Tóm tắt Luận án Nghiên cứu sự đa dạng tuyến trùng ký sinh gây sần rễ Meloidogyne SPP. ở Tây Nguyên

tên Meloidogyne daklakensis n. sp. và 01 loài còn lại đã được gửi công bố.  Lần đâu tiên tại Việt Nam đã đánh giá khả năng ký sinh và gây chết của nấm Pacylomyces javanicus, vi khuẩn Lysobacter antibioticus HS124 và chất kháng sinh 4-HPAA đối với tuyến trùng sần rễ M. incognita trong điều kiện phòng thí nghiệm. 6. Bố cục của luận án Luận án gồm: 179 trang; Mở đầu 4 trang, tổng quan tài liệu 22 trang. Đối tượng và phương pháp nghiên cứu:13 trang; kết quả và thảo luận: 119 trang; Kết luận và kiến nghị: 2 trang; Luận án gồm 34 bảng, 39 hình và 183 tài liệu tham khảo. Các danh mục các công trình công bố, phụ lục đi kèm. CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Tình hình nghiên cứu tuyến trùng sần rễ giống Meloidogyne trên thế giới 1.1.1. Lịch sử nghiên cứu: Berkeley (1855) là nhà khoa học đầu tiên công bố sự xuất hiện của tuyến trùng sần rễ trên rễ. Đến năm 1949, Chitwood thống nhất tách giống tuyến trùng Meloidogyne Göldi, 1887 dựa trên loài chuẩn M. exigua (Goldi, 1887) tách khỏi tuyến trùng bào nang Heterodera. Vị trí phân loại của giống Meloidogyne hiện tại được theo hệ thống Karsen et al. (2013) 1.1.2. Đặc điểm sinh học, vòng đời của tuyến trùng sần rễ giống Meloidogyne: Chu kỳ sống của tuyến trùng sần rễ Meloidogyne bao gồm 5 giai đoạn phát triển bao gồm: trứng; ấu trùng tuổi 1(J1) nằm trong trứng; ấu trùng tuổi 2 (ấu trùng cảm nhiễm-J2) là giai đoạn di động; ấu trùng tuổi 3, 4 (J3, J4) và giai đoạn trưởng thành với con cái và con đực được cố 5 định trong rễ. Tuyến trùng sần rễ Meloidogyne spp. có 2 hình thức sinh sản khác nhau: sinh sản hữu tính-giao phối bắt buộc (amphimixis) và phần lớn các loài còn lại là sinh sản lưỡng tính (parthenogensis) không cần con đực. 1.1.3. Khả năng gây hại trên một số cây trồng: Tuyến trùng sần rễ Meloidogyne có khả năng ký sinh trên hầu như tất cả các loại cây trồng, lên tới 5500 loại cây khác nhau, bao gồm từ các cây công nghiệp, nông nghiệp cho đến các cây cỏ dại. Thiệt hại cho kinh tế của thế giới hàng năm ước tính lên tới hàng trăm tỷ đô la . 1.1.4. Nghiên cứu phân loại các loài tuyến trùng sần rễ thuộc giống Meloidogyne 1.1.4.1. Phương pháp phân tích hình thái: Chitwood (1949) và Jebson (1983) sử dụng chi tiết các đặc điểm: kim hút, DGO, đặc điểm tấm cắt cutin của con cái, vùng đầu con đực, hình thái lượng của kim hút; khoảng cách từ gốc kim hút đến lỗ đổ của tuyến thực quản lưng (DGO) để mô tả các loài. Các nghiên cứu gần nhất đã sử dụng chi tiết các chỉ số hình thái và hình thái lượng. 1.1.4.2. Phương pháp sinh học phân tử: Các phương pháp hiện nay bao gồm phân tích các vùng gen ribosome (rDNA) trong hệ gen nhân và các vùng gen trong hệ gen ty thể (mtDNA). 