Tóm tắt Luận án Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học cây máu chó trái dày (knema pachycarpa) và cây máu chó đá (knema saxatilis)

chất phân lập được bằng các phương pháp vật lý và hóa học. 3. Đánh giá hoạt tính ức chế enzyme acetylcholinesterase của các hợp chất phân lập được 4. Đánh giá hoạt tính gây độc tế bào của các hợp chất phân lập được. Bố cục của luận án: Luận án bao gồm 157 trang với 41 bảng, 114 hình và 84 tài liệu tham khảo. Luận án bao gồm 4 chương: Mở đầu (2 trang), Chương 1: Tổng quan (27 trang); Chương 2: Đối tượng và phương pháp nghiên cứu (6 trang); Chương 3: Thực nghiệm (20 trang), Chương 4: Kết quả và thảo luận (89 trang); Kết luận (1 trang); Kiến nghị (1 trang); Các bài báo liên quan đến luận án (1 trang); Tài liệu tham khảo (10 trang); Phụ lục (102 trang). 3 Chương 1. Tổng quan Bao gồm phần tổng quan các nghiên cứu trong nước và quốc tế về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của chi Knema. 1.1. Giới thiệu chung chi Knema: Phần này giới thiệu về đặc điểm, phân bố, các nghiên cứu về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của chi Knema. 1.1.1. Đặc điểm thực vật của chi Máu chó (Knema) Chi Knema (Máu chó) là chi lớn thuộc họ Myristicaceae. Chi này được phân bố khắp nơi trên thế giới và nhiều nhất tại Ấn Độ, Malaysia, Trung Quốc, Việt Nam. Chi Knema có khoảng hơn 60 loài ở Đông Nam Á [5], Ở Việt Nam chi Knema gồm 14 loài. 1.1.2. Sử dụng trong y học cổ truyển của các nước Các loài thuộc chi Knema được sử dụng trong y học cổ truyền các nước Đông Nam Á để điều trị các bệnh trị viêm loét, mụn nhọt và bệnh ung thư. 1.2. Các nghiên cứu về thành phần hóa học của chi Knema 1.2.1. Nghiên cứu trong nước Hầu như chưa có nghiên cứu về thành phần hóa học về chi Knema được công bố. 1.2.2. Nghiên cứu trên thế giới Các nghiên cứu từ năm 1978 cho đến nay cho thấy đã có 12 loài thuộc chi Knema được nghiên cứu về thành phần hóa học. Các hợp chất phân lập từ chi Knema khá đa dạng với lớp chất chủ yếu của chi là nhóm các hợp chất phenol lipid bao gồm: resorcinol, anacardic acid, cardanol và acetophenone. Ngoài ra còn có một số hợp chất flavonoid, lignan, stilbene, terpene tuy nhiên số lượng các hợp chất phân lập được còn hạn chế, mới chỉ có 93 hợp chất đã tìm ra. 1.3. Các nghiên cứu về hoạt tính sinh học của chi Knema Các loài thuộc chi Knema thể hiện nhiều hoạt tính đáng quan tâm như: Kháng khuẩn, chống ung thư, độc tính tế bào và ức chế enzyme acetylcholinesterase. 4 1.4. Tác dụng ức enzyme acetylcholinesterase (AChE) Trong chứng rối loạn nhận thức nguyên nhân chủ yếu là sự thiếu hụt trong dẫn truyền thần kinh cholinergic có liên quan đến acetylcholinesterase (AChE). Các chất ức chế AChE đã được phê duyệt đầu tiên cho việc điều trị các triệu chứng mất trí nhớ. Chương 2. Đối tượng và phương pháp nghiên cứu 2.1. Mẫu thực vật Mẫu máu chó trái dày (quả, thân cành, lá) được ThS. Đào Đình Cường thu hái tại A Lưới-Thừa Thiên Huế, ngày 22 tháng 05 năm 2015. Mẫu cây đã được TS. Nguyễn Quốc Bình (Bảo tàng thiên nhiên