Tóm tắt Luận án Nghiên cứu phương pháp điện di mao quản sử dụng detector độ dẫn không tiếp xúc xác định một số phụ gia thực phẩm

để định lượng các anion, cation cơ bản, phụ gia thực phẩm, kháng sinh, thuốc kích dục, thuốc gây mê, ma túy tổng hợp CHƢƠNG 2. NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Mục tiêu và nội dung nghiên cứu Mục tiêu của luận án là nghiên cứu phát triển ứng dụng của phương pháp điện di mao quản sử dụng detector độ dẫn không tiếp xúc theo kiểu kết nối tụ điện (CE - C4D) nhằm xác định một số chất phụ gia và kích thích sinh học trong mẫu thực phẩm và mẫu sinh học. Để đạt được mục tiêu nghiên cứu đề ra, các nội dung chính được thực hiện gồm: Khảo sát các điều kiện tối ưu để xác định đồng thời bốn acid hữu cơ (acid formic, acid acetic, acid propionic, acid butyric), bốn chất tạo ngọt (acesulfam kali, aspartam, cyclamat natri, saccharin)và ba chất tạo nạc lựa 7 chọn thuộc nhóm các β - agonist (sabutamol, ractopamin, metoprolol). Nghiên cứu phương pháp chiết pha rắn làm sạch và làm giàu salbutamol trong mẫu nước tiểu và mẫu thịt lợn nhằm xác định bằng phương pháp CE - C4D. Áp dụng các điều kiện tối ưu thu được để phân tích các mẫu thực tế, đánh giá độ tin cậy của phương pháp phân tích. 2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu 2.2.1. Phương pháp CE - C 4 D Nghiên cứu được thực hiện trên hệ thiết bị điện di mao quản sử dụng detector độ dẫn không tiếp xúc kết nối kiểu tụ điện (CE -C4D). Một hệ thiết bị CE cơ bản bao gồm các bộ phận: Mao quản tách, dung dịch đệm điện di, nguồn điện thế cao, detector (cảm biến) độ dẫn không tiếp xúc kết nối kiểu tụ điện (C4D) và bộ phận điều khiển. 2.2.2. Phương pháp khảo sát các điều kiện tối ưu Việc khảo sát các điều kiện tách đồng thời các chất phân tích được thực hiện trên thiết bị điện di CE-C4D với cột mao quản có chiều dài 60 cm, đường kính trong 50 µm. Bơm mẫu bằng phương pháp thuỷ động lực học kiểu xi phông. Các điều kiện này được giữ nguyên trong tất cả các thí nghiệm. Ngoài ra cũng khảo sát một số điều kiệnkhác bao gồm: Dung dịch đệm điện di, thế điện di, chiều cao và thời gian bơm mẫu theo phương pháp đơn biến. 2.2.3. Phương pháp lấy mẫu và xử lý mẫu thực phẩm Các mẫu thực phẩm được lấy ngẫu nhiên trên địa bàn Hà Nội. Các mẫu ở dạng lỏng chỉ cần lọc qua màng lọc 0,45 µm, pha loãng với tỷ lệ phù hợp. Các mẫu ở dạng rắn được đồng nhất mẫu, thêm nước cất đề ion, rung siêu âm trong khoảng thời gian hợp lý sau đó lọc qua màng lọc. 2.2.4. Phương pháp lấy mẫu và xử lý, làm giàu mẫu nước tiểu và mẫu thịt lợn Mẫu nước tiểu lợn, mẫu thịt lợn được lấy từ con lợn nuôi thí nghiệm, được xử lý sơ bộ rồi cho qua cột chiết pha rắn (SPE). Các cột chiết pha rắn khảo sát gồm cột C18, cột SCX 3 ml, cột SCX 6 ml và cột MCX 6 ml. Các bước chiết pha rắn gồm: Hoạt hóa cột chiết, nạp mẫu vào cột chiết, rửa loại tạp chất và rửa giải chọn lọc chất phân tích. 2.2.5. Phương pháp đánh giá độ tin cậy của phương pháp phân tích Độ tin cậy của phương pháp CE - C4D trong phân tích một số phụ gia thực phẩm được đánh giá qua các thông số: giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng, độ lặp lại, hiệu suất thu hồi. 2.3. Thiết bị và hóa chất Thiết bị CE là hệ thiết bị tự chế, bán tự động được thiết kế và chế tạo tại Việt Nam bởi Công ty 3Sanalysis ( trên cơ sở hợp tác với Bộ môn Hóa Phân tích (Khoa Hóa học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQGHN) và nhóm nghiên cứu của GS. Peter Hauser (khoa Hóa, trường đại học Basel, Thụy Sỹ). Thiết bị có nguồn thế cao lên đến 25 kV, sử dụng cảm biến độ dẫn không tiếp xúc (C4D). 8 Hình 2.2. Ảnh chụp hệ thiết bị CE-C4D triển khai tại Việt Nam (1: Hộp thế an toàn, 2: Bộ điều khiển cao thế, 3: Cảm biến độ dẫn không tiếp xúc, 4: Ống dẫn dung dịch đệm, 5: Núm điều chỉnh , 6: Bộ phận điều khiển, 7: Bình khí nén) Tất cả các hóa chất sử dụng đều thuộc loại tinh khiết phân tích và được pha chế bằng nước deion. CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Xác định đồng thời acidformic, acid acetic, acid propionic, acid butyric bằng phƣơng pháp CE-C 4 D Quá trình điện di của của các ion chất phân tích trong mao quản là tổng hợp của dòng chuyển động của các ion này dưới tác động của điện trường và dòng EOF. Thông thường, các cation sẽ di chuyển cùng chiều với dòng EOF và các anion di chuyển ngược chiều. Tùy thuộc vào các đặc tính của chất phân tích như điện tích, cấu trúc không gian, kích thước phân tử, độ linh động điện di, chúng ta sẽ sử dụng kĩ thuật phân cực phù hợp để vừa có thể tách được chất phân tích vừa lợi dụng (hoặc hạn chế) được ảnh hưởng của dòng EOF. Nhóm các acid formic, acid acetic, acid propionic, acid butyric có pKa lần lượt là 3,75, 4,75, 4,88, 4,82. Trong khoảng pH điện di từ 5÷ 9, các acid trên tồn tại dưới dạng anion, có độ linh động điện di cao, tốc độ điện di lớn... Tuy chuyển động của các anion là ngược chiều với dòng EOF, nhưng tại các giá trị pH thấp, tốc độ dòng EOF là nhỏ không đáng kể so với tốc độ điện di của anion nên ít gây cản trở. Vì vậy để xác định các acid này, ta có thể sử dụng kĩ thuật phân cực thường tức là áp thế âm vào mao quản tại đầu bơm mẫu. Anion có độ linh động điện di lớn sẽ di chuyển nhanh hơn và ngược lại, do đó các anion sẽ được tách ra khỏi nhau theo thứ tự lần lượt là HCOO-, CH3COO - , C2H5COO - , C3H7COO - . 3.1.1. Khảo sát các điều kiện tối ưu Để tối ưu hóa quá trình tách điện di, các yếu tố ảnh hưởng quan trọng đến hiệu quả tách như dung dịch đệm điện di, pH, thế tách,.. sẽ được khảo sát và biện luận. 9 a) Khảo sát dung dịch đệm điện di Trong phương pháp CE-C4D, dung dịch đệm điện di có vai trò rất quan trọng, ảnh hưởng đến tốc độ điện di của chất phân tích. Trong dung dịch đệm điện di, ba yếu tố gồm: pH, thành phần và nồng độ của dung dịch đệm điện di đóng vai trò quan trọng nhất. Với mao quản silica, vùng giá trị pH điện di thường dùng và có thể thay đổi trong khoảng từ 2 - 10, tùy thuộc vào mỗi loại mẫu phân tích. Thành phần của dung dịch đệm gồm các ion có độ điện di nhỏ, tức là phải có điện tích nhỏ nhưng kích thước tương đối lớn, ngoài ra các chất đệm phải tan tốt trong nước, bền vững trong mao