Tóm tắt Luận án Nghiên cứu tạo đột biến in vitro và đánh giá sinh trưởng, phát triển, sai khác di truyền của các dòng đột biến giống hoa cẩm chướng Quận Chúa (Dianthus caryophyllus L.)

iên cӭu ảnh hưӣng cӫa tổ hợp cytokinin và auxin đến hệ số nhân, sự sinh trưӣng cӫa chồi in vitro. - Nghiên cӭu ảnh hưӣng cӫa α-NAA và than hoạt tính trong môi trưӡng MS tới khả nĕng ra rễ cӫa chồi in vitro. - Nghiên cӭu ảnh hưӣng cӫa giá thể ra cây đến tỷ lệ sống và sinh trưӣng cӫa cây in vitro ngoài vưӡn ươm. 2.2.2. Nghiên cứu các phương pháp xử lý gây t̩o đột biến in vitro cho cây cẩm chướng - Nghiên cӭu xử lý EMS cho cây hoa cẩm chướng in vitro. - Nghiên cӭu xử lý tia gamma nguồn 60Co cho cây hoa cẩm chướng in vitro. - Nghiên cӭu xử lý kết hợp EMS và tia gamma nguồn 60Co cho cây cẩm chướng in vitro. 2.2.3. Nghiên cứu phân lập các d̩ng chồi in vitro biến dị sau xử lý và đánh giá sự sinh trưởng phát triển của các d̩ng chồi - Nghiên cӭu phân lập các dạng chồi biến dị về mặt hình thái. - Nghiên cӭu khả nĕng ra rễ cӫa các dạng chồi phân lập sau xử lý. - Nghiên cӭu khả nĕng sinh trưӣng phát triển cӫa các dạng chồi 6 trong điều kiện vưӡn ươm. 2.2.4. Nghiên cứu sự sinh trưởng phát triển và phân lập các d̩ng biến dị của cây cẩm chướng sau xử lý trong điều kiện tự nhiên Cây cẩm chướng sau xử lý được đưa ra trồng tại nhà lưới, theo dõi phân lập các dạng biến dị. 2.2.5. Nghiên cứu đánh giá sự sai khác di truyền của một số dòng biến dị có triển vọng đ̃ phân lập bằng chỉ thị SSR Chọn lọc một số dòng biến dị có tiềm nĕng đánh giá sự sai khác di truyền ӣ mӭc độ phân tử bằng chỉ thị SSR. 2.2.6. Nghiên cứu quy trình nhân giống in vitro cho một số dòng đột biến được tuyển chọn - Nghiên cӭu ảnh hưӣng cӫa thӡi gian khử trùng đến tỷ lệ sống cӫa mẫu - Nghiên cӭu ảnh hưӣng cӫa môi trưӡng nuôi cấy đến hệ số nhân, sinh trưӣng cӫa chồi in vitro. - Nghiên cӭu ảnh hưӣng cӫa auxin trong môi trưӡng MS tới khả nĕng ra rễ cӫa chồi in vitro. - Nghiên cӭu ảnh hưӣng cӫa giá thể ra cây đến tỷ lệ sống và sinh trưӣng cӫa cây in vitro ngoài vưӡn ươm. 2.3. Phѭѫng pháp nghiên cӭu. 2.3.1. Phương pháp bố trí thí nghiệm Các thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên với 3 lần nhắc lại. 2.3.2. Phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật. Sử dụng phương pháp nuôi cấy in vitro trên môi trưӡng cơ bản MS (Murahige and Skoog, 1962) với 6,5 g/l agar, 30 g/l saccarose và 100 mg/l innositol) có bổ sung các chất điều tiết sinh trưӣng. Các thí nghiệm nhân nhanh, tạo cây hoàn chỉnh mẫu được nuôi cấy ӣ nhiệt độ 20 – 220C, cưӡng độ chiếu sáng 2.000 lux, thӡi gian chiếu sáng 16 giӡ/ngày. Các công thӭc thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên, mỗi công thӭc thí nghiệm bố trí 150 mẫu, chia làm 3 lần nhắc lại. 2.3.3. Phương pháp gây t̩o đột biến in vitro Phương pháp gây tạo đột biến được tiến hành theo quy trình cӫa Novak and Brunner (1992) có cải tiến. Mỗi công thӭc thí nghiệm xử lý 3 lần nhắc lại mỗi lần 60 mẫu với liều lượng xử lý như sau: - Xử lý