Việt Nam) giám định tên khoa học. Mẫu tiêu bản (VN-1527) được lưu giữ tại Viện sinh thái và tài nguyên sinh vật, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Mẫu máu chó đá (lá, thân cành) được ThS. Đào Đình Cường thu hái tại Hướng Hóa-Quảng Trị, ngày 14 tháng 05 năm 2006. Mẫu cây đã được TS. Nguyễn Quốc Bình (Bảo tàng thiên nhiên Việt Nam) giám định tên khoa học. Mẫu tiêu bản (VN-1672) được lưu giữ tại Viện sinh thái và tài nguyên sinh vật, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. 2.2. Phương pháp phân lập các hợp chất Sử dụng các phương pháp sắc ký 2.3. Phương pháp xác định cấu trúc Sử dụng các phương pháp phổ hiện đại như: NMR, MS, GC/MS 2.4. Phương pháp xác định hoạt tính sinh học Thử hoạt tính ức chế enzyme acetylcholinesterase và gây độc tế bào 5 Ngâm chiết với MeOH Chiết phân bố với n-hexan, EtOAc D: Dichlomethane, M: Methanol E: Ethylacetate, H: n-Hexan A: Acetonitril, W: H2O, A: Acetone c.c: Column chromatography TLC: Thin layer chromatography Chương 3. Thực nghiệm 3.1. Phân lập các hợp chất từ loài máu chó trái dầy (Knema pachycarpa) Hình 3.1. Sơ đồ phân lập các hợp chất từ quả máu chó trái dày 380 g quả Máu chó trái dày Cao MeOH (190 g) 150 g cao n-hexan (MDH) Dịch nước 2,3 g cao EtOAc (MDE) 6 Ngâm chiết với MeOH Chiết phân bố với n-hexan, EtOAc Hình 3.2. Sơ đồ phân lập các hợp chất từ thân cành máu chó trái dày Cao MeOH (400 g) 165 g cao n-hexan (MCH) Dịch nước 160 g cao EtOAc (MCE) 3,5 kg thân cành Máu chó trái dày D: Dichlomethane M: Methanol E: Ethylacetate; H: n-Hexan AN: Acetonitrile; N: H2O 7 Ngâm chiết với MeOH Chiết phân bố với n-hexan, EtOAc Hình 3.3. Sơ đồ phân lập các hợp chất từ lá máu chó trái dày Cao MeOH (400 g) 225 g cao n-hexan (LMCH) Dịch nước 110 g cao EtOAc (LE) 2,0 kg lá Máu chó trái dày D: Dichlomethane M: Methanol E: Ethylacetate, H: n-Hexan A: Acetone c.c: Column chromatography 8 Ngâm chiết với MeOH Chiết phân bố với n-hexan, EtOAc, n-butanol 3.2. phân lập các hợp chất từ loài máu chó đá (Knema saxatilis) 3.4. Sơ đồ phân lập các hợp chất từ thân cành máu chó đá Cao MeOH (80 g) 5 g cao n-hexan Dịch nước 10 g cao EtOAc D: Dichlomethane M: Methanol A: Acetone 1,12 kg thân cành Máu chó đá 53 g cao n-butanol 9 Ngâm chiết với MeOH Chiết phân bố với n-hexan, EtOAc Hình 3.5. Sơ đồ phân lập các hợp chất từ lá máu chó đá Cao MeOH (110 g) 53 g cao n-hexan Dịch nước 39 g cao EtOAc D: Dichlomethane M: Methanol A: Acetone 1,1 kg thân cành Máu chó đá 10 3.3. Dữ liệu phổ của các hợp chất mới phân lập được Knepachycarpic acid A (MC1): Chất dạng sáp, không màu. HR-ESI-MS: m/z 425.2350 [M-H] - , công thức phân tử C26H34O5 (M 426). 1 H-NMR (500MHz, CDCl3) δH ppm: 6,84 (d, J = 8,0 Hz, H-3), 7,33 (t, J = 8,0 Hz, H-4), 6,75 (d, J = 8,0 Hz, H-5), 2,95 (t, J = 7,5 Hz, H-1'), 1,53-1,60 (m, 4H, H-2', H-11'), 1,29-1,25 (m, 16H, H-3', H-4', H-5', H-6', H-7', H-8', H-9', H-10'), 2,50 (t, J = 7,5, H-12'), 6,66 (d, J = 1,0 Hz, H-2''), 6,71 (d, J = 8,0 Hz, H-5''), 6,61 (brd, J = 8,0 Hz, H-6''), 5,90 (s, OCH2O). 