quản và trong quá trình điện di. Sau thành phần, pH của hệ đệm điện di, nồng độ đệm được lựa chọn thích hợp để có dung lượng đệm đủ lớn và khống chế hệ đệm không đổi trong suốt quá trình điện di. Các hệ đệm điện di phân tích đồng thời acid formic, acid acetic, acid propionic, acid butyric cần có pH xung quanh khoảng 5 đến 6 để đảm bảo các chất phân tích ở dạng anion và dòng EOF không quá lớn. Tỉ lệ nồng độ đệm tương ứng với pH được khảo sát là: His 30 mM/Mes 50 mM (pH = 5,6), His 30 mM/Mes 40 mM (pH = 5,8), và His 50 mM/Mes 40 mM (pH = 6,3). Kết quả cho thấy, hệ đệm His 30 mM/Mes 40 mM (pH = 5,8) cho diện tích pic của các chất phân tích lớn nhất và đường nền tốt nhất. Do đó, dung dịch đệm điện di His 30 mM/Mes 40 mM (pH =5,8) được lựa chọn cho các khảo sát tiếp theo. b) Khảo sát ảnh hưởng của thế tách Quá trình điện di trong mao quản chỉ xảy ra khi có một nguồn thế tách cao V, tạo ra lực điện trường E và dòng điện I trong mao quản, là một yếu tố quan trọng quyết định kết quả điện di các chất phân tích. Việc khảo sát thế được thực hiện ở các giá trị thế -15 kV, -18 kV và -20 kV cho thấy khi tăng thế thời gian di chuyển của các chất phân tích giảm. Để đảm bảo độ phân giải khi phân tích mẫu thực và thời gian phân tích phù hợp, thế -18 kV là thế phù hợp cho phép phân tích. c) Khảo sát ảnh hưởng của chiều cao và thời gian bơm mẫu Trong phương pháp bơm mẫu thủy động lực học kiểu xi phông, lượng mẫu bơm vào tỷ lệ thuận với chiều cao bơm mẫu và thời gian bơm mẫu. Trong quá trình nạp mẫu vào mao quản, lượng mẫu bơm vào phải đủ lớn để đảm bảo độ nhạy và khả năng tách tốt. Chiều cao bơm mẫu càng lớn thì sự chênh lệch về chiều cao của hai đầu ống mao quản càng lớn dẫn tới lượng mẫu bơm vào mao quản càng nhiều. Tương tự chiều cao bơm mẫu, nếu thời gian bơm mẫu càng lớn thì lượng mẫu bơm vào mao quản càng nhiều. Tuy nhiên nếu lượng mẫu được bơm vào mao quản quá lớn sẽ dẫn đến sự phân tán mẫu lớn làm giảm khả năng tách chất. Các chiều cao bơm mẫu được lựa chọn khảo sát gồm: 10 cm, 15 cm và 20 cm; các thời gian bơm mẫu được khảo sát là 10 s, 20 s, 25 s. Kết quả thu được thể hiện ở hình 3.3, 3.4: 10 4003002001000 20 mV formic acetic propionic butyric Thêi gian di chuyÓn (s) 10cm 15cm 20cm 4003002001000 20 mV Thêi gian di chuyÓn (s) formic acetic propionic butyric 10s 20s 25s Hình 3.3. Ảnh hưởng của chiều cao bơm mẫu đến sự phân tách acid formic, acid acetic, acid propionic, acid butyric Hình 3.4. Ảnh hưởng của thời gian bơm mẫu tới sự phân tách acid formic, acid acetic, acid propionic, acid butyric Kết quả cho thấy, tại thời điểm bơm mẫu 20 s và chiều cao bơm mẫu 15 cm, thời gian di chuyển của các chất là nhỏ nhất, tín hiệu đo ổn định, nhiễu nền ít đồng thời đảm bảo được độ nhạy cao mà vẫn có sự tách tốt giữa các chất phân tích và thậm chí là giữa các chất phân tích và các chất có thể có trong mẫu thực. Vì vậy, chiều cao bơm mẫu 15 cm và thời gian 20 s được lựa chọn cho các khảo sát tiếp theo. Từ các kết quả khảo sát thu được, các điều kiện tối ưu nhằm xác định đồng thời acid formic, acid acetic, acid