Tóm tắt Luận án Nghiên cứu tách, thủy phân glucomannan từ cây Amorphophallus Konjac K.Koch định hướng ứng dụng hạ đường huyết của sản phẩn tạo thành

am, đồng thời góp phần nâng cao giá trị sử dụng của glucomannan nhằm tạo ra 3những sản phẩm dược phẩm, thực phẩm chức năng có giá trị thực tiễn cao t cây Nưa Amorphophalus konjac K.Koch ở Việt Nam chúng tôi đã lựa chọn đề tài “Nghiên cứu tách, thủy phân glucomannan từ cây Amorphophallus Konjac K.Koch định hướng ứng dụng hạ đường huyết của sản phẩn tạo thành”. 2. Mục tiêu của luận án: - Tách, xác định tính chất và chứng minh cấu trúc cùa glucomannan t củ của cây Amorphophallus Konjac K.Koch thu nhận tại Việt Nam. - Xác định điều kiện tối ưu cho phản ứng thủy phân Konjac glucomannan để chế tạo các loại glucomannan với khối lượng phân tử thấp bằng các phương pháp khác nhau. - Thăm dò hoạt tính hạ đường huyết và cơ chế hạ đường huyết của sản phẩm thủy phân. 3. Các nội dung nghiên cứu chính của luận án * Nghiên cứu thành phần hóa học chính của củ cây A.Konjac K.Koch: Xác định tỷ lệ manose/glucose, cấu trúc hóa học, khối lượng phân tử bằng các phương pháp hóa lý hiện đại (IR, NMR, TGA, ) * Xác định điều kiện tối ưu cho phản ứng thủy phân konjac glucomannan bằng phương pháp hóa học và phương pháp enzym, xác định cấu trúc, tính chất của sản phẩm thủy phân. * Nghiên cứu ảnh hưởng của konjac glucomannan và konjac glucomannan thủy phân đến khả năng hấp thu và dung nạp glucozơ máu của chuột nhắt trắng. Xác định khả năng kích hoạt enzym AMPK của konjac glucomannan thủy phân. 44. Ý nghĩa khoa học và đóng góp mới của luận án. 1-Đã nghiên cứu đầy đủ về glucomannan t cây nưa Amorphophallus Konjac K.Koch t tách chiết đến nghiên cứu cấu trúc và thủy phân bằng các phương pháp khác nhau. 2-Sử dụng quy hoạch hóa thực nghiệm bậc 2 của Box- Benh Ken, xác định được điều kiện tối ưu cho phản ứng thủy phân glucomannan và bằng enzym. Sản phẩm thủy phân tạo thành là oligome có khối lượng phân tử giảm t 1598 kDa xuống còn 2051,77 Da, tan tốt trong nước độ tan 92,5% mà vẫn giữ được cấu trúc, tính chất của polime ban đầu. 3-Đã đánh giá khả năng kích hoạt enzym AMPK trên invitro và khả năng giảm sự hấp thu và tăng khả năng dung nạp glucose trên chuột nhắt trắng của glucomannan và glucomannan thủy phân. Kết quả nghiên cứu cho thấy glucomannan thủy phân có khả năng kích hoạt enzym AMPK và làm hạ glucose huyết trên chuột nhắt trắng.. 5. Bố cục của luận án. Luận án gồm 124 trang với 29 bảng số liệu, 33 hình và 9 sơ đồ. Bố cục của luận án: Mở đầu: 2 trang, chương 1 - Tổng quan: 40 trang; chương 2 - Đối tượng và phương pháp nghiên cứu: 18 trang; chương 3 - Kết quả và bàn luận 53 trang; kết luận chung - 2 trang. Danh mục các công trình khoa học đã công bố liên quan đến luận án: 1 trang. 5B. NỘI DUNG LUẬN ÁN CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN 1.1. Giới thiệu chung về glucomannan 1.1.1.Nguồn gốc, cấu trúc glucomannan 1.1.2. Tính chất vật lý của glucomannan. 