Tóm tắt Luận án Nghiên cứu thành phần hóa học một số loài cây thuộc chi Polygonum, họ Rau răm (Polygonaceae)

B10.2) - chất lần đầu tiên được phân lập từ chi Polygonum Được phân lập từ phân đoạn MTB10. Chất rắn màu vàng, đnc. 191-193°C. Rf = 0,23 (TLC, silica gel, n-butanol/acid acetic/nước 4/1/5), hiện màu đen với dung dịch FeCl3/etanol 5%. ESI-MS: pos, m/z: 795,2 [M+Na]+, M=772 đvC, CTPT: C33H40O21.1H-NMR (500 MHz, CD3OD-d4), δ (ppm): 6,23 (1H, d, J= 2,0 Hz, H-6), 6,41 (1H, d, J=2,0 Hz, H-8), 7,68 (1H, d, J= 2,0 Hz, H-2'), 6,95 (1H, d, J=8,5 Hz, H-5'), 7,56 (1H, dd, J= 8,5; 2,0 Hz, H-6'); β-glc: 5,30 (1H, d, J=7,5 Hz, H-1''), 3,33 (1H, m, H-2''), 3,77 (1H, s, H-3''), 3,44(1H, m, H-4''), 3,42 (1H, m, H-5''), 3,83 (1H, dd, J= 1,5; 2,0 Hz, Hb-6′′′), 3,74 (1H, dd, J= 11,5, 5,0 Hz, Ha-6′′′); β-glc: 4,78 (1H, d, J=7,5 Hz, H-1'''), 3,42 (1H, m, H-2'''), 3,35 (1H, m, H-3'''), 3,33 (1H, m, H-4'''), 3,60 (1H, m, H-5'''), 3,37 (1H, s, Ha-6′′), 3,80 (1H, m , Hb-6′′); α-rham: 4,51(1H, d, J=1,0 Hz, H-1''''), 3,50 (1H, dd, J= 9,5; 3,5 Hz, H-2''''), 3,60 (1H, m, H-3''''), 3,27 (1H, t, J=9,5 Hz, H-4''''), 3,45 (1H, m, H-5''''), 1,11 (3H, d, J=6,5 Hz , H-6''''). 13C-NMR (125 MHz, CD3OD-d4), δ (ppm): 158,5 (C-2), 134,9 (C-3), 179,6 (C-4), 163,1 (C-5), 99,9 (C-6), 165,9 (C-7), 94,9 (C-8), 159,2(C-9), 105,7 (C-10), 123,23 (C-1'), 116,2 (C-2'), 145,9 (C-3'), 149,8 (C-4'), 117,7 (C-1'), 123,17 (C-6'); β-glc: 101,2 (C-1''), 76,99 (C-2''), 82,6 (C-3''), 71,1 (C-4''), 77,9 (C-5''), 62,4 (C-6''), β-glc: 104,8 (C-1'''), 75,5 (C-2'''), 78,2 (C-3'''), 71,3 (C-4'''), 77,9 (C-5'''), 68,1 (C-6'''); α- rham: 102,2 (C-1''''), 72,3 (C-2''''), 72,1 (C-3''''), 73,9 (C-4''''), 69,7 (C-5''''), 17,8 (C-6'''') Chương 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Chương này trình bày kết quả định tính các lớp chất có mặt trong ba đối tượng nghiên cứu, biện giải cấu trúc của các hợp chất phân lập được và kết quả thử hoạt tính sinh học của các cặn chiết và một số chất tinh khiết. 4.1. ĐỊNH TÍNH CÁC NHÓM CHẤT TRONG NGUYÊN LIỆU THỰC VẬT 8 Kết quả định tính sơ bộ thành cho thấy thành phần hóa học chủ yếu của cả ba đối tượng là các flavonoid, phytosterol, acid hữu cơ, chất béo. 4.2. HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA CÁC CAO CHIẾT 4.2.1. Kết quả thử hoạt tính độc tế bào của các mẫu cặn chiết Bảng 4.2. Hiệu suất của các cặn chiết khác nhau STT Cây Bộ phận Dung môi Hiệu suất (%) 1 P. barbatum thân rễ MeOH 5,1 2 P. barbatum thân rễ EtOH 90% 6,9 3 P. barbatum thân rễ H2O 7,2 4 P. barbatum lá MeOH 3,2 5 P. perfoliatum thân rễ MeOH 9,3 6 P .perfoliatum thân rễ EtOH 90% 19,3 7 P. perfoliatum thân rễ H2O 20,7 8 P. perfoliatum lá MeOH 13,2 9 P. plebeium toàn cây MeOH 8,7 10 P. plebeium toàn cây EtOH 90% 11,6 11 P. plebeium toàn cây H2O 6,6 Theo tiêu chuẩn của U.S. National Cancer Institute một dịch chiết được xem có khả năng độc tế bào in vitro khi giá trị IC50 nhỏ hơn 20 μg/mL, trong khi với chất tinh khiết, giá trị này được tính là nhỏ hơn 10 μg/mL. Qua