1.2. Tình hình nghiên cứu tuyến trùng sần rễ giống Meloidogyne tại Việt Nam. 1.2.1. Tình hình nghiên cứu chung tuyến trùng sần rễ giống Meloidogyne tại Việt Nam: Các nghiên cứu công bố đã đề cập đến nhiều khía cạnh khác nhau, trong đó chủ yếu là thành phần loài, phạm vi ký chủ, sự phát triển số lượng quần thể tuyến trùng và các biện pháp phòng trừ. Nguyễn Ngọc Châu và Nguyễn Vũ Thanh (2000) có 5 loài tuyến trùng sần rễ thuộc giống Meloidogyne. Cho đến nay các nghiên cứu còn hạn chế chủ yếu tập trung vào một số phương pháp phòng trừ. 1.2.2. Tình hình nghiên cứu tuyến trùng sần rễ giống Meloidogyne tại Tây Nguyên 1.2.2.1. Tổng quan Tây Nguyên: Tây Nguyên là khu vực cao nguyên bao gồm 5 tỉnh, xếp theo thứ tự vị trí địa lý từ bắc xuống nam gồm Kon Tum, Gia Lai, Đắk Lắk, Đắk Nông và Lâm Đồng đây là một trong 3 tiểu vùng của miền Trung Việt Nam. Nằm trong vùng nhiệt đới xavan, khí hậu ở Tây Nguyên được chia làm hai mùa: mùa mưa từ tháng 5 đến hết tháng 10 và mùa khô từ tháng 11 đến tháng 4 năm sau. Tây Nguyên có đến 2 6 triệu hecta đất bazan màu mỡ, tức chiếm đến 60% diện tích đất bazan trên cả nước, đất bazan giàu chất dinh dưỡng, tầng phong hoá sâu, phân bố tập trung thuận lợi cho việc hình thành các vùng chuyên canh qui mô lớn với những cây công nghiệp như cà phê, ca cao, hồ tiêu, nên đây là vùng có diện tích cây công nghiệp lớn nhất cả nước với các cây trồng xuất khẩu chủ lực là cà phê và hồ tiêu. 1.2.2.2. Tuyến trùng sần rễ giống Meloidogyne tại Tây Nguyên Tuyến trùng sần rẽ Meloidogyne được xem được xem là đối tượng gây hại nghiêm trọng trên các vùng trồng cà phê và hồ tiêu ở Tây Nguyên do gây ra các bệnh vàng lá, còi cọc, chậm lớn trên cà phê, bệnh chết chậm trên cây hồ tiêu. 1.3. Biện pháp phòng trừ sinh học tuyến trùng sần rễ Meloidogyne. Phòng trừ sớm là giải pháp quan trọng trong việc kiểm soát tuyến trùng. Hiện nay, các biện pháp phòng trừ được sử dụng khi cây đã có biểu hiện triệu chứng thì bệnh do tuyến trùng gây ra đã tương đối nặng nên việc phòng trừ sẽ khó có hiệu quả hoặc có tác dụng chậm trễ. Biện pháp sinh học hay phòng trừ sinh học là một biện pháp tạo ra các sản phẩm tác động trực tiếp hoặc gián tiếp tới tuyến trùng ký sinh thực vật. Nấm Paecilomyces javanicus có khả năng ký sinh gây chết tuyến trùng Meloidogyne. Dịch chiết vi khuẩn Lysobacter antibioticus HS124 và hoạt chất kháng sinh 4-HPAA do chủng vi khuẩn này sinh ra có khả năng ức chế tuyến trùng Meloidogyne incognita. CHƢƠNG 2 THỜI GIAN, ĐỐI TƢỢNG, ĐỊA ĐIỂM VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Đối tƣợng, vật liệu, địa điểm và thời gian nghiên cứu 2.1.1. Đối tượng nghiên cứu Các loài tuyến trùng sần rễ thuộc giống Meloidogyne . 2.1.2. Vật liệu nghiên cứu Một số cây trồng vùng Tây Nguyên: cà phê, hồ tiêu, rau màu, ổi, lúa... Nấm Paecilomyces javanicus, dịch chiết vi khuẩn Lysobacter antibioticus HS124, Kháng sinh 4-Hydroxyphenylacetic (4-HPAA) (Hãng Sigma) 2.1.3. Thời gian, địa điểm nghiên cứu Thời gian khảo sát thực địa được tiến hành từ tháng 1/ 2014 đến tháng 10 năm 2017 tại một số địa điểm thuộc các huyện: CuM‘ga (tỉnh Đắk Lắk); Di Linh (tỉnh Lâm Đồng); Kiến Đức (tỉnh Đắk Nông); Chư Sê (tỉnh Gia Lai) và Đắk Hà (tỉnh Kon Tum) 7 2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu 2.2.1. Khảo sát thực địa và phương pháp thu mẫu 2.2.2. Phương pháp tách lọc tuyến trùng từ đất Tuyến trùng được tách lọc từ đất theo phương pháp được mô tả của Nguyễn Ngọc Châu (2003). 