1.1.3. Tính chất hóa học của glucomannan 1.1.4. Hoạt tính sinh học và tác dụng dược lý của glucomannan 1.2. Cây nưa A.konjac K.Koch và quy trình tách chiết glucomannan 1.2.1. Cây Nưa Amorphophallus Konjac K.Koch 1.2.2. Quy trình tách chiết glucomannan từ củ A.konjac 1.3. Phản ứng cắt mạch glucomannan 1.3.1. Cắt mạch bằng các phương pháp lý -hóa học 1.3.2. Thủy phân với xúc tác enzym 1.4. Enzym AMPK và vai trò của nó trong hạ đường huyết 1.4.1. Quá trình chuyển hóa glucose trong cơ thể 1.4.2. Khái quát về enzym Adenoidin 5'-monophosphat kích hoạt protein kinase (AMPK ) 1.4.3. Các phương pháp kích hoạt AMPK 1.5. Tính hình nghiên cứu glucomannan từ cây nưa A.konjac tại Việt Nam CHƯƠNG 2. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Đối tượng nghiên cứu Nguyên liệu được dùng cho nghiên cứu là củ Nưa (thân củ) Amorphophallus Konjac K.Koch được trồng tại tỉnh Lâm 6Đồng trong 3 năm, được thu vào tháng 10 năm 2016. Mẫu được giám định tên khoa học bởi TS Nguyễn Văn Dư, Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật, tiêu bản được lưu giữ tại nhà lưới lưu mẫu ở tỉnh Đắc Nông của Trung tâm phát triển công nghệ cao - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. - Vi khuẩn Bacillus substilis và Bacillus lichenifomis Trong nghiên cứu này đã sử dụng khuẩn lạc của 2 chủng Bacillus substilis và Bacillus lichenifomis được cung cấp bởi phòng thí nghiệm nuôi giữ chủng vi sinh vật gốc để sản xuất chế phẩm sinh học AT- BiO của Công ty TNHH Sản xuất & Dịch vụ An Thái. Cả 2 chủng này đều là những vi khuẩn có lợi, an toàn sinh học và nguồn gốc xuất xứ rõ ràng và có bản giải trình tự gen của chủng gốc kèm theo phụ lục của luận án này. Các vi sinh vật hữu ích được mua chủng gốc t Công ty cổ phần Công nghệ vi sinh và Môi trường. - Enzym endo-1,4 β-Mannanase (Bacillus sp.) EC 3.2.1.78Cazy Family: GH26CAS: 37288-54-3 của công ty Megazyme. -Tế bào C2C12 (tế bào cơ vân nguyên phát của chuột nhắt, CRL-1772) được cung cấp bởi hệ thống chủng chuẩn của Mỹ - Động vật: chuột nhắt trắng, cả hai giống, khoẻ mạnh, trọng lượng t 20-30g, do học viện Quân y cung cấp 2.2. Phương pháp nghiên cứu 2.2.1. Phương pháp xác định hàm lượng glucomannan. Được thực hiện theo phương pháp DNS: Thủy phân glucomannan sau đó cho dịch thủy phân tác dụng với axit 3,5- 7dinitrosalicylic axit tạo sản phẩm có màu nâu đỏ. Xác định hàm lượng mono saccharide bằng đường chuẩn glucose. 2.2.2. Tách glucose từ củ nưa A.Konjac. Sử dụng phương pháp kết hợp khô, ướt có cải tiến để tách glucomannan t củ nưa A.Konjac K.Koch. Bước 1: Củ nưa Konjac được rửa sạch, loại bỏ tạp chất, thái lát nhỏ, ngâm vào dung dịch NaHSO3 0,25 ‰. Bước 2: Thêm dung dịch etanol/nước tỷ lệ 1,5:1với tỷ lệ củ/dung môi là 1:2.Thời gian xay nghiền 20 phút. Bước 3: Ly tâm thu tủa (dạng sệt). Bước 4: Sấy khô hỗn hợp sản phẩm thu được bột konjac glucomannan (KGM). Bước 5: Tinh chế sản phẩm bằng cách hòa tan bột KGM vào dung dịch etanol 40% gia nhiệt, khuấy đều, ly tâm thu tủa, bỏ phần dịch lọc. Lặp lại quá trình 3 lần thu được KGM tinh chế. 2.2.2. Phương pháp xác định cấu trúc Cấu trúc hóa học của các hợp chất được xác định trên cơ sở sử dụng các phép xác định thông số vật lý và các phương pháp đo phổ bằng các thiết bị