Tóm tắt Luận án Nghiên cứu quy trình tách chiết, phân tích ADN và tế bào phôi thai tự do trong máu ngoại vi của mẹ để chẩn đoán trước sinh

 Kết quả biến thiên nồng độ ADN phôi thai tự do trong máu ngoại vi của mẹ

Để kiểm tra xem nồng độ ADN phôi thai tự do trong máu ngoại vi của mẹ biến

đổi theo tuần thai của thai nhi chúng tôi tiến hành định lƣợng các mẫu nghiên cứu này ở

các tuần từ 6 tuần đến 22 tuần tuổi. Kết quả cho thấy nồng độ biến thiên nồng độ ADN

phôi thai tự do trong 1 ml huyết tƣơng có sự thay đổi giữa các tuần và nồng độ này có xu

hƣớng tăng lên theo tuổi thai, mặc dù trong từng trƣờng hợp nồng độ này có lúc giảm

nhƣng sau đó xu hƣớng tăng trở lại ở các tuần sau. (xem đầy đủ các biểu đồ ở phần phụ

lục Hình ảnh các biểu đồ số 1 đến biểu đồ số 15)

pdf23 trang | Chia sẻ: lavie11 | Lượt xem: 442 | Lượt tải: 0download
Bạn đang xem trước 20 trang tài liệu Tóm tắt Luận án Nghiên cứu quy trình tách chiết, phân tích ADN và tế bào phôi thai tự do trong máu ngoại vi của mẹ để chẩn đoán trước sinh, để xem tài liệu hoàn chỉnh bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên
của thai kì, đã phát hiện đƣợc các tế bào của thai gồm: Trophoblast (tế bào lá nuôi phôi), bạch cầu lympho, hồng cầu nhân, tế bào gốc, song số lƣợng các tế bào này rất thấp. Các tế bào này mang vật chất di truyền của phôi thai do vậy rất có ý nghĩa trong chẩn đoán dị tật sớm cho thai. Tuy nhiên, có sự khác biệt giữa các loại tế bào:Trophoblast (lá nuôi phôi): xuất hiên sớm nhất, nhanh bị hủy, không xuất hiện trong máu ngoại vi của mẹ ở tất cả các thai, không có kháng nguyên bề mặt đặc hiệu.Bạch cầu phôi thai: Lần đầu tiên bạch cầu phôi thai đƣợc chứng minh có mặt trong máu ngoại vi của mẹ vào năm 1969 bởi Walknowska, đặc biệt với những thai nhi mang giới tính nam. Sự tồn tại của nó đƣợc chứng minh bằng sự khác biệt trong biểu hiện kháng nguyên bạch cầu ngƣời (HLA). Tuy vậy, việc nghiên cứu về loại tế bào này gặp phải những khó khăn nhất định: (1) các tế bào này không có kháng nguyên bề mặt đặc hiệu; (2) tuổi thọ của các tế nào này tƣơng đối dài có thể tồn tại nhiều năm sau khi sinh dẫn đến tăng khả năng chẩn đoán sai.Hồng cầu nhân (hồng cầu thai nhi hay NRBCs): Luôn đƣợc coi là loại tế bào đầy hứa hẹn cho kỹ thuật này với những ƣu điểm: xuất hiện sớm và tồn tại trong suốt trong thai kì, tuổi thọ ngắn loại bỏ đƣợc khả năng của các tế bào xuất hiện từ lần mang thai trƣớc đó, có kháng nguyên bề mặt đặc hiệu. Hơn nữa số lƣợng tế bào này còn tăng lên ở những phôi thai mang các dị tật bẩm sinh. Do vậy, các nghiên cứu trên thế giới đang tập trung vào phân tách hồng cầu có nhân của thai nhi. Hình 1.6: Hình minh họa các thành phần trong máu ngoại vi của mẹ( _.pdf ) Các đặc trƣng chính của hồng cầu nhân: Xuất hiện sớm trong máu ngoại vi, mang bộ gen hoàn chỉnh của phôi thai, mang kháng nguyên bề mặt đặc hiệu, thời gian tồn tại ở máu ngoại vi có giới hạn. CHƢƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU  VẬT LIỆU  Đối tƣợng nghiên cứu Mẫu máu ngoại vi của những phụ nữ mang thai từ 6 tuần tuổi đến 22 tuần tuổi thai số lƣợng mẫu 279 mẫu và 5 mẫu máu ngoại vi của những phụ nữ mang thai mắc các hội chứngtrisomy 