bảng 4.3. kết quả thử hoạt tính độc tế bào có thể nhận thấy toàn bộ 11 cặn chiết từ ba loài cây nghiên cứu đều cho tác dụng độc tế bào trên năm dòng tế bào ung thư ở người bao gồm HT-1080, MDA-MB 231, MCF-7/adr, MCF-7/TAMR và Hela với giá trị IC50 trong khoảng 5,1-19,9 µg/mL. Bảng 4.3. Kết quả thử độc tế bào của các mẫu cao chiết trên 5 dòng tế bào ung thư IC50 (µg/mL) STT Mẫu HT-1080 MDA-MB 231 MCF-7/adr MCF-7/TAMR Hela 1 8.5 ± 0.3 5.5 ± 0.3 7.8 ± 0.2 8.1 ± 0.4 7.1 ± 0.5 2 5.1 ± 0.7 6.6 ± 0.5 5.9 ± 0.3 5.4 ± 0.3 7.2 ± 0.4 3 7.4 ± 0.5 8.2 ± 0.4 9.2 ± 0.4 7.1 ± 0.6 9.4 ± 0.5 4 11.5 ± 0.4 12.6 ± 0.5 12.5 ± 0.5 14.2 ± 0.6 13.2 ± 0.4 5 12.8 ± 0.6 13.7 ± 0.3 18.2 ± 0.7 15.8 ± 0.8 13.5 ± 0.4 6 12.9 ± 0.3 13.4 ± 0.4 14.5 ± 0.7 15.4 ± 0.5 15.4 ± 0.6 7 17.5 ± 0.4 16.4 ± 0.5 17.2 ± 0.3 19.9 ± 0.4 13.8 ± 0.5 8 11.1 ± 0.5 10.6 ± 0.4 11.9 ± 0.7 12.4 ± 0.9 10.3 ± 0.4 9 12.6 ± 0.9 10.2 ± 0.4 11.7 ± 0.3 11.5 ± 0.4 10.4 ± 0.6 10 14.3 ± 0.2 13.5 ± 0.3 12.6 ± 0.4 11.8 ± 0.6 10.9 ± 0.5 11 11.9 ± 0.8 9.1 ± 0.5 12.4 ± 0.4 11.9 ± 0.6 12.4 ± 0.5 Tamoxifen** - 12.4 ± 0.8 10.9 ± 1.1 11.1 ± 0.8 - * Kết quả được lấy trung bình của 3 lần thí nghiệm khác nhau; ** chứng dương; - Không thử Trong số các mẫu này, bốn cặn chiết từ cây P. barbatum (1-4) thể hiện khả năng gây độc tế bào trên năm dòng tế bào kể trên mạnh hơn cả với các giá trị IC50 chỉ từ 5,1 – 9,4 µg/mL, bốn mẫu P. perfoliatum (5- 9 8) và ba mẫu P. plebeium (9-11) thể hiện tác dụng này yếu hơn với IC50 từ 9,1 -19,9 µg/mL. Các cao chiết EtOH 90% bộ phận thân rễ của P. perfoliatum, P. barbatum và P. plebeium, đều thể hiện tác dụng độc tế bào mạnh hơn các cao chiết metanol, nước của cùng một cây cũng như phụ thuộc vào từng dòng tế bào. Đây cũng là một cơ sở để định hướng cho quá trình chiết xuất, phân lập các hợp chất từ ba loài cây này. Kết quả nghiên cứu tác dụng độc tế bào này của luận án lần đầu tiên được công bố. 4.2.2. Kết quả thử hoạt tính chống oxy hóa của các cặn chiết Bảng 4.4. Kết quả đánh giá khả năng quét gốc tự do DPPH của các cặn chiết STT Tên mẫu IC50 (µg/ml) 1 Cặn EtOH 90% cây thồm lồm gai 107,50 ± 3,95 2 Cặn EtOH 90% cây nghể trắng 35,53 ± 2,41 3 Cặn EtOH 90% cây mễ tử liễu 55,60 ± 3,92 4 Acid ascorbic 34,08 ± 0,36 Trong ba cặn chiết EtOH 90% của ba đối tượng nghiên cứu, cặn chiết từ cây nghể trắng cho tác dụng cao nhất với IC50 = 35,53 ± 2,41 µg/ml xấp xỉ bằng chất đối chứng là acid ascorbic IC50 = 34,08 ± 0,36 µg/ml. Bảng 4. 5. Kết quả định lượng ABTS•+ của các cặn chiết STT Tên mẫu IC50 (µg/ml) 1 Cặn EtOH 90% cây thồm lồm gai 48,57 ± 8,874 2 Cặn EtOH 90% cây nghể trắng 29,83 ± 6,60 3 Cặn EtOH 90% cây mễ tử liễu 26,50 ± 5,92 4 Trolox 9,47 ± 0,25 Nhận xét: Từ bảng 4.2. cho thấy cả ba cặn chiết EtOH 90% của ba đối tượng nghiên cứu đều có khả năng dọn gốc tự do ABTS•+. Trong đó cây mễ tử liễu cho tác dụng cao nhất với IC50 = 26,50 ± 5,92 µg/ml, tiếp đó là cây nghể trắng với IC50 = 29,83 ± 6,60 µg/ml và cuối cùng là cây thồm lồm gai với IC50 = 48,57 ± 8,874 µg/ml với chất đối chứng Trolox