2.2.3 Phương pháp tách lọc tuyến trùng từ rễ Phương pháp tách mẫu rễ theo xay nghiền: theo mô tả Nguyễn Ngọc Châu (2003). Các mẫu rễ có nốt sần sẽ được soi trực tiếp dưới kính hiển vi soi nổi để tách con cái và túi trứng.Con cái được phân tích sơ bộ hình thái và ủ nở trứng thành ấu trùng để nhân nuôi phục vụ cho các nghiên cứu 2.2.4. Nhân nuôi tuyến trùng sần rễ Meloidogyne spp. Tuyến trùng thuộc giống Meloidogyne được nhân nuôi trên cây cà chua theo phương pháp được mô tả của López-Pérez et al. 2011. 2.2.5.Phương pháp xử lý làm trong và làm tiêu bản tuyến trùng Phương pháp cố định tuyến trùng theo Courtney et al., 1955, Phương pháp làm tiêu bản cố định; Phương pháp cắt tấm cutin vùng hậu môn- sinh dục (Hartman & Sasser, 1985). 2.2.6. Nghiên cứu hình thái Phân loại các loài tuyến trùng sần rễ thuộc giống Meloidogyne dựa trên khóa phân loại của Eisenback (1985), Hewlett & Tarjan (1981; 1983), Jepson (1987), Karssen (2002), Kazachenko & Mukhina (2013) kết hợp với các tài liệu khác có liên quan. 2.2.7. Nghiên cứu đa dạng di truyền 2.2.7.1. Tách chiết DNA: Theo Holterman et al. 2009: Ấu trùng được ủ nở từ các túi trứng của từng con cái sẽ được sử dụng để tách chiết DNA. 2.2.7.2. Phản ứng PCR Multiplex-PCR phân loại nhanh các loài Meloidogyne: 3 loài M. arenaria, M. incognita, M. javanica sử dụng đồng thời 3 cặp mồi đặc hiệu Far/Rar; Mi2F4/Mi1R1; Fjav/Rjav được mô tả theo Kiewnick et al. (2013). PCR khuếch đại các vùng gen: Các vùng gen được sử dụng trong nghiên cứu gồm gen ribosome (D2D3, ITS) và các vùng gen ty thể (COI, COII-16S, NAD5) 2.2.7.3. Điện di sản phẩm: Kết quả phản ứng Multiplex PCR được so sánh theo kết quả của Kiewnick et al. (2013). 8 2.2.7.4. Tinh sạch sản phẩm PCR và đọc trình tự DNA: bằng kít GenJet PCR Purification (Thermo Scientific- Đức) theo quy trình của nhà sản xuất và được gửi giải trình tự ở công ty Macrogen- Hàn Quốc. 2.2.7.5. Phân tích trình tự DNA: Các trình tự sẽ được lựa chọn để phân tích, so sánh bằng chương trình ClustalW trong phần mềm BioEdit (Hall. 1999) 2.2.7.6. Thiết lập cây phát sinh chủng loại: Các trình tự của từng vùng gen sẽ được thiết lập cây phát sinh chủng loại theo phương pháp ML (Maximum Likelihood) với mô hình phù hợp nhất cho từng trình tự bằng chương trình Modeltest trong MEGA 6.0 (Tamura et al., 2013), 2.2.8. Nghiên cứu khả năng phòng trừ trong điều kiện phòng thí nghiệm 2.3.8.1. Chuẩn bị nguồn vi sinh vật: Nấm Paecilomyces javanicus cung cấp bởi trường Đại học Khoa học Tự nhiên- ĐHQGHN, Vi khuẩn Lysobacter antibioticus từ chế phẩm GCM của Đại học Quốc gia Chonnam (Hàn Quốc)., Hợp chất 4-HPAA từ hãng Sigma. 2.2.8.2. Đánh giá khả năng ức chế tuyến trùng M. incognita: Các phương pháp được thực hiện theo phương pháp mô tả của Yoon et al., 2012 có hiệu chỉnh. 