hiện đại đồng thời kết hợp với phân tích và tra cứu tài liệu tham khảo. 2.2.2.1. Phổ hồng ngoại IR 2.2.2.2. Phổ cộng hưởng t nhân (NMR) 2.2.2.3.Giản đồ phân tích nhiệt 2.2.2.4. Thiết bị đo áp suất thẩm thấu OSMOMAT 090 8Tỷ lệ đơn vị cấu trúc manose/glucose được xác định dựa vào giá trị tích phân trên phổ cộng hưởng t hạt nhân proton 1H- NMR, theo công thức sau: Glu  H1 ManH1 Man/Glu I I R (2.3) Trong đó: RGlu/Man là tỷ lệ glucose/mannose IH1-Glu là giá trị tích phân proton H1 của glucose. IH1 -Man là giá trị tích phân proton H1 của mannose. * Xác định độ axetyl hóa Độ axetyl hóa DA được xác định dựa vào giá trị tích phân trên phổ cộng hưởng t hạt nhân proton 1H-NMR, theo công thức sau: %100 3 1 3   H CH I I DA (2.4) Trong đó: ICH3 là giá trị tích phân của H trong nhóm CH3 IH1 là giá trị tích phân của proton liên kết với C1. 2.2.3. Thủy phân glucomannan 2.2.3.1. Thủy phân bằng axit - Lấy vào mỗi cốc một thể tích chính xác dung dịch hỗn hợp axit CH3COOH và axit HCl. Cân 10g glucomannan, phân tán vào dung dịch hỗn hợp axit, khuấy dung dịch đến đồng nhất đối với cả 2 phương pháp thủy phân bằng axit và bằng axit kết hợp sóng siêu âm. - Tiến hành siêu âm mẫu ở nhiệt độ thường trong khoảng 30 phút sau đó khuấy t có gia nhiệt đối với mẫu thủy phân kết hợp sử dụng sóng siêu âm với cường độ 20 Hz và chỉ khuấy t 9có gia nhiệt đối với mẫu thủy phân bằng axit. Tiến hành phản ứng tại các nồng độ xác định ở một nhiệt độ, thời gian nhất định. Đo độ nhớt của hỗn hợp phản ứng tại các thời điểm nghiên cứu. - Kết thúc phản ứng, rửa hỗn hợp bằng etanol, sấy khô hỗn hợp phản ứng ở 60oC đến khối lượng không đổi nhận được sản phẩm glucomannan thủy phân. Phương pháp thủy phân bằng axit kết hợp sóng siêu âm cho sản phẩm LKGM-1. Phương pháp thủy phân bằng axit thu được sản phẩm LKGM-2. - Khảo sát các điều kiện của phản ứng bằng phương pháp truyền thống: nồng độ axit HCl thay đổi lần lượt là: 0,05M; 0,1M; 0,15M, 0,2M, 0,25M. Các mức nhiệt độ là: 50 oC, 60 oC, 70 oC, 80 oC, Sau các khoảng thời gian 1 giờ, 2 giờ, 3 giờ, 4 giờ, 5 giờ, Tỉ lệ rắn/lỏng được thay đổi: 1/5; 1/10; 1/15; 1/20 (g/ml) Hiệu quả thủy phân được đánh giá thông qua độ nhớt của hỗn hơp phản ứng. 2.2.3.2. Thủy phân bằng enzym * Định tính xác định khả năng phân huỷ glucomannan của các enzym t vi khuẩn.Chúng tôi lựa chọn 2 loại vi khuẩn có sản sinh enzym β-mannanase là bacillus substilis và bacillus lichenifomis để phân hủy Konjac glucomannan. * Thủy phân Konjac Glucomannan xúc tác enzym Sau khi định tính xác định được loại enzym có khả năng phân hủy glucomannan, chúng tôi sử dụng enzym t vi khuẩn đã thương mại hóa của công ty Megazyme đã được tiêu chuẩn hóa trong các thực nghiệm tiếp theo. Khảo sát điều kiện tối ưu của phản ứng bằng kế hoạch hóa thực nghiệm bậc 2 của Box Behken 4 yếu tố 3 mức độ 10 Bảng 2.1. Các mức của các yếu tố ảnh hưởng Các mức Các yếu tố -1 0 +1 Nhiệt độ (X1, oC) 30 40 50 Thời gian (X2, h) 4 6 8 pH (X3) 5 7 9 Tỉ lệ E/S (v/w), X4 0,1 0,4 0,7 Chuẩn bị 27 bình phản ứng 500ml. Lần lượt phân tán 10g glucomannan trong 300ml H2O vào mỗi bình, pH của dung dịch