13, 18, 21, Klinefelter (XXY tại Bệnh Viện Từ Dũ, và 34 mẫu máu ngoại vi của các phụ nữ có nguy cơ sinh con dị tật đƣợc chọc ối và chẩn đoán tại Trung tâm nghiên cứu Sinh Y Dƣợc học – HVQY. Thể tích mẫu máu ngoại vi cần lấy từ 5 ml từ các phụ nữ mang thai tuần 14-22 tuần. Mẫu chứng: Các phụ nữ chƣa mang thai và chƣa quan hệ tình dục bao giờ lấy 02 mẫu máu ngoại vi. Mẫu máu ngoại vi của phụ nữ mang thai có nguy cơ sinh con bị TSTTBS là 11 mẫu, Teo cơ Duchenne là 10 mẫu máu ngoại và 13 mẫu máu ngoại vi của những phụ nữ có nhóm máu Rh(-) đang mang thai để chẩn đoán nhóm máu Rh củacon.  Hoá chất và thiết bị máy móc  Hoá chất tách chiết ADN  Hoá chất cho PCR  Hoá chất dùng cho điện di Agarose, Đệm TBE 1, buffer GA 1X, Polymer POP4, HiDi formamid, Gene Scan GS500.  PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU  Phƣơng pháp tách ADN phôi thai tự do và phƣơng pháp nhân gen PCR và realtime-PCR  Quy trình tách và phân lập tế bào phôi thai tự do, phƣơng pháp nhuộm tế bào bằng kỹ thuật FISH, phƣơng pháp QF-PCR chứng minh sự tồn tại của tế bào phôi thai trong máu ngoại vi của mẹ  Kỹ thuật phân lập tế bào phôi thai trong máu ngoại vi của mẹ  Kỹ thuật cố định tế bào phôi thai và nhuộm tế bào phôi thai sau khi phân lập  Tách chiết ADN từ phôi bào và khuếch đại bộ gen bằng bộ kit WGA REPLI-g Single Cell Kit của Qiagene  Kỹ thuật QF-PCR cho chẩn đoán bệnh nhiễm sắc thể bằng phương pháp phân tích đoạn STRs  Kỹ thuật điện di sản phẩm QF-PCR trên máy ABI 3130 XL  Phương pháp phân tích kết quả sản phẩm định lượng huỳnh quang sau điện di mao quản CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN  KẾT QUẢ QUY TRÌNH TÁCH CHIẾT ADN PHÔI THAI TỰ DO TRONG MÁU NGOẠI VI CỦA MẸ  Kết quả tách chiết ADN phôi thai tự do trong máu ngoại vi của mẹ Mẫu huyết tƣơng này sẽ đƣợc tách ADN phôi thai tự do bằng nhiều phƣơng pháp, phƣơng pháp ban đầu chúng tôi tách là dùng 200µl dung dịch huyết tƣơng sau đó biến tính ở nhiệt độ 99oC trong 5 phút, dung dịch sau biến tính sẽ đƣợc ly tâm tốc độ cao 13.000 vòng/phút trong 2 phút và thu dung dịch trong phía trên vào ống 1,5ml mới khác. Phƣơng pháp thứ 2 chúng tôi tách là sử dụng bộ kít của Qiagene có cải tiến với các bƣớc đƣợc nêu chi tiết trong phần phƣơng pháp nghiên cứu. Sau khi tách xong và đo nồng độ của ADN phôi thai tự do tách chiết đƣợc nhƣ sau: Bảng 3.1. Bảng kết quả đo nồng độ ADN của phương pháp tách bằng nhiệt và phương pháp tách bằng bộ Kít Qiagene (Chi tiết ở Phụ luc bảng 3.1) ST T Mã BN Tuổi thai Tuổi mẹ Bằng nhiệt độ Kít Qiagene Nồng độ ADN (ng/ul) Độ tinh sạch Nồng độ ADN (ng/ul) Độ tinh sạch 1 811 8.2 32 1,12 1,00 3,00 1,82 2 812 8 31 0,81 1,20 3,20 1,78 29 839 9 32 0,86 0,67 3,99 1,78 30 840 8 35 0,93 1,34 3,78 1,80 TB 0,81 0,97 3,95 1,81 SD 0,18 0,20 0,53 0,31 Từ bảng số liệu tách chiết ADN phôi thai tự do bằng hai phƣơng pháp trên chúng tôi nhận thấy nồng độ ADN tách chiết đƣợc bằng cách sử dụng nhiệt thấp hơn rất nhiều so với phƣơng pháp tách chiết bằng bộ kít qiagene có cải tiến. Mặt khác độ tinh sạch của ADN tách chiết đƣợc bằng bộ kít qiagene cao hơn và đạt đƣợc tiêu chuẩn cho phép về độ tinh sạch của ADN nằm trong khoảng từ 1,80 đến 2,00. Trong