13 C-NMR (125MHz, CDCl3) δC ppm: 110,5 (C-1), 163,5 (C-2), 115,7 (C- 3), 135,0 (C-4), 122,5 (C-5), 147,4 (C-6), 36,4 (C-1'), 32,0 (C-2'), 29,8 (C- 3'), 29,6 (C-4', C-5'), 29,1 (C-6'), 29,5 (C-7', C-8'), 29,4 (C-9', C-10'), 31,7 (C-11'), 35,6 (C-12'), 136,8 (C-1''), 108,8 (C-2''), 147,4 (C-3''), 145,3 (C- 4''), 108,0 (C-5''), 121,0 (C-6''), 100,6 (OCH2O), 174,1 (COOH). Knepachycarpic acid B (MC2): Chất dạng sáp, không màu. HR-ESI-MS: m/z 397.2023 [M-H] - , công thức phân tử C24H30O5 (M 398). 1 H-NMR (500MHz, CDCl3) δH ppm: 6,86 (dd, J = 1,0, 8,0 Hz, H-3), 7,34 (t, J = 8,0 Hz, H-4), 6,76 (dd, J = 1,0, 8,0 Hz, H-5), 2,96 (t, J = 7,5 Hz, H- 1'), 1,53-1,60 (m, 4H, H-2', H-9'), 1,37-1,25 (m, 12H, H-3', H-4', H-5', H- 6', H-7', H-8'), 2,50 (t, J = 7,5, H-10'), 6,66 (d, J = 2,0 Hz, H-2''), 6,70 (d, J = 8,0 Hz, H-5''), 6,60 (dd, J = 2,0, 8,0 Hz, H-6''), 5,90 (s, OCH2O), 11,01 (s, OH). 13 C-NMR (125MHz, CDCl3) δC ppm: 110,6 (C-1), 163,6 (C-2), 115,8 (C- 3), 135,3 (C-4), 122,7 (C-5), 147,7 (C-6), 36,5 (C-1'), 32,0 (C-2'), 29,7 (C- 3'), 29,5 (C-4', C-8'), 29,1 (C-5'), 29,4 (C-6', C-7'), 31,7 (C-9'), 35,7 (C- 10'), 136,8 (C-1''), 108,8 (C-2''), 147,4 (C-3''), 145,3 (C-4''), 108,0 (C-5''), 121,0 (C-6''), 100,6 (OCH2O), 175,1 (COOH). Knepachycarpanol A (MC3): Chất dạng sáp, không màu. HR-ESI-MS: m/z 327.1956 [M+H] + , công thức phân tử C21H26O3 (M 326). 1 H-NMR (500MHz, CDCl3) δH ppm: 6,65 (br s, H-2), 6,64 (d, J = 8,0 Hz, H-4), 7,12 (t, J = 8,0 Hz, H-5), 6,72 (d, J = 8,0 Hz, H-6), 2,54 (t, J = 7,5 Hz, H-1'), 1,53-1,62 (m, 4H, H-2', H-7'), 1,29-1,25 (m, 8H, H-3', H-4', H- 5', H-6'), 2,50 (t, J = 7,5, H-8'), 6,68 (d, J = 1,5 Hz, H-2''), 6,71 (d, J = 8,0 Hz, H-5''), 6,61 (dd, J = 1,5, 8,0 Hz, H-6''), 5,90 (s, OCH2O). 11 13 C-NMR (125MHz, CDCl3) δC ppm: 144,8 (C-1), 115,3 (C-2), 155,6 (C- 3), 112,5 (C-4), 129,3 (C-5), 120,7 (C-6), 35,8 (C-1'), 31,0 (C-2'), 29,39 (C-3'), 29,37 (C-4'), 29,2 (C-5'), 29,1 (C-6'), 31,6 (C-7'), 35,6 (C-8'), 136,8 (C-1''), 108,8 (C-2''), 147,4 (C-3''), 145,3 (C-4''), 108,0 (C-5''), 121,0 (C- 6''), 100,6 (OCH2O). Knepachycarpanol B (MC4): Chất dạng sáp, không màu. HR-ESI-MS: m/z 355.2269 [M+H] + , công thức phân tử C23H30O3 (M 354). 1 H-NMR (500MHz, CDCl3) δH ppm: 6,64 (d, J = 1,0 Hz, H-2, H-6), 6,65 (d, J = 8,0 Hz, H-4), 7,12 (t, J = 8,0 Hz, H-5), 6,74 (d, J = 8,0 Hz, H-6), 2,54 (t, J = 8,0 Hz, H-1'), 1,54-1,61 (m, 4H, H-2', H-9'), 1,27-1,30 (m, 12H, H-3', H-4', H-5', H-6', H-7', H-8'), 2,51 (t, J = 8,0, H-10'), 6,66 (d, J = 1,5 Hz, H-2''), 6,71 (d, J = 8,0 Hz, H-5''), 6,61 (dd, J = 1,5, 8,0 Hz, H-6''), 5,90 (s, OCH2O). 13 C-NMR (125MHz, CDCl3) δC ppm: 144,9 (C-1), 115,3 (C-2), 155,4 (C- 3), 112,4 (C-4), 129,3 (C-5), 120,9 (C-6), 35,8 (C-1'), 31,2 (C-2'), 29,54 (C-3'), 29,53 (C-4'), 29,1 (C-5'), 29,2 (C-6'), 29,4 (C-7', C-8'), 31,7 (C-9'), 35,6 (C-10'), 136,8 (C-1''), 108,8 (C-2''), 147,4 (C-3''), 145,3 (C-4''), 108,0 (C-5''), 121,0 (C-6''), 100,6 (OCH2O). Knepachycarpasinol (MC5): Chất dạng sáp, không màu. HR-ESI-MS: m/z 371,2216 [M+H] + , công thức phân tử C23H30O4 (M 370). 