gây t̩o đột biến bằng tác nhân EMS: Mẫu được xử lý ӣ 7 các mӭc nồng độ EMS 0,2; 0,4; 0,6; 0,8; 1,0% với 3 mӭc thӡi gian 1, 2 và 3 giӡ. - Xử lý gây t̩o đột biến bằng tia gamma nguồn 60Co: Mẫu được xử lý với các liều hấp thụ 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70 Gᵧ. - Xử lý gây t̩o đột biến bằng EMS kết hợp tia gamma nguồn 60Co: Mẫu được xử lý EMS với nồng độ 0,1; 0,2; 0,3; 0,4% trong thӡi gian 2 giӡ kết hợp tia gamma nguồn Co60 với liều hấp thụ 10, 20, 30 Gᵧ. 2.3.4. Phương pháp đánh giá sự sai khác di truyền của các dòng đột biến bằng chỉ thị phân tử SSR Để tiến hành phân tích và đánh giá sự sai khác di truyền cӫa các giống hoa cẩm chướng ӣ mӭc độ phân tử, DNA cӫa 7 mẫu hoa cẩm chướng được nhân bản bằng phương pháp PCR với 20 mồi SSR. Các sản phẩm được điện di trên gel agarose 3,5%. 2.3.4.1. Phương pháp chiết tách DNA Trong thí nghiệm này chúng tôi chiết tách DNA tổng số cӫa các mẫu cẩm chướng dựa theo phương pháp cӫa Obara – Okeyo P. and Kako (1998) có cải tiến. 2.3.4.2. Phương pháp PCR – SSR Phản ӭng PCR được thực hiện với nhiều chu kì, nhiệt độ biến tính DNA 950C, nhiệt độ gắn mồi 37- 550C tuỳ theo từng mồi, nhiệt độ tổng hợp chuỗi DNA 720C. 2.3.4.3. Phương pháp điện di trên gel agarose Sản phẩm cӫa phản ӭng PCR-SSR được kiểm tra trên gel agarose 1% và soi gel dưới ánh sáng đèn UV, nhận biết sản phẩm khuếch đại dựa vào thang chuẩn DNA 1Kb. 2.3.4.4. Phương pháp phân tích số liệu Các số liệu này được đưa vào xử lý theo chương trình NTSYSpc 2.1 cӫa Rohlf (2002) để tính ma trận tương đồng giữa các cặp mẫu. ảệ số PIC - Chỉ số thông tin đa hình (Nei, 1973). ��� = 1 − ∑ ��2 Trong đó: pi là tần số xuất hiện alen thӭ i. 8 Tỷ lệ dị hợp tử (ả%) H%= Số mồi xuất hiện ≥2 alen/ 1locus SSR Tổng số mồi sử dụng-Số mồi khuyết số liệu x 100 2.3.5. Phương pháp theo dõi, đánh giá đặc điểm nông, sinh học Các chỉ tiêu đánh giá ngoài đồng ruộng theo Quy phạm khảo nghiệm tính khác biệt, tính đồng nhất và tính ổn định cӫa Hiệp hội Quốc tế về bảo hộ giống cây trồng mới (Hiệp hội Quốc tế về bảo hộ giống cây trồng mới, 2008). 2.4. Phѭѫng pháp xử lý sӕ liӋu Số liệu được xử lý theo phương phân tích phương sai (ANOVA) theo chương trình Irristat 5.0S và Excel. Số liệu phân tích SSR được xử lý bằng phần mềm NTSYS pc2.1. Sử dụng thuật toán nội suy lagrange để xây dựng mô hình toán học. Sử dụng phương pháp Reed and Muench (1983), Behrens and Karber (1935) để xác định liều gây chết 50% mẫu thí nghiệm (LD50). Chѭѫng 3 KӂT QUҦ NGHIÊN CӬU VÀ THҦO LUҰN 3.1. Nghiên cӭu nhân giӕng in vitro cho cây cẩm chѭớng giӕng Quұn Chúa 3.1.1. Nghiên cứu t̩o vật liệu khởi đầu Kết quả nghiên cӭu cho thấy, đối với cây cẩm chướng giống Quận Chúa sử dụng hóa chất HgCl2 0,1% để khử trùng mẫu có hiệu quả tốt hơn so với NaOCl (5%). Trong các công thӭc thí nghiệm được nghiên cӭu công thӭc 2 (sử dụng HgCl2 0,1% trong thӡi gian 7 phút) cho hiệu quả tốt nhất. 3.1.2. Nghiên cứu nhân nhanh chồi in vitro 3.1.2.1. ̪nh hưởng của BA và kinetin trong môi trường MS đến hệ số