điều chỉnh pH 5÷9 bằng axit HCl. Thêm vào các dung dịch lượng enzym (w/w) t0,1÷0,7%, lắc và khuấy dung dịch đến đồng nhất. Ủ hỗn hợp trong tủ ấm trong các khoảng thời gian 48 giờ. Tiến hành phản ứng tại nhiệt độ30 50oC. Kết thúc phản ứng, đo độ nhớt của hỗn hợp phản ứng, thêm dư dung môi EtOH tuyệt đối vào hỗn hợp, ly tâm tốc độ 9000 vòng/phút. Loại bỏ dung dịch, sấy khô chân không ở nhiệt độ 50oC đến khối lượng không đổi nhận được sản phẩm glucomannan thủy phân LKGM-2. Xử lý số liệu bằng phần mềm Design Expert. 2.2.3. Phương pháp xác định hoạt tính sinh học 2.2.3.1. Đánh giá tác dụng hoạt hóa AMPK của Konjac glucomannan Đánh giá khả năng hoạt hóa AMPK của mẫu thử thông qua đánh giá mức độ biểu hiện của AMPK đã phosphoryl hóa ở phân tử threonin 172 (kí hiệu là p-AMPK). Phương pháp được sử dụng để đánh giá mức độ biểu hiện của các enzym này dùng 11 kỹ thuật lai Western plot. Quá trình được thực hiện tại bộ môn Dược lực Trường Đại học Dược Hà Nội. 2.2.3.1. Hoạt tính hạ đường huyết của Konjacglucomannan trên chuột nhắt trắng. Khả năng kích thích sự dung nạp glucose huyết của sản phẩm thủy phân được xác định trên mô hình chuột bình thường, khỏe mạnh bằng nghiệm pháp xét nghiệm dung nạp glucose qua đường uống (Oral glucose tolerance test - OGTT). Nghiệm pháp trên được thực hiện tại trường Đại học Dược Hà Nội. Chương 3. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1. Nghiên cứu tách, tinh chế và đặc điểm cấu trúc, tính chất của glucomannan trong củ nưa A.konjac 3.1.1. Hàm lượng glucomannan trong củ Nưa A.Konjac Bột glucomannan t củ nưa Amorphophallus Konjac là chất bột màu trắng tan trong nước với độ tan 32% hàm lượng 12,26% trong củ tươi. hàm lượng tro 4,17%, độ hút ẩm 9%, hàm lượng Asen 0,208 ppm, hàm lượng chì 0,184 ppm. So sánh với kết quả các nghiên cứu trước, hàm lượng glucomannan trong củ nưa Konjac cao hơn so với các loài nưa chuông (Paeonnifolius) hàm lượng 1,67% và nưa đầu nhăn (Corrugatus) 6%. Điều này khẳng định vai trò của cây Amorphophallus Konjac trong định hướng phát triển các loài Nưa ở Việt Nam. 3.1.2. Cấu trúc của Konjac glucomannan. Để xác định cấu trúc của KGM, chúng tôi đã tiến hành ghi phổ hồng ngoại, phổ cộng hưởng t hạt nhân 1H, 13C và phổ HSQC của KGM. Độ dịch chuyển hóa học (δ ppm) của proton (1H) của KGM được quy kết như ở bảng 3.5. 12 Bảng 3.5: Độ dịch chuyển hóa học của proton (1H) của KGM Tín hiệu Mannose (δ ppm) Glucose (δ ppm) H1 5,30; 5,60 5,65;5,04 H2 4,24;4,29 3,94÷3,99 H3 4,32÷4,69 4,20÷4,23 H4 3,80÷3,89 3,79 H5 3,65÷3,65 4,06÷4,08 H6 4,29;4,27 4,18÷4,19 H của CH3CO- 2,52 Kết quả phân tích phổ cho thấy glucomannan tách t cây A.konjac, có cấu trúc vô định hình, có tỷ lệ manose/glucose là 1,6/1, độ axetyl hóa ≈8%, khối lượng phân tử 1.598 kDa, phân nhánh tại vị trí C6. So với các loại Nưa khác đã tìm thấy tại Việt Nam, glucomannan thu được t cây nưa A, Konjac có độ acetyl hóa lớn nhất (nưa chuông; nưa thái có DA =0; nưa trạm trổ có DA = 7,22; nưa đầu nhăn có DA = 7,57)[9]. Khối lượng phân tử của glucomannan được xác định bằng phương pháp áp suất thẩm thấu Kết quả này chứng