propionic, acid butyric bằng phương pháp CE-C 4D được tóm tắt ở bảng 3.5. Bảng 3.5. Điều kiện tối ưu xác định đồng thời acid formic, acid acetic, acid propionic, acid butyric Các yếu tố Điều kiện Detector CE-C4D Mao quản Mao quản silica, tổng chiều dài 60cm, chiều dài hiệu dụng là 50 cm, đường kính trong là 50 µm Phương pháp bơm mẫu Thủy động lực học kiểu xi phông:15 cm Thời gian bơm mẫu 20 s Dung dịch đệm điện di His-Mes (30 mM/40 mM), pH = 5,8 Thế tách - 18 kV 3.1.2. Xây dựng đường chuẩn cho các chất phân tích và đánh giá phương pháp Các phương trình đường chuẩn xác định acid formic, acid acetic, acid propionic, acid butyric được nêu trong bảng 3.6. 11 Bảng 3.6. Phương trình đường chuẩn của acid Formic, acid Acetic, acid Propionic và acid Butyric Tên chất Phƣơng trình đƣờng chuẩn R2 P Acid formic y = (10,16538±6,5321)+(61,7982±1,16188)x 0,99912 <0,001 Acid acetic y = (-0,52484±2,98169)+(31,4926±0,67235)x 0,99909 <0,001 Acid propionic y = (-5,07988±6,11372)+(61,63352±1,09553)x 0,99921 <0,001 Acid butyric y = (6,70525±5,2828)+(57,9034±0,99063)x 0,99927 <0,001 LOD của acid formic, acid acetic, acid propionic và acid butyric lần lượt là 0,05; 0,12; 0,17 và 0,18 ppm. Độ lệch chuẩn tương đối (RSD) từ 1,5 % đến 2,7 %, hiệu suất thu hồi từ 89,6 ÷ 104,0 %. Như vậy phương pháp có độ chụm và độ đúng tương đối tốt, đáp ứng yêu cầu của hiệp hội các nhà Hóa học Phân tích (AOAC). 3.1.3. Phân tích đồng thời acid formic, acid acetic, acid propionic, acid butyric trong mẫu thực phẩm Tiến hành phân tích bảy mẫu thực tế được mua ngẫu nhiên tại các cửa hàng/siêu thị ở Hà Nội. Kết quả phân tích không phát hiện acid butyric trong tất cả các mẫu phân tích, nhưng phát hiện đồng thời 2 hoặc 3 acid còn lại trong hầu hết các mẫu. Sáu trong tổng số bảy mẫu phân tích đã được phân tích đối chứng bằng phương pháp tiêu chuẩn (HPLC). Bảng 3.9. Kết quả phân tích đối chứng acid formic, acid acetic, acid propionic, acid butyric trong thực phẩm bằng phương pháp tiêu chuẩn HPLC Mẫu acid Formic acid Acetic acid Propionic CE-C 4 D HPLC ER % CE-C 4 D HPLC ER % CE-C 4 D HPLC ER % Cam ép (mg/l) ND ND - 6130±53 6570±45 -6,7 249±8 261±9 -4,6 Nước C2 (mg/l) ND ND - 1990±17 2390±17 -16,7 448±11 473±12 -5,3 Rượu nho Pháp (mg/l) ND ND - 83,9±3,9 90.8±4.5 -7,6 471±12 450±11 +4,7 Rượu Soliera Tempranillo (mg/l) ND ND - 1080±9 1100±8 1,8 851±8 875±9 -2,7 Cà phê Viet (mg/kg) 7550±66 7710 ± 57 -2,1 1260±10 1320±10 -4,5 4050±36 4120±31 -1,7 Cà phê G7 (mg/kg) 7440±65 8590 ± 61 -13,4 2320±20 2110±15 +10,0 9490±84 9920±74 -4,3 Rượu vang Thăng Long (mg/l) 270±9 - - 935±8 - - 41,5±2,8 - - ND: Không phát hiện được với LOD của acid formic, acid acetic, acid propionic và acid butyric lần lượt là 0,05; 0,12; 0,17 và 0,18 ppm. -: Không phân tích Kết quả phân tích đối chứng được thể hiện trong bảng 3.9 cho sự sai khác giữa hai phương pháp đa số đều dưới 15 %. Từ đó, có thể kết luận kết quả phân tích đồng thời acid formic, acid acetic, acid propionic và acid butyric bằng phương pháp CE-C4D là đáng tin cậy. 12 3.2. Xác định đồng thời chất tạo