy-5,2′,4′- trihydroxylflavanone (hợp chất mới) Hình 4.1. Cấu trúc hóa học và các tương tác HMBC (H→C), COSY (H─H) của hợp chất G246-1 và cấu trúc hóa học hợp chất tham khảo. Hợp chất G246-1 được phân lập dưới dạng chất rắn vô định hình màu trắng, độ quay cực [α]25D = - 28 (c 0,8, MeOH). Phổ khối phân giải cao của hợp chất này cho pic phân tử proton hóa ở m/z 439,2115 [M+H]+ tính toán lý thuyết cho công thức phân tử C26H31O6 (m/z 439,2121), kết hợp với phổ 13C-NMR có thể xác định được công thức phân tử của G246-1 là C26H30O6. Phổ IR của G246-1 có các đỉnh hấp thụ đặc trưng cho nhóm hydroxyl (νmax 3299 cm -1) và carbonyl (νmax 1670 cm -1). Trên phổ 1H-NMR, ở vùng aromatic có sự xuất hiện tín hiệu của hệ ABX ở δH 6,35 (1H, d, J = 2,0 Hz, H-3′), 6,37 (1H, dd, J = 2,0, 8,5 Hz, H-5′), 7,31 (1H, d, J = 8,5 Hz, H- 6′) và một proton singlet ở δH 6,13 (1H, H-8). Ngoài ra, trên phổ 1 H-NMR có tín hiệu của 3 proton dạng đỉnh double doublet ở H 2,71 (1H, dd, J = 2,5; 16,5, H-3ax), 2,89 (1H, dd, J = 13,0; 16,5, H-3eq), 5,56 (1H, dd, J = 2,5; 12,5, H-2) là các tín hiệu đặc trưng cho vị trí 10 nhóm methylene CH2-3 và proton H-2 của một flavanone. Thêm vào đó là các tín hiệu cộng hưởng của một nhóm methoxy ở H 3,83, ba nhóm methyl singlet ở H 1,97, 1,98 và 1,65, 3 proton olefinic ở H 4,98, 4,54 và 4,59 và các proton thuộc vùng aliphatic. Phân tích phổ 13C-NMR kết hợp với DEPT, HSQC cho biết phân tử của G246-1 có 26 nguyên tử cacbon bao gồm một nhóm ketone ở C 193,9, năm nhóm methine sp 2 ở C 93,4; 103,4; 103,7; 128,5; 132,0, một nhóm methylene sp2 ở C 111,2, hai nhóm methine sp 3 ở C 48,2; 75,5, ba nhóm methylene sp 3 ở C 28,2; 32,4; 48,2, ba nhóm methyl ở C 17,8; 19,2; 25,9, một nhóm methoxy ở C 55,9 và 10 cacbon sp 2 không liên kết trực tiếp với hydro. Bên cạnh hệ aromatic ABX, hai hệ tương tác spin-spin cũng được ghi nhận trên phổ COSY: H-2/CH2-3 (I) và CH2-1″/H-2″/CH2-3″/H-4″ (II). Độ chuyển dịch hóa học của các nguyên tử cacbon ở C 75,5 (C-2), 156,6 (C-2′), 159,5 (C-4′), 164,9 (C-5), 161,9 (C-7) và 164,9 (C-9) gợi ý đến chúng được liên kết với nguyên tử oxy. Trên phổ HMBC cho thấy tương tác giữa proton của nhóm CH3-10″ và CH2-9″ với C-2″ và tương tác giữa proton của nhóm CH2-1″ với C-8″ chứng tỏ sự kết nối của C-2″ của hệ spin II với nhóm isopropenyl. Tiếp theo, tương tác HMBC của H-4″ với C-6″ và C- 7″, tương tác của CH2-3″ với C-5″ chỉ ra sự có mặt của nhóm lavandulyl trong cấu trúc của G246-1. Sự có mặt của vòng B được khẳng định bằng tương tác của H-3′ với C-1′, C-2′, C- 4′ và C-5′. Tương tự, vòng A được thiết lập dựa trên tương tác HMBC của H-8 với C-6, C- 7, C-9 và C-10. Các đặc trưng về phổ của hệ spin I và tương tác của các proton trong hệ spin này với nhóm carbonyl (C 