phƣơng pháp tách ADN tự do bằng kỹ thuật biến tính ở nhiệt độ 99oC trong 5 phút cho thấy nồng độ trung bình của phƣơng pháp này khá thấp 0,81±0,18 ng/µl và độ tinh sạch 0,97±0,20. Kết quả tách chiết bằng bộ kít Qiagene nồng độ cao hơn 3,95±0,53 ng/µl và độ tinh sạch 1,81±0,31. Trong quá trình tách chiết ADN tự do bằng bộ kít Qiagene chúng tôi có cải tiến sử dụng 400ul huyết tƣơng, việc tăng lƣợng mẫu để tách ADN phôi thai tự do cũng đã đƣợc Lo và cộng sự đề cập tới năm 1998 khi ông sử dụng từ 400ul đến 700ul mẫu để tách ADN.  Kết quả chạy PCR nhân gen SRY Các mẫu ADN sau khi tách xong ở trên sẽ đƣợc nhân gen bằng kỹ thuật Nested PCR (PCR lồng) cho gen SRY và nhân gen PCR thƣờng cho gen GAPDH. Hình 3.1. Hình ảnh kết quả điện di của gen SRY với gen GAPDH của các mẫu nghiên cứu từ 811 đến 825 M: Marker 100bp- Thang ADN với band nhỏ nhất là 100bp; Các giếng từ 811 đến 825 là các mẫu nghiên cứu. Phía trên là các mẫu nhân gen SRY kích thước sản phẩm 198bp. Phía dưới là các mẫu nhân gen GAPDH với kích thước sản phẩm PCR là 97bp. Nhận xét: Các mẫu từ 811 đến mẫu số 825 chúng tôi thấy đều xuất hiện băng của gen GAPDH (nửa điện di phía dƣới) điều này cho thấy các mẫu này chúng tôi đều tách đƣợc ADN. Từ các hình trên cho chúng ta thấy các băng điện di xuất hiện khá rõ nét và gọn, kích thƣớc sản phẩm PCR phù hợp với tính toán lý thuyết. Trong hình ảnh kết quả điện di các mẫu nghiên cứu của gen SRY có một số mẫu không xuất hiện băng vạch của 198bp và các mẫu xuất hiện băng vạch 198bp. Các mẫu này đƣợc nhân gen GAPDH ở hình trên cho chúng ta thấy tất cả các mẫu nghiên cứu này đều xuất hiện băng vạch của gen GAPDH 97bp điều đó chứng tỏ các mẫu nghiên cứu này đều tách chiết đƣợc ADN. Từ kết quả này chúng tôi chứng minh đƣợc rằng trong máu mẹ ngƣời mang thai có ADN phôi thai tự do của con lƣu hành trong đó. Kết quả này đƣợc kiểm chứng bằng kỹ thuật siêu âm ở tuần thứ 16 và sau sinh cho kết quả hoàn toàn phù hợp. Dƣới đây là kết quả của 30 trƣờng hợp nghiên cứu ban đầu cho Nghiên cứu quy trình tách chiết ADN phôi thai tự do trong máu ngoại vi của mẹ và chứng minh đƣợc sự tồn tại của ADN phôi thai tự do lƣu hành trong máu ngoại vi của mẹ. Theo nghiên cứu của Zolotukhina T.V., (2005), tách chiết ADN phôi thai trong huyết tƣơng và huyết thanh mẹ xác định giới tính bằng nested PCR qua mồi SRY trên nhiễm sắc thể Y. Nghiên cứu của chúng tôi cũng cho thấy kết quả hoàn toàn phù hợp với các nghiên cứu của các tác giả trên thế giới. Với 30 mẫu máu ngoại vi của các phụ nữ mang thai với tuổi thai từ tuần thứ 7 đến tuần thứ 9 của thai kỳ, kết quả chúng tôi thấy xuất hiện 16/30 trƣờng hợp dƣơng tính với gen SRY và 14/30 trƣờng hợp âm tính với gen SRY, 30 mẫu nghiên cứu này đều dƣơng tính với gen GAPDH, do vậy chúng tôi nhận định rằng các mẫu nghiên cứu đều tách đƣợc ADN phôi thai tự do, các mẫu âm tính với gen SRY là âm tính thật. Từ kết quả trên đây, chúng tôi cũng đã chứng minh đƣợc sự tồn tại của ADN phôi thai tự do lƣu hành trong máu mẹ. Và các nhận định rằng quy trình tách chiết ADN phôi thai tự do lƣu hành trong máu ngoại vi của mẹ có cải tiến bằng bộ kít Qiagene đạt kết quả tốt. Kết quả này mở ra một hƣớng mới trong chẩn đoán trƣớc sinh không.  