nhân, sinh trưởng của chồi in vitro cây cẩm chướng Kết quả nghiên cӭu cho thấy: các công thӭc có bổ sung kinetin hoặc BA đều cho sự phát sinh chồi cao hơn đối chӭng. Tuy nhiên, ӣ mỗi nồng độ BA hoặc kinetin bổ sung khác nhau thì số chồi phát 9 sinh và sự sinh trưӣng thân lá cӫa các chồi cũng có sự khác nhau khác nhau. Trong các công thӭc thí nghiệm công thӭc CT6 (MS + 1,0 mg/l kinetin) cho hệ số nhân chồi cao nhất. 3.1.2.2. ̪nh hưởng của của tổ hợp kinetin và auxin đến hệ số nhân, sinh trưởng của chồi in vitro cây cẩm chướng Số liệu cho thấy, khi cố định nồng độ kinetin thay đổi nồng độ IAA và α-NAA với các mӭc 0,25; 0,50; 0,75 và 1,0 mg/l thì chiều cao và hệ số nhân chồi có xu hướng giảm dần (hệ số nhân chồi đạt từ 2,11 đến 2,72 chồi/tháng), thấp hơn so với đối chӭng. Từ kết quả thí nghiệm 1 và thí nghiệm 2 cho thấy môi trưӡng MS bổ sung 1,0 mg/l kinetin cho hệ số nhân chồi cao chất lượng chồi tốt nhất cho giống Quận Chúa. 3.1.3. Nghiên cứu t̩o cây hoàn chỉnh Các công thӭc thí nghiệm khác nhau cho tỷ lệ mẫu phát sinh rễ, số lượng, chiều dài rễ, chiều cao cây, số cặp lá trên cây ӣ các công thӭc thí nghiệm rất khác nhau. Tỷ lệ mẫu phát sinh rễ ӣ các công thӭc thí nghiệm đều cao hơn so với đối chӭng (đạt 92,22 đến 100%). Công thӭc thí nghiệm MS bổ sung 0,5 g/l than hoạt tính và 0,25 mg/l α-NAA cho tỷ lệ phát sinh rễ, số rễ và chiều dài rễ cao hơn và thӡi gian ra rễ sớm hơn so với các công thӭc thí nghiệm khác. 3.1.4. Nghiên cứu ̫nh hưởng của phương pháp ra cây đến tỷ lệ sống và sinh trưởng của cây in vitro ngoài vườn ươm Qua kết quả nghiên cӭu chúng tôi thấy công thӭc cho tỷ lệ sống cao thì đồng thӡi cây cũng sinh trưӣng phát triển tốt. Trong các loại giá thể được sử dụng giá thể đất cho tỷ lệ sống thấp (83,33%), giá thể đất + trấu hun (1:1) cho tỷ lệ sống cao và chất lượng tốt. 3.2. Nghiên cӭu xử lý gây tҥo đӝt biӃn cho cây hoa cẩm chѭớng in vitro bằng EMS và chiӃu xҥ tia gamma nguӗn 60Co 3.2.1. Nghiên cứu xử lý gây t̩o đột biến cho cây hoa cẩm chướng nuôi cấy in vitro bằng EMS 3.2.1.1. Nghiên cứu ̫nh hưởng của EMS tới sự sinh trưởng của chồi in vitro cây hoa cẩm chướng EMS đã có ảnh hưӣng đến khả nĕng sống cӫa mẫu. Ӣ các công 10 thӭc xử lý EMS, tỷ lệ mẫu sống giảm mạnh khi tĕng nồng độ EMS và thӡi gian xử lý. Tỷ lệ mẫu sống đạt cao nhất tại công thӭc xử lý nồng độ 0,2% trong thӡi gian 1 giӡ (91,11%) và tỷ lệ mẫu sống thấp nhất tại công thӭc xử lý nồng độ 1,0% trong thӡi gian 3 giӡ (18,89%). Trong các công thӭc xử lý EMS ӣ mӭc thӡi gian 1 và 2 giӡ tỷ lệ phát sinh chồi đạt cao nhất khi xử lý ӣ mӭc nồng độ 0,4%. Bằng thuật toán nội suy chúng tôi đã xây dựng được mô hình toán học biểu diễn mối quan hệ giữa nồng độ EMS xử lý và tỷ lệ mẫu chết với các mӭc thӡi gian 1, 2 và 3 giӡ như sau: Y = - 62,16x + 1157,07x2 – 4145,10x3 + 5626,30x4 – 2508,33x5 Y = 1,17 + 52,91x-57,06x2+563,85x3-1107,81x4+581,77x5 Y = 2,22+195,48x-997,26x2+2299,84x3-2109,11x4+689,48x5 Trong đó: x là nồng độ EMS xử lý ; Y là tỷ lệ mẫu chết. Từ kết quả nghiên cӭu đã xác định được liều gây chết 50% mẫu thí nghiệm (LD50) với các mӭc thӡi gian 1, 2 và 3 giӡ như sau: LD50, EMS,1 giӡ = 0,79%; LD50, EMS,2 giӡ = 0,76%; LD50, EMS, 3 giӡ = 0,71%. 