2.2.8.3. Phân tích số liệu: Số liệu để tính tỷ lệ trứng nở (%) và tỷ lệ chết của ấu trùng (%) được chuyển sang hàm Asin ((x/100)^1/2) và phân tích so sánh ANOVA trong chương trình thống kê SPSS 20. CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 3.1. Tần suất xuất hiện, đặc điểm phân bố, khả năng gây hại của các loài tuyến trùng sần rễ giống Meloidogyne 3.1.1. Tần suất xuất hiện của các loài tuyến trùng sần rễ giống Meloidogyne trên một số cây trồng ở Tây Nguyên Kết quả phân tích 553 mẫu trên 22 cây chủ khác nhau ở các tỉnh thuộc Vùng Tây Nguyên với sự hiện diện của tuyến trùng sần rễ Meloidogyne ở 17/22 cây ký chủ với tần suất bắt gặp trung bình là 55,6%. Lớn nhất được ghi nhận trên cây hồ tiêu 84,3%, cà chua 83,3% và cà phê 68%, các mẫu lạc, bơ, sầu riêng, sắn không ghi nhận được sự xuất hiện của của tuyến trùng sần rễ Meloidogyne. 3.1.2. Phân bố, mật độ của các loài tuyến trùng sần rễ giống Meloidogyne bắt gặp trên các vùng thu mẫu và cây chủ Trên cơ sở phân tích hình thái dựa trên tấm cutin vùng chậu của con cái, hình dạng đuôi của ấu trùng , phần đầu của con đực của các quần thể tuyến trùng sần rễ Meloidogyne và phản ứng Multiplex-PCR đã ghi nhận được 7 loài ở các địa điểm nghiên cứu: M. incognita, M. javanica, 9 M. arenaria, M. enterolobii, M. graminicola và xác định 02 loài mới cho khoa học, một loài được đặt tên và mô tả với tên Meloidogyne daklakensis và một loài chưa được công bố tạm đặt là Meloidogyne sp. 3.2. Đặc điểm hình thái các loài tuyến trùng sần rễ Meloidogyne ở Tây Nguyên 3.2.1. Loài M. incognita (Kofoid & White, 1919) Chitwood, 1949 3.2.1.1. Đặc điểm hình thái & hình thái lượng Con cái: Cơ thể dạng quả lê đến hình cầu, thân tròn, cổ ngắn đến hơi dài. Phần cutin với vòm lưng nhô cao, hơi vuông và bóp hẹp lại từ hai phía bên, vân bụng tròn mịn, đứt đoạn không đều, cấu trúc vulva, anus và mút đuôi rõ ràng. Vùng bên đặc trưng với dạng đứt nối giữa các vân vùng bụng và vùng lưng. Con đực: Cơ thể hình giun, thuôn nhỏ ở hai đầu. Đầu dạng bằng, vùng môi hơi nhô lên, tách biệt với cơ thể. Môi giữa và đĩa môi tạo thành dạng tròn, hơi nhô cao so với môi giữa. Kim hút to khỏe, chiều dài từ 15- 21µm. Núm gốc lớn, dạng tròn, tách rời nhau . Ấu trùng: Cơ thể dạng giun, thon nhỏ vào ở phần đầu và đuôi. Đuôi thuôn nhọn với phần hyaline dài từ 9,2-17,8µm chiếm khoảng 33% chiều dài đuôi. 3.2.1.2. Đa dạng hình thái và các đặc điểm chẩn loại Các quần thể M. incognita trong nghiên cứu có sự đa dạng cao về các đặc điểm hình thái, hình thái lượng của con cái, con đực, ấu trùng trên các cây chủ và các địa điểm thu mẫu khác nhau. Trong đó các đặc điểm tấm cắt cutin vùng hậu môn- sinh dục, đặc điểm kim hút, chiều dài hyaline ở ấu trùng và đặc điểm vùng đầu của con đực giữa các quần thể là ít biến đổi nhất. 3.2.2. Loài Meloidogyne javanica (Treub, 1885) Chitwood, 1949 3.2.2.1. Đặc điểm hình thái và hình thái lượng Con cái: Cơ thể lớn, hình cầu. Phần môi nhô lên tách biệt với cơ thể từ 1-2 vòng đầu ,với phần cổ dài. Nhóm này với đặc trưng rõ rệt nhất ở tấm cutin vùng sinh dục là có 2 đường bên rất rõ ràng, chạy từ phía trong ra đến hết vân, vùng lưng cao vuông và hơi hẹp, cho đến thấp tròn, hai vùng bên hơi phình ra hai phía, các vân mịn và mờ dần phía dưới hậu môn. Con đực: Cơ thể hình