Kết quả định lƣợng số bản copy của ADN phôi thai trong máu ngoại vi của mẹ Từ bảng này chúng tôi cũng thấy rằng nồng độ trung bình của ADN phôi thai tự do trong máu ngoại vi của mẹ ở các tuần từ tuần thứ 6 đến tuần thứ 12 này có độ lệch chuẩn rất lớn, và lớn hơn cả giá trị trung bình điều này chứng tỏ nồng độ ADN phôi thai này dao động ở một khoảng rất lớn nhƣ ở tuần 6 của thai kỳ nồng độ trung bình của ADN phôi thai tự do trong máu ngoại vi của mẹ là 50,69 ± 83,56 bản copy/ml, hay ở tuần thứ 12 là 206,63 ± 742,55 copy/ml. Bảng 3.6. Bảng kết quả số bản copy và nồng độ gen DYS14 và nồng độ gen GAPDH ở các tuần 6 đến 12 của thai kỳ (chi tiết xem phần phụ lục bảng 3.6) Tuần 6 Tuần 7 Tuần 8 Tuần 9 Tuần 10 Tuần 11 Tuần 12 S T T Mã bện h nhâ n Số bản cop y gen DY S14 Số bản copy gen GAP DH Tỷ lệ gen DYS14/G APDH (%) Số bản cop y gen DY S14 Số bản copy gen GAP DH Tỷ lệ gen DYS14/G APDH (%) Số bản cop y gen DY S14 Số bản copy gen GAP DH Tỷ lệ gen DYS14/G APDH (%) Số bản copy gen DYS 14 Số bản copy gen GAP DH Tỷ lệ gen DYS14/G APDH (%) Số bản copy gen DYS 14 Số bản copy gen GAP DH Tỷ lệ gen DYS14/G APDH (%) Số bản copy gen DYS 14 Số bản copy gen GAP DH Tỷ lệ gen DYS14/G APDH (%) Số bản cop y gen DY S14 Số bản copy gen GAP DH Tỷ lệ gen DYS14/G APDH (%) 1 269 332 6942 4,78 129 1 9692 13,32 297 0 18900 0 1,57 2998 23965 12,51 3754 1799 0 20,87 3897 5157 4 7,56 378 9 1887 6 20,07 2 270 4613 0 463 0 81300 0 8791 0 5080 0 3620 0 5100 0 3 271 27482 0 2410 0 1380 0 1562 0 692 0 3620 0 3210 0 0 4 275 12411 0 1380 0 27400 0 22111 0 1890 0 0 4810 0 1510 0 0 5 276 2380 0 874 0 52800 0 25021 0 4330 0 1870 0 1600 0 6 277 13 7156 0,18 15 2470 0,61 24 3470 0,69 30 4123 0,73 45 756 5,95 59 1160 5,09 70 4300 1,63 7 280 1508 0 943 0 1880 0 2467 0 3471 0 1830 0 1980 0 8 295 16110 0 756 0 52100 0 41289 0 1380 0 4300 0 3217 0 9 296 3,5 13440 0,03 12 3190 0,38 50 508 9,84 37 988 3,74 36 978 3,68 46 986 4,67 27 610 4,43 .. . ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... 59 622 125 15123 0,83 238 15100 1,58 350 28900 1,21 367 13901 2,64 380 2810 0 1,35 398 3090 0 1,29 412, 6 2290 0 1,80 60 623 68,8 22820 0,30 125 22800 0,55 260 21300 1,22 278, 3 15600 1,78 289 1089 2 2,65 312, 8 1130 0 2,77 345, 9 2190 0 1,58 61 Âm nội chứ ng 13332 0,00 13303 0,00 13300 0,00 13303 2 0,00 1333 1 0,00 1333 0 0,00 1336 0 0,00 1 62 Âm nội chứ ng 2 14094 0,00 14070 0,00 14043 0,00 14090 0,00 1409 3 0,00 1400 2 0,00 1389 0 0,00 T B 50,6 13980 ,2 0,52 85,7 7 10395 1,97 135, 1 17951 ,1 1,68 151, 6 22583 ,3 1,72 167, 2 9700 ,5 2,26 182, 9 1054 2 2,83 206, 6 1117 2,2 3,70 S D 83,5 18877 ,2 1,05 295, 16 14412 3,4 3,60 632, 3 39348 ,1 3,45 642, 9 8580 3,38 755, 1 9966 ,2 5,36 761, 3 1344 2,5 6,52 742, 5 2040 4,4 4,57 Để xác định đƣợc tuổi thai thích hợp nhất, tuổi thai thấp nhất và có nồng độ cao để có thể chẩn đoán chính xác nhất khi ứng dụng vào sàng lọc và chẩn đoán các bệnh di truyền trƣớc sinh. Chúng tôi tiến hành nhân gen SRY bằng kỹ thuật Nested PCR, siêu âm ở tuổi thai 16 tuần và kiểm tra lại sau sinh và so sánh với kỹ thuật Realtime PCR. Bảng 3.7. Bảng kết quả so sánh của kỹ thuật Nested PCR, Realtime PCR với siêu âm ở tuần thứ 16 và sau sinh (chi tiết kết quả bảng được thể hiện trong bảng 3.7 ở phần Phụ lục bảng kết quả nghiên cứu) ST T Mã bệnh nhân Tuầ n 6 Tuần 7 Tuầ n 8 Tuần 9 Tuần 10 Tuần 11 Tuần 12 Siêu âm Sau sin h 1 269 +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ + + .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. 60 623 +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ + + 61 Âm nội chứng 1 -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- - - 62 Âm nội chứng 2 -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- - - Ghi chú: -/-; +/+: Kết quả chẩn đoán của kỹ thuật Nested PCR và kỹ thuật Realtime –PCR đều giống nhau cùng âm tính và hoặc dương tính. -/+: : Kết quả chẩn đoán của kỹ thuật Nested PCR và kỹ thuật Realtime –PCR khác nhau. Nested âm tính còn Realtime dương tính. Từ các kết quả trên, chúng tôi nhận thấy rằng để ứng dụng ADN phôi thai vào sàng lọc và chẩn đoán các bệnh di truyền trƣớc sinh ở thời điểm thích hợp nhất đối với phƣơng pháp Reatime PCR là tuần thứ 7 trở đi và với kỹ thuật Nested PCR thì phải tuần thứ 8 trở đi.  Kết quả biến thiên nồng độ ADN phôi thai tự do trong máu ngoại vi của mẹ Để kiểm tra xem nồng độ ADN phôi thai tự do trong máu ngoại vi của mẹ biến đổi theo tuần thai của thai nhi chúng tôi tiến hành định lƣợng các mẫu nghiên cứu này ở các tuần từ 6 tuần đến 22 tuần tuổi. Kết quả cho thấy nồng độ biến thiên nồng độ ADN phôi thai tự do trong 1 ml huyết tƣơng có sự thay đổi giữa các tuần và nồng độ này có xu hƣớng tăng lên theo tuổi thai, mặc dù trong từng trƣờng hợp nồng độ này có lúc giảm nhƣng sau đó xu hƣớng tăng trở lại ở các tuần sau. (xem đầy đủ các biểu đồ ở phần phụ lục Hình ảnh các biểu đồ số 1 đến biểu đồ số 15) Hình 3.10. Biểu đồ biến thiên nồng độ ADN tự do của trƣờng hợp 269 Trục tung biểu diễn nồng độ ADN phôi thai (tính bằng số bản copy/ml), trục hoành biểu diễn tuổi thai ở các tuần từ 6 đến 22 tuần. Trong trƣờng hợp 269 này đƣờng cong biểu diễn nồng độ ADN phôi thai trong máu ngoại vi của mẹ tăng lên rất nhanh từ tuần thai thứ 6 đến tuần thai 14, nhƣng đến tuần thứ 16 nồng độ này giảm một cách đáng kể xuống gần bằng nồng độ ADN phôi thai ở 8 tuần tuổi thai, sau đó ở các tuổi thai sau nồng độ ADN phôi thai lại tăng dần trở lại.Kết quả chạy nhân gen SRY trên 189 bệnh nhân nghiên cứu Sau khi hoàn thành quy trình tách chiết ADN phôi thai tự do và nhân gen bằng kỹ thuật Nested PCR chúng tôi tiến hành đánh giá độ nhạy và độ đặc hiệu của phƣơng pháp này. Chúng tôi nghiên cứu trên 189 trƣờng hợp cho kết quả ở bảng dƣới đây, kết quả này đƣợc kiểm chứng sau sinh cho kết quả hoàn toàn phù hợp. Chúng tôi nhận thấy rằng độ nhạy của phƣơng pháp này là 100% và độ đặc hiệu là 100%. Kết quả này cũng tƣơng tự kết quả của tác giả Sekizawa và cộng sự (2007) 302 trƣờng hợp từ 7 tuần đến 16 tuần tuổi thai thấy 298 trên 302 trƣờng hợp xác định chính xác khi nhân gen SRY, với độ nhạy 97,2% và độ đặc hiệu là 100%. Bảng 3.8. Bảng kết quả nhân gen SRY và kiểm chứng sau sinh của 189 mẫu nghiên cứu (Chi tiết xem phần Phụ lục bảng 3.8) STT Mã BN Kết quả trƣớc sinh Kết quả sau sinh Tuổi Tuổi thai 1 841 (-) (-) 31 8 . . 