193,9) trên phổ HMBC chứng tỏ G246-1 là một flavanone. Sự kết nối của nhóm lavandulyl với vòng A ở C-6 được chứng minh dựa trên tương tác HMBC giữa proton của CH2-1″ với C-5, C-6 và C-7. Cuối cùng, tương tác trên phổ HMBC của proton thuộc nhóm methoxy ở H 3,85 với C-7(C 161,9) và tương tác NOESY giữa nhóm 7-OCH3 với H-8 cho phép xác định vị trí của nhóm methoxy tại C-7. Như vậy từ các dữ liệu phổ 1D và 2D-NMR của hợp chất G246-1 và chất tham khảo sophorflavanone G [89] xác định được G246-1 là 6-lavandulyl-7-methoxy-5,2′,4′- trihydroxylflavanone. Phổ CD của G246-1 cho hiệu ứng Cotton dương tại 336 nm (Δ +2,98 mdeg) và hiệu ứng Cotton âm tại 292 nm (Δ - 9,08 mdeg), cho phép xác định cấu hình tuyệt đối tại C-2 là 2S [89]. Cấu hình tuyệt đối tại vị trí C-2″ của G246-1 được xác định dựa vào phương pháp tính toán lượng tử hóa học điện tử lưỡng sắc tròn (ECD - Electronic Circular Dichroism) dựa trên phần mềm Gaussian 09. Tính toán lý thuyết cho 2 đồng phân 2S,2″S- 11 và 2S,2″R- cho phép xác định cấu hình 2S,2″S của hợp chất G246-1 phù hợp với mô hình tính toán (xem hình 4.10). Từ các phân tích trên phổ khối, phổ IR, 1D và 2D NMR, phổ CD kết hợp với phương pháp tính toán lượng tử hóa học điện tử lưỡng sắc tròn (ECD- Electronic Circular Dichroism) đã thiết lập nên cấu trúc của G246-1, đây là hợp chất mới được xác định là (2S,2″S)-6-lavandulyl-7-methoxy-5,2′,4′-trihydroxylflavanone. Bảng 4. 1. Số liệu phổ NMR của hợp chất G246-1 và hợp chất tham khảo a) đo trong CD3OD; b) đo trong CD3COCD3; δC # số liệu của hợp chất sophoraflavanone G [89] Vị trí C #,b C a H (độ bội, J, Hz) 2 75,3 75,5 5,56 (dd, 2,5; 13,0) 3 42,8 48,2 2,89 (dd, 13,0; 16,5) 2,71 (dd, 2,5; 16,5) 4 198,2 193,9 5 163,0 164,9 6 96,2 109,6 7 165,3 161,9 8 107,8 93,4 6,13 (s) 9 162,1 164,9 10 103,2 105,7 1′ 117,9 118,5 2′ 156,1 156,6 3′ 103,4 103,4 6,35 (d, 2,0) 4′ 159,4 159,5 5′ 107,8 107,6 6,37 (dd, 2,0; 8,5) 6′ 128,6 128,5 7,31 (d, 8,5) 1′′ 27,7 28,2 2,64 (m) 2′′ 47,8 48,2 2,52 (m) 3′′ 31,9 32,4 2,02 (m) 4′′ 124,5 124,8 4,98 (t, 6,5) 5′′ 131,6 132,0 6′′ 17,9 17,8 1,97 (s) 7′′ 25,8 25,9 1,98 (s) 8′′ 149,1 149,8 9′′ 111,2 111,2 4,54 (s) 4,59 (s) 10′′ 19,1 19,2 1,65 (s) OMe 55,9 3,84 (s) 12 4.6.2. Hợp chất G246-2: (2″S)-5′-lavandulyl-4′-methoxy-2,4,2′,6′- tetrahydroxylchalcone (hợp chất mới) Hình 4. 2. Cấu trúc hóa học và các tương tác HMBC (H→C), COSY (H─H) của hợp chất G246-2 và cấu trúc hóa học hợp chất tham khảo G246-1 Hợp chất G246-2 thu được dưới dạng chất rắn vô định hình màu trắng, độ quay cực [α]25D = -8,6 (c 0,25, CH2Cl2). Phổ khối phân giải cao chỉ ra pic ion giả phân tử ở m/z 439,2115 [M+H]+ (tính toán lý thuyết cho công thức phân tử C26H31O6 với m/z 439,2121), kết hợp với các dữ liệu trên phổ 13C-NMR gợi ý đến công thức phân tử C26H30O6 cho hợp chất G246-2. So sánh các dữ liệu phổ 1D-NMR của hợp chất này với dữ liệu phổ NMR của G246-1 cho thấy hợp chất G246-2 cũng có nhóm lavandulyl và hệ vòng A, B như của hợp chất G246-1. Sự khác nhau giữa hai hợp chất này là hệ CH=CH thay vì các tín hiệu của hệ spin thứ nhất (CH-2/CH2-3) của G246-1. Các phân tích trên gợi ý đến khung chalcone của G246-2, điều này cũng được khẳng định dựa trên tương tác của H- với C-2, C-6 và C-γ trên phổ HMBC của G246-2. Nhóm lavandulyl được gắn vào khung chalcone ở vị trí C-5′ dựa trên tương tác HMBC của H- 1″ với C-5′ (δC 107,4), C-6′ (δC 165,8), C4′(δC 161,1) và tương tác HMBC của H-2″ với C-5′ (δC 107,4), C-8″(δC 150,5), C-9″(δC 110,5). Tương tự, tương tác HMBC của proton thuộc nhóm methoxy ở H 3,85 với C-4′ (δC 161,0) xác định vị trí của nhóm methoxy ở C-4′ của khung chalcone. Cấu hình tuyệt đối tại vị trí C-2″ của hợp chất G246-2 được xác định dựa vào phương pháp tính toán lượng tử hóa học điện tử lưỡng sắc tròn (ECD - Electronic Circular Dichroism) dựa trên phần mềm Gaussian 09 tương tự như hợp chất G246-1. Tính toán lý thuyết cho 2 đồng phân 2″S- và 2″R- cho phép xác định cấu hình 2″S của hợp chất G246-2 phù hợp với mô hình tính toán. Kết hợp phân tích các phổ và so sánh với hợp chất G246-1 đã xác định được G246-2 là (2″S)-5′-lavandulyl- 4′-methoxy-2,4,2′,6′-tetrahydroxylchalcone, đây là hợp chất mới. 13 Bảng 4. 2. Số liệu phổ NMR của hợp chất G246-2 và chất so sánh G246-1 a) đo trong CDCl3; b) đo trong CD3OD; δC # số liệu của hợp chất G246-1 C# C #,b C C a H (độ bội, J, Hz) 1′ 118,5 1 116,5 2′ 156,6 2 156,9 3′ 103,4 3 106,2 6,37 (br,s) 4′ 159.5 4 159,1 5′ 107,6 5 109,1 6,43 (br d, 8,0) 6′ 128,5 6 131,0 7,39 (d, 8,0) 10 105,7 1′ 106,2 9 164,9 2′ 161,0 8 93,4 3′ 90,9 5,92 (s) 7 161,9 4′ 161,0 6 109,6 5′ 107,4 5 164,9 6′ 165,8 1′′ 28,2 1′′ 29,7 2,70 (dd, 6,0; 14,0) 2,71 (dd, 8,0; 14,0) 2′′ 48,2 2′′ 46,5 2,39 (m) 3′′ 32,4 3′′ 31,9 2,14 (m) 4′′ 124,8 4′′ 122,8 5,11 (t, 6,5) 5′′ 132,0 5′′ 132,9 6′′ 17,8 6′′ 18,0 1,60 (s) 7′′ 25,9 7′′ 25,8 1,69 (s) 8′′ 149,8 8′′ 150,5 9′′ 111,2 9′′ 110,7 4,76 (s)/ 4,79 (s) 10′′ 19,2 10′′ 20,7 1,72 (s) OH-6′ 14,46 (s) OMe 55,9 OMe 55,7 3,85 (s) 3 48,2 α 126,0 7,82 (d, 16,0) 2 75,5 β 137,5 7,96 (d, 16,0) 4 193,9 γ 193,2 14 4.7. Xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất phân lập đƣợc từ chủng xạ khuẩn Streptomyces sp. G261 Hình 4. 1. Cấu trúc hóa học của hợp chất G261-1 đến G261-13 Từ dịch nuôi cấy của chủng vi sinh vật Streptomyces sp. G261 đã phân lập và xác định cấu trúc hóa học của 13 hợp chất: norharman (G261-1), 2,3-butanediol (G261- 2), 1H-pyrrole-2-carboxylic acid (G261-3), 2-oxo-2,3-dihydrobenzo[d]oxazole-4- carboxylic acid (G261-4), 3-hydroxy-4-methoxybenzoic acid (G261-5), 2- acetamidobenzamide (G261-6), phenyl alanin (G261-7), cyclo-(Pro-Gly) (G261-8), cyclo-(Pro-Ala) (G261-9), cylo-(Pro- Leu) (G261-10), cyclo-(Pro-Tyr) (G261-11), cyclo-trans-4-OH-(Pro-Phe) (G261-12), cyclo-(Leu-Tyr) (G261-13), trong đó có 1 chất lần đầu phân lập được từ tự nhiên là 2-oxo-2,3-dihydrobenzo[d]oxazole-4-carboxylic acid (G261-4). Dưới đây trình bày chi tiết phương pháp xác định cấu trúc của các hợp chất G261-4 là hợp chất lần đầu tiên phân lập được từ thiên nhiên. 4.7.1. Hợp chất G261-4: 2-oxo-2,3-dihydrobenzo[d]oxazole-4-carboxylic acid Hình 4.32. Cấu trúc hóa học và các tương tác trên phổ HMBC của G261-4 15 Phổ khối ESI-HRMS của G261-4 cho pic ion giả phân tử ở m/z 178,0152 [M-H]- (tính toán lý thuyết cho công thức phân tử C8H4NO4 m/z 178,0140). Phổ 1H-NMR thấy xuất hiện tín hiệu của các proton vòng thơm ở δH 7,24 (1H, d, J = 8,0 Hz, H-7); 7,23 (1H, dd, J = 8,0; 8,0 Hz, H-6); 7,49 (1H, dd, J = 2,0; 7,0 Hz, H-5). Phổ 13C-NMR kết hợp với HSQC cho thấy 3 nhóm methine vòng thơm ở δC 118,1 (C-5); 123,6 (C-7); 126,4 (C-6); và 3 cacbon bậc bốn sp2 ở δC 116,7 (C-4); 144,2 (C-3); 146,5 (C-7a); Ngoài ra thấy xuất hiện của 1 nhóm cabonyl ở vùng trường thấp gắn với dị tố nitơ ở δC 149,2 và một nhóm cacbonyl ở δC 163,4. Trên phổ HMBC thấy có tương tác xa của proton H-5 (δH 7,49) với C-4 (δC 116,7); C-3a (δC 144,2) và C=O (δC 163,4) tương tác của proton H-7 (δH 7,24) với C-7a (δC 146,5), C-6 (δC 123,6). Kết hợp các dữ liệu phổ và so sánh với tài liệu tham khảo [102] cho phép xác đinh được G261-4 là 2-oxo-2,3- dihydrobenzo[d]oxazole-4-carboxylic acid. Đây là hợp chất lần đầu phân lập từ tự nhiên [103]. 4.8. Xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất thứ cấp từ chủng xạ khuẩn Streptomyces sp. G248 Hình 4.81. Cấu trúc hóa học của hợp chất G248-1 đến G248-13 Từ dịch chiết nuôi cấy của chủng xạ khuẩn biển Streptomyces sp. G248, bằng các phương pháp sắc ký và phương pháp phổ MS, 1D-NMR, 2D-NMR đã phân lập và xác định cấu trúc hóa học của 13 hợp chất ký hiệu từ G248-1 đến G248-13 gồm cyclo 16 (Pro – Leu) (G248-1), cyclo-(Pro-Phe) (G248-2), norharman (G248-3), cyclo-(Pro-Tyr) (G248-4), cyclo-(Pro-Gly) (G248-5), cyclo-(Pro-Trp) (G248-6), Adenine (G248-7), 2- (4-hydroxyphenyl)acetic acid (G248-8), (2S,2″S)-6-lavandulyl-7,4′-dimethoxy-5,2′- dihydroxylflavanone (G248-9), (2S)-6-prenyl-4′-methoxy-5,7-dihydroxylflavanone G248-10, (2S,2″S)-6-lavandulyl-5,7,2′,4′-tetrahydroxylflavanone (G248-11), (2″S)-5′- lavandulyl-2′-methoxy-2,4,4′,6′-tetrahydroxylchalcone (G248-12), (2S,2″S)-6- lavandulyl-7-methoxy-5,2′,4′-trihydroxylflavanone (G248-13). Trong đó có 3 hợp chất mới là G248-9, G248-11, G248-12 thuộc loại hợp chất flavonoids. Dưới đây trình bày chi tiết phương pháp xác định cấu trúc của 2 hợp chất mới 4.8.1. Hợp chất G248-9: (2S,2″S)-6-lavandulyl-7,4′-dimethoxy-5,2′- dihydroxylflavanone Hình 4. 2. Cấu trúc hóa học và các tương tác HMBC (H→C), COSY (H─H) của hợp chất G248-9 và cấu trúc hóa học hợp chất tham khảo. Hợp chất G248-9 được phân lập dưới dạng chất rắn vô định hình, màu vàng, độ quay cực [α]25D –5 (c 0,8, MeOH). Phổ khối HR-ESI-MS của hợp chất này cho pic phân tử proton hóa ở m/z 453,2270 [M+H]+ (số khối tính toán cho công thức phân tử C27H33O6 là 453,2277), kết hợp với phổ 13C-NMR có thể xác định được công thức phân tử của G248-9 là C27H32O6. Phổ IR của G248-9 có các đỉnh hấp thụ đặc trưng cho nhóm hydroxyl (νmax 3433 cm -1) và carbonyl (νmax 1648 cm -1 ). Dữ liệu phổ NMR của hợp chất G248-9 rất giống với hợp chất G246-1, chỉ khác là thấy xuất hiện thêm 1 nhóm methoxy. Giống như hợp chất G246-1, trên phổ 1H-NMR của hợp chất G248-9 có tín hiệu của 4 proton aromatic ở δH 6,47 (1H, dd, J = 2,0; 8,0 Hz, H- 5′), 6,49 (1H, d, J = 2,0 Hz, H-3′), 7,38 (1H, d, J = 8,5 Hz, H-6′), 6,12 (1H, s, H-8) và tín hiệu của 3 proton đặc trưng cho vị trí nhóm methylene CH2-3 và proton H-2 của một flavanone ở H 2,67 (1H, dd, J = 2,5; 17,0 Hz, H-3ax), 2,89 (1H, dd, J = 13,5; 17,0 Hz, H- 3eq), 5,55 (1H, dd, J = 2,5; 13,0 Hz, H-2). Ngoài ra, tín hiệu của 1 nhóm lavandulyl và 2 nhóm methoxy cũng được quan sát thấy trên phổ 1H-NMR (xem bảng 4.18). Phân tích phổ 17 13 C-NMR kết hợp với HSQC cho biết phân tử của G248-9 có 27 cacbon bao gồm một nhóm ketone (C 193,6), 10 cacbon bậc 4 sp 2 ở C 164,7; 109,6; 161,9; 165,4; 105,6; 119,7; 160,1; 132,0; 149,8; 159,0, năm nhóm methine sp2 ở C 93,6; 99,8; 108,1; 128,5; 124,8, một nhóm methylene sp2 ở C 111,2; hai nhóm methine sp 3 ở C 48,2; 75,0, ba nhóm methylene sp 3 ở C 28,2; 32,3; 45,4, ba nhóm methyl ở C 17,8; 25,8; 19,1 và hai nhóm methoxy ở C 55,9. Bên cạnh hệ aromatic ABX, hai hệ tương tác spin-spin cũng được ghi nhận trên phổ COSY: H-2/CH2-3 (I) và CH2-1″/H-2″/CH2-3″/H-4″ (II). Độ chuyển dịch hóa học của các nguyên tử cacbon ở C 75,0 (C-2), 160,1 (C-2′), 159,0 (C-4′), 164,7 (C-5), 161,9 (C-7) và 165,4 (C-9) gợi ý đến chúng được liên kết với nguyên tử oxy. Trên phổ HMBC, nhìn thấy tín hiệu tương tác giữa các proton thuộc nhóm CH3-10″ và CH2-9″ với C-2″, tương tác HMBC giữa các proton của nhóm CH2-1″ với C-8″ chứng tỏ sự kết nối của C-2″ của hệ spin II với nhóm isopropenyl. Tiếp theo, tương tác của H-4″ với C-6″ và C-7″, tương tác của CH2-3″ với C-5″ chỉ ra sự có mặt của nhóm lavandulyl trong cấu trúc của G248-9. Sự có mặt của vòng B được khẳng định bằng tương tác của H- 3′ với C-1′, C-2′, C-4′ và C-5′. Tương tự, vòng A được thiết lập dựa trên tương tác HMBC của