minh Konjac glucomannan có khả năng hòa tan trong nước lớn hơn nhiều loại nưa khác đã được tìm thấy tại Việt Nam. Nhờ có tính chất này, Konjac glucomannan được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực như thực phẩm, dược phẩm và các lĩnh vực khác. kDamolg d C KT M C n 598.1)/(910.597.1 )(848 lim 0      13 Trên phổ hai chiều 1H-13C-HSQC-NMR, mỗi tương tác C/H được đặc trưng bằng một tín hiệu, các liên kết trực tiếp C- H trong vòng pyranose được quy kết chính xác như sau: Manose: C1/H1 (94.71;94.33/5.30; 5.60), C2/H2 (71.04/4,24;4.29), C3/H3(71.45/4.32÷4.69), C4/H4(76.76/3.80÷3.89), C5/H5(74.976/3.651÷3.658), C6/H6(61.97/4.29;4.27). Glucose: C1/H1 (96.68;92.78/5.65;5.04), C2/H2 (72,27;72,18/3,94÷3,99), C3/H3(73,12/4,20÷4,23), C4/H4(76,60; 76,56/3,79), C5/H5(73.82/4.06÷4.08), C6/H6(61.63; 61.54/4.18÷4.19). 3.2. Thủy phân Glucomannan bằng xúc tác axit Kết quả khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến phản ứng thủy phân glucomannan xúc tác axit đã xác định được điều kiện thích hợp để thủy phân glucomannan xúc tác axit kết hợp sóng siêu âm là: nồng độ axit CH3COOH 10%, axit HCl 0,15M, nhiệt độ phản ứng là 50oC, thời gian phản ứng 4 giờ, tỷ lệ KGM/dd axit 1/10(g/ml). Đối với phản ứng thủy phân glucomannan xúc tác axit không kết hợp sóng siêu âm thực hiện ở: nồng độ axit CH3COOH 10%, axit HCl 0,15M, nhiệt độ phản ứng là 50oC, thời gian phản ứng 6 giờ, tỷ lệ KGM/dd axit 1/10 (g/ml). Sản phẩm thủy phân có khối lượng phân tử giảm t 1598kDa xuống 88,561kDa. Độ tan trong nước của LKGM-1 đạt 82,6% . Cấu trúc mạch oligome của sản phẩm được xác định bằng phổ IR, phổ NMR 1H, 13C và giản đồ phân tích nhiệt. 14 Hình 3.17: Phổ 1H của LKGM-1 Kết quả phân tích cho thấy, với việc sử dụng hỗn hợp axit CH3COOH và HCl nhóm axetyl trong phân tử glucomannan được bảo vệ nên độ DA của sản phẩm thủy phân giảm không đáng kể. Cấu trúc mạch của LKGM-1 ít thay đổi so với glucomannan ban đầu: tỷ lệ M/G là 1,51, DA của LKGM-1 là 7,03%, 3.3. Thủy phân Konjac glucomannan bằng enzym 3.3.1. Định tính xác định khả năng phân huỷ glucomannan của các enzym từ vi khuẩn Kết quả thực nghiệm cho thấy, enzym sinh ra t 2 loại vi khuẩn Bacillus subtilis và bacillus licheniformis đều có khả năng phân hủy glucomannan. Khác biệt có ý nghĩa thống kê so với lô chứng. Trong đó chủng vi khuẩn bacillus subtillis có khả năng phân hủy tốt hơn với P<0,05 so với mẫu bacillus licheniformis. 15 T kết quả định tính trên chúng tôi lựa chọn enzym t vi khuẩn Bacillus subtilis đã thương mại hóa của công ty Megazyme được sử dụng làm thí nghiệm tiếp theo trong luận án. 3.3.2.Phản ứng thủy phân Konjac Glucomannan bằng enzym từ vi khuẩn bacillus subtilis Mô hình quy hoạch hóa thực nghiệm của Box Behnken đã được áp dụng để nghiên cứu ảnh hưởng đồng thời của các yếu tố nhiệt độ, thời gian phản ứng, độ pH và tử lệ enzym/cơ chất đến độ nhớt của sản phẩm phản ứng. Kết quả được xử lý bằng phần mềm Design Expert thu được phương trình hồi quy như sau: Y = 62.21 – 12.81X1 – 6.85X2 – 25.03X3–14.95 X4 + 20.02 X1X2 + 8.01X1X3 – 10.02 X1X4 + 3.75 X2X3 + 3.72 X2X4 – 