ngọt acesulfam kali, aspartam, cyclamat natri, saccharin trong thực phẩm bằng phƣơng pháp CE-C 4 D Các chất tạo ngọt:acesulfam kali, aspartam, cyclamat natri, saccharin (Ace - K, Asp, Cyc, Sac) có pKa lần lượt là 2,0; 3,2; 1,7; 1,6. Trong dung dịch có pH = 8 ÷ 10 các chất này tồn tại chủ yếu dưới dạng anion, có kích thước cồng kềnh, điện tích nhỏ, có độ linh động điện di thấp dẫn đến tốc độ điện di riêng nhỏ. Ở khoảng pH cao, dòng EOF lại có tốc độ lớn, có khả năng cuốn theo các anion chất tạo ngọt trong khối liên kết tương tác bền vững với các phần tử mang điện dương về phía cực âm. Để lợi dụng ảnh hưởng này của dòng EOF, các chất tạo ngọt thường được phân tích theo kiểu phân cực ngược. 3.2.1. Khảo sát các điều kiện tối ưu a) Khảo sát dung dịch đệm điện di Bốn hệ đệm điện di khảo sát bao gồm: Arg/Mes, Arg/CAPS, Tris/His và Tris/Ches. Các giá trị pH được thay đổi từ 8,5 đến 9,7 bằng cách thay đổi tỷ lệ giữa các thành phần đệm. Trên điện di đồ, pic của các chất xuất hiện theo thứ tự: pic của dòng EOF, Asp, Cyc, Sac, Ace - K. Khi pH tăng, thời gian phân tích và độ phân giải của bốn chất tạo ngọt cũng đồng thời giảm. Cả bốn hệ đệm khảo sát đều cho tín hiệu chất phân tích đẹp, hiệu quả tách tốt, đường nền ổn định và thời gian phân tích hợp lý nhất tại pH = 9,2. Để có thể lựa chọn được hệ đệm tốt nhất, các điện di đồ ở pH = 9,2 của bốn hệ đệm được so sánh trong hình 3.12. Hình 3.12. So sánh khả năng phân tách Ace - K, Asp, Cyc, Sac của các đệm điện di Tris/Ches, Tris/His, Arg/Mes, Arg/CAPS ở pH = 9,2 Hình 3.12 cho thấy, tại pH = 9,2, hai hệ đệm điện di Tris/His và Tris/Ches đều cho độ phân giải tốt, đường nền ổn định và thời gian phân tích hợp lý. Hệ đệm Tris/Ches cho pic sắc nét hơn tuy nhiên hệ đệm Tris/His lại cho khả năng phân tách tốt hơn nhiều. Hệ đệm Tris/His (100 mM/10 mM), 13 pH = 9,2 được lựa chọn cho các khảo sát tiếp theo để đảm bảo độ phân giải của các chất phân tích. b) Khảo sát ảnh hưởng của thế tách Các chất tạo ngọt được phân tích theo kiểu phân cực ngược (áp điện thế dương). Bốn giá trị thế + 10 kV, + 15 kV, + 17 kV, + 20 kV được lựa chọn khảo sát. Kết quả cho thấy khi áp thế càng cao, thời gian phân tích và độ phân giải càng giảm. Thế + 15 kV cho thời gian phân tích ngắn (gần 8 phút), đường nền ổn định và độ phân giải tương đối tốt được lựa chọn cho các thí nghiệm tiếp theo. c) Khảo sát thời gian bơm mẫu Thời gian bơm mẫu được khảo sát với các giá trị 10 s, 15 s, 20 s, 30 s.Thời gian bơm mẫu 10 s và 15 s đều cho độ phân giải tốt nhưng với thời gian 15 s, tín hiệu chất phân tích cao hơn và thời gian phân tích ngắn hơn. Để đảm bảo độ phân giải và độ nhạy của phương pháp, thời gian bơm mẫu tối ưu được lựa chọn là 15 s. Từ các kết quả thu được, điều kiện tối ưu để phân tích đồng thời bốn chất tạo ngọt Ace - K, Asp, Cyc, Sac bằng phương pháp CE - C4D được trình bày tóm tắt trong bảng 3.12. Bảng 3.12. Điều kiện tối ưu để phân tích hỗn hợp chất tạo ngọt Ace-K, Asp, Cyc, Sac bằng phương pháp CE-C4D Các yếu tố Điều kiện Detector CE-C4D Mao quản Mao quản silica, tổng chiều dài 60 