IC50 =9,47 ± 0,25 µg/ml. Qua kết quả định tính nhóm chất và kết quả khảo sát tác dụng độc tế bào, chống oxy hóa của các phần chiết khác nhau từ các bộ phận khác nhau của cả ba loài nhận thấy cặn chiết etanol 90% bộ phận thân rễ của hai loài thồm lồm gai, nghể trắng và toàn cây mễ tử liễu cho thấy tác dụng độc tế bào và tác dụng quét gốc DPPH rõ rệt nhất. Hơn nữa dung môi chiết xuất etanol 90% là dung môi có thể chiết xuất được hầu hết các các nhóm chất có độ phân cực khác nhau có mặt trong cả ba loài. Vì vậy, luận án lựa chọn đối tượng nghiên cứu cụ thể cho quá trình phân lập các chất là thân rễ thồm lồm gai, thân rễ nghể trắng, toàn cây mễ tử liễu với dung môi chiết xuất là etanol 90%. 4.3. ĐIỀU CHẾ CÁC PHẦN CHIẾT Quy trình chiết được áp dụng chung cho cả ba mẫu thực vật nêu trên và được tóm tắt ở Sơ đồ 4.1 10 4.4. PHÂN TÍCH THÀNH PHẦN HÓA HỌC CÁC PHẦN CHIẾT Phần này trình bày kết quả phân tích các phần chiết bằng sắc ký lớp mỏng, hệ dung môi dung để phân lập các chất bằng sắc ký cột. 4.5. PHÂN TÁCH CÁC PHẦN CHIẾT Phần này trình bày chi tiết quá trình phân lập các hợp chất từ các phân đoạn khác nhau của ba đối tượng nghiên cứu. 4.5.1. Phân lập các hợp chất từ cây thồm lồm gai Từ phần chiết n-hexan cây thồm lồm gai thu được các hợp chất TLH4 (30 mg), TLH5 (15 mg), TLH7 (12 mg), TLH9 (15 mg), TLH23.3 (21 mg), TLH24 (27 mg), TLH29 (13 mg). Từ phần chiết etyl axetat (TLE) thu được chất TLE 1.1 (8 mg), TLE1.1.2 (12 mg), TLE1.1.3 (14 mg) TLE 1.1.4 (11 mg), TLE1.2 (20 mg), TLE1.3 (8 mg), TLE1.4 (11 mg), TLE1.5 (11 mg), TLE1.7 (21 mg), TLE1.8 (13 mg), TLE1.9 (13 mg), TLE 2.1 (13mg), TLE 2.1.3 (18 mg), TLE 2.1.4 (30 mg), TLE2.2 (12 mg), TLE2.6 (13 mg), TLE3 (16 mg), TLE5 (17 mg). Từ phần chiết n- butanol thu được chất TLB1(11 mg), TLB4 (23 mg), Mẫu nguyên liệu (TL 2,5 kg; NT 2,5 kg, MT 2,5 kg) Dịch nước Dịch nước Phần chiết n-butanol (TLB; 47,30 g, 1,89 %) (NTB; 35,76 g, 1,43 %) (MTB; 41,43 g, 1,66 %) Phần chiết nước (TLW; 105,00 g, 4,20 %) (NTW; 76,80 g, 3,07 %) (MTW; 96,00 g, 3,84 %) 1. Hòa vào nước cất 2. Chiết bằng n-hexan 3. Cất loại kiệt n-hexan, 60 °C Sơ đồ 4.1. Quy trình điều chế các phần chiết từ ba đối tượng nghiên cứu 1. Ngâm chiết với EtOH 90% (4 ngày, 3 lần) 2. Lọc, cất loại EtOH Dịch nước Phần chiết n-hexan (TLH; 17,00 g, 0,68 %) (NTH; 40,29 g, 1,61 %) (MTH; 71,86 g, 2,87 %) 1. Chiết với EtOAc 2. Cất loại kiệt EtOAc, 60 °C Phần chiết EtOAc (TLE; 100,00 g, 4,00 %) (NTE; 50,97 g, 2,04 %) (MTE; 71,25 g, 2,85 %) 1. Chiết với n-butanol 2. Cất loại kiệt n-butanol, 70 °C Cất loại kiệt nước, 100 °C Phần chiết tổng (TL; 290,00 g, 11,60 %) (NT; 207,26 g, 8,29 %) (MT; 289,85g, 11,59 %) 11 TLB7 (24 mg), TLB11 (16 mg), TLB13 (13 mg). 4.5.2. Phân lập các hợp chất từ cây nghể trắng Từ phần chiết n-hexan thu được chất NTH1 (50 mg), NTH2 (140 mg), NTH6 (14 mg), NTH24.1 (13 mg), NTH24.2 (21 mg), NTH26.2 (15 mg), NTH26.3 (35 mg), NTH30 (30 mg). Từ phần chiết etyl axetat (NTE) thu được chất NTE1.1 (9 mg), NTE1.6 (14 mg), NTE2.4.2 (8 mg), NTE 2.6.1 (13 mg), NTE2.6.2 (40 mg), NTE2.7.1 (15 mg), NTE3 (15 mg), NTE 5.7 (11 mg), NTE8 (22 mg), NTE12 (14 mg). Từ phần chiết n-butanol thu được chất NTB3 (17 mg), NTB4 (20 mg), NTB8 (13 mg), NTB11 (38 mg). 