1 H-NMR (500MHz, CDCl3) δH ppm: 6,23 (s, H-2, H-6), 6,16 (s, H-4), 2,47 (t, J = 7,5 Hz, H-1'), 1,55 (m, 4H, H-2', H-9'), 1,25-1,29 (m, 12H, H-3', H- 4', H-5', H-6', H-7', H-8'), 2,51 (t, J = 8,0, H-10'), 6,67 (br s, H-2''), 6,72 (d, J = 8,0 Hz, H-5''), 6,61 (d, J = 8,0 Hz, H-6''), 5,91 (s, OCH2O). 13 C-NMR (125MHz, CDCl3) δC ppm: 146,1 (C-1), 108,0 (C-2, C-6), 156,6 (C-3, C-5), 100,1 (C-4), 35,8 (C-1'), 31,0 (C-2'), 29,2 (C-3'), 29,49 (C-4'), 29,44 (C-5', C-6'), 29,5 (C-7'), 29,1 (C-8'), 31,7 (C-9'), 35,6 (C-10'), 136,8 (C-1''), 108,8 (C-2''), 147,4 (C-3''), 145,3 (C-4''), 108,0 (C-5''), 121,0 (C- 6''), 100,6 (OCH2O). Knepachycarpanone A (MC9): Chất dạng sáp, không màu. HR-ESI-MS: m/z 385.2008 [M+H] + , công thức phân tử C23H28O5 (M 384). 1 H-NMR (500MHz, CDCl3) δH ppm: 6,26 (d, J = 1,5 Hz, H-3), 6,25 (d, J = 1,5 Hz, H-5), 2,80 (t, J = 7,5 Hz, H-1'), 1,57 (m, 4H, H-2', H-7'), 1,29-1,35 12 (m, 8H, H-3', H-4', H-5', H-6'), 2,51 (t, J = 7,0, H-8'), 6,68 (d, J = 1,5 Hz, H-2''), 6,71 (d, J = 8,0 Hz, H-5''), 6,61 (d, J = 8,0 Hz, H-6''), 5,91 (s, OCH2O), 2,62 (CH3), 13,02 (OH). 13 C-NMR (125MHz, CDCl3) δC ppm: 115,1 (C-1), 165,9 (C-2), 101,6 (C- 3), 161,5 (C-4), 110,8 (C-5), 147,7 (C-6), 36,3 (C-1'), 32,19 (C-2'), 29,6 (C-3'), 29,3 (C-4', C-5'), 29,0 (C-6'), 31,6 (C-7'), 35,6 (C-8'), 136,7 (C-1''), 108,8 (C-2''), 147,4 (C-3''), 145,3 (C-4''), 108,0 (C-5''), 121,0 (C-6''), 100,6 (OCH2O), 204,2 (CO), 32,1 (CH3). Knepachycarpanone B (MC10): Chất dạng sáp, không màu. HR-ESI-MS: m/z 413.2302 [M+H] + , công thức phân tử C25H32O5 (M 412). 1 H-NMR (500MHz, CDCl3) δH ppm: 6,26 (d, J = 1,5 Hz, H-3), 6,25 (d, J = 1,5 Hz, H-5), 2,82 (t, J = 8,0 Hz, H-1'), 1,57 (m, 4H, H-2', H-9'), 1,27-1,36 (m, 12H, H-3', H-4', H-5', H-6', H-7', H-8'), 2,51 (t, J = 7,5, H-10'), 6,66 (d, J = 1,0 Hz, H-2''), 6,71 (d, J = 8,0 Hz, H-5''), 6,61 (d, J = 8,0 Hz, H-6''), 5,90 (s, OCH2O), 2,63 (CH3), 12,98 (OH). 13 C-NMR (125MHz, CDCl3) δC ppm: 115,2 (C-1), 166,0 (C-2), 101,6 (C- 3), 161,2 (C-4), 110,6 (C-5), 147,7 (C-6), 36,3 (C-1'), 32,2 (C-2'), 29,6 (C- 3'), 29,48 (C-4', C-5'), 29,43 (C-6'), 29,3 (C-7'), 29,1 (C-8'), 31,6 (C-9'), 35,6 (C-10'), 136,8 (C-1''), 108,8 (C-2''), 147,4 (C-3''), 145,3 (C-4''), 108,0 (C-5''), 121,0 (C-6''), 100,6 (OCH2O), 204,1 (CO), 32,1 (CH3). Knepachycarpanol C (MC11): Chất dạng sáp, không màu. HR-ESI-MS: m/z 417.2210 [M+Cl] - , công thức phân tử C25H34O3 (M 382). 1 H-NMR (500MHz, CDCl3) δH ppm: 6,65 (s, H-2), 6,64 (d, J = 8,0 Hz, H- 4), 7,12 (t, J = 8,0 Hz, H-5), 6,74 (d, J = 8,0 Hz, H-6), 2,54 (t, J = 7,5 Hz, H-1'), 1,56 (m, 4H, H-2', H-11'), 1,29-1,25 (m, 16H, H-3', H-4', H-5', H-6', H-7', H-8', H-9', H-10'), 2,51 (t, J = 8,0, H-12'), 6,66 (d, J = 1,5 Hz, H-2''), 6,72 (d, J = 8,0 Hz, H-5''), 6,61 (dd, J = 1,5, 8,0 Hz, H-6''), 5,90 (s, OCH2O). 13 C-NMR (125MHz, CDCl3) δC ppm: 144,9 (C-1), 115,3 (C-2), 155,5 (C- 3), 112,4 (C-4), 129,3 (C-5), 120,8 (C-6), 35,8 (C-1'), 31,2 (C-2'), 29,6 (C- 3', C-4', C-5'), 29,5 (C-6', C-7', C-8'), 29,2 (C-9'), 29,1 (C-10'), 31,7 (C- 11'), 35,6 (C-12'), 136,8 (C-1''), 108,8 (C-2''), 147,4 (C-3''), 145,3 (C-4''), 108,0 (C-5''), 121,0 (C-6''), 100,6 (OCH2O). 