cm, chiều dài hiệu dụng 50 cm, đường kính trong 75 µm Phương pháp bơm mẫu Thủy động lực học kiểu xiphông (chiều cao 10 cm) Thời gian bơm mẫu 15 s Dung dịch đệm điện di Tris/His (100 mM/10 mM), pH = 9,2 Thế tách +15 kV 3.2.2. Đường chuẩn phân tích và đánh giá phương pháp nghiên cứu Đường chuẩn của bốn chất tạo ngọt Asp, Cyc, Sac, Ace - K được thiết lập trong khoảng nồng độ 2,5-180 ppm. Kết quả được thể hiện trong bảng 3.13. Bảng 3.13. Phương trình đường chuẩn của Ace-K, Asp, Cyc, Sac Tên chất Phƣơng trình đƣờng chuẩn (y = a + bx) R2 P Ace - K y = (1,94236 ± 5,21557) + (6,6173 ± 0,08186)x 0,99946 < 0,0001 Asp y = (-1,81667 ± 0,67261) + (0,43397 ± 0,00598)x 0,99934 < 0,0001 Cyc y = (5,0723 ± 3,59551) + (3,33964 ± 0,05321)x 0,99924 < 0,0001 Sac y = (7,6561 ± 4,50568) + (4,62568 ± 0,06668)x 0,99938 < 0,0001 14 LOD của Ace-K, Asp, Cyc, Sac lần lượt là: 0,7 ppm; 5,0 ppm; 1,0 ppm; 1,0 ppm. Độ lệch chuẩn tương đối (RSD) của Asp, Cyc, Sac và Ace-K nhỏ, dao động từ 0,9 % đến 2,0 %, hiệu suất thu hồi của Asp, Cyc, Sac và Ace-K khá cao, từ 95,7 ÷ 99,3 %. Như vậy phương pháp là phù hợp để phân tích các chất tạo ngọt trong mẫu thực phẩm. 3.2.3. Phân tích chất tạo ngọt acesulfam kali, aspartam, cyclamat natri, saccharin trong thực phẩm Áp dụng quy trình tối ưu đã khảo sát ở trên để phân tích bốn chất tạo ngọt: Ace - K, Asp, Cyc, Sac trong 16 mẫu gồm mẫu nước giải khát và 2 mẫu thạch. Kết quả ở hình 3.19 cho thấy đã phát hiện một hoặc đồng thời 2 chất tạo ngọt (Asp và Ace - K) trong số bốn chất tạo ngọt phân tích. Riêng mẫu chè đỗ đen phát hiện Sac với hàm lượng là 111 ppm. Hình 3.19: Kết quả phân tích chất tạo ngọt trong mẫu nước giải khát bằng phương pháp CE - C4D Kết quả phân tích bằng phương pháp CE-C4D được so sánh đối chứng với phương pháp tiêu chuẩn (HPLC) hình 3.19 cho thấy kết quả giữa hai phương pháp khá phù hợp (sai số dưới 15%) chứng tỏ phương pháp phân tích là chính xác và đáng tin cậy. 3.3. Khảo sát các điều kiện tối ƣu phân tích β-agonist salbutamol, metoprolol và ractopamintrong mẫu thức ăn chăn nuôi, nƣớc tiểu lợn và mẫu thịt lợn bằng phƣơng pháp CE-C 4 D Salbutamol, metoprolol và ractopamin là ba chất thuộc nhóm β - agonist, có cấu trúc tương tự với các dẫn xuất amin, đều có pKa> 9. Tại pH nhỏ hơn pKa, các β - agonist này tồn tại dưới dạng cation, di chuyển cùng chiều với dòng EOF, thuận lợi để tách được bằng CE-C4D theo phương pháp phân cực bình thường (tức là áp thế dương vào mao quản đầu bơm mẫu) 3.3.1. Khảo sát các điều kiện tối ưu 3.3.1.1. Khảo sát dung dịch đệm điện di a. Khảo sát dung dịch đệm điện di Ở pH thấp điện tích của các cationβ-agonist lớn, tuy nhiên dòng EOF lại nhỏ, còn ở pH cao dòng EOF lớn nhưng điện tích của các cation này lại nhỏ, chính vì vậy khoảng pH trung gian (khoảng pH từ 4,9 đến 5,5) đảm bảo được 15 điện tích của cation và dòng EOF phù hợp sẽ cho khả năng phân tách bằng phương pháp điện di mao quản của các β-agonist (salbutamol, metoprolol, ractopamin) là tốt nhất. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của pH với bốn giá trị pH 4,5; 4,9; 5,5 và 6,0 cho thấy ở giá trị pH = 4,9 các chất được tách tốt nhất, pic gọn nhất đồng thời cho tín hiệu đường nền ổn định và thời gian phân tích hợp lý. Do đó, pH = 4,9 được lựa chọn cho các bước khảo sát tiếp theo. Thành phần dung dịch đệm khảo sát là Arg (pK = 2,18; 9,09; 12,50) và His (pK = 1,78; 5,97; 9,97) kết hợp với các acid phosphoric (Phos), ascorbic (Asc) hoặc acetic (Ace). Kết quả khảo sát thành phần dung dịch đệm được thể hiện trong hình 3.24 cho thấy hệ đệm Arg/Ace cho kết quả độ phân giải giữa các pic tốt nhất và tín hiệu của các pic cao nhất nên sẽ được lựa chọn cho các khảo sát tiếp theo. 6005004003002001000 Arg/Ace Arg/Asc His/Ace 50mV Sal Met Rac Arg/Phos Hình 3.24. Ảnh hưởng của thành phần hệ đệm đến sự phân tách của Sal, Met, Rac Các nồng độ 10 mM, 15 mM, 20 mM của hệ đệm Arg/Ace được khảo sát để tìm ra nồng độ đệm tối ưu. Kết quả khảo sát ở nồng độ đệm 10 mM cho thấy tại giá trị nồng độ này hình dáng các pic khá cân đối và sắc nét, các chất được tách tương đối tốt và thời gian phân tích hợp lý. Do đó, đệm Arg/Ace có nồng độ 10 mM được lựa chọn là dung dịch đệm tối ưu. b) Khảo sát ảnh hưởng của thế tách Tại pH = 4,9, Sal, Met và Rac đều mang điện dương. Các điện thế được lựa chọn khảo sát là: 10 kV, 15 kV, 18 kV và 20 kV. 16 1000800600400200 Thêi gian di chuyÓn (s) 20kV 18kV 15kV 10kV 20mV Sal Met Rac Hình 3.27. Điện di đồ khảo sát ảnh hưởng của thế tách đến thời gian di chuyển và sự phân tách các pic Kết quả ở hình 3.27 cho thấy, thế tách 18 kV cho hiệu quả tách tốt, thời gian phân tích phù hợp nên được chọn cho các khảo sát tiếp theo. c) Khảo sát ảnh hưởng của thời gian bơm mẫu Thời gian bơm mẫu được khảo sát ở 10 s, 20 s, 30 s và 50 s. Kết quả cho thấy, khi tăng thời gian bơm mẫu, thời gian di chuyển của các chất hầu như không thay đổi hoặc thay đổi rất ít nhưng diện tích pic tăng tương ứng khi tăng thời gian bơm mẫu từ 10 s đến 50 s. Thời gian bơm mẫu 20 s được lựa chọn để đảm bảo độ nhạy và khả năng tách là tốt nhất đối với cả mẫu chuẩn và mẫu thực là mẫu thức ăn chăn nuôi. Điều kiện tối ưu cho phân tích hỗn hợp Sal, Met và Rac bằng phương pháp CE-C 4D được tổng hợp trong bảng 3.21. Bảng 3.21. Điều kiện tối ưu cho phân tích hỗn hợp Sal, Met, Rac bằng phương pháp CE-C4D Các yếu tố Điều kiện Detector CE-C 4 D Mao quản Mao quản silica, tổng chiều dài 60 cm, chiều dài hiệu dụng 53 cm, đường kính trong 50 µm Phương pháp bơm mẫu Thủy động lực học kiểu xiphông: 10cm Thời gian bơm mẫu 20 s Dung dịch đệm điện di Arg/Ace (10 mM) pH=4,9 Thế tách 18 kV 3.3.2. Đường chuẩn phân tích và đánh giá phương pháp phân tích 3.3.2.1. Đƣờng chuẩn phân tích Các dung dịch để dựng đường chuẩn có nồng độ biến thiên trong khoảng 2,5- 250,0 ppm. Kết quả khảo sát và tính toán được trình bày trong bảng 3.22 17 Bảng 3.22. Phương trình đường chuẩn của Sal, Met và Rac Tên chất Phƣơng trình đƣờng chuẩn (y=a+bx) R 2 P Sal y = (-0,28196±0,68338)+(0,97536±0,01028)x 0,99967 <0,0001 Met y = (0,38201 ±0,63116)+(0,78866±0,00947)x 0,99957 <0,0001 Rac y= (-0,6955±0,38796)+(0,93506±0,00582)x 0,99988 <0,0001 LOD của Sal là 0,5 ppm, của Met và Rac là 0,7 ppm. Độ lệch chuẩn tương đối (RSD) < 3 %, hiệu suất thu hồi của Sal, Met và Rac khá cao, từ 99,0 ÷ 99,5%, cho thấy phương pháp lặp lại, độ đúng cao. Quy trình phân tích này sẽ được áp dụng để phân tích các mẫu thực tế là mẫu thức ăn chăn nuôi. 3.3.3. Xác định đồng thời salbutamol, metoprolol và ractopamin trong mẫu thức ăn chăn nuôi Trước khi xác định Sal và Rac trong mẫu thức ăn chăn nuôi, các cation có thể gây ảnh hưởng đến phép phân tích đã được khảo sát sơ bộ và khẳng định được các cation nếu có trong mẫu thức ăn chăn nuôi cũng không ảnh hưởng đến việc xác định các chất phân tích. Mẫu thức ăn chăn nuôi được cung cấp bởi Viện Kiểm nghiệm An toàn Vệ sinh Thực phẩm Quốc gia. Đây là mẫu lưu, đã phân tích cho kết quả có hàm lượng chất tạo nạc. Điện di đồ thể hiện trong hình 3.33. 6005004003002001000 20mV Sal cations Thêi gian di chuyÓn (s) Rac Rac 1 2 3 Hình 3.33. Điện di đồ xác định Sal, Met, Rac trong một số mẫu thức ăn chăn nuôi. Các đường số 1, 2, 3 tương ứng với các mẫu TACN 1, 2, 3 Từ kết quả ở hình 3.33 cho thấy không có Met trong cả ba mẫu thức ăn chăn nuôi nhưng có Rac và Sal trong hai mẫu. Các mẫu này được gửi phân tích đối chứng bằng phương pháp HPLC cho sai số giữa hai phương pháp dao động dưới 15 % chứng tỏ hàm lượng Sal và Rac thu được theo hai phương pháp khá phù hợp ở hàm lượng cỡ ppm. 18 Bảng 3.26. Kết quả phân tích Sal và Rac trong mẫu thức ăn chăn nuôi (TACN) Tên mẫu Hàm lƣợng chất phân tích (bằng CE - C 4 D) Hàm lƣợng chất phân tích (bằng HPLC-MS) Sai số giữa phƣơng pháp (%) TACN 1 - có Rac ND - - TACN 2 - có Rac 36,21 ± 0,15 (ppm) 31,53 (ppm) 12,92 TACN 3 - có Sal 297,13 ±0,92 (ppm) 281,03 (ppm) 5,42 ND: Không định lượng được với LOQ của Rac là 2,3 ppm -: Không phân tích Đối tượng nghiên cứu tiếp theo của chúng tôi là các mẫu nước tiểu và mẫu thịt lợn của lợn đã được nuôi bằng thức ăn chăn nuôi có chứa chất tạo nạc, cụ thể là salbutamol. Tuy nhiên các đối tượng mẫu này có đặc điểm là thành phần nền phức tạp và có hàm lượng Sal thấp hơn LOD, LOQ của phương pháp CE-C 4 D, do vậy trước khi phân tích bằng phương pháp điện di cần tiến hành tách và làm giàu Sal từ nền mẫu bằng phương pháp chiết tách phù hợp. 3.3.4. Nghiên cứu phương pháp chiết pha rắn (SPE) salbutamol trong mẫu nước tiểu lợn Kĩ thuật chiết pha rắn (SPE) được chọn làm kĩ thuật làm sạch, làm giàu salbutamol trong mẫu nước tiểu và mẫu thịt lợn. Các yếu tố ảnh hưởng quyết định đến hiệu suất chiết và hiệu quả làm sạch như cột chiết, dung dịch chiết, dung môi rửa giải, dung môi rửa tạp,.. sẽ được khảo sát để lựa chọn điều kiện tối ưu. a) Khảo sát lựa chọn cột chiết Salbutamol có cấu trúc tương tự như các catecholamin, ở khoảng pH chiết nhỏ hơn pKa Sal tồn tại ở dạng cation phân cực mạnh nên theo lý thuyết các cột SPE theo cơ chế trao đổi cation sẽ có hiệu lực tốt để chiết Sal. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của các cột chiết khảo sát bao gồm cột C18 3 ml, cột SCX 3 ml và cột CX 6 ml tới hiệu suất thu hồi của quá trình chiết được thể hiệ