4.5.3. Phân lập các hợp chất từ cây mễ tử liễu Từ phần chiết n-hexan thu được chất MTH8.1 (31 mg), MTH10 (35 mg), MTH11 (15 mg), MTH13 (12 mg), MTH16 (17 mg), MTH 18 (205m g). Từ phần chiết etyl axetat (MTE) thu được chất MTE2.4 (17 mg), MTE2.5 (10 mg), MTE2.9 (17 mg), MTE2.9.9 (14 mg), MTE2.10.1 (13 mg), MTE2.10.2 (20 mg), MTE3.4 (11 mg), MTE3.8 (16 mg), MTE4 (30 mg), MTE5 (15 mg), MTE8.1 (7 mg). Từ phần chiết etyl axetat n- butanol thu được chất MTB4 (35 mg), MTB6 (22 mg), MTB 10.2 (56 mg). 4.6. CẤU TRÚC CỦA CÁC HỢP CHẤT PHÂN LẬP Cấu trúc của các chất được xác định dựa vào việc phân tích các dữ kiện phổ thực nghiệm, kết hợp khảo sát các đặc trưng vật lý, kết hợp tham khảo các tài liệu. Dưới đây chỉ ra cấu trúc các chất đã được xác định, và trình bày phương pháp xác định cấu trúc của một số hợp chất điển hình từ ba loài cây. 4.6.1. Các hợp chất được phân lập từ thân rễ cây thồm lồm gai Từ các phần chiết thân rễ cây thồm lồm gai đã phân lập và xác định cấu trúc được 24 hợp chất bao gồm: HO 17 18 19 20 22 5 24 26 27 28 29 3 β-Sitosterol (TLH4) OHOH O 1 2 3 45 6 7 8 9 10 Musizin (TLH5) Mới trong cây OH 1 3 5 8910 13 14 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30O H3C 3-Acetocycloart-25-ene-24(R/S)-ol (TLH9) -Mới trong cây HN OH OH O H HOHO OH O OH 1 2 3 18 O OH 3' 1' 2' 5 6 7 8 9 10 11 12 13 29 4' 5' 6' 7' 8' 10' 11' 12' 13' 20' 1-O-(β-D-glucopyranosyl)-(2S,3S,4R,8E)-2-[(2'R,10'Z)-2'-hydroxyicos-10'- enoylamino]-8-nonacosene-1, 3, 4-triol (TLH23)- chất mới trong tự nhiên 10 9 2 3 45 6 7 8 1' 2' 3' 4' 10' 5' 6' 7' 8' 9' O OHO OCH3 6-Geranyl-7-hydroxy-8-methoxy coumarin (TLH29)-Mới trong chi Polygonum O 17 18 19 21 22 5 24 26 27 28 29 3O H HOHO OH OH Daucosterol (TLE1.2) O O OH HO OH OH OH 2 3 46 8 10 1' 4' 6' Quercetin (TLE1.3) OHO OH O OH OH OH 1 2 3 4 5 7 9 10 1' 2' 3' 6' OH Myricetin (TLE 1.5) 12 O O OHO 13 6 6aO O 1' 3' 6' 6'a O OCH3 3a 3'-O-methyl-3,4-methylenedioxy ellagic axit (TLE1.1) Mới trong chi Polygonum O O 1 3 45 6 8 9 10 8a 9a 4a10a OCH3H3C OHOH Physcion (TLE1.1.2) O O OH OH 1 34 5 8 4-Hydroxymellein (TLE1.1.4) Mới trong cây O O OH3CO 1 23 4 5 6 7 1'' 2'' 3'' 4'' 5'' 6'' O OH OH HO CH3 O O OCH3 H3CO 1' 2' 3' 4' 5'6' 7' 3,3',4-Trimethoxy 4'-O-α-L- rhamnopyranoside ellagic acid (TLE1.4) Mới trong cây O O HO O OH HO OH OH OH 1 2 3 6 4 5 9' 8' 7' 1' 2' 3' 4' 5' 6' Acid chlorogenic (TLE1.7) O OH OCH3 OCH3 O HO OH 2 3 4 5 7 9 10 2' 6' 4',5,7-Trihydroxy-3',5'- dimethoxyflavone (TLE1.8) Mới trong cây OO OHO OH O OH OH CH3 OH HO OH OH 1 2 34 5 7 9 10 1' 3' 6' 1'' 2'' 3'' 4'' 5'' 6'' Myricetin 3-O-α-L-rhamnopyranosid (TLE1.9) O O O HO OH OH 2 45 7 9 1' 3' 1'' 5'' O HO OH OH COOH 2" 4" 6" OH H Quercetin-3-O-β-D-glucuronid (TLE2.1.4) O OH OH HO OH OH 2 3 45 6 7 8 9 10 1' 2' 3' 4' 5' 6' (-)- Epicatechin (TLE2.1) O H HO HO OH O OH O H HO OH OH OH1' 4 Maltose (TLE2.1.3) O OOH HO OH O O OH OH OH O O OHHO HO 1'' 1''' Kaempferol-3-β-D-glucopyranosyl- (1→6)-α-L-rhamnopyranosid (TLB4) HN NH O O N H O HO 7 6 4 5 23 1 N-[(4R)-2,5-dioxo-4- imidazolidinyl]-carbamic acid (TLE5) Mới trong chi Polygonum O OH O O O O OH OH HO HO O H3CO HO O OCH3 OH 1 2 3 4 5 OH 6 1'' 2'' 3'' 4'' 5''6'' 1''' 2'''3''' 4''' 5''' 6''' 7''' 8''' 9''' 7'' 8'' 9'' 1' 2'3' 4' 5' 6' 1,3- Diferuloyl O-Z-β-D-fructofuranosyl (1→2)-α-D-glucopyranosid (TLB11) 13 OH OCH3 OH H3CO O H3CO HO OCH3 13 6 7 8 9 1' 2'6' 7' 8' 9' O HO OH OH 1" 5" Lyoniside (TLB13) O OH OH HO OH O 2 35 7 9 10 1' 3' 6' O OH OH OH 7' 9' 11' 13' 8' OH (–)-Epigallocatechin 3-O-gallate (TLE2.6) O O O HO OH OH 2 45 7 9 1' 3' 1'' 5'' O HO OH OH OH 2" 4" 6" OH Quercetin 3-O-β-D- glucopyranosid (TLE3) 3-Acetocycloart-25-ene-24(R/S)-ol (TLH9)- chất mới trong cây cây thồm lồm gai. Phổ 1H-NMR của TLH9 cho tín hiệu singlet của các proton thuộc về bảy nhóm metyl, trong đó có 6 nhóm metyl thế ba lần ở δH 1,73 (3H, s, H-18), 0,97 (6H, s, H-21& H-28), 0,87 (3H, s, H-27), 0,80 (3H, s, H- 29), 0,89 (3H, s, H-30) và một nhóm metyl cacbonyl ở δH 2,17 (3H, s, 3-COCH3); hai proton của vòng cyclopropane cho tín hiệu doublet rất đặc trưng tại δH 0,33 (1H, d, J=4,5Hz, H-19a), 0,55 (1H,d, J=4,0Hz, H- 19b). Một proton metin cộng hưởng chuyển dịch về trường thấp hơn (δH 4,10) chứng tỏ nó phải liên kết với cacbon gần dị tố (ở đây là nguyên tử oxi của nhóm hydroxyl). Tín hiệu proton của một nối đôi đầu mạch δH 4,83 và 4,93. Thêm vào đó, sự có mặt của proton ở δH 3,28 (1H, m, H-3) chứng tỏ rằng TLH9 là một triterpene có khung cycloartane. Kết hợp giữa phổ 13C-NMR và DEPT cho thấy TLH9 gồm 7 nhóm CH3, 11 nhóm CH2, 6 nhóm CH và 7 C bậc 4. Tín hiệu δC 170,0 và 21,4 (C-COCH3) đặc trưng cho sự có mặt của chức acetoxy (COCH3) trong công thức cấu tạo của TLH9. Sự xuất hiện của nối đôi đầu mạch (>C=CH2) cũng được khẳng định bởi các tín hiệu tại δC 147,5 (24S) (C-25), 147,8 (24R) (C-25), 110,9 (24S) (C-26), 111,4 (24R) (C-26) tương ứng với hai tín hiệu proton ở δ 4,83 và 4,93. Điều đặc biệt ở đây là sự xuất hiện của các pic cacbon theo cặp đôi của C-25 và C-26 ở δC 147,5 (24S) (C-25), 147,8 (24R) (C-25) và 110,9 (24S) (C-26), 111,4 (24R) chứng tỏ rằng hợp chất TLH9 là một hỗn hợp epimer R/S với tỷ lệ khoảng 01:01 gây ra bởi nguyên tử carbon bất đối ở C- 24. Từ việc phân tích trên, kết hợp với tham khảo tài liệu, so sánh các dữ kiện phổ đã công bố cho các hợp chất tương tự [10] cho phép kết luận về cấu trúc của TLH9 là 3-acetocycloart-25-ene-24(R/S)-ol. Hợp chất này lần đầu tiên được phân lập từ cây thồm lồm gai. OH 1 3 5 8910 13 14 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30O H3C 1-O-(β-D-glucopyranosyl)-(2S,3S,4R,8E)-2-[(2'R,10'Z)-2'-hydroxyicos-10'-enoylamino]-8-nonacosene- 1, 3, 4-triol (TLH23) - chất mới chưa có công bố trên tạp chí khoa học Hợp chất TLH23 kết tinh dưới dạng tinh thể hình kim màu trắng, có điểm nóng chảy ở 216-218°C. Các