189 1029 (-) (-) 29 8.2 Từ bảng trên chúng tôi nhận thấy trong 189 mẫu nghiên cứu này thấy xuất hiện 84 mẫu dƣơng tính với gen SRY và 105 mẫu âm tính với gen SRY. Các kết quả trƣớc sinh và sau sinh là hoàn toàn phù hợp với nhau.  Kết quả biến thiên nồng độ ADN phôi thai tự do trong máu ngoại vi của mẹ sau khi sinh Để đánh giá đƣợc nồng độ ADN phôi thai tự do trong máu ngoại vi của mẹ sau khi sinh chúng tôi thu thập các mẫu nghiên cứu và định lƣợng nồng độ ADN phôi thai tự do trƣớc sinh ở tuần thai 36 của thai kỳ và mẫu máu mẹ sau sinh ở 3 thời điểm 1 giờ, 2 giờ, 3 giờ sau khi sinh. Bảng 3.9. Bảng kết quả nồng độ ADN biến thiên sau sinh STT Mã bệnh nhân Số bản copy gen DYS14 Trƣớc sinh 1 tháng (Tuần thai 36 tuần) 1 giờ sau sinh 2 giờ sau sinh 3 giờ sau sinh 1 SS01 587 42 0 0 2 SS02 329 25 0 0 3 SS03 890 45 4 0 4 SS04 532 60 0 0 5 SS05 716 34 0 0 6 SS06 413 27 0 0 7 SS07 344 27 0 0 Trung bình 544,43 37,14 0,57 0 SD 206,02 12,72 1,51 0 Trên bảng trên là kết quả nồng độ ADN phôi thai tự do trong máu ngoại vi của mẹ trƣớc và sau kkhi sinh, chúng tôi nhận thấy rằng nồng độ bản copy gen DYS14/1ml huyết tƣơng rất cao trung bình là 554,43 ± 206,02 copy/ml. Và sau 1 giờ nồng độ gen DYS14 trong 1ml là 37,14 ± 12,72 copy/ml, sau 2 giờ sau sinh giá trị trung bình số bản copy của gen DYS14 là 0,57± 1,51 bản copy/ml, và hoàn toàn không còn ADN tự do của con sau khi sinh ở giờ thứ 3 sau khi sinh. Trong 7 trƣờng hợp này có 6 trƣờng hợp ADN phôi thai tự do không đƣợc tìm thấy sau 2 giờ sau khi sinh, chỉ còn một trƣờng hợp là sau 2 giờ sau khi sinh ADN phôi thai vẫn còn tồn tại trong máu ngoại vi của mẹ. Ba giờ sau khi sinh thì nồng độ ADN phôi thai không còn tìm thấy trong máu ngoại vi của mẹ. Lo YM, Zhang J, Leung TN, Lau TK, Chang và cộng sự (1999), nghiên cứu trên 10 phụ nữ mang thai nam. Tác giả đã lấy mẫu ở các thời điểm 6 tuần, 4 tuần, 1 tuần, 1 ngày sau khi sinh tác giả thấy ở tất cả các thời điểm này không phát hiện đƣợc ADN phôi thai tự do nữa. Lần thứ 2 tác giả nghiên cứu trên 12 phụ nữ mang thai khác, tác giả đã lấy mẫu ở các thời điểm 5 phút, 15 phút, 30 phút, 45, 60 và 120 phút, kết quả cho thấy ADN phôi thai tự do trong máu mẹ có thời gian bán thải vào khoảng 16,3 giờ Error! Reference source not found.. Hình 3.14. Biểu đồ biến thiên nồng độ ADN phôi thai tự do sau khi sinh Từ kết quả này chúng tôi cũng đã lựa chọn thời điểm lấy mẫu là khoảng 1 giờ, 2 giờ và 3 giờ sau khi sinh. Kết quả của chúng tôi cho thấy ADN phôi thai tự do sau khi sinh bị mất hoàn toàn ở giờ thứ 3 sau khi sinh là hoàn toàn phù hợp với nghiên cứu của Lo và cộng sự năm 1999. Từ kết quả này chúng tôi nhận định rằng ADN phôi thai lƣu hành trong máu ngoại vi của mẹ chỉ tồn tại một thời gian rất ngắn sau khi sinh con. Ở nghiên cứu này chúng tôi nhận thấy chỉ sau 3 giờ sau khi sinh ADN phôi thai đã không thấy xuất hiện trong máu ngoại vi của mẹ.  