giun, thuôn nhỏ ở hai đầu. Đầu dạng bằng, vùng môi hơi nhô lên, tách biệt với cơ thể với chiều cao môi từ 4,2-7,0µm. Môi giữa và đĩa môi tạo thành dạng tròn, hơi nhô cao so với môi giữa. Kim hút to 10 khỏe, chiều dài trung bình từ 17,8-19,7µm. Núm gốc lớn, dạng tròn, tách rời nhau. Ấu trùng: Cơ thể có dạng giun, vót nhọn ở phần đầu và đuôi. Đuôi hình chóp dài với mút đuôi tròn, chiều dài đuôi từ 31-63µm, phần hyaline chiếm 1/3 chiều dài đuôi với chiều dài từ 9,1-16,7µm, hình dạng đuôi biến đổi. 3.2.2.2. Đa dạng hình thái và các đặc điểm chẩn loại Các quần thể M. javanica có sự biến đổi các đặc điểm hình thái, hình thái lượng của con cái, con đực, ấu trùng trên các cây chủ và vùng thu mẫu khác nhau. 3.2.3. Loài M. arenaria (Neal, 1889) Chitwood, 1949 3.2.3.1. Đặc điểm hình thái và hình thái lượng Con cái: Cơ thể hình quả bầu, hồ lô, cổ ngắn đến hơi dài. Tấm cutin vùng hậu môn-sinh dục với đặc điểm phần lưng hơi phình sang hai bên, vùng lưng tròn, thấp sát vào phía phasmid, không có đường bên nhưng có một đường dài chạy xen giữa các vân sang hai phía làm đường giao nhau cho vân vùng lưng và bụng, vulva hẹp với chiều dài vulva từ 16-26µm. Khoảng cách phasmid nhỏ, mút đuôi không rõ ràng. Con đực: Cơ thể hình giun, thuôn nhỏ ở hai đầu. Đầu dạng bằng, vùng môi hơi nhô lên, tách biệt với cơ thể, chiều cao môi 4,2-5,8. Môi giữa và đĩa môi tạo thành dạng tròn, đĩa môi nằm ngang với môi giữa. Kim hút to khỏe, chiều dài trung bình từ 14,3-20µm. Núm gốc lớn, dạng tròn, tách rời nhau. Ấu trùng: Có dạng giun, vót nhọn ở phần đầu và đuôi. Đuôi hình chóp dài với mút đuôi tròn, chiều dài từ 39-60µm, phần hyaline chiếm 1/3-1/4 chiều dài đuôi với chiều dài từ 12-15,7µm. Hình dạng đuôi biến đổi nhiều. 3.2.3.2. Đa dạng hình thái và các đặc điểm chẩn loại Các quần thể loài M. arenaria có các chỉ số chiều dài, chiều rộng, chiều dài cổ, chiều dài từ đầu- lỗ bài tiết, các đặc điểm hình thái và hình thái lượng tấm cutin ở con cái, các đặc điểm chiều cao môi, chiều dài đuôi, phasmid, b, b’, c, c’ ở con đực, chỉ số chiều dài kim hút, chiều dài đuôi, chiều dài hyaline ở ấu trùng ít biến đổi. 3.2.4. Loài Meloidogyne enterolobii Yang, Eisenback., 1983 3.2.4.1. Đặc điểm hình thái và hình thái lượng Con cái: Cơ thể dạng tròn hoặc quả lê với phần cố từ ngắn đến hơi dài. Tấm cutin vùng hậu môn-sinh dục thường xuyên có dạng ô van, với các vân thô và nhẵn; vòm lưng thường từ trung bình đến cao, thường xuyên có dạng vuông, một số hơi tròn. Đường bên hơi mờ. Vân của vùng trung tâm thường mịn hoặc nhẵn, mấu đuôi quan sát được; ống phasmid lớn. 11 Con đực: Cơ thể màu trắng đục, dạng giun dài, thuôn nhỏ ở hai đầu. Đầu dạng bằng, vùng môi hơi cao từ 4,2-5,6µm tách biệt với cơ thể. Môi giữa và đĩa môi tạo thành dạng quả tạ, đĩa môi dạng tròn, nằm ngang so với môi giữa. Kim hút khá mảnh. Núm gốc lớn, dạng tròn, tách rời nhau. Ấu trùng: Cơ thể hình giun, thon, mảnh thon dần cả hai phía, phía đuôi nhọn. Phần đuôi khá dài, chóp đuôi nhọn, mút đuôi khá đậm, hyaline dài từ 20,1- 26,7µm, đuôi nhỏ, hình dạng đuôi biến đổi. 3.2.4.2. Đa dạng hình