dữ kiện phổ 1H và 13C-NMR của chất TLH23 chỉ ra sự có mặt của một chức amid đặc trưng bởi một nhóm metin liên kết với nitơ ở δH 4,27 (1H, m, H-2) và tín hiệu cacbon cacbonyl ở δC 177,1 (C-1'); hai mạch cacbon béo đặc trưng bởi các tín hiệu ở δH 1,31 (60 H) và δH 0,92 (6H, t, J=6,5 Hz, H-20' & H-29), tín hiệu của hai nối đôi ở δH 5,44 (m, H-8, H-9) tương ứng với δC 131,5 (C-8), 131,4 (C-9) và 5,38 (m, H-10', H-11') tương ứng với δC 130,8 (C-10'), 130,9 (C-11'). Sự có mặt của đường glucose được đặc trưng bởi tín hiệu proton anome [δH 4,30 (d, J = 7,5 Hz, H-1'')] và cacbon anome δC 104,7 (C-1') và các tín hiệu 13C-NMR khác 14 nhau ở δC 62,7 (C-6''), 71,6 (C-4''), 75,0 (C-2''), 78,0 (C-5'') và 77,9 (C-3''). Tương tác giữa C-1 và H-1'' trên phổ HMBC cho phép khẳng định vị trí của liên kết glucosid giữa đường và amid. Các dữ kiện trên cho ta giả thiết hợp chất TLH23 là một glycosphingolipid được tạo thành bởi hai hợp phần acid béo và bazơ mạch dài [117]. Phân tích tiếp phổ 1H-NMR còn cho tín hiệu của ba proton hydroxymetin khác chuyển dịch về trường thấp ở δH 3,62, 3,53 , 4,04. Các tương tác COSY quan sát được của hai proton metylen (H-1) ở δH 4,08 và 3,82 với proton metin ở δH 4,27, tương tác của hai proton metin ở δH 4,27 với δH 3,62, tương tác của proton metin δH 3,62 với proton metin ở δH 3,53; đồng thời tương quan HMBC của proton ở δH 4,04 và C=O (δC 177,1) cho phép xác định vị trí liên kết chính xác của các proton này là ở C-3, C-4 và C 2'. Từ đây, cũng khẳng định về cấu trúc 1,3,4-triol của sphingolipid này . HN OH OH 1 2 3 R2 O OH 1' 2' R1RO 4 R1, R2: Mach dài R: glucose hoac galactose Để xác định hai hợp phần này ta sử dụng phương pháp thủy phân và kết hợp khảo sát phổ ESI-MS của sản phẩm như sau: Hợp chất TLH23 (15 mg) được hòa tan trong hỗn hợp dung môi metanol-acid HCl (5ml, 1M HCl trong 82% aq. MeOH), đun hồi lưu ở 80°C trong 18 giờ [117]. Để nguội phản ứng và chiết với n- hexan. Phần chiết n-hexan sau đó được cô loại dung môi thu được sản phẩm là metyl este của hợp phần acid béo (TLH23.1). Độ dài mạch của hợp phần TLH23.1 được xác định bởi phổ ESI-MS (neg) với píc ion m/z 339 [M-H]- cho thấy mạch acid béo phải có 20 cacbon và chứa một nối đôi. Như vậy, nối đôi còn lại thuộc về hợp phần base. Vị trí của nối đôi trong phần acid béo được xác định tại C-10'/C-11' dựa trên các phân mảnh ở phổ ESI-MS (neg) của TLH23.1: m/z 227 [M-H-C8H18]-, m/z 213 [M-H-C9H18]-, m/z 187 [M-H- C11H21]-, , m/z 173 [M-H-C12H23]-. Cấu hình của nối đôi này là Z do sự chuyển dịch về trường cao của hai cacbon kề bên C-9 (δC 28,3) và C-12 (δC 28,4). O O OH 3' 1' 2' 4' 5' 6' 7' 8' 10' 11' 12' 13' 20' 173 187 227 213 m/z: 339 [M-H]- Trên phổ khối của TLH23 cho pic ion m/z 962 [M+Na]+ tương ứng với khối lượng phân tử 939 đvC và công thức phân tử C55H105NO10. Kết hợp với việc xác định được phần acid béo ở trên, ta xác định được độ dài của hợp phần base là 29 cacbon. Phân tích tỉ mỉ các tương tác COSY và HMBC xác định được vị trí của nối đôi trong mạch