3.2.1.2. ̪nh hưởng của EMS đến sự phát sinh hình thái và kh̫ nĕng sinh trưởng của các d̩ng chồi in vitro của cây cẩm chướng Sau xử lý chúng tôi đã phân lập được 5 dạng chồi (Dạng A, dạng b, dạng C, dạng D và dạng E). Dạng A Dạng B Dạng C Dạng D Dạng E Hình 3.1. Các dҥng chӗi thu đѭӧc sau xử lý EMS EMS có ảnh hưӣng rất lớn đến khả nĕng sinh trưӣng phát triển 11 cӫa chồi cũng như sự biến đổi hình thái cӫa chồi. Ӣ các công thӭc thí nghiệm, tỷ lệ chồi biến dị tĕng dần theo sự tĕng cӫa nồng độ và thӡi gian xử lý EMS. Sự phân bố cӫa các dạng chồi ӣ các công thӭc không giống nhau. Khi xử lý ӣ nồng độ 0,2% xuất hiện 4 dạng chồi: A, B, C và D. Khi tĕng nồng độ EMS lên 0,4; 0,6; 0,8% thì kết quả cho cả 5 dạng chồi A, B, C, D, E. Ӣ nồng độ xử lý 1,0 % số dạng chồi xuất hiện lại giảm chỉ có 4 dạng: A, B, C và D. Bҧng 3.1. Ҧnh hѭӣng cӫa EMS đӃn sự phát sinh hình thái cӫa chӗi in vitro cây cẩm chѭớng với thӡi gian xử lý 1 giӡ Công thӭc Nồng độ EMS (%) Tỷ lệ các dạng chồi (%) Dạng A Dạng B Dạng C Dạng D Dạng E Tỷ lệ chồi biến dị ĐC CT1.1 CT1.2 CT1.3 CT1.4 CT1.5 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 97,76 86,75 74,40 64,91 54,62 47,50 2,24 8,10 17,32 22,32 33,25 34,72 0,00 2,16 2,54 4,78 6,12 15,45 0,00 3,00 4,19 4,28 3,82 2,33 0,00 0,00 1,55 3,70 2,19 0,00 2,24 13,20 15,60 34,75 45,72 52,50 Bҧng 3.2. Ҧnh hѭӣng cӫa EMS đӃn sự phát sinh hình thái cӫa chӗi in vitro cây cẩm chѭớng với thӡi gian xử lý 2 giӡ Công thӭc Nồng độ EMS (%) Tỷ lệ các dạng chồi (%) Dạng A Dạng B Dạng C Dạng D Dạng E Tỷ lệ chồi biến dị ĐC CT2.1 CT2.2 CT2.3 CT2.4 CT2.5 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 95,81 81,82 70,24 61,36 51,15 42,12 4,19 10,08 17,55 27,11 32,51 36,42 0,00 3,13 3,75 5,42 10,63 21,46 0,00 3,29 4,64 3,69 3,47 0,00 0,00 1,69 3,81 2,41 2,25 0,00 4,19 18,51 28,25 38,53 49,53 57,88 12 Khi xử lý ӣ nồng độ cao và thӡi gian dài cho tỷ lệ chồi biến dị nhiều tuy nhiên số dạng chồi biến dị xuất hiện lại giảm, đa số các chồi bị chết. Dạng biến dị tĕng chӫ yếu ӣ dạng biến dị B, C, trong đó dạng chồi C có khả nĕng sinh trưӣng phát triển kém. Nồng độ EMS thích hợp cho xử lý gây tạo đột biến in vitro đối với cây cẩm chướng giống Quận Chúa là 0,4% trong thӡi gian 2 giӡ. Bҧng 3.3. Ҧnh hѭӣng cӫa EMS đӃn sự phát sinh hình thái cӫa chӗi in vitro cây cẩm chѭớng với thӡi gian xử lý 3 giӡ Công thӭc Nồng độ EMS (%) Tỷ lệ các dạng chồi (%) Dạng A Dạng B Dạng C Dạng D Dạng E Tỷ lệ chồi biến dị ĐC CT3.1 CT3.2 CT3.3 CT3.4 CT3.5 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 94,13 69,71 66,33 53,59 44,71 34,76 5,87 19,71 21,73 31,46 38,06 35,44 0,00 4,69 5,39 9,31 14,33 29,80 0,00 3,50 4,36 3,57 2,90 0,00 0,00 2,39 2,20 2,08 0,00 0,00 5,87 29,93 33,33 46,01 56,33 64,49 Từ kết quả thu được, chúng tôi đã xác định được hệ số tương quan giữa nồng độ EMS xử lý và