17,34 X3X4 + 46.94 X12 + 27.20 X22 + 94.30 X32+ 38.45 X42 Kết quả phân tích phương sai (ANOVA) cho thấy mô hình và các hệ số hồi qui đều phù hợp và có ý nghĩa thống kê (được đánh giá qua p-value đều nhỏ hơn 0,05). Thêm vào đó sự không tương hợp (Lack of fit) của mô hình là 78,77 có P=0,1021 > 0,05) cho thấy giá trị này không có ý nghĩa thống kê. Điều đó chứng tỏ mô hình thực nghiệm là hoàn toàn tin cậy. Giá trị hệ số xác định R2 phản ánh độ phù hợp của phương trình hồi quy so với thực tế. Hệ số xác định R2 bằng 0,9988, là rất cao xấp xỉ 1. Điều đó chứng tỏ phương trình hồi qui hoàn toàn phù hợp với kết quả thực nghiệm. Phân tích sự phù hợp và sự có nghĩa của mô hình thực nghiệm được đánh giá bằng phần mềm phân tích Design Expert. Kết quả được chỉ ra ở bảng ANOVA (Bảng 3.20) 16 Bảng 3.20. Kết quả phân tích ANOVA tối ưu hóa điều kiện phản ứng thủy phân Yếu tố Tổng bình phương Bậ c tự do Trung bình bình phương Giá trị F Giá trị P Mô hình 65344,95 14 4667,50 695,95 < 0,0001 A-Nhiệt độ 1915,47 1 1915,47 285,61 < 0,0001 B-Thời gian 563,07 1 563,07 83,96 < 0,0001 C-pH 7412,76 1 7412,76 1105,29 < 0,0001 D-tỷ lệ E/S 2681,43 1 2681,43 399,82 < 0,0001 AB 1604,00 1 1604,00 239,17 < 0,0001 AC 223,35 1 223,35 33,30 < 0,0001 AD 402,00 1 402,00 59,94 < 0,0001 BC 57,00 1 57,00 8,50 0,0130 BD 55,35 1 55,35 8,25 0,0140 CD 1200,62 1 1200,62 179,02 < 0,0001 A² 11662,98 1 11662,98 1739,02 < 0,0001 B² 3973,30 1 3973,30 592,44 < 0,0001 C² 47246,57 1 47246,57 7044,76 < 0,0001 D² 7920,57 1 7920,57 1181,01 < 0,0001 Phần dư 80,48 12 6,71 Lack of fit 78,77 10 7,88 9,19 0,1021 R2 0,9988 Ảnh hưởng của các cặp yếu tố đến độ nhớt của hỗn hợp phản ứng được biểu diễn trên hình 3.23. 17 a) Độ pH và nhiệt Design-Expert® Software Factor Coding: Actual Y (mpa.s) Design points above predicted value Design points below predicted value 61.15 250.15 X1 = A: Temperature X2 = C: pH Actual Factors B: Time = 6 D: E/S = 0.4 5 6 7 8 9 30 35 40 45 50 50 100 150 200 250 300 Y ( m p a. s) A: Temperature (oC)C: pH b)Tỷ lệ E/S và nhiệt độ Design-Expert® Software Factor Coding: Actual Y (mpa.s) Design points above predicted value Design points below predicted value 61.15 248 X1 = A: Temperature X2 = D: E/S Actual Factors B: Time = 6 C: pH = 7 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 30 35 40 45 50 50 100 150 200 250 Y ( m p a. s) A: Temperature (oC)D: E/S Design-Expert® Software Factor Coding: Actual Y (mpa.s) Design points above predicted value Design points below predicted value 61.15 250.15 X1 = A: Temperature X2 = B: Time Actual Factors C: pH = 7 D: E/S = 0.4 4 5 6 7 8 30 35 40 45 50 50 100 150 200 250 300 Y (m p a. s) A: Temperature (oC)B: Time (h) c)Thời gian phản ứng và nhiệt độ Design-Expert® Software Factor Coding: Actual Y (mpa.s) Design points above predicted value Design points below predicted value 61.15 250.15 X1 = B: Time X2 = C: pH Actual Factors A: Temperature = 40 D: E/S = 0.4 5 6 7 8 9 4 5 6 7 8 50 100 150 200 250 300 Y ( m p a .s ) B: Time (h)C: pH d)Thời gian phản ứng và độ pH Hình 3.23. Đường mức và mặt đáp ứng 3D ảnh hưởng của