base là ở vị trí C-8. Cấu hình của nối đôi này được xác định là E dựa trên sự chuyển dịch về trường thấp của hai cacbon bên cạnh C-7 (δC 33,8) và C-10 (δC 33,7). Kết hợp với tài liệu tham khảo [27] cho phép kết luận cấu trúc hợp chất TLH23 là 1-O-(β-D-glucopyranosyl)-(2S,3S,4R,8E)-2-[(2'R,10'Z)-2'- hydroxyicos-10'-enoylamino]-8-nonacosene-1,3,4-triol. Đây là lần đầu tiên hợp chất này được công bố phân lập từ thiên nhiên. HN OH OH O H HOHO OH O OH 1 2 3 18 O OH 3' 1' 2' 5 6 7 8 9 10 11 12 13 29 4' 5' 6' 7' 8' 10' 11' 12' 13' 20' 15 3'-O-methyl-3,4-methylenedioxy ellagic acid (TLE1.1)- chất lần đầu tiên được phân lập từ chi Polygonum Phổ 1H-NMR của TLE1.1 chỉ xuất hiện 2 tín hiệu singlet tại δH 7,535 (1H, s, H-5') và 7,533 (1H, s, H- 5) được xác định là hai proton của vòng benzen. Tín hiệu singlet tại δH 6,38 (2H, s, H-3a) cho thấy sự có mặt của 2 proton methylenedioxy. Ngoài ra, nhóm methoxy được xác định bởi tín hiệu ở δH 4,05 (3H, s). Phổ 13C-NMR và DEPT của TLE1.1 cho thấy hợp chất này có 15 C trong đó 12 tín hiệu δC 110,9 (C- 1'), 112,1 (C-5'), 103,8 (C-5), 116,0 (C-6'), 116,0 (C-6), 112,7 (C-1), 140,2 (C-3'), 131,0 (C-2), 138,3 (C-3), 141,6 (C-2'), 150,0 (C-4), 150,0 (C-4') thuộc về hai vòng benzen với 10 cacbon bậc 4 và 2 cacbon metin. Ngoài ra, hai tín hiệu cacbon cacbonyl xuất hiện tại δC 157,6 (C-6'a), 158,3 (C-6a), rất đặc trưng cho cặp este nội vòng trong các dẫn xuất của ellagic acid. Phổ 13C-NMR và DEPT còn cho thấy sự xuất hiện của nhóm CH2 liên kết với 2 nguyên tử O tại δC 104,3 (C-3a) và nhóm methoxy tại δC 60,9 (s, 3-OCH3). Dựa vào dữ liệu phổ trên đồng thời so sánh với các dữ kiện phổ đã được công bố trước đó [21], [152], cấu trúc của chất TLE1.1 được xác định là 3'-O-methyl-3,4-methylenedioxyellagic acid. Đây là công bố đầu tiên về sự có mặt của hợp chất này trong P. perfoliatum cũng như các loài trong chi Polygonum. O O OHO 13 6 6aO O 1' 3' 6' 6'a O OCH3 3a N-[(4R)-2,5-dioxo-4- imidazolidinyl]-carbamic acid (TLE5)- chất lần đầu tiên được phân lập từ chi Polygonum Hợp chất TLE5 có dạng tinh thể hình trụ màu trắng. Hiện màu tím với thuốc thử ninhydrin cho giả thiết về sự có mặt của nhóm amino trong cấu trúc của TLE5. Phổ 1H và 13C- NMR (DMSO-d6) chỉ ra sự có mặt của 5 proton ở δH 10,52 (1H, s), 8,04 (1H, s), 6,87 (1H, d, J=8,0 Hz), 5,24 (1H, d, J=8,0 Hz), 5,77 (1H, s) và 4 tín hiệu cacbon (δC 173,6, 157,3, 156,7 và 62,3). Tuy nhiên trên phổ HSQC chỉ quan sát thấy duy nhất một tương tác doublet của một cacbon (δC 62,4) và proton (δH 5,24). Như vậy khung cấu trúc của hợp chất TLE5 không chỉ chứa cacbon và hydro mà còn có chứa các nguyên tử khác. Phổ HMBC chỉ ra tương tác của proton ở δH 8,04 với cacbon ở δC 62,4, 156,7, 173,6; của proton δH 6,87 với cacbon δC 62,4, 157,3, 173,6; proton ở δH 5,24 với cacbon at δC 157,3, 173,6; proton δH 5,77 và cacbon δC 62,4. Phổ MS của TLE5 không chỉ ra pic ion phân tử mà cho các phân mảnh ở m/z: 158, 141, 130, 115 và 87. Từ các dữ kiện phổ trên, kết hợp với tài liệu tham khảo [156] cho