13 Chương 4. Kết quả và thảo luận Bảng 4.1. Kết quả phân tích GC-MS thành phần hóa học cặn hexane quả cây máu chó trái dày RT Hợp chất %TIC RT Hợp chất %TIC Axít mạch dài 7,7 44,90 Anacardic acid (C15:1) 5,4 28,23 Myristic acid 2,0 45,09 Anacardic acid (C15:1) (isomer) 5,0 32,13 Palmitic acid 0,9 45,12 Anacardic acid (C15:0) 5,0 35,10 Stearic acid 0,5 47,47 Anacardic acid (C17:1) 1,5 35,22 Oleic acid 4,3 47,68 Anacardic acid (C17:1) (isomer) 10,5 Cardanols 18,5 47,85 Anacardic acid (C17:1) (isomer) 10,0 36,39 Cardanol (C13:0) Tr, Acetophenones 5,9 39,40 Cardanol (C15:1) 2,4 45,69 Acetophenone (C15:1) 3,0 39,60 Cardanol (C15:1) (isomer) 2,9 45,88 Acetophenone (C15:1) (isomer) 1,5 39,70 Cardanol (C15:0) 1,6 48,31 Acetophenone (C17:1) 0,6 Cardanol (C17:1) 0,6 48,46 Acetophenone (C17:1) (isomer) 0,8 42,52 Cardanol (C17:1) (isomer) 4,8 Lignans 4,9 42,69 Cardanol (C17:1) (isomer) 6,1 48,98 Seasamin 0,7 Cardanol (C17:0) 50,07 Pluviatilol 0,8 45,38 Cardanol (C19:1) 0,1 50,26 Piperitol 2,1 Cardols 4,7 51,50 Pinoresinol 1,3 40,10 Cardol (C13:0) Tr, epi-Pinoresinol 42,92 Cardol (C15:1) 1,6 Hợp chất chưa xác định 8,9 3,00 Cardol (C15:0) 0,8 57,53 Hợp chất K1 0,1 45,38 Cardol (C17:1) 0,2 53,33 Hợp chất K2 2,8 45,52 Cardol (C17:1) (isomer) 2,1 45,32 Hợp chất K3 0,8 Anacardic acids 37,5 58,19 Hợp chất K4 3,9 42,26 Anacardic acid (C13:1) 0,1 50,74 Hợp chất K5 1,3 RT: Retention time: thời gian lưu, TIC: Total ion chromatogram: sắc ký ion tổng 14 4.1. Xác định cấu trúc của hợp chất phân lập được 4.1.1. Hợp chất MC1: Acid knepachycarpic A (chất mới) Hình 4.1. Cấu trúc hóa học của MC1 và hợp chất tham khảo Hợp chất MC1 được phân lập dưới dạng sáp, không màu. Công thức phân tử của MC1 được xác định là C26H34O5 dựa vào kết quả phổ khối lượng phân giải cao HR-ESI-MS xuất hiện pic ion giả phân tử tại m/z 425,2350 [M-H] - (tính toán lý thuyết cho công thức [C26H33O5] - : 425,2328). Phổ IR cho đỉnh hấp thụ carbonyl ở bước sóng 1646 cm-1. Phổ 1H-NMR của hợp chất MC1 xuất hiện tín hiệu của 6 proton vòng thơm, trong đó gồm tín hiệu của 2 hệ tương tác spin. Hệ tương tác spin thứ nhất gồm một tín hiệu triplet ở δH 7,33 với hằng số tương tác J = 8,0 Hz và hai tín hiệu doublet ở δH 6,84 (J = 8,0 Hz) và 6,75 (J = 8,0 Hz). Sự xuất hiện của một tín hiệu triplet và 2 doublet gợi ý cho cấu trúc hợp chất thế 1,2,6-phenyl. Dựa trên phổ 13C-NMR và phổ 2D-NMR như HSQC và HMBC cho phép xác định các tín hiệu carbon của vòng thơm tại δC 110,5 (C-1), 163,5 (C-2), 115,7 (C-3), 135,3 (C-4), 122,5 (C-5) và 147,4 (C-6). Trên phổ HMBC cho thấy tương tác giữa proton H-4 (δH 7,33) với 2 carbon C-2 (δC 163,5) và C-6 (δC 147,7); proton H-3 (δH 6,87) tương tác với C-1 (δC 110,5). Dữ liệu phổ NMR của vòng thơm cùng với tín hiệu nhóm carbonyl tại δC 174,1 gợi ý cho cấu trúc dẫn chất anacardic acid [17]. Hệ spin vòng thơm thứ 2 là hệ ABX (dẫn chất thế 1,3,4-phenyl) gồm