các cặp yếu tố đến độ nhớt của hỗn hợp phản ứng Chúng tôi đã sử dụng chương trình tính FLEXI viết bằng ngôn ngữ thuật toán FORTRAN để tìm điều kiện tối ưu của phản ứng. Kết quả của bài toán tối ưu tìm được điều kiện của phản ứng thủy phân xúc tác enzym là: nhiệt độ= 42,376oC, thời gian = 5,681h, pH = 7,241,tỉ lệ E/S = 0,536. Khối lượng phân tử trung bình của sản phẩm thủy phân là 2051,28 Da Cấu trúc của sản phẩm thủy phân được khảo sát bằng phổ proton 1H, 13C, HSQC. Bảng 3.23: 1H NMR độ dịch chuyển hóa học của LKGM-E 18 Proton Mannose (δ ppm) Glucose (δ ppm) H1 5,26 5,03;5,02 H2 4,41 3,87 H3 4,30 4,22 H4 4,32 4,16 H5 4,01 4,08 H6 4,28; 4,20 4,49 H của CH3CO- 2,70 Bảng 3.24: Độ dịch chuyển hóa học 13C - NMR của LKGM-E Tín hiệu Mannose (δ ppm) Glucose (δ ppm) C1 102,15;101,99 104,45 C2 72,52;72,18 75,35;75,11 C3 73,63; 73,15 76,19 C4 77,79÷78,90 80,86 C5 77,26 76,97;76,83 C6 62,92;62,78 62,57;62,45 C của CH3CO- 22,17; 176,80 β-Man(14)-β-Glc 71,77 β-Man(14)-β-Man 71,56 Phổ hai chiều HSQC của LKGM-E các tương tác đặc trưng cho vòng pyranose được quy kết chính xác như sau: 19 Mannose: C1/H1 (102,15; 101,99/5,26), C2/H2 (72,52; 72,18/4,41), C3/H3 (73,63; 73,15/4,30), C4/H4 (77,79;78,90/4,32), C5/H5 (77,26/4,01), C6/H6 (62,92; 62,78/4,28; 4,20). Glucose: C1/H1 (104,45/5,03; 5,02), C2/H2 (75,35; 75,11/3,87), C3/H3 (76,19/4,22), C4/H4 (80,86/4,16), C5/H5 (76,97; 76,83/4,08), C6/H6 (62,57; 62,45/4,49). Qua các phương pháp phổ cho thấy KGM-E có cấu trúc không thay đổi nhiều so với glucomannan ban đầu. . Tỷ lệ M/G Tỷ lệ M/G là 1,2, độ acetyl hóa DA là 7,56 % và độ tan 92,5%. 3.4. Hoạt tính hạ đường huyết của LKGM-E 3.4.1. Hoạt tính hạ đường huyết của LKGM-E trên mô hình in vitro actin p-AMPK Hình 3.31. Hình ảnh mức độ biểu hiện p-AMPK và actin thu được bằng kĩ thuật Western Trong nghiên cứu của chúng tôi, tác dụng hoạt hóa AMPK của glucomannan thủy phân được tiến hành đánh giá trên tế bào cơ vân chuột nhắt nguyên phát (C2C12) sau khi đã được biệt hóa thành tế bào trưởng thành bằng phương pháp Western lot. Đây là phương pháp hiện đại có độ nhạy cao, phát hiện protein bằng phản ứng đặc hiệu kháng nguyên – kháng thể tương ứng nên cho kết quả có độ tin cậy cao chứng AICAR m100 m50 m25 m12,5 m6,25 20 So sánh tỷ lệ mức độ biểu hiện p-AMPK/ β-actin của lô tế bào có ủ mẫu thử với lô chứng để đánh giá tác dụng hoạt hóa AMPK của mẫu thử. Kết quả thực nghiệm cho thấy Konjac glucomannan thủy phân ở các nồng độ 100μg/ml và nồng độ 50μg/ml làm tăng đáng kể mức độ biểu hiện của p-AMPK (lần lượt là 1,47 lần và 1,81 lần so với lô chứng, p<0,05), glucomannan thủy phân ở nồng độ thấp hơn 25 µg/ml, 12,5 µg/ml và 6,25 µg/ml không làm tăng mức độ biểu hiện của p-AMPK so với lô chứng. Điều đó chứng tỏ glucomannan thủy phân nồng độ 100μg/ml và nồng độ 50μg/ml có khả năng kích hoạt enzym AMPK. 3.4.2. Hoạt tính hạ đường huyết của LKGM-E trên mô hình in vivo Kết quả nghiệm pháp dung nạp glucose đường uống được thể hiện trên hình 3.29. Tỷ lệ phần trăm tăng glucose huyết trước và sau cho uống glucose so với thời điểm ban đầu được trình bày trong hình 