thái và các đặc điểm chẩn loại Các chỉ số chiều dài kim hút, DGO và chiều dài ở ấu trùng là các đặc điểm ít biến đổi nhất ở loài M. enterolobii giữa các mẫu nghiên cứu, đây là các đặc điểm có thể sử dụng để phân loại M. enterolobii kết hợp với các đặc điểm ở tấm cắt cutin vùng hậu môn- sinh dục của con cái. 3.2.5. Loài Meloidogyne graminicola Golden & Birchfield 1965 3.2.5.1. Đặc điểm hình thái và hình thái lượng của loài M. graminicola Con cái: Cơ thể hình quả lê, tròn với phần cổ ngắn, thẳng. Phần cutin vùng hậu môn-sinh dục hình tròn vân mịn, vân đều liên tục không bị đứt đoạn, vòm lưng thấp và tròn bao quanh vulva, anus và mút đuôi.. Vulva tròn, nằm ở vị trí trung tâm của vùng không có vân. Con đực: Cơ thể dạng trụ, hình giun, thuôn nhỏ về phía trước hơn về phía sau. Các vòng cutin phân đốt rõ ràng. Vùng môi liên tục với cơ thể hoặc hơi tách biệt bằng một sự thắt lại, gần như phẳng ở phần trước, bao gồm một vòng môi rõ ràng và theo sau bởi 1 hoặc đôi khi là 2 vòng sau môi rộng. Khung đầu kitin hóa mạnh. Kim hút khá khỏe với các núm gốc tròn và nghiêng về phía sau chiều dài từ 13,2-17µm. Ấu trùng : Cơ thể dạng trụ, hình giun và thuôn nhỏ dần về phía hai đầu. các vòng cutin khá mịn và được đánh dấu bởi các vân ngang rõ ràng. Đuôi dài 47,7-74,8µm, đuôi nhọn, nhỏ, mút đuôi vót nhọn, hyaline khá dài, từ 16-24,4µm. 3.2.5.2. Đa dạng hình thái loài M. graminicola 3.2.6. Loài Meloidogyne daklakensis Trinh, Le, Nguyen, Nguyen, Liebanas & Nguyen, 2018 3.2.6.1. Đặc điểm hình thái và hình thái lượng. Con cái: Cơ thể hình quả lê với phần cổ ngắn, thẳng không bị uốn cong. Phần đầu nhọn. Miệng dạng khe ngang với phần môi phân thành 2 đốt, hơi tách biệt với phần còn lại của cơ thể, đĩa môi không hợp nhất với phần giữa môi và hơi nhô cao, phần môi bên mở rộng. Phần cutin vùng hậu môn-sinh dục hình tròn hoặc bầu dục, vân mịn, vân đều liên tục 12 không bị đứt đoạn, vòm lưng thấp và tròn bao quanh vulva, anus và mút đuôi. Phasmids không rõ. Vulva nằm ở vị trí trung tâm của vùng không có vân. Hình 3.13. Ảnh chụp loài Meloidogyne daklakensis (A-E: con cái: A: hình dạng; B-C: phần đầu; D-E: phần hậu môn- sinh dục; F-I: ấu trùng: F: phần miệng; G: đường bên; H-I: phần đuôi; K-N: con đực: K, L: phần đầu- miệng; M: đường bên;N: phần đuôi; thước đo:A: 100 µm; B-N: 10 µm; B, C, E, F, G, I, L, M, N: ảnh chụp SEM; A, D, H, K: ảnh chụp kính hiển vi) Con đực: Vùng đầu cao, hơi tách ra khỏi cơ thể bao gồm một vòng môi lớn, môi giữa và đĩa môi tạo thành hình cái nơ, môi bên lơn và có dạng tam giác, hơi thấp hơn đĩa môi và môi giữa; lỗ mở amphid dạng khe ngang lớn khá dài nằm ở giữa đĩa môi và môi bên. Vòng môi sau chia thành bốn phần bởi các khía dọc. Kim hút mập và thẳng, một núm gốc bên phát triển, hai núm còn lại vát về phía sau. 13 Ấu trùng: Cơ thể dài dạng mảnh, thon dài về phía đuôi. Đuôi thuôn dài và nhọn. 3.2.7. Loài Meloidogyne sp. 3.2.7.1. Đặc điểm hình thái và hình thái lượng Hình 3.16. Ảnh chụp loài Meloidogyne sp. (A-E: con cái: A: hình dạng cơ thể; B-C: phần đầu; D-E: phần hậu môn- sinh dục; F-K: ấu trùng: F,G: phần đầu ; H: đường bên; I-K: phần đuôi ;L-O: con đực: L,M: phần đầu- miệng; N: đường bên; O: phần đuôi; thước đo: A: 100 µm; B-M:10 µm; B, E, G, H, K, M, N, O: ảnh chụp SEM; A, C, F, I, L: Ảnh chụp kính hiển vi) Con cái: Con cái dạng trong phần đuôi hơi lồi ra ngoài, màu trắng đục. Phần đầu hơi tách biệt với cơ thể, lỗ miệng dạng khe ngang, nằm trong vùng trước miệng hình trứng, bao quanh bởi 6 nhú môi trong. Đĩa môi dạng tròn, hơi 14 nhô cao so với môi. Tấm cutin vùng hậu môn-sinh dục dạng tròn đến oval, các vân nhẵn, liên tục. Vòm lưng thấp và tròn bao quanh vulva và mấu đuôi. Con đực: Phần đầu là cao và tròn, gồm vòng môi lớn và hai vòng sau môi, đôi khi chứa các vòng không hoàn toàn. Vùng đầu là không tách biệt với cơ thể. Các môi phụ lưng và môi phụ bụng hợp nhất thành môi giữa, mỗi môi với hai nhú đầu. Ấu trùng: Cở thể mảnh, thuôn dần đến phần đuôi thuôn dài. Đuôi dạng nón nhọn với chóp tròn không phân đốt. Hyaline rõ ràng. Phasmids nhỏ, rõ ràng 3.3. Đa dạng hình thái, hình thái lƣợng các loài Meloidogyne 3.3.1. Phân tích đa dạng hình thái lượng giữa các loài Meloidogyne spp. Ở con cái qua phân tích các chỉ số khác biệt (CDA) bằng phần mềm Genstat 12 với 20 chỉ số hình thái lượng ghi nhận được 3 giá trị có ý nghĩa là chỉ số Stl, EP, a và tỷ lệ EP/ST, đây là các chỉ số phù hợp với các mô tả của các loài Meloidogyne.Kết quả phân tích CDA của 26 chỉ số hình thái lượng của con đực chỉ có 2 chỉ số cho vectơ có ý nghĩa là chỉ số b’ và c’ có thể sử dụng trong phân loại các loài Meloidogyne.Trong phân tích CDA của 16 chỉ số hình thái lượng của ấu trùng ghi nhận 3 chỉ số cho chỉ số vectơ có ý nghĩa là chiều cao môi, DGO, Hyaline, b và c’ đây được xem là các chỉ số có thể phân biệt được các loài. 3.3.2. Đa dạng hình thái giữa các loài Meloidogyne spp. Hình 3.21. Đặc điểm so sánh tấm cutin vùng chậu của con cái các loài tuyến trùng sần rễ Meloidogyne spp., (Thước đo: 10 µm;) 15 Hình 3.22. Đặc điểm so sánh vùng đầu con đực giữa các loài tuyến trùng sần rễ Meloidogyne spp. (Thước đo: 10 µm) Hình 3.23. Đặc điểm so sánh phần đuôi ấu trùng tuổi 2 giữa các loài tuyến trùg sần rễ Meloidogyne spp., (Mũi tên chỉ vị trí phasmid; thước đo:10 µm) 16 3.4 . Phân tích đa dạng di truyền các loài Meloidogyne spp. 3.4.1. Phản ứng Multiplex-PCR Kết quả sản phẩm điện di của loài M. incognita cho kích thước 300 bp, loài M. arenaria cho kích thước 420 bp và loài M. javanica cho kích thước 670 bp, phù hợp với nghiên cứu của Kiewnick et al., 2013. Phương pháp này có thể sử dụng để phân loại nhanh 3 loài M. incognita, M. javanica, M. arenaria trong cùng một phản ứng Multiplex-PCR. Hình 3.24. Hình điện di sản phẩm Multiplex PCR (Giếng M: Marker 100; J: M. javanica; A: M. arenaria; I: M. incognita; 1-27: M. incognita ; 28-29: M. graminicola; 30-36: M. javanica; 37-40: M. daklakensis; 41-43: M. enterolobii; 44-48: M. arenaria; 49-50: Meloidogyne sp; +, - : mẫu đối chứng) 17 3.4.2. Phân tích đa dạng di truyền 3.4.2.1 Vùng gen ITS-rDNA Hình 3.25. Cây phát sinh chủng loại các loài Meloidogyne spp., dựa trên vùng gene