So sánh nồng độ ADN phôi thai trong máu ngoại vi của mẹ với kết quả QF- PCR Dƣới đây là hình ảnh các mẫu chạy chẩn đoán bất thƣờng nhiễm sắc thể bằng bộ Kít Aneufast Kit đƣợc điện di mao quản: Hình 3.15. Hình ảnh mẫu QF64 (tƣơng ứng mẫu nghiên cứu BT05) bình thƣờng có bộ NST 46, XY Hình ảnh trên cho chúng tôi thấy các locus 13, 18, 21 và XY đều cho các peak với tỷ lệ 1:1. Đối với nhiễm sắc thể giới tính có các locus Amel; X22; DXYS28; DXYS267 nằm trên cả nhiễm sắc thể X và nhiễm sắc thể Y xuất hiện 2 peak với tỷ lệ 1:1. Riêng locus SRY chỉ nằm trên NST Y ở mẫu nghiên cứu này xuất hiện 1 peak chứng tỏ mẫu này là thai nam mang bộ nhiễm sắc thể bình thƣờng 46, XY. Chúng tôi đối chiếu so sánh mẫu nghiên cứu này khi định lƣợng nồng độ ADN phôi thai trong máu ngoại vi của mẹ thấy rằng nồng độ ADN phôi thai tự do trong máu ngoại vi của mẹ của mẫu này là 9,69%. Chúng tôi cũng nhận thấy rằng các mẫu đƣợc chẩn đoán có bộ NST bình thƣờng 46, XY đối chiếu so sánh với nồng độ ADN phôi thai tự do trong máu ngoại vi của mẹ thấy nồng độ ADN phôi thai của các mẫu có bộ nhiễm sắc thể 46, XY trung bình khoảng 10,01 ± 2,67%. Hình 3.16. Hình ảnh điện di mao quan của mẫu QF 61 (tƣơng ứng với mẫu DT 02) có bộ NST 47XY, +21 Từ hình ảnh trên cho chúng ta thấy các locus trên NST số 13, 18, XY xuất hiện các peak với tỷ lệ 1:1 dị hợp tử và một peak đồng hợp tử. Ở mẫu này các locus trên NST số 21: D21S1442, D21S1411 xuất hiện peak với tỷ lệ 1:1:1. Locus D21S1435, D21S1446 xuất hiện các peak với tỷ lệ 2:1. Từ kết quả này chúng tôi kết luận rằng mẫu nghiên cứu này bị là thai nam bị hội chứng Down (Trisomy 21) Bảng 3.10: Bảng nồng độ ADN phôi thai tự do trong huyết tương mẹ của các bệnh nhân mang thai có bộ NST 46, XY (Chi tiết xem phần phụ lục bảng 3.10) STT Mã bệnh nhân Tuổi mẹ Tuổi thai Số bản copy gen DYS14 Số bản copy gen GAPDH Tỷ lệ gen DYS14/GAPDH (%) QF- PCR 1 BT01 41 16 3312,0 27506,0 12,04 46,XY 29 BT29 39 17,5 579,3 4318,0 13,42 46XY TB 33,55 18,36 848,7 7923,4 10,01 SD 6,10 2,46 1141,3 10036,0 2,67 Bảng 3.11: Bảng nồng độ ADN phôi thai tự do trong huyết tương mẹ của các bệnh nhân mang thai có bộ NST bất thường STT Mã bệnh nhân Tuổi mẹ Tuổi thai Hội chứng Số bản copy gen DYS14 Số bản copy gen GAPDH Tỷ lệ gen DYS14/GAP DH (%) QF-PCR 1 DT01 40 20 47,+21 4561,4 11380,0 40,08 47,XY,+21 2 DT02 36 16 47,+21 890,7 1044,0 85,32 47,XY,+21 3 DT03 27 19 47,XXY 465,9 1541,0 30,23 47,XXY 4 DT04 32 23 47,+21 306,7 648,0 47,33 47,XY,+21 5 DT05 37 17 47,+21 819,0 1606,9 50,97 47,XY,+21 6 DT06 36 16 47,+21 935,4 2831,6 33,03 47,XY,+21 7 DT07 40 18 47,+21 1419,3 2188,0 64,87 47,XY,+21 8 DT08 36 19 47,+18 1209,0 3787,2 31,9 47,XY,+18 9 DT09 30 19 47,XXY 279,5 935,4 29,9 47,XXY 10 DT10 34 20 45, XO 0,0 1389,6 0,0 45, XO TB 34,89 18,56 1209,7 2884,7 46,0 SD 4,40 2,19 1315,4 3337,3 18,8 So sánh nồng độ AND phôi thai ở bảng 3.10 và 3.11 thấy nồng độ ADN phôi thai trong huyết tƣơng của mẹ ở trƣờng hợp bình thƣờng 10,01 ± 2,67% và trƣờng hợp bất thƣờng là 46,0 ± 18,8%, điều này cho thấy nồng độ ADN phôi thai tự do của những trƣờng hợp bị dị tật cao hơn trƣờng hợp bình thƣờng khoảng 4,5 lần, sự khác nhau này có ý nghĩa thống kê với p=0,00043 (< 0,05), mặc dù tuổi thai và tuổi mẹ trung bình của hai nhóm này không khác nhau nhiều, sự khác nhau về tuổi mẹ của 2 nhóm này không có ý nghĩa thống kê với p=0,48 (> 0,05). Chungwen Wei và cs. (2001), nghiên cứu sàng lọc ADN phôi thai tự do trong máu mẹ qua gen xác định giới tính nam giới SRY và gen - lactin. Trong số 30 đối tƣợng thai phụ, 19 trƣờng hợp thai nam đã đƣợc xác định chính xác qua phân tích ADN phôi thai trong máu mẹ với độ chính xác 100% khi đối chiếu với kết quả phân tích bộ nhiễm sắc thể qua tế bào dịch ối. Nồng độ ADN tách chiết đƣợc tăng cao trong trƣờng hợp thai nhi bị Down, nồng độ ADN phôi thai trƣờng hợp bất thƣờng tăng cao hơn trƣờng hợp bình thƣờng khoảng 2,9 lầnError! Reference source not found.. Kết quả của chúng tôi cũng khá phù hợp với kết quả của tác giả Chungwen năm 2001.  KẾT QUẢ QUY TRÌNH PHÂN LẬP TẾ BÀO PHÔI THAI TRONG MÁU NGOẠI VI CỦA MẸ  Kết quả phân lập tế bào phôi thai trong máu ngoại vi của mẹ Để phân lập đƣợc tế bào phôi thai trong máu ngoại vi của mẹ chúng tôi tiến hành phân lập dựa vào phức hợp kháng nguyên kháng thể với kháng thể chúng tôi lựa chọn là kháng thể CD71+. Để phân lập tốt giữa tế bào phôi thai và tế bào máu ngoại vi của mẹ chúng tôi còn dựa vào nguyên tắc của hạt từ tính. Các hạt từ tính này chúng tôi bọc bề mặt ngoài của hạt từ là Streptavidin, còn kháng thể chúng tôi gắn Biotin. Mối liên kết giữa Streptavidin với Biotin là một liên kết rất bền chặt về mặt hóa học. Sau khi thu đƣợc hồng cầu có nhân bằng phƣơng pháp này chúng tôi nhuộm hồng cầu có nhân bằng thuốc nhuộm huỳnh quang để chứng minh sự tồn tại của tế bào phôi thai tự do trong máu ngoại vi của mẹ. Sau khi thực hiện chúng tôi thu đƣợc một số kết quả sau: Hình 3.21. Hình ảnh tế bào phôi thai của mẫu số 831 Hình 3.22. Hình ảnh tế bào phôi thai của mẫu số 837 Từ hình ảnh kết quả trên chúng tôi nhận thấy rằng các tế bào phôi chúng tôi tách đƣợc có xuất hiện tín hiệu màu vàng của NST Y, điều này chứng minh rằng quy trình tách tế bào phôi thai trong máu ngoại vi của mẹ đạt kết quả tốt. Theo tác giả Babochkinavà cộng sự năm 2005 đã nghiên cứu nhuộm tế bàophôi thai tự do trong máu ngoại vi của mẹ trên 19 trƣờng hợp mang thai từ tuần thứ 12 đến 37 tuần với độ nhạy của phản ứng lai huỳnh quang NST Y là 91% và độ đặc hiệu là 75% và tác giả đã chứng minh rằng có tế bào phôi thai của con lƣu hành tự do trong máu mẹ.  Kết quả nhân gen SRY sau khi phân lập tế bào phôi thai trong máu ngoại vi của mẹ Sau khi phân lập tế bào phôi thai trong máu ngoại vi của mẹ chúng tôi tiến hành khuếch đại cả bộ gen của các tế bào phân lập đƣợc đó, sau đấy chúng tôi tiến hành chạy nhân gen SRY để chứng minh sự tồn tại của tê bào phôi thai trong máu ngoại vi của mẹ. Quy trình khuếch đại bộ gen từ các tế bào bằng bộ kít Repli-G của Qiagene đƣợc miêu tả chi tiết trong phần phƣơng pháp nghiên cứu và quy trình nhân gen của các locus trên NST X và NST Y đƣợc thực hiện bằng bộ kít Aneufast cho kết quả dƣới đây: Hình 3.23. Hình kết quả nhân gen các locus trên NST giới tính X và Y của mẫu nghiên cứu 964 Từ hình ảnh kết quả trên cho chúng tôi thấy sau khi nhân gen các locus trên NST giới tính X và Y các alen xuất hiện với tín hiệu là các Peak cao và rõ nét. Trong kết quả này có xuất hiện Alen của NST Y ở locus Amel, locus SRY và locus DXYS

Các file đính kèm theo tài liệu này:

  • pdftt_nghien_cuu_quy_trinh_tach_chiet_phan_tich_adn_va_te_bao_phoi_thai_tu_do_trong_mau_ngoai_vi_cua_me.pdf
Tài liệu liên quan