các tín hiệu đặc trưng: một tín hiệu doublet ở δH 6,66 với hằng số tương tác nhỏ J = 1,0 Hz; hai tín hiệu doublet ở δH 6,71 (d, J = 8,0 Hz) và 6,61 (br d, 15 J = 8,0 Hz). Ngoài ra còn xuất hiện tín hiệu singlet của nhóm methylenedioxy ở δH 5,90 (2H, s). Dữ liệu phổ 13 C-NMR, phổ HSQC và HMBC cho phép xác định mảnh cấu trúc thế 1''-(3'',4''- dimethylenedioxyphenyl) với các tín hiệu carbon tại δC 136,8 (C-1''); 108,8 (C-2); 147,4 (C-3''); 145,3 (C-4''); 108,0 (C-5''); 121,0 (C-6'') và 100,6 (OCH2O) [17]. Trên phổ HMBC cho thấy tương tác của proton H-2'' (δH 6,66) với 2 carbon C-6'' (δC 121,0) và C-4'' (δC 145,3); tương tác của proton H-5'' (δH 6,71) với 2 carbon C-1'' (δC 136,8) và C-4'' (δC 145,3). Tương tác HMBC của proton nhóm methylene (δH 5,90) với 2 carbon bậc 4 liên kết với oxy C-3'' (δC 147.4) và C-4'' (δC 145.3) cho phép xác định vị trí của nhóm thế methylenedioxy tại vị trí 3'' và 4''. Bên cạnh các tín hiệu proton, carbon vòng thơm và nhóm methylendioxy, trên phổ NMR còn thấy xuất hiện nhiều tín hiệu nhóm methylene trong phân tử. Dữ liệu phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1 chiều và 2 chiều cho phép xác định cấu trúc của hợp chất MC1 được cấu tạo từ hai mảnh cấu trúc anacardic acid và 3'',4''-dimethylenedioxyphenyl liên kết với nhau qua mạch thẳng carbon bão hòa gồm nhiều nhóm methylene. Cấu trúc hợp chất MC1 và hợp chất kneglobularic acid B phân lập từ cây K.globularia có sự tương đồng, chỉ sai khác về số lượng nhóm methylene trong mạch liên kết. Số lượng nhóm methylene được xác định chính xác dựa trên phổ khối HR-MS và công thức phân tử C26H34O5. Hai mảnh cấu trúc anacardic acid và 1'',3'',4''-methylenedioxyphenyl có công thức C14H10O5 nên mạch carbon liên kết được xác định gồm 12 nhóm methylene (C12H24). Trên phổ HMBC cho thấy các tương tác giữa proton H-1' (δH 2,95) với C-1 (δC 110,5); C-5 (δC 122,5); C-6 (δC 147,4) và C-2' (δC 32,0); tương tác của proton H-12' (δH 2,50) với C-1'' (δC 136,8); C-2'' (δC 108,8); C-6'' 16 (δC 121,0) và C-11' (δC 31,7); cho phép xác định mạch carbon liên kết với các gốc phenyl ở vị trí C-6 và C1''. Kết hợp các dữ liệu phổ cho phép xác định cấu trúc của MC1 là 2- hydroxy-6-(12'-(3'',4''-methylendioxyphenyl)dodecyl)-benzoic acid. Tra cứu trên dữ liệu SciFinder, kết luận đây là một hợp chất mới và được đặt tên là knepachycarpic acid A. Cấu trúc của hợp chất knepachycarpic acid A được khẳng định thêm qua các dữ liệu GC/MS sau khi trimethylsilyl hóa. Hợp chất MC1 thu được trùng với hợp chất K1 trong phân tích GC/MS. Trên phổ MS xuất hiện tín hiệu m/z 570 của pic ion phân tử MC1-diTMS (C32H50O5Si2). Quá trình phân mảnh xảy ra ở các vị trí (1), (2), (3) và (4) như hình 4.10 cho các pic ion đặc trưng. Quá trình phân mảnh ở vị trí (1) khi hợp chất mất một nhóm methyl tạo ra pic ion [(M+2TMS)-15 (CH3)] + với tín hiệu m/z 555. Phân mảnh ở vị trí (2) khi phân tử mất một nhóm OTMS hình thành pic ion [(M+2TMS)-90(OTMS)] + xuất hiện ở m/z 480. Phân mảnh ở vị trí (3) xảy ra tại liên kết γ trên mạch