nhận định về cấu trúc của hợp chất TLE5 là 2,5-dioxo-4- imidazolidinyl)-carbamic acid. Đây là lần đầu tiên hợp chất này được phân lập từ cây thồm lồm gai và chi polygonum. Trên thế giới, cho đến nay cũng mới chỉ ghi nhận một tài liệu tham khảo về sự phân lập hợp chất này trong tự nhiên (trong cây Cistanche deserticola Y.C.ma, một loài cây thuộc họ Orabanchaceae ở Trung Quốc). HN NH O O N H O HO 7 6 4 5 23 1 Kaempferol-3-β-D-glucopyranosyl-(1→6)-α-L-rhamnopyranosid (TLB4) - chất mới từ chi Polygonum Trên phổ 1H-NMR cho các tín hiệu cộng hưởng của 2 proton nhân thơm với hằng số tương tác J = 1,5 Hz đặc trưng cho proton ở vị trí meta ở vòng A của 5,7-flavonol với H 6,22 (1H, H-6), 6,42 (1H, H-8). Cặp 16 hai tín hiệu doublet khác tại H 8,10 (2H, d, J = 9,0, H-2', H-6') và 6,90 (2H, d, J = 9,0 Hz, H-3', H-5') đặc trưng cho hai proton ở vị trí meta với nhau thuộc vòng B thế para. Các dữ kiện trên cho ta giả thiết TLB4 là một flavonoid có nhân kaempferol. So sánh số nguyên tử cacbon của TLB4 với kaempferol, kết hợp phân tích các tín hiệu cộng hưởng của nhiều proton trong vùng H 3,29 - 5,06 ppm chứng tỏ TLB4 phải chứa 2 đường. Trong đó một đường là rhamnose đặc trưng bởi tín hiệu cộng hưởng proton doublet rất mạnh ở H 1,20 ppm (3H, d, J = 6,0 Hz) của nhóm CH3. Một đường khác là glucose với proton anomer ở H 5,05 (H-l'', d, J = 8,0 Hz) gắn trực tiếp vào nhân kaempferol tại OH ở vị trí C-3 (C 135,7) và nối với rhamnose ở H-1''' (H 4,55, s) thể hiện rõ nét trên phổ HMBC qua tương tác C-3 và H-1' và C-6'' và H-1'''. Cấu trúc kaempferol glycosid của TLB4 một lần nữa được khẳng định qua các dữ liệu phổ 13C-NMR với 27 tín hiệu C, trong đó ngoài 12 tín hiệu của 2 vòng đường tại C 105,6 (C-1''), 73,9 (C-2''), 75,4 (C-3''), 70,1 (C-4''), 75,1 (C-5''), 67,4 (C-6''), 101,9 (C-1'''), 72,1 (C-2'''), 72,3 (C-3'''), 72,9 (C-4'''), 69,7 (C-5'''), 17,9 (C-6'''), 15 tín hiệu còn lại của 15 nguyên tử cabon thuộc vào khung flavon. Hai tín hiệu CH bị chập đôi tại C 132,46 và 116,13 với cường độ cao gấp đôi các tín hiệu CH khác và trên phổ HSQC chúng tương ứng với 2 tín hiệu proton mà mỗi tín hiệu có cường độ tích phân là 2H cũng khẳng định rõ vòng B thế para. Kết hợp với việc phân tích các dữ kiện phổ COSY, HSQC, HMBC có thể khẳng định rằng TLB4 là một flavonoid có tên gọi kaempferol-3-β- D-glucopyranosyl-(1→6)-α-L-rhamnopyranosid [18]. Hợp chất này lần đầu tiên được công bố phân lập từ cây thồm lồm gai và chi polygonum. O OOH HO OH O O OH OH OH O O OHHO HO 1'' 1''' O OOH HO OH O O OH OH OH O O OHHO HO HMBC:H C 4.6.2. Các hợp chất được phân lập từ cây nghể trắng Từ các phần chiết thân rễ cây nghể trắng đã phân lập và xác định cấu trúc 17 hợp chất bao gồm: O OH 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 Axit margaric (NTH1) Mới trong cây HO 17 18 19 20 22 5 24 26 27 28 29 3 β-Sitosterol (NTH2) CH3 O O H N N H O O 20 14 13 12 8 7 1 4 9 1016 21 17 18 19 22 25 28 31 Asperglaucide (NTH6) Mới trong cây COOCH3 HO 12 3 4 5 6 7 810 11 12 13 14 15 16 17