3.32. Hình 3.32. Tỷ lệ phần trăm tăng glucose huyết trước và sau cho uống glucose so với thời điểm ban đầu 21 Kết quả nghiên cứu cho thấy, tại thời điểm mới cho uống glucose, do đã được uống chế phẩm trước 2 giờ và để nhịn đói nên tất cả các lô đều có hàm lượng glucose giảm. Lô uống gliclazide có độ hạ glucose huyết mạnh hơn rõ rệt so với lô chứng (P<0,01). Điều này là phù hợp với sự hấp thu glucose của cơ thể. Sau khi uống glucose được hấp thụ qua thành ruột vào máu rất nhanh nên hàm lượng glucose trong máu tăng dần và đạt nồng độ cao nhất trong máu sau khi uống 30 phút ở tất cả các mẫu thử nghiệm. Ở thời điểm này các lô 3 và 5 có tỷ lệ ％ tăng glucose huyết thấp hơn so với lô 1 (lô đối chứng), sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (P≤ 0,05). Điều này có thể thấy glucomannan thủy phân với liều 6g/kg cân nặng có khả năng giảm hấp thu glucose ở ruột. Điều này được giải thích do glucomannan là chất xơ hòa tan có độ nhớt cao, khả năng trương nở lớn làm tăng cảm giác no và làm giảm hấp thu đường huyết giúp ổn định đường huyết. Thời điểm 60 phút và 120 phút sau khi uống glucose, ở tất cả các lô hàm lượng glucose máu đều giảm so với ban đầu. Các lô glyclazide vì glyclazide là thuốc hạ đường huyết nên tỷ lệ % hạ glucose huyết mạnh nhất. Các lô 3,4 được cho uống chế phẩm glucomannan và glucomannan thủy phân hàm lượng 6g/kg có tỷ lệ % hạ glucose huyết lớn hơn so với lô 1, khác biệt có ý nghĩa P<0,05. Điều này chứng tỏ các chế phẩm t glucomannan với liều 6g/kg ngoài việc có tác dụng làm giảm sự hấp thu glucose ở ruột còn có khả năng kích thích sự chuyển hóa tiêu thụ glucose. 22 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của KGM và LKGM-E đến khả năng dung nạp glucose được trình bày ở hình 3.33. Hình 3.33: Glucose huyết trước và sau khi cho uống LKGM-E và KGM Tại thời điểm 60 phút và 120 phút sau khi uống glucose, tỷ lệ hạ glucose huyết ở lô uống glucomannan thủy phân cao hơn so với lô uống glucomannan cùng liều lượng 6g/kg cân nặng. Khác biệt này có ý nghĩa thống kê với P<0,05. Điều này chứng tỏ sản phẩm thủy phân có khả năng kích thích sự dung nạp glucose tốt hơn so với glucomannan ban đầu. Kết quả này là phù hợp với kết quả thực nghiệm trên invivo. Vì LKGM-E có khả năng kích hoạt enzym AMPK, là enzym hoạt hóa kích thích các quá trình sinh ra năng lượng [84–88]. Chính vì vậy lượng glucose khi hấp thu vào máu được vận chuyển nhiều vào tế bào và chuyển hóa thành Glucose-6-phosphat được đốt cháy tạo năng lượng cung cấp cho các hoạt động của tế bào 23 KẾT LUẬN T các kết quả thu được, chúng tôi rút ra các kết luận chung sau: 1. Đã tách, tinh chế và xác định được cấu trúc, tính chất của glucomannan t củ nưa A.konjac ( Amorphophallus Konjac K.Koch): - Hàm lượng glucomannan trong củ A.konjac K.Koch tại Lâm Đồng, Việt Nam là 12,26% trong củ tươi. Bột KGM đạt độ sạch 92%, hàm lượng tro 4,17%, độ hút ẩm 9%, hàm lượng Asen 0,208 ppm, hàm lượng chì 0,184 ppm. - Glucomannan tách t cây A.konjac có cấu trúc vô định hình, được cấu tạo bởi các mắt xích D-mannose và D- glucose liên kết với nhau bằng liên kết β-(1→