dài nối với vòng phenolic tạo ra pic ion m/z 219 (C12H15O2Si), đặc trưng cho nhóm anacardic acid [28, 58]. Phân mảnh ở vị trí (4) xảy ra tại liên kết β trên mạch dài nối với vòng thơm chứa nhóm thế methylenedioxy tạo ra pic ion m/z 135 (C8H7O2). Đây là tín hiệu tương ứng với mảnh phân tử 3'',4''-methylenedioxybenzyl. Hình 4.2. Cơ chế phân mảnh của dẫn xuất MC1 di-trimethylsilyl 17 Bảng 4.2. Số liệu phổ NMR của hợp chất MC1 và hợp chất tham khảo C Kneglobularic acid B [17] MC1 δC d δH c δC b δH a 1 110,6 - 110,5 - 2 163,5 - 163,5 - 3 115,8 6,87, d (8,4) 115,7 6,84, d (8,0) 4 135,3 7,36, t (8,4) 135,0 7,33, t (8,0) 5 122,7 6,77, d (8,4) 122,5 6,75, d (8,0) 6 147,7 - 147,4 - 1' 36,4 2,98, t (8,0) 36,4 2,95, t (7,5) 2' 31,9 1,50-1,65, m 32,0 1,53-1,60, m 3' 29,7 1,20-1,42, m 1,20-1,42, m 1,20-1,42, m 1,20-1,42, m 29,8 1,29-1,25, m 1,29-1,25, m 1,29-1,25, m 1,29-1,25, m 1,29-1,25, m 1,29-1,25, m 1,29-1,25, m 1,29-1,25, m 4' 29,1 29,6 5' 29,4 29,6 6' 29,4 29,59 7' 31,7 1,53-1,60, m 29,55 8' 35,6 2,50, t (7,5) 29,47 9' - - 29,47 10' - - 29,1 11' - - 31,7 1,53-1,60, m 12' - - 35,6 2,50, t (7,5) 1'' 136,8 - 136,8 - 2'' 108,8 6,67, s 108,8 6,66, d (1,0) 3'' 147,4 - 147,4 - 4'' 145,3 - 145,3 - 5'' 108,0 6,71, d (8,0) 108,0 6,71, d (8,0) 6'' 121,0 6,61, d (8,0) 121,0 6,61 brd (8,0) OCH2O 100,6 5,91, s 100,6 5,90, s COOH 175,9 - 174,1 - a: 500MHz, CDCl3; b: 125MHz, CDCl3; c: 400MHz, CDCl3; d: 100MHz, CDCl3 Hình 4.3. Các tương tác HMBC quan trọng của hợp chất MC1 18 4.1.2. Các hợp chất phân lập từ loài máu chó trái dày Từ các bộ phận quả, thân cành và lá loài máu chó trái dày (Knema pachycarpa), sử dụng kết hợp các phương pháp sắc ký đã phân lập được 23 hợp chất, bao gồm 8 hợp chất phenylalkylphenol, 3 hợp chất lignan, 11 hợp chất flavonoids, 2 hợp chất terpene. Trong số đó có 8 chất mới (MC1, MC2, MC3, MC4, MC5, MC9, MC10, MC11), 11 hợp chất lần đầu phân lập từ chi Knema (MC6, MC7, MC8, MC12, MC13, MC15, MC17, MC18, MC21, MC22, MC23). 19 Hình 4.4. Các hợp chất phân lập được từ loài máuchó trái dày 20 4.1.2. Các hợp chất phân lập từ loài máu chó đá Hình 4.5. Các hợp chất phân lập được từ loài máu chó đá Từ loài máu chó đá (Knema saxatilis), sử dụng kết hợp các phương pháp sắc ký đã phân lập được 10 hợp chất, trong đó từ thân cành có 6 hợp chất bao gồm (MC14, MC16, MC19, MC24, MC25, MC26); từ lá có 4 hợp chất bao gồm (MC20, MC27, MC28, MC29). Trong số các hợp chất phân lập có 4 hợp chất flavonoid đã được phân lập từ lá loài Knema pachycarpa (MC14, MC16, MC19, MC20). Có 3 chất lần đầu tiên được phân lập từ chi Knema (MC24, MC28, MC29). 