Tóm tắt Luận án Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học một số loài thuôc chi chòi mòi (antidesma) ở Việt Nam

iện phổ của các hợp chất phân lập từ loài A. ghaesembilla Phần này trình bày thông số vật lý và dữ kiện phổ của 14 hợp chất phân lập được từ loài A. ghaesembilla. 2.5. Kết quả thử hoạt tính của các hợp chất phân lập được 2.5.1. Kết quả thử hoạt tính gây độc tế bào ung thư của các hợp chất phân lập từ loài A. acidum - 12 hợp chất (AC1-AC12) được đánh giá hoạt tính gây độc tế bào ung thư HL-60 theo phương pháp thử hoạt tính gây độc tế bào MTT. Bảng 2.1. % ức chế dòng tế bào HL-60 của các hợp chất AC1-AC12 tại nồng độ 100 µM Hợp chất Tỷ lệ ức chế (%) Hợp chất Tỷ lệ ức chế (%) AC1 95,18 ± 0,55 AC7 95,22 ± 0,20 AC2 42,10 ± 2,68 AC8 95,29 ± 0,53 AC3 93,95 ± 0,74 AC9 47,30 ± 3,20 AC4 95,00 ± 0,46 AC10 95,55 ± 0,12 AC5 94,99 ± 0,98 AC11 48,93 ± 4,44 AC6 95,51 ± 0,11 AC12 36,17 ± 3,96 6 Bảng 2.2. Kết quả đánh giá hoạt tính gây độc dòng tế bào HL-60 và dòng tế bào HEL-299 theo nồng độ của các hợp chất AC1, AC3-AC8 và AC10 Hợp chất IC50 (µM) Hợp chất IC50 (µM) HL-60 HEL-299 HL-60 HEL-299 AC1 4,8 ± 0,2 >100 AC6 22,5 ± 0,9 >100 AC3 26,4 ± 0,6 >100 AC7 28,1 ± 0,2 >100 AC4 8,0 ± 0,9 >100 AC8 25,4 ± 0,8 >100 AC5 24,8 ± 0,7 >100 AC10 44,7 ± 3,3 >100 ĐC* 6,8 ± 0,9 >100 *ĐC: Mitoxantrone được sử dụng là chất đối chứng dương. 2.5.2. Kết quả thử hoạt tính kháng viêm của các hợp chất phân lập được từ loài A. hainanensis - Kết quả sