Tóm tắt Luận án Nghiên cứu phối hợp esterase và hệ enzyme thủy phân từ nấm trong chuyển hóa phụ phẩm công - Nông nghiệp để thu nhận bioethanol

2.3.3. Sơ đồ lên men bioethanol từ dịch đường chuyển hóa Chương 3: Kết quả và thảo luận 3.1. Phân lập và sàng lọc nấm Từ các mẫu nấm thu từ rừng QG Cúc Phương (Ninh Bình) đã phân lập được 44 chủng nấm thuộc 13 họ và định tên khoa học đến loài. Các taxon nấm phân lập được: 3.1.1. Ngành nấm đảm Basidiomycota Họ Polyporaceae: Coriolus unicolor, Tyromyces lacteus, Trametes insularis, Tr. consors, Tr. gibbosa, Hexagonia apiaria, Nigroporus aratus Họ Ganodermataceae: Ganoderma komingshegii, G. applanatum, Ganoderma sp. 5 Họ Coriolaceae: Poria versipora Họ Marasmiaceae: Campanella junghuhnii, Marasmius maximus Họ Agaricaceae: Coprinus disseminates Họ Mycenaceae: Mycena galericulata Họ Auriculariaceae: Auricularia delicate Họ Hymernochaetaceae: Inonotus substygius, Polystictus didrichsenii Họ Hygrophoropsidaceaee: Hygrophoropsis aurantiaca 3.1.2. Ngành nấm túi Ascomycota Họ Xylariaceae: Xylaria polymorpha, X. carpophila, Hypoxylon monticulosum (CP629), Rosellinia sp. (CP564), Nodulisporium sp. (CP582). Họ Helotiaceae: Bisporella citrine Họ Pleosporaceae: Alternaria tenuissima (SP66) Họ Bionectriaceae: Bionectria sp. (CP587) 3.2. Khả năng sinh tổng hợp esterase và lựa chọn chủng nấm 3.2.1. Sàng lọc hoạt tính feruloyl esterase (FAE) Khả năng sinh tổng hợp feruloyl esterase của 44 chủng nấm lựa chọn được đánh giá qua khả năng phân giải cơ chất ethyl ferulate (ethyl 4-hydroxy-3-methoxycinnamate) trên đĩa thạch. Chủng Alt. tenuissima SP66 do biểu hiện hoạt tính feruloyl esterase cao nên được lựa chọn cho những nghiên cứu tiếp theo để xác định các điều kiện nuôi cấy như thời gian, cơ chất/nguồn carbon, nguồn nitơ, nhiệt độ và pH. 3.2.2. Sàng lọc hoạt tính acetyl esterase (AE) Dịch lên men của 44 chủng nấm sau khi ly tâm để loại bỏ sinh khối và các thành phần tạp để xác định hoạt tính acetyl esterase (AE) qua khả năng thủy phân cơ chất p-nitrophenyl acetate. Chủng X. polymorpha A35 do biểu hiện hoạt tính acetyl esterase cao nên được lựa chọn cho những nghiên cứu tiếp. Sau khi sàng lọc hoạt tính feruloyl esterase và acetyl esterase đã lựa chọn hai chủng nấm có hoạt tính cao là Alt. tenuissima SP66 và X. polymorpha A35. Sau đó các nghiên cứu về tối ưu các điều kiện lên men sinh tổng hợp enzyme, tinh sạch và đặc tính AE và FAE cũng như sử dụng enzyme cho xúc tác chuyển hóa sinh khối lignocellulose sẽ được thực hiện. 3.3. Định danh nấm bằng phương pháp sinh học phân tử Hình 3.1. (A) Hình ảnh điện di ADN tổng số trên gel agarose 1% và (B) Sản phẩm PCR của nấm SP66 và A35 SP66 A35 M SP66 A35 A B 6 Từ kết quả phân loại bằng phương pháp sinh học phân tử và phân tích hình thái bào tử có thể kết luận mẫu nấm phân lập ký hiệu SP66 là loài nấm túi Alternaria tenuissima SP66 thuộc họ Pleosporaceae và chủng nấm A35 là Xylaria polymorpha A35 thuộc họ Xylariaceae. 3.4. Động học sinh tổng hợp enzyme esterase Tối ưu hóa được các điều kiện sinh tổng hợp acetyl esterase và feruloyl esterase của hai chủng nấm X. polymorpha A35 và Alt. tenuissima Sp66 như sau: Hoạt tính acetyl esterase: Chủng X. polymorpha A35 nuôi cấy trên môi trường cơ bản có bổ sung nguồn cơ chất rơm, nguồn nitơ là pepton, thời gian nuôi cấy 10 ngày, nhiệt độ 25oC, pH 7, có khuấy lắc 200 v/ph, khi đó, hoạt tính acetyl esterase cao nhất đạt 135,4 U/l. Hoạt tính feruloyl esterase: Chủng Alt. tenuissima nuôi cấy trên môi trường cơ bản có bổ sung nguồn cơ chất rơm, thời gian nuôi cấy 12 ngày, nhiệt độ 25oC, pH 7, có khuấy lắc 200 v/ph, khi đó, hoạt tính acetyl esterase cao nhất đạt 1154,4 U/l. 3.5. Tinh sạch enzyme từ môi trường nuôi cấy nấm 3.5.1. Tinh sạch và đặc tính acetyl esterase của nấm X. polymorpha A35 (XpoAE) Dịch chiết enzyme thô từ môi trường nuôi cấy nấm sau 3 tuần được cô đặc bằng siêu lọc (màng lọc 10 kDa cut-off). Sau đó, protein enzyme biểu hiện hoạt tính XpoAE đối với cơ chất p-nitrophenyl acetate được tinh sạch bằng sắc ký lỏng. Bước đầu tiên của quá trình rửa giải protein được thực hiện qua cột sắc ký trao đổi anion DEAE Sepharose và kết quả đã thu được 3 phân đoạn hoạt tính enzyme XpoAE (ký hiệu phân đoạn I, II và III). Tổng thể tích rửa giải của phân đoạn hoạt tính enzyme cao nhất (phân đoạn III) được nạp tiếp lên cột SuperdexTM 75. Sau bước sắc ký lọc gel này, một phân đoạn hoạt tính enzyme XpoAE được thu (Hình 3.2). Sau quá trình tinh sạch đã thu được lượng protein enzyme tinh sạch là 20,6 mg, tương đương 27 U và hiệu suất 26,8 % với độ tinh sạch 18,3 lần. Phân đoạn enzyme tinh sạch này được sử dụng cho các nghiên cứu tiếp theo về đặc tính protein enzyme cũng như nghiên cứu chuyển hóa in vitro vật liệu giàu lignocellulose (Bảng 3.1). Hình 3.2. Tinh sạch XpoAE từ nấm X. polymorpha A35 qua các bước sắc ký lỏng (A) sắc ký trao đổi anion DEAE Sepharose và (B) sắc ký lọc gel SuperdexTM 75; (─) độ hấp thụ ở λ=280 nm và (●) hoạt tính XpoAE trên cơ chất p-nitrophenyl acetate 7 Bảng 3.1. Các bước tinh sạch enzyme XpoAE Các bước tinh sạch Protein tổng (mg) Hoạt tính tổng (U) Hoạt tính riêng (U mg-1) Hiệu suất (%) Độ tinh sạch (lần) Dịch chiết thô 1408,0 1009 0.7 100 1,0 Siêu lọc 30-10 kDa 872,1 944 1.1 93,6 1,5 DEAE Sepharose (phân đoạn III) 86,0 432 5.0 42,8 7,0 SuperdexTM 75 20,6 270 13.1 26,8 18,3 Đặc tính hóa-lý của XpoAE: Điện di SDS-PAGE của phân đoạn III qua các bước tinh sạch ở trên cho thấy một vạch protein hoạt tính XpoAE sau khi nhộm với Colloidal Blue Staining Kit với trọng lượng phân tử MW = 44 kDa. Trong khi đó, điện di điểm đẳng điện IEF cho thấy 2 vạch protein gần kề có giá trị pI lần lượt là 3,5 và 3,6 (Hình 3.3). Đặc tính hóa-lý của XpoAE tương ứng với đặc tính của các AE đã công bố (34-56 kDa). Hình 3.3. Protein tinh sạch (1,3) biểu hiện hoạt tính acetyl esterase (XpoAE) trên gel điện di SDS-PAGE (A) và IEF (B); (2,4) protein marke Nhiệt độ và pH tối ưu: Để xác định nhiệt độ phản ứng tối ưu, phản ứng giữa enzyme XpoAE tinh sạch và cơ chất p-nitrophenyl acetate được tiến hành trong khoảng nhiệt độ từ 35-70°C. Kết quả cho thấy, hoạt tính XpoAE tăng dần từ 40% ở nhiệt độ 35°C lên cực đại ở 42°C (100%). Sau đó, khi tăng nhiệt độ thì hoạt tính của enzyme giảm dần chỉ còn 51% ở 61°C (Hình 3.4-B). Giá trị pH 5,0 thích hợp. Hoạt động tương đối giảm dần từ 100% ở pH 6,5 xuống 57% ở pH 7.0 (Hình 3.4-A). Hình 3.4. Ảnh hưởng của pH (A) và nhiệt độ (B) đến hoạt tính enzyme XpoAE tinh sạch 8 Độ bền nhiệt và pH của enzyme XpoAE: Enzyme tương đối bền ở nhiệt độ 400C sau 3 giờ ủ, sau đó giảm hơn 50% hoạt tính khi ủ thời gian 4 giờ và lâu hơn. Hoạt tính của enzyme giảm nhanh ở 600C và mất hầu hết hoạt tính sau 1 giờ ủ ở nhiệt độ này. Enzyme tinh sạch cho thấy bền hoạt tính ở pH 5,0 nhưng mất trên 90% hoạt tính trong thời gian ủ 1 giờ dưới điều kiện axít mạnh (pH 3; Hình 3.5). Enzyme XpoAE tinh sạch từ nấm X. polymorpha A35 tương đối bền trong khoảng nhiệt độ 40°C ở pH 5. Hình 3.5. Độ bền enzyme XpoAE tinh sạch từ nấm X. polymorpha A35 ở các điều kiện nhiệt độ (A) và pH (B) khác nhau: (A): ♦ 40 oC, ▲60 oC; (B): ▲ pH 3, ● pH 5, ♦ pH 6 3.5.2. Tinh sạch và đặc tính feruloyl esterase của Alt. tenuissima SP66 (AltFAE) Dịch enzyme thô từ môi trường nuôi cấy nấm sau 2 tuần được siêu lọc 10 kDa cut-off, qua đó các protein và tạp chất có trọng lượng phân tử nhỏ cũng được loại bỏ. Sau đó, protein enzyme biểu hiện hoạt tính feruloyl esterase đối với cơ chất methyl ferulate được tinh sạch bằng sắc ký lỏng. Bước đầu tiên của quá trình rửa giải protein được thực hiện qua cột sắc ký trao đổi anion DEAE Sepharose. Sau bước sắc ký thứ nhất độ tinh sạch tăng không đáng kể (từ 1,4 lần) nhưng có thể loại phần lớn các chất mầu (có thể là các hợp chất polyphenolic) khỏi protein hoạt tính FAE đích. Tổng thể tích rửa giải của phân đoạn hoạt tính enzyme cao nhất được nạp tiếp lên cột SuperdexTM 75. Hiệu quả tinh sạch cao nhất ở bước sắc ký lọc gel này, thể hiện ở độ tinh sạch tăng từ ~12 lên ~30 lần với hiệu suất ~ 44%). Trong khi đó, sử dụng sắc ký trao đổi anion mạnh (Q Sepharose; Hình 3.6) ở bước tiếp theo độ tinh sạch tăng lên 35,8 lần nhưng lượng protein và tổng hoạt tính tương ứng với hiệu suất tinh sạch giảm tới gần ½ (hiệu suất cuối 28,9%; Bảng 3.2). Như vậy, bước tinh sạch cuối cùng cần thiết cho các nghiên cứu cơ bản (yêu cầu độ tinh sạch tối đa), trong nghiên cứu ứng dụng enzyme AltFAE từ Alt. tenuissima SP66 có thể sử dụng ngay sau bước sắc ký lọc gel để đảm bảo hiệu suất thu hồi cao và tiết kiệm thời gian, chi phí. 9 Hình 3.6. Tinh sạch AltFAE từ nấm Alt. tenuissima SP66 qua cột sắc ký trao đổi anion Q Sepharose® (●) Hoạt tính AltFAE đối với cơ chất methyl ferulate, (─) protein hấp thụ ở λ=280 nm Bảng 3.2. Tinh sạch enzyme AltFAE từ dịch lên men nấm Alt. tenuissima SP66 Các bước tinh sạch Protein tổng (mg) Hoạt tính tổng (U) Hoạt tính riêng (U mg-1) Hiệu suất (%) Độ tinh sạch (lần) Dịch chiết thô 1673,2 523,7 0,3 100 1,0 Siêu lọc 10 kDa 259,5 421,7 1,6 80,5 5,2 DEAE Sepharose 79,1 305,4 3,9 58,3 12,3 SEC SuperdexTM 75 24,1 228,3 9,5 43,6 30,3 Q Sepharose® 13,5 151,2 11,2 28,9 35,8 Đặc tính hóa-lý của AltFAE: Điện di SDS-PAGE sau bước tinh sạch cuối cùng qua cột Q Sepharose® cho thấy một băng protein biểu hiện hoạt tính FAE (cơ chất methyl ferulate) sau khi nhộm với Colloidal Blue Staining Kit với trọng lượng phân tử MW=30,3 kDa (Hình 3.7). Hình 3.7. Protein tinh sạch (1) biểu hiện hoạt tính feruloyl esterase (AltFAE) trên gel điện di SDS-PAGE (A); (2) protein marker 10 Nhiệt độ và pH tối ưu: Nhiệt độ enzyme AltFAE được xác định trong khoảng từ 30-800C và pH từ 4,0-9,0. Hoạt tính tương đối giảm dần từ 100% ở pH 7.0 xuống 84% ở pH 9.0 (Hình 3.8-A). Enzyme được tinh sạch ổn định trong suốt 2 giờ ủ ở pH trung hòa với hoạt tính còn lại là 97% ở pH 6.0 và 89% ở pH 8.0. Ngược lại, khi ủ ở môi trường axit (pH 4.0) làm mất hoạt độ enzyme 57% sau 2 giờ ủ. Khi ủ ở 600C làm cho hoạt tính mất hơn 50% trong vòng 2 giờ, trong khi hơn một nửa hoạt độ ban đầu vẫn được xác định sau 8 giờ ủ ở 400C, khi nhiệt độ tăng lên đến 700C hoạt tính enzyme giảm chỉ còn 30%. Do vậy, nhiệt độ tối ưu của enzyme AltFAE là 42°C và pH 7 (Hình 3.8-B). Hình 3.8. Ảnh hưởng của nhiệt độ (A) và pH (B) lên enzyme AltFAE Phản ứng được thực hiện ở nhiệt độ từ 30-80°C và pH từ 4-9. Các thí nghiệm được thực hiện ba lần, độ lệch chuẩn (SD) <5% Độ bền nhiệt và pH của enzyme AltFAE: Enzyme tương đối bền ở nhiệt độ 250C và 400C sau 2 giờ ủ, sau đó giảm hơn 10% hoạt tính sau 4 giờ ủ ở 250C và giảm 35% khi ủ lâu hơn 2 giờ ở 400C. Hoạt tính của enzyme giảm nhanh ở 60oC và mất hầu hết hoạt tính sau 1 giờ ủ ở nhiệt độ này. Enzyme tinh sạch cho thấy bền hoạt tính ở môi trường có pH 5 và pH 6 nhưng mất trên 75% hoạt tính trong thời gian ủ 2 giờ dưới điều kiện môi trường pH 8 (Hình 3.9). Hình 3.9. Độ bền nhiệt của AltFAE ở nhiệt độ (A) và pH (B) khác nhau theo thời gian 11 (A): 25°C (KH: kim cương), 40°C (KH: vòng tròn), 60°C (KH: tam giác); (B): pH 10 (KH: kim cương), pH 8.0 (KH: vòng tròn), pH 7.0 (KH: sao), pH 5.0 (KH: tam giác) Kết quả phân tích peptide của AltFAE: Trình tự chuỗi peptide của protein biểu hiện hoạt tính AltFAE từ nấm Alt. tenuissima SP66 được xác định thành công bằng phổ khối lượng ESI-MS (Hình 3.10 & Bảng 3.3) là cơ sở phân loại ban đầu và có thể sử dụng dữ liệu cho thiết kế mồi (primer) xác định gen mã hóa cho protein này. Hình 3.10. Dữ liệu phổ ESI-MS/MS các đoạn peptide của AltFAE tinh sạch Bảng 3.3. Các đoạn peptide của enzyme AltFAE tinh sạch từ nấm Alt.tenuissima SP66 xác định bằng thủy phân với trypsin và LC-ESI-MS/MS Peptide* Trọng lượng phân tử (Da) GAYSLSLR 865,99 GFFLFVEGGR 1128,3 GSSIFGLAPGK 1033,19 GKVALDDLLTQR 1327,75 LNTLETEEWFFK 1556,75 LNTLETEEWFFK 1556,75 *Ký hiệu cho các axit amin theo quy định của IUPAC (International Union of Pure and Applied Chemistry) 3.5.3. Quy trình lên men, chiết tách và tinh sạch esterase từ nấm + Tinh sạch enzyme XpoAE từ nấm X. polymorpha A35 Quy trình lên men sinh tổng hợp và tinh sạch esterase bao gồm các bước chính sau: Nuôi cấy nấm và sinh tổng hợp enzyme trên môi trường lên men dịch thể (5 L/mẻ): Chủng X. polymorpha A35 được lên men 5 lít/mẻ trong môi trường cơ bản (cho mỗi 1 lít) với thành phần như sau: MgSO4: 0,5 g; KH2 PO4: 1,5 g; Cao nấm men: 2,0 g; Dịch nguyên tố vi lượng (vết): 1 mL. Môi trường cơ bản có bổ sung nguồn cơ chất rơm, nguồn nitơ là pepton, nhiệt độ 25oC, pH 7 trong điều kiện nuôi lắc 200 v/ph, thời gian lên men 10 ngày. Song song với quá trình lên men lỏng thì chủng nấm trên cũng được lên men rắn sử dụng 2-3 kg rơm khô được ngâm trong nước qua đêm sau đó cho vào các túi plastic chịu nhiệt và khử trùng ở 1210C trong 30 phút. Sử dụng 2-3 hộp peptri môi trường thạch-malt có khuẩn ty nấm nghiền đồng thể. Tiếp theo, cấy chuyển toàn bộ dịch khuẩn ty vào mỗi túi plastic với cơ chất rơm, toàn bộ quá trình 12 nuôi cấy được thực hiện ở điều kiện vô trùng. Khuẩn ty nấm được ủ ở 230C trong khoảng từ 10 - 14 ngày, sau đó môi trường lên men bề mặt được chiết với nước cất (d.H2O) qua đêm trên máy lắc. Chiết tách dịch enzyme thô bằng siêu lọc: Sau khi nuôi cấy ở các điều kiện thích hợp trên môi trường rắn và lỏng, enzyme sẽ được lọc sơ bộ qua vải thô và giấy lọc (GF6 và RC 55, WhatmanTM, Trung Quốc). Dịch chiết có hoạt tính esterase được loại khuẩn ty nấm và cơ chất bằng ly tâm 5000-10 000 v/ph và siêu lọc 5, 10 và 30 kDa cut-off (hệ LongerPump K235 với màng UFP 30MW, Amersham BioScience, Westborough, MA, USA, hoặc Vivaflow200, màng Polyethersulfon 10MW, Sartorius, Goettingen, CHLB Đức, hoặc amicon Ultra Centrifugal Filters, 5MW, Millipore, Bedford, USA) ở 11oC. Tinh sạch protein enzyme bằng sắc ký: Để thu acetyl esterase tinh sạch từ nấm X. polymorpha A35 dịch enzyme thô biểu hiện hoạt tính esterase được tinh sạch qua các bước sắc ký trao đổi ion và sắc ký lọc gel sử dụng cột DEAE Sepharose và SuperdexTM 75 (GE Healthcare, Freiburg, CHLB Đức). Bước đầu tiên được thực hiện trên cột trao đổi ion DEAE Sepharose ở pH 4,5 với đệm Na-acetate 50 mM. Sau khi lọc rửa có thể thu được các phân đoạn hoạt tính với lượng 86,0 mg protein hoạt tính AE (43,2 U). Bước tiếp theo sử dụng phương pháp sắc ký lọc gel qua cột SuperdexTM 75 ở pH 6,5 với đệm Na-acetate 50 mM và nồng độ NaCl 100 mM, phân đoạn hoạt tính acetyl esterase (đối với cơ chất p-nitrophenyl acetate). Các phân đoạn hoạt tính enzyme được trộn lẫn, cô đặc và thẩm tách qua màng lọc kích thước 10 kDa như trên với đệm Na-acetate 10 mM (pH 6,0) và bảo quản ở -200C. Sau quá trình tinh sạch thu được 20,6 mg protein enzyme/mẻ tương đương hoạt tính enzyme tổng là 270 U. Protein sau mỗi bước siêu lọc và sắc ký được đo hoạt độ, đánh giá độ tinh sạch và xác định trọng lượng phân tử bằng điện di SDS-PAGE (Novex Xcell SureLock mini cell; Laemmli 1970) và Native-IEF (Novex IEF gel) (Hình 3.11). 13 Hình 3.11. Quy trình chiết tách và tinh sạch XpoAE từ nấm X. polymorpha A35 Dịch chiết môi trường lên men X. polymorpha A35 (5 L/mẻ môi trường lỏng và 2-3 kg rắn, protein tổng 1408 mg) Dịch sau ly tâm - Lọc chân không (Whatman GF6) - Ly tâm 5000 v/ph trong 10 phút Cặn ly tâm (Loại bỏ) Siêu lọc 30kDa cut-off (cô đến 1000 ml) Siêu lọc 10kDa cut-off (872 mg protein) Sắc ký DEAE Sepharose Sắc ký lọc gel SuperdexTM 75 X ác đ ịn h ho ạt đ ộ en zy m e; đ ịn h lư ợn g pr ot ei n Đ iệ n di S D S -P A G E và IE F Acetyl esterase tinh sạch (20,6 mg protein, 270 U enzyme) 14 + Tinh sạch enzyme AltFAE từ nấm Alt. tenuissima SP66 Quy trình lên men sinh tổng hợp và tinh sạch esterase bao gồm các bước chính sau: Nuôi cấy nấm và sinh tổng hợp enzyme trên môi trường lên men dịch thể (5 L/mẻ): Nấm Alt.tenuissima SP66 được nuôi cấy trên môi trường cơ bản, sau đó, bổ sung nguồn cơ chất rơm, thời gian nuôi cấy 12 ngày, nhiệt độ 25oC, pH 7 trong các bình Erlenmeyer 1000 ml hoặc trên thiết bị lên men AmAr (Mumbai, Ấn Độ) ở điều kiện có sục khí và lắc liên tục 200 v/ph. Chiết tách dịch enzyme thô bằng siêu lọc: Sau khi nuôi cấy ở các điều kiện tối ưu, enzyme sẽ được lọc sơ bộ qua vải thô và giấy lọc (GF6 và RC 55, WhatmanTM, Trung Quốc). Dịch chiết có hoạt tính enzyme esterase được loại khuẩn ty nấm và cơ chất bằng ly tâm 5000-10000 v/ph và siêu lọc 10 và 30 kDa cut-off (UFP 30MW, Amersham BioScience, hoặc Vivaflow 200, Polyethersulfon 10MW, Sartorius hoặc 5MW, Millipore) ở 110C. Tinh sạch protein enzyme bằng sắc ký: Dịch enzyme thô biểu hiện hoạt tính esterase được tinh sạch qua các bước sắc ký trao đổi ion và sắc ký lọc gel sử dụng cột DEAE Sepharose, Q sepharose và SuperdexTM 75 (GE Healthcare, Freiburg, CHLB Đức) với đệm rửa giải Na-acetate (10mM; pH 4,5), NaCl từ 0-1 M và cột Superdex 75, đệm Na-acetate (50mM; pH 6,5). Protein rửa giải được xác định trực tiếp sử dụng đầu dò ở λ=280nm hoặc bằng phương pháp so màu theo quy trình của Bradforf (1976) ở λ=590/450nm. Các phân đoạn có hoạt tính esterase được gộp chung, cô loại bớt dịch và hòa lại với đệm Na-acetate 10mM, pH 6,0. Mẫu được lưu giữ ở -200C. Bước tinh sạch cuối cùng được thực hiện với cột trao đổi anion ở pH 5,0 với đệm Na-acetate 50 mM. Từ 5L dịch lên men sau quá trình tinh sạch có thể thu được 13,5 mg protein enzyme FAE/mẻ tương đương hoạt tính enzyme tổng là 151,2 U. Protein sau mỗi bước siêu lọc và sắc ký được đo hoạt độ, đánh giá độ tinh sạch và xác định trọng lượng phân tử bằng điện di SDS-PAGE (Novex Xcell SureLock mini cell; Laemmli 1970) (Hình 3.12). 15 Hình 3.12. Quy trình chiết tách và tinh sạch AltFAE từ nấm Alt. tenuissima SP66 X ác đ ịn h ho ạt đ ộ en zy m e; đ ịn h lư ợn g pr ot ei n Đ iệ n di S D S -P A G E và IE F Dịch môi trường lên men Alt.tenuissima SP66 (5 L/mẻ; protein 1673 mg) Dịch sau ly tâm - Lọc chân không (Whatman GF6) - Ly tâm 5000 v/ph trong 10 phút Cặn ly tâm (Loại bỏ) Siêu lọc 10 kDa cut-off (cô đến 500 ml; 259,5 mg protein) Sắc ký DEAE Sepharose Sắc ký lọc gel SuperdexTM 75 Sắc ký Q Sepharose Feruloyl esterase tinh sạch (13,5 mg protein; 151,2 U enzyme) 16 3.6. Sàng lọc nguồn cơ chất giàu lignocellulose cho chuyển hóa sinh học Tiến hành đánh giá sản phẩm đường khử sau chuyển hóa trên 5 cơ chất là rơm rạ (RR), bã mía (MIA), bã cà phê (CAF), mùn gỗ (MG), rong túi (RT) bằng hỗn hợp “enzyme cocktail” (Cell/Xyl = 50 U/gds, AltFAE = 5 U/gds và XpoAE = 5 U/gds) theo các thí nghiệm khác nhau, phản ứng được ủ trong 24 giờ , ở 400C, sản phẩm chuyển hóa được xác định bằng sắc ký bản mỏng (TLC). Hình 3.13. Vết chất đường đơn xuất hiện trên bản mỏng Các chất chuẩn là các đường khử có khả năng lên men: glucose (Rf (Glu) = 0,34), galactose (Rf(Gla)= 0,28), xylose (Rf(Xyl) = 0,48) và mannose (Rf(Man) = 0,325) Hàm lượng đường khử thu được sau chuyển hóa sinh học: Sử dụng phương pháp sắc ký bản mỏng (TLC) để xác định vết chất đường đơn trong dung dịch sau chuyển hóa bằng hỗn hợp enzyme (XpoAE, AltFAE và Cell/xyl) trên 5 cơ chất: rơm rạ, bã mía, bã cà phê, mùn gỗ, rong, bã mía được lựa chọn là vật liệu nguyên cứu do trên bản mỏng xuất hiện vết đường đơn đậm nét và tổng đường khử thu được cao nhất đạt 154,7mg/g. Hình 3.14. Tổng đường khử tạo thành sau chuyển hóa bằng các đơn enzyme và “enzyme cocktail” 3.7. Tối ưu hóa enzyme cocktail bằng mô hình quy hoạch thực nghiệm Áp dụng mô hình quy hoạch thực nghiệm đã xác định được các điều kiện tối ưu cho hỗn hợp enzyme cocktail để chuyển hóa bã mía (10%, w/v) thành các đường lên men, phản ứng diễn ra ở 400C, pH 5 và thời gian ủ 48 giờ. Sử dụng thuật toán flexible quy hoạch phi tuyến với phương trình quy hồi mô tả hiệu quả chuyển hóa 17 biểu thị qua tổng hàm lượng đường khử sinh ra phụ thuộc vào thành phần tham gia của mỗi enzyme đơn với hoạt độ enzyme (x) tương ứng: Cell/Xyl (x1), AltFAE (x2), XpoAE (x3), phương trình có dạng: y = 206,946 + 29,954x1 + 5,501x2 + 7,323x3 + 2,288x2x3 – 7,011 21x , tương ứng hoạt độ (U) của “enzyme cocktail” trên 1 gram bã mía sử dụng là Cell/Xyl = 100 U/gds, AltFAE = 7,56 U/gds, XpoAE = 10,8 U/gds với giá trị ymax = 251,86 mg/g. 3.8. Kết hợp xử lý hóa học nâng cao hiệu quả chuyển hóa 3.8.1. Kết hợp thủy phân bã mía bằng kiềm và “enzyme cocktail” Để nâng cao hiệu quả cho quá trình chuyển hóa bã mía trước khi thủy phân bằng “enzyme cocktail” ở điều kiện tối ưu, bã mía được xử lý bằng NaOH với các nồng độ khác nhau để đánh giá hiệu quả chuyển hóa. Bảng 3.4. Tổng đường khử sau thủy phân bã mía bằng kiềm và “enzyme cocktail” (*)Bã mía (10%; w/v) được nghiền nhỏ ngâm trong dung dịch NAOH, trong 2,5 giờ, ở 850C. Chuyển hóa sinh học sử dụng hỗn hợp “enzyme cocktail” (100U Cell/Xyl/gds, 7,56U AltFAE/gds và 10,8U XpoAE/gds), trong 48 giờ, ở 400C, pH 5.0. Các dữ liệu được trình bày là trung bình của hai lần lặp lại. 3.8.2. Kết hợp thủy phân bã mía bằng axít và “enzyme cocktail” Bảng 3.5. Tổng đường khử sau thủy phân bã mía bằng axít và “enzyme cocktail” Stt H2SO4 (C%) Tổng hàm lượng đường khử (mg/g) Xử lý bằng axít Xử lý bằng axít và “enzyme cocktail” (*) 1 0 0 198,2 2 0,05 42,51 253,1 3 0,1 74,23 319,5 4 0,15 81,58 304,8 5 0,2 97,32 294,9 6 0,3 90,15 269,2 7 0,4 74,81 227,2 8 0,5 70,97 193,7 9 0,6 68,07 156,8 Stt NaOH (M) Tổng hàm lượng đường khử (mg/g) Xử lý bằng kiềm Xử lý bằng kiềm và “enzyme cocktail” (*) 1 0 0 198,2 2 0,1 34,8 231,5 3 0,15 42,8 265,8 4 0,2 49,6 271,5 5 0,25 64,8 277,5 6 0,3 78,6 287,4 7 0,35 86,2 265,9 8 0,4 91,4 236,3 9 0,5 74,8 187,3 18 (*)Bã mía (10%; w/v) được nghiền nhỏ ngâm trong dung dịch H2SO4 trong 2,5 giờ, ở 850C. Chuyển hóa sinh học sử dụng hỗn hợp “enzyme cocktail” (Cell/Xyl/gds: 100U, AltFAE/gds: 7,56U, XpoAE/gds: 10,8U), trong 48 giờ, ở 400C, pH 5.0. Các dữ liệu được trình bày là trung bình của hai lần lặp lại. 3.8.3. Kết hợp thủy phân bã mía bằng thiết bị gia nhiệt và “enzyme cocktail” Bảng 3.6. Tổng đường khử sau thủy phân bã mía bằng thiết bị gia nhiệt và “enzyme cocktail” Tổng hàm lượng đường khử (mg/g) Thiết bị gia nhiệt Thiết bị gia nhiệt + “enzyme cocktail” (*) 32,18 221,73 (*)Bã mía (10%; w/v) nghiền nhỏ ngâm trong nước cất được thủy phân trong thiết bị gia nhiệt, ở 1210C trong 120 phút dưới áp suất 1 atm. Chuyển hóa sinh học sử dụng “enzyme cocktail” (Cell/Xyl/gds: 100U, AltFAE/gds: 7,56U, XpoAE/gds: 10,8U), trong 48 giờ, ở 400C, pH 5.0. Các dữ liệu được trình bày là trung bình của hai lần lặp lại. 3.8.4. Hàm lượng đường đơn trong dung dịch sau chuyển hóa Bảng 3.7. Hàm lượng carbohydrate sau chuyển hóa sinh học Enzyme Sản phẩm phản ứng (Carbohydrat; mg/g) Galactose Glucose Mannose Xylose Tổng Carbohydrat Hỗn hợp enzyme cocktail (Cell/Xyl, AltFAE & XpoAE) Không xác định 195,4 Không xác định 60,5 255,9 Trong các phương pháp thủy phân bã mía bằng kiềm, axít, gia nhiệt kết hợp với hỗn hợp “enzyme cocktail” (Cell/Xyl, AltFAE & XpoAE). Xác định được phương pháp thủy phân bã mía bằng axít H2SO4 loãng (0,1%, 850C, 2,5 giờ) kết hợp thủy phân bằng “enzyme cocktail” cho hiệu quả tốt nhất với tổng đường khử đạt 319,5 mg/g cơ chất. Trong đó, hàm lượng glucose và xylose, tương ứng là 195,4 mg/g và 60,4 mg/g và các đường lên men khác chiếm khoảng 18 %. 3.9. Nghiên cứu sản xuất bioethanol 3.9.1. Ảnh hưởng của thành phần môi trường Nguồn dinh dưỡng là một trong số những nhân tố tác động trực tiếp đến quá trình sinh trưởng, phát triển của vi sinh vật nói chung và nấm men Saccharomyces cerevisiae SH1 nói riêng. Do vậy, cần tiến hành nghiên cứu khảo sát để tìm ra môi trường lên men bioethanol thích hợp. Thí nghiệm được tiến hành trên hai môi trường BM (dịch đường sau chuyển hóa) và môi trường BM+ (dịch đường sau chuyển hóa bổ sung các thành phần từ môi trường hansen). Bổ sung 3% giống nấm men trên tổng thể tích dịch lên men, lên men ở 300C, pH = 4,8. Bảng 3.8. Hiệu suất quá trình lên men trên môi trường BM và BM+ Thời gian Kết quả 12 giờ 24 giờ BM(1) BM+ (2) BM(1) BM+ (2) Tổng đường khử còn lại (mg/g) 173,32 146,38 162,71 132,34 Hàm lượng bioethanol (g/l) 2,65 3,50 3,17 4,82 Hiệu suất (g/g) 0,026 0,035 0,031 0,048 (1)Môi trường lên men sử dụng dịch đường sau chuyển hóa 19 (2)Môi trường lên men sử dụng dịch đường sau chuyển hóa bổ sung thêm một số thành phần của môi trường Hansen 3.9.2. Thời gian lên men Thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của thời gian lên men được tiến hành ở 300C; pH 4,8, bổ sung 3% giống nấm men theo thể tích và sử dụng môi trường bổ sung các thành phần dinh dưỡng của môi trường Hansen. Bảng 3.9. Ảnh hưởng của thời gian đến hiệu suất lên men Stt Thời gian (giờ) OD620 Tổng đường khử còn lại (mg/g) Hàm lượng bioethanol (g/l) Hiệu suất (g/g) 1 6 0,243 187,9