tỷ lệ chồi biến dị và xây dựng được mô hình toán học biểu diễn mối quan hệ giữa nồng độ EMS và tỷ lệ biến dị cӫa chồi với các mӭc thӡi gian xử lý 1, 2 và 3 giӡ như sau: Y = 2,24 + 266,34x-1823,63x2+4983,33x3-5431,25x4+2061,46x5 Y = 4,19+99,15x-192,33x2+311,72x3-201,04x4+36,20x5 Y = 5,87+327,25x-1665,40x2+3870,73x3-3865,10x4+1391,15x5 Trong đó : Y là tỷ lệ chồi biến dị; x là Nồng độ EMS xử lý. 3.2.2. Nghiên cứu xử lý gây t̩o đột biến cho cây hoa cẩm chướng nuôi cấy in vitro bằng chiếu x̩ tia gamma nguồn 60Co 3.2.2.1. Nghiên cứu ̫nh hưởng của xử lý chiếu x̩ tia gamma nguồn 60Co tới sự phát sinh và sinh trưởng của cây hoa cẩm chướng in vitro Kết quả nghiên cӭu cho thấy, ӣ các công thӭc thí nghiệm cho 13 thấy có sự phụ thuộc tuyến tính giữa liều lượng xử lý chiếu xạ tia gamma nguồn 60Co và tỷ lệ mẫu chết, tỷ lệ mẫu phát sinh chồi. Khi liều lượng xử lý tĕng, tỷ lệ mẫu sống và phát sinh chồi giảm. Trong các công thӭc thí nghiệm, tỷ lệ mẫu sống và phát sinh chồi đạt cao nhất tại CT1 (tỷ lệ sống đạt 91,33%, tỷ lệ mẫu phát sinh chồi đạt 91,99%), khi xử lý ӣ liều hấp thu 70 Gᵧ thì 100% mẫu bị chết. Từ kết quả thu được, bằng thuật toán nội suy Lagrange chúng tôi đã xây dựng mô hình toán học biểu diễn mối quan hệ giữa liều lượng xử lý gamma với tỷ lệ mẫu chết. Y= 57,83.10-10x7 + 1,42.10-6x6 - 1,38.10-4x5 + 6,65.10-3x4 - 0,166x3 + 1,995x2 - 8,096x + 2 Trong đó: Y : Tỷ lệ mẫu chết (%); x: Liều lượng xử lý gamma (Gᵧ) Bằng phương pháp Behrens and Karber (1935), đã xác định được liều lượng gây chết 50% mẫu thí nghiệm LD50= 38,57Gᵧ 3.2.2.2. ̪nh hưởng của chiếu x̩ tia gamma nguồn 60Co đến sự phát sinh biến dị hình thái chồi in vitro cây cẩm chướng Sau xử lý chúng tôi đã phân lập được 6 dạng chồi (Dạng A, dạng F, dạng G, dạng H, dạng I và dạng K). Dạng A Dạng F Dạng G Dạng H Dạng I Dạng K Hình 3.2. Các dҥng chồi thu được sau xử lý tia gamma nguồn 60Co Số liệu thực nghiệm cho thấy có sự phụ thuộc tuyến tính cӫa tỷ lệ các chồi biến dị hình thái vào liều lượng xử lý, liều lượng càng cao tỷ lệ chồi biến dị càng lớn. Sự phân bố cӫa các dạng chồi ӣ các công thӭc thí nghiệm không giống nhau. Khi xử lý ӣ liều hấp thu 20Gᵧ đến 14 50Gᵧ xuất hiện 6 dạng chồi: A, F, G, H, I và K. Ӣ liều hấp thu thấp 10Gᵧ chỉ thu được 3 dạng chồi A, F, H. Đặc biệt khi tĕng liều lượng xử lý lên 60Gᵧ chỉ thu được 2 dạng chồi I và K. Ӣ liều lượng xử lý cao, tỷ lệ chồi biến dị cao tuy nhiên số dạng chồi biến dị lại giảm. Đặc biệt dạng chồi G, H (chồi có khả nĕng sinh trưӣng phát triển tốt) có xu hướng giảm mạnh. Bҧng 3.4. Tỷ lӋ chӗi biӃn dӏ vƠ các dҥng chӗi sau xử lý tia gamma nguӗn 60Co Liều hấp thu (Gᵧ) Dạng A (%) Dạng F (%) Dạng G (%) Dạng H (%) Dạng I (%) Dạng K (%) Tỷ lệ biến dị (%) 0 96,20 3,80 0,00 0,00 0,00 0,00 3,80 10 89,68 6,53 0,00 3,79 0,00 0,00 10,32 20 64,04 9,53 7,39 7,39 6,35 5,29 35,96 30 52,99 10,72 13,69 8,93 6,54 7,14 47,01 40 41,54 18,00 8,92 6,77 10,16 14,61 58,46 50 22,34 25,12 8,37 8,37 13,71 22,09 77,66 60 0,00 0,00 0,00 0,00 16,67 83,33 100,0 70 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 Từ kết quả nghiên cӭu chúng tôi cũng đã xây dựng được mô hình toán học biểu diễn mối quan hệ giữa liều lượng xử lý tia gamma nguồn 60Co và tỷ lệ chồi biến dị. Y= 7,255.10-8x6 - 15,533.10-6x5 + 12,865.10-4x4 - 5,05.10-2x3 + 0,92x2 - 4,639x + 3,80 Trong đó: Y là tỷ lệ chồi biến dị (%); X liều hấp thu (Gᵧ). 