21 4.2. KẾT QUẢ THỬ HOẠT TÍNH SINH HỌC 4.2.1.Kết quả thử hoạt tính của các hợp chất phân lập từ loài máu chó trái dày Tám hợp chất mới thuộc nhóm phenylalkylphenol phân lập được đều thể hiện khả năng ức chế enzyme acetylcholinesterase mạnh với giá trị IC50 từ 0,72 μM đến 8,19 μM. Trong đó hợp chất MC10 thể hiện hoạt tính mạnh nhất với giá trị IC50 0,72 μM. Hợp chất MC10 cũng thể hiện hoạt tính tốt nhất trong các hợp chất mới được thử nghiệm hoạt tính gây độc tế bào, hợp chất này thể hiện hoạt tính trên cả 3 dòng trên dòng tế bào ung thư Hep3B, MCF-7, Hela với giá trị IC50 lần lượt 70,80 µM; 46,22 µM và 30,20 µM Bảng 4.3. Kết quả thử hoạt tính ức chế AChE Tên mẫu Giá trị IC50 (µM) Knepachycarpic acid A (MC1) 8,19 Knepachycarpic acid B (MC2) 3,89 Knepachycarpanol A (MC3) 2,60 Knepachycarpanol B (MC4) 7,09 Knepachycarpasinol (MC5) 2,46 Knepachycarpanone A (MC9) 1,74 Knepachycarpanone B (MC10) 0,72 Knepachycarpanol C (MC11) 3,35 Globulol (MC12) 23,06 Biochanin A (MC14) 73,07 5,7,3 ’ -Trihydroxy-5 ’ -methoxyl-isoflavone (MC15) NA Luteolin (MC16) NA Chrysoeriol (MC17) NA (+) - Catechin (MC19) NA Hydnocarpin D (MC22) NA Donepezil 0,12 NA (not active): không có tác dụng 22 Bảng 4.4. Kết quả thử độc tế bào của các hợp chất phenylalkylphenol Tên mẫu Giá trị IC50 (µM) Hela MCF-7 Hep3B Knepachycarpic acid A (MC1) 91,20 NA NA Knepachycarpic acid B (MC2) NA NA NA Knepachycarpanol A (MC3) 81,28 82,74 NA Knepachycarpanol B (MC4) 33,11 31,36 NA Knepachycarpasinol (MC5) 32,36 41,30 NA Knepachycarpanone A (MC9) 26,92 52,88 NA Knepachycarpanone B (MC10) 30,20 46,22 70,80 Knepachycarpanol C (MC11) NA NA NA Camptothecin 0,15 0,20 0,20 NA (not active): không có tác dụng 4.2.2. Kết quả thử hoạt tính của các hợp chất phân lập từ loài máu chó đá Các hợp chất thể hiện hoạt tính yếu trên các dòng tế bào ung thư được thử nghiệm. Bảng 4.3. Kết quả thử độc tế bào hợp chất phân lập cây máu chó đá Tên mẫu Giá trị IC50 (µM) Lu MCF-7 Eriodictyol (MC24) 159,7 218,4 Sulfuretin A (MC25) 237,0 355,5 Taxifolin (MC26) 65,8 NA Ellipticin 1,5 1,9 NA (not active): không có tác dụng. 23 KẾT LUẬN 1. Từ quả, thân cành và lá máu chó trái dày (K. pachycarpa) đã phân lập và xác định được cấu trúc hóa học của 23 hợp chất. Trong số các hợp chất phân lập được có:  8 hợp chất mới thuộc nhóm phenylalkylphenol: knepachycarpic acid A (MC1), knepachycarpic acid B (MC2), knepachycarpanol A (MC3), knepachycarpanol B (MC4), knepachycarpasinol (MC5), knepachycarpanone A (MC9), knepachycarpanone B (MC10), knepachycarpanol C (MC11).  11 hợp chất lần đầu tiên phân lập từ chi Knema: - 3 hợp chất lignan: (+)-Pinoresinol (MC6), (+)-epipinoresinol (MC7), Piperitol (MC8). - 6 hợp chất flavonoid: 5,7,3’-Trihydroxy-5’-methoxyl-isoflavone (MC15), Chrysoeriol (MC17), Naringenin (MC18), Kaempferol-3-O- rutinoside (MC21), hydnocarpin D (MC22), Hydnocarpin (MC23). - 2 hợp chất terpene: Globulol (MC12), Caryolol (MC13). 2. Từ thân cành và lá máu chó đá (K. saxatilis) đã phân lập và xác định được cấu trúc hóa học của 10 hợp chất, trong đó có:  3 hợp chất lần đầu tiên phân lập từ chi Knema: - 1 hợp chất flavonoid: Eriodictyol (MC24) - 1 hợp chất sesquiterpene: Clovan-2β,9α-diol (MC28) - 1 hợp chất lignan: (+)-Isolariciresinol (MC29) 3. Lần đầu tiên nghiên cứu hoạt tính ức chế enzyme acetylcholinesterase của các chất phân lập được. Kết quả cho thấy các hợp chất nhóm phenylalkylphenol thể hiện hoạt tính tốt với giá trị IC50 từ 0,72 μM đến 8,19 μM, trong đó h