H-8 với C-6, C-7, C-9 và C-10. Các đặc trưng về phổ của hệ spin I và tương tác của các proton trong hệ spin này với nhóm carbonyl (C 198,5) trên phổ HMBC chứng tỏ G248-9 là một flavanone. Sự kết nối của nhóm lavandulyl với vòng A ở C-6 qua C-6/C- 1″ được chứng minh dựa trên tương tác HMBC giữa các proton CH2-1″ với C-5, C-6 và C- 7. Cuối cùng, nhóm methoxy ở H 3,83 tương tác HMBC với C-7(C 161,9), C-8 (C 93,6) và tương tác ROESY giữa các proton của nhóm methoxy với H-8, điều này xác định vị trí của nhóm này tại C-7 và nhóm methoxy ở H 3,82 tương tác HMBC với C-4′(C 159,0) và tương tác ROESY giữa các proton của nhóm methoxy với H-3′, H-5′ giúp ta xác định vị trí của nhóm này tại C-4′. Từ các dữ liệu phổ MS, 1D, 2D –NMR của G248-9 và so sánh với chất tham khảo G246-1 có thể khẳng định được cấu trúc của G248-9 là 6-lavandulyl-7,4′- dimethoxy-5,2′-dihydroxylflavanone. Phổ CD của G248-9 cho hiệu ứng Cotton dương tại 336 nm (Δ +2,7) và hiệu ứng Cotton âm tại 292 nm (Δ - 8,5), cho phép xác định cấu hình tuyệt đối tại C-2 là 2S [90]. Cấu hình tuyệt đối tại vị trí C-2″ của G248-9 được xác định dựa vào phương pháp tính toán lượng tử hóa học điện tử lưỡng sắc tròn (ECD - Electronic Circular Dichroism) dựa trên phần mềm Gaussian 09. Tính toán lý thuyết cho 2 đồng phân 2S,2″S- và 2S,2″R- cho phép xác định cấu hình 2S,2″S của hợp chất G248-9 phù hợp với mô hình tính toán (Hình 4. 66). Từ các phân tích trên HR-ESI-MS, phổ IR, 1D và 2D 18 NMR, phổ CD và ECD đã thiết lập nên cấu trúc của G248-9 là (2S,2″S)-6-lavandulyl-7,4′- dimethoxy-5,2′-dihydroxylflavanone. Tra cứu trên cơ sở dữ liệu Scifinder cho phép kết luận đây là hợp chất mới. Bảng 4. 3. Dữ liệu phổ NMR của hợp chất G248-9 và hợp chất tham khảo G246-1 a) đo trong CD3OD; δC # số liệu của hợp chất tham khảo G246-1 Vị trí C #,a C a H (độ bội, J, Hz) 2 75,5 75,0 5,55 (dd, 2,5; 13) 3 48,2 45,4 2,67 (dd, 2,5; 17,0) 2,89 (dd, 13,5; 17,0) 4 193,9 193,6 5 164,9 164,7 6 109,6 109,6 7 161,9 161,9 8 93,4 93,6 6,12 (s) 9 164,9 165,4 10 105,7 105,6 1′ 118,5 119,7 2′ 156,6 160,1 3′ 103,4 99,8 6,49 (d, 2,0) 4′ 159,5 159,0 5′ 107,6 108,1 6,47 (dd, 2,0; 8,5) 6′ 128,5 128,5 7,38 (d, 8,5) 1′′ 28,2 28,2 2,63 (m) 2′′ 48,2 48,2 2,50 (m) 3′′ 32,4 32,3 2,02 m 4′′ 124,8 124,8 4,96 (t, 5,5) 5′′ 132,0 132,0 6′′ 17,8 17,8 1,48 (s) 7′′ 25,9 25,8 1,57 (s) 8′′ 149,8 149,8 9′′ 111,2 111,2 4,52 (s)/ 4,59 (s) 10′′ 19,2 19,1 1,64 (s) OMe 55,9 55,9 3,83 (s) OMe 55,9 3,82 (s) 19 4.8.2. Hợp chất G248-12: (2″S)-5′-lavandulyl-2′-methoxy-2,4,4′,6′- tetrahydroxylchalcone Hình 4. 