ITS xây dựng theo phương pháp Maximum Likelihood (mô hình TN92+G). Số ở gốc các nhánh là giá trị bootstrap với 1000 lần lấy lại mẫu (%). Các số hiệu phía sau tên loài là ký hiệu mẫu hoặc mã số genbank 18 3.4.2.2 Vùng gen D2D3-rDNA Hình 3.26. Cây phát sinh chủng loại các loài Meloidogyne spp., dựa trên vùng gene D2D3 xây dựng theo phương pháp Maximum Likelihood (mô hình K2+G). Số ở gốc các nhánh là giá trị bootstrap với 1000 lần lấy lại mẫu (%). Các số hiệu phía sau tên loài là ký hiệu mẫu hoặc mã số genbank 19 3.4.2.3.Vùng gen COI-rRNA Hình 3.27. Cây phát sinh chủng loại các loài Meloidogyne spp., dựa trên vùng gene COI xây dựng theo phương pháp Maximum Likelihood (mô hình GTR+G). Số ở gốc các nhánh là giá trị bootstrap với 1000 lần lấy lại mẫu (%). Các số hiệu phía sau tên loài là ký hiệu mẫu hoặc mã số genbank 20 3.4.2.4. Vùng gen COII-16S rRNA Hình 3.28. Cây phát sinh chủng loại các loài Meloidogyne spp., dựa trên vùng gene COII-16S xây dựng theo phương pháp Maximum Likelihood (mô hình HKY+G+I). Số ở gốc các nhánh là giá trị bootstrap với 1000 lần lấy lại mẫu (%). Các số hiệu phía sau tên loài là ký hiệu mẫu hoặc mã số genbank 21 3.4.2.5. Vùng gen NAD5 Hình 3.29. Cây phát sinh chủng loại các loài Meloidogyne spp., dựa trên vùng gene NAD5 xây dựng theo phương pháp Maximum Likelihood (mô hình GTR+G). Số ở gốc các nhánh là giá trị bootstrap với 1000 lần lấy lại mẫu (%). Các số hiệu phía sau tên loài là ký hiệu mẫu hoặc mã số genbank. Thảo luận: Trong nghiên cứu này khi phân tích cả 5 vùng gen ở tất cả các loài Meloidogyne phổ biến được nhóm lại với nhau (M. incognita, M. javanica, M. arenaria, M. arabicida, M. izalcoensis) tạo thành 1 nhánh (nhánh Ia) với bootstrap lên tới 99 ở gen ITS, 92 ở gen D2D3, 96 ở gen COI, 99 ở gen COII-16S và 98 ở gen NAD5, đây được xem là các loài nhiệt đới do được ghi nhận nhiều nhất ở các nước nhiệt đới, trong khi các 22 loài ôn đới (M. hapla; M. fallax, M. chitwoodi) nhóm lại với nhau thành 1 nhánh khác. Ba loài thuộc nhánh Ia bao gồm M. incognita, M. javanica, M. arenaria có mức độ tương đồng rất cao khó có khả năng phân biệt chúng. Jansen et al., 2016 đã phân tích các vùng gen ty thể bao gồm COI, COII, CO3, NAD1, NAD3, NAD5 kết quả các loài Meloidogyne nhánh Ia này có thể phân loại một các chính xác, trong đó đoạn gen NAD5 chứa số vị trí sai khác nhiều nhất và đây được xem là vùng gen ưu tiên cho các loài Meloidogyne nhánh Ia. Việc giải trình tự và phân tích vùng gen NAD5 hiệu quả nhất cho các loài M. incognita, M. javanica, M. arenaria, đối với các loài còn lại như M. ethiopica, M. inornata, M. luci ở nhánh Ia có thể cần bổ sung thêm vùng gen COII-16S. Kết quả đó cũng thể hiện trong nghiên cứu này khi phân tích 5 vùng gen ở 3 loài M. incognita, M. javanica, M. arenaria ghi nhận sự biến đổi nucleotide ở vùng NAD5 là nhiều nhất từ 1-2%, và tạo thành các nhánh khác nhau ở 3 loài này. Vị trí biến đổi và các phân tích phát sinh chủng loại cũng thể hiện điều này khi các nhóm loài được tách ra thành các nhánh gần nhau. Các phân tích loài M. enterolobii (5342, 534