3.2.3. Nghiên cứu xử lý kết hợp EMS và chiếu x̩ tia gamma nguӗn 60Co cho cây hoa cẩm chướng in vitro 3.2.3.1. Nghiên cứu ̫nh hưởng của xử lý kết hợp EMS và tia gamma nguồn 60Co tới sự sinh trưởng của chồi in vitro cây hoa cẩm chướng Kết quả thí nghiệm cho thấy khi tĕng liều xử lý lên thì tỷ lệ mẫu sống, tỷ lệ mẫu phát sinh chồi giảm dần. Trong các công thӭc thí 15 nghiệm, tỷ lệ mẫu sống, tỷ lệ mẫu phát sinh chồi đạt cao nhất tại công thӭc CT1 (Tỷ lệ mẫu sống 87,33%, tỷ lệ mẫu phát sinh chồi 89,33%), tỷ lệ mẫu sống thấp nhất tại công thӭc CT12 (Tỷ lệ mẫu sống 24,67%, tỷ lệ mẫu phát sinh chồi 60,00%). 3.2.3.2. ̪nh hưởng của xử lý kết hợp EMS và tia gamma nguồn 60Co đến sự phát sinh biến dị hình thái chồi in vitro Sau xử lý chúng tôi đã phân lập 8 dạng chồi (Dạng A, dạng F, dạng G, dạng L, dạng M, dạng N, dạng O và dạng P). Dạng A Dạng E Dạng G Dạng L Dạng M Dạng N Dạng O Dạng P Hình 3.3. Các dҥng chӗi sau xử lý kӃt hӧp EMS vƠ tia gamma nguӗn 60Co Số liệu thực nghiệm cho thấy có sự phụ thuộc tuyến tính cӫa tỷ lệ các chồi biến dị hình thái vào liều lượng xử lý, liều lượng càng cao tỷ lệ chồi biến dị càng lớn. Sự biến động về số dạng chồi biến dị cũng có xu hướng tương tự như khi xử lý riêng rẽ EMS hoặc chiếu xạ tia gamma. Khi tĕng liều xử lý thì tỷ lệ chồi biến dị có xu hướng tĕng lên, tuy nhiên số dạng chồi lại có xu hướng giảm ӣ các công thӭc xử lý với liều lượng cao. Đặc biệt dạng chồi G (chồi có khả nĕng sinh trưӣng phát triển tốt) chỉ xuất hiện ӣ công thӭc CT4 đến CT10. Công thӭc CT5 xuất hiện nhiều dạng chồi, trong đó dạng chồi tiềm nĕng có tỷ lệ cao (Dạng G: 9,12%). Xử lý kết hợp EMS và tia gamma xuất hiện nhiều dạng chồi biến dị hơn hơn so với xử lý riêng rẽ hai tác nhân này (Nguyễn Thị Lý Anh và cs., 2009). 16 Bҧng 3.5. Tỷ lӋ chӗi biӃn dӏ vƠ các dҥng chӗi in vitro sau xử lý kӃt hӧp EMS vƠ tia gamma nguӗn 60Co Công thӭc Nồng độ EMS (%) Liều hấp thụ gamma (Gᵧ) Dạng A (%) Dạng F (%) Dạng G (%) Dạng L (%) Dạng M (%) Dạng N (%) Dạng O (%) Dạng P (%) Tỷ lệ chồi biến dị (%) ĐC CT1 CT2 CT3 CT4 CT5 CT6 CT7 CT8 CT9 CT10 CT11 CT12 0,0 0,1 0,1 0,1 0,2 0,2 0,2 0,3 0,3 0,3 0,4 0,4 0,4 0,0 10 20 30 10 20 30 10 20 30 10 20 30 95,92 86,79 79,65 71,26 72,66 57,50 37,89 45,96 34,34 29,49 39,62 28,90 27,77 0,00 4,73 5,33 11,63 8,48 7,98 18,40 13,27 15,48 18,49 16,36 25,52 27,87 0,00 0,00 0,00 0,00 3,26 9,12 6,90 6,60 7,16 5,44 4,36 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 4,78 6,54 7,38 7,82 8,96 4,08 8,50 10,18 10,95 8,36 11,30 13,80 11,18 11,13 12,04 12,26 15,65 18,15 0,00 0,00 4,84 6,17 7,26 8,72 9,20 11,18 11,45 12,04 11,12 7,82 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 6,90 2,49 6,26 6,02 0,00 3,91 8,62 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 5,37 6,90 9,32 9,39 9,95 8,90 10,36 8,62 4,08 13.21 20,35 28,74 27,34 42,50 62,11 54,04 65,66 70,51 60,38 71,10 72,23 16 17 3.3. Nghiên cӭu khҧ nĕng sinh trѭӣng cӫa các dҥng chӗi in vitro 3.3.1. Nghiên cứu kh̫ nĕng ra rễ của các d̩ng chồi in vitro cây cẩm chướng sau xử lý Trong môi trưӡng ra rễ, trừ dạng chồi G, các dạng chồi biến dị có khả nĕng ra rễ thấp hơn so với dạng chồi bình thưӡng. Khả nĕng ra rễ cao nhất là dạng G (100%) thấp nhất là dạng chồi C (37,78%), đặc biệt dạng chồi I và dạng chồi M không có khả nĕng sống khi cấy sang môi trưӡng ra rễ. 3.3.2. Nghiên cứu sự sinh trưởng và phát triển của các d̩ng chồi in vitro cây cẩm chướng sau xử lý trong điều kiện khí canh Các dạng chồi biến dị có khả nĕng sống và sinh trưӣng thân lá thấp hơn rất nhiều so với dạng chồi bình thưӡng. Tỷ lệ sống cӫa các dạng chồi rất khác nhau, cao nhất là chồi dạng G (100%) sau đó là chồi dạng A, B, H, D, E, F, L, P, K,. Chồi dạng C, K có khả nĕng sống rất thấp (Dạng C: 3,33%; dạng K: 13,33%). Chồi dạng I, M, O không có khả nĕng sống ngay cả trong điều kiện vưӡn ươm. 3.3.3. Nghiên cứu sự sinh trưởng và phát triển của các d̩ng chồi in vitro cây cẩm chướng sau xử lý giai đo̩n ngoài đồng ruộng Hầu hết các dạng chồi khả nĕng trong điều kiện vưӡn ươm kém (dạng C, K, P) đều bị chết sau khi trồng ra ngoài ruộng. Khả nĕng sống và sinh trưӣng cӫa các dạng chồi ӣ giai đoạn ngoài đồng ruộng cũng có sự tương đồng với giai đoạn trong phòng thí nghiệm và giai đoạn khí canh. Cụ thể dạng chồi G, A có khả nĕng sinh trưӣng phát triển tương đối tốt, cho tỷ lệ sống cao trên 80%, thân lá phát triển tốt. Các dạng chồi D, E, F, H, L, N có tỷ lệ sống thấp. 3.4. Nghiên cứu ҧnh hưởng của xử lý gây tҥo đột biến đến sự phát sinh biến dị của cây cẩm chướng giai đoҥn ngoài đồng ruӝng Để đánh giá hiệu quả cӫa sự tác động cӫa các tác nhân gây đột biến chúng tôi đã tiến hành phân lập các dạng biến dị về mặt hình thái và khả nĕng sinh trưӣng phát triển cӫa cây cẩm chướng giai đoạn ngoài đồng ruộng. Qua theo dõi chúng tôi đã phân lập được một số dạng biến dị về thӡi gian sinh trưӣng, hình thái lá và màu sắc hoa và được phân thanh 3 nhóm như sau: 18 Nhóm 1: Biến dị về hình thái lá: lá cuộn, lá hình ống. Nhóm 2: Chồi nách phát triển. Nhóm 3: Biến dị về màu sắc hoa: H1: Hoa màu tím; H2: Hoa màu phấn hồng viền tím; H3: Hoa màu trắng viền đỏ; H4: Hoa màu trắng sọc tím; H5: Hoa màu trắng viền tím nhẹ, một số cánh hoa không có viền tím; H6: Hoa trắng viền phấn hồng; H7: Hoa màu tím nhạt viền tím đậm. Đối chӭng Lá hình ống Đầu lá cuộn Chồi nách phát triển Hình 3.10. Mӝt sӕ dҥng biӃn dӏ vӅ hình thái thơn lá Đối chӭng H1 H2 H3 H4 H5 H6 H7 Hình 3.4. Hình ҧnh mӝt sӕ dҥng biӃn dӏ vӅ màu sắc hoa 3.4.1. ̪nh hưởng của xử lý EMS đến sự phát sinh biến dị của cây cẩm chướng giai đo̩n ngoài đồng ruộng Khi xử lý EMS xuất hiện cả 3 nhóm biến dị, trong đó có 5 dạng biến dị về màu sắc hoa (H1, H2, H4, H5, H7), dạng H3, H6 không xuất hiện khi xử lý EMS. Ӣ các công thӭc xử lý nồng độ cao và thӡi gian dài, các biến dị về hình thái thân lá xuất hiện nhiều hơn, biến dị về hoa tĕng chӫ yếu ӣ dạng H5 (dạng biến dị không có lợi). Trong các công thӭc thí nghiệm công thӭc CT7 (xử lý EMS nồng độ 0,4% trong thӡi gian 2 giӡ) cho biến dị về màu sắc hoa nhiều nhất. Đặc biệt là dạng hoa H7 chỉ xuất hiện ӣ công thӭc này. 19 3.4.2. Ҧnh hưởng của xử lý chiếu xҥ tia gamma nguồn 60Co đến tỷ lệ biến dị của cây cẩm chướng sau xử lý giai đoҥn ngoài đồng ruộng Kết quả nghiên cӭu cho thấy khi xử lý chiếu xạ gamma xuất hiện 2 nhóm biến dị (biến dị về hình thái lá và biến dị về màu sắc hoa), biến dị khả nĕng phát triển chồi nách mạnh không xuất hiện. Trong nhóm biến dị về màu sắc hoa chỉ thu được 3 dạng (H4, H5, H6), dạng H1, H2, H3 và H7 không xuất hiện khi xử lý chiếu xạ gamma riêng rẽ. Trong các công thӭc thí nghiệm công thӭc CT3 (xử lý liều 30Gᵧ) cho biến dị về màu sắc hoa nhiều nhất. Đặc biệt là dạng hoa H7 chỉ xuất hiện ӣ công thӭc này. 3.4.3. ̪nh hưởng của xử lý kết hợp EMS và chiếu x̩ tia gamma nguồn 60Co đến tỷ lệ biến dị của cây cẩm chướng sau xử lý giai đo̩n ngoài đồng ruộng Kết quả nghiên cӭu cho thấy việc xử lý kết hợp EMS và chiếu xạ gamma đã làm tĕng tỷ lệ biến dị lên rất nhiều so với xử lý riêng rẽ EMS hoặc gamma. Tỷ lệ biến dị đạt cao nhất tại công thӭc CT5 (24,66%) và thấp nhất tại công thӭc CT1 (4,0%). Xử lý kết hợp EMS và chiếu xạ gamma cho kết quả xuất hiện cả 3 nhóm biến dị (biến dị về hình thái lá, biến dị về phát triển chồi nách và biến dị về màu sắc hoa). Tuy nhiên, trong nhóm biến dị về màu sắc hoa chỉ thu được 5 dạng (H1, H3, H4, H5 và H7), dạng H2 và H6 không xuất hiện. Kết quả nghiên cӭu cho thấy khi xử lý kết hợp làm xuất hiện thêm một dạng mới (H3). Kết quả thực nghiệm cho thấy, các dạng biến dị về màu sắc tập chung chӫ yếu ӣ dạng chồi A (dạng chồi bình thưӡng), một số ít xuất hiện ӣ dạng chồi B, F, G, H. Dạng biến dị H5 chiếm tỷ lệ cao ӣ dạng chồi F. Các dạng chồi D, E, L chỉ xuất hiện các biến dị về hình thái lá và khả nĕng phát triển chồi nách mạnh. 3.4.4. Đặc điểm hình thái một số d̩ng biến dị về màu sắc hoa sau xử lý giai đo̩n ngoài đồng ruộng Về đặc điểm hình thái cӫa một số dạng biến dị về màu sắc hoa ӣ các chỉ tiêu khác nhau có sự khác nhau. Trong các giai đoạn phát triển khác nhau, các cá thể trong các dòng đột biến có tốc độ tĕng trưӣng tương tự nhau. Trong giai đoạn 20 chuyển sang giai đoạn sinh trưӣng sinh thực các dòng bắt đầu có tốc độ phát triển khác nhau dẫn đến chiều cao trung bình cӫa các dòng bắt đầu có sự thay đổi. Chiều cao cây cӫa các dạng H1, H3, H4, H6, H7 và dạng đối chӭng tương đối đồng đều. Dạng H5 có chiều cao cây trung bình thấp hơn (98 ± 9,23cm). Kích thước hoa khi nӣ dao động từ 5,2 đến 7,1 cm. Dạng H2, H3, H4 có kích thước lớn hơn dạng đối chӭng và các dạng còn lại. Cấu trúc cánh hoa có sự khác biệt, bề mặt cánh hoa dạng đối chӭng, H4 và H5 gấp nếp, dạng H1, H2, H3, H6, H7 bề m