3. Cấu trúc hóa học, các tương tác HMBC (H→C), COSY (H─H) của hợp chất G248-12 và cấu trúc hóa học hợp chất tham khảo Hợp chất G248-12 thu được dưới dạng chất rắn vô định hình màu vàng, độ quay cực [α]25D -1,8 (c 0,54, CH2Cl2). Phổ khối phân giải cao chỉ ra pic ion giả phân tử ở m/z 439,2115 [M+H]+ (tính toán lý thuyết cho công thức phân tử C26H31O6 là 439,2121), kết hợp với các dữ liệu trên phổ 13C-NMR gợi ý đến công thức phân tử C26H30O6 cho hợp chất G248-12. So sánh các dữ liệu phổ 1D-NMR của hợp chất G248-12 với dữ liệu phổ NMR của Kuraridin đã được phân lập từ loài Sophora flavescen [115] cho thấy 2 hợp chất là giống nhau (xem bảng 4.23). Từ các dữ liệu phổ 1D- NMR và 2D-NMR của hợp chất G248-12 và so sánh với chất tham khảo Kuraridin [115] và G246-2 giúp ta xác định cấu trúc phẳng của G248-12 là 5′-lavandulyl-2′-methoxy-2,4,4′,6′- tetrahydroxylchalcone. Tuy nhiên hai hợp chất có độ quay cực khác nhau nên về mặt cấu trúc lập thể của hợp chất G248-12 là khác với kuraridin (có độ quay cực [α]25D −25.5 (c 0,1, MeOH). Cấu hình tuyệt đối tại vị trí C-2″ của G248-12 được xác định dựa vào phương pháp tính toán lượng tử hóa học điện tử lưỡng sắc tròn (ECD - Electronic Circular Dichroism) dựa trên phần mềm Gaussian 09. Tính toán lý thuyết cho 2 đồng phân 2″S- và 2″R- cho phép xác định cấu hình 2″S của hợp chất G248-12 phù hợp với mô hình tính toán (Hình 4. 76). Kết hợp phân tích các phổ 1D, 2D-NMR phổ CD và ECD chúng tôi đã xác định được G248-12 là (2″S)-5′-lavandulyl-2′- methoxy-2,4,4′,6′-tetrahydroxylchalcone. Tra cứu trên cơ sở dữ liệu Scifinder cho phép kết luận đây là hợp chất mới. 20 Bảng 4. 4. Dữ liệu phổ NMR của hợp chất G248-12 và hợp chất tham khảo a) đo trong CD3OD; # δC, *δC số liệu của hợp chất tham khảo G246-2 và kuraridin [115] Nhận xét chung về các hợp chất thứ cấp tách chiết từ 3 chủng xạ khuẩn biển nghiên cứu: Từ 3 chủng xạ khuẩn thể hiện hoạt tính kháng VSVKĐ và hoạt tính gây độc tế bào bao gồm G246, G261, G248 đã phân lập và xác định cấu trúc hóa học 36 hợp chất. Tuy nhiên có nhiều hợp chất giống nhau nên thực tế chỉ thu được 26 hợp chất khác nhau. Trong đó có 6 hợp chất thuộc lớp chất flavonoids, 9 hợp chất thuộc lớp chất dicyclopeptid và 3 hợp chất indol và các hợp chất khác. Các hợp chất mới là G246-1, G246-2, G248-9, G248-11, G248-12 đều thuộc lớp chất flavonoids. Vị trí #C a (G246-2) *C a (Kuraridin) C a H (độ bội, J, Hz) 1 116,5 125,0 124,4 2 156,9 160,3 160,3 3 106,2 103,7 103,7 6,37 (d, 2) 4 159,1 162,4 162,4 5 109,1 108,9 109,0 6,36 (m) 6 131,0 131,6 131,6 7,42 (d, 8,0) 1′ 106,2 108,9 108,8 2′ 161,0 164,0 164,0 3′ 90,9 91,6 91,6 6,02 (s) 4′ 161,0 162,4 162,3 5′ 107,4 116,3 116,2 6′ 165,8 166,6 166,6 1′′ 29,7 28,2 28,2 2,64 (m) 2′′ 46,5 48,0 48,0 2,57 (m) 3′′ 31,9 32,4 32,4 2,10 (m) 4′′ 122,8 125,0 125,0 5,06 (m) 5′′ 132,9 131,8 131,8 6′′ 18,0 17,9 17,9 1,58 (s) 7′′ 25,8 25,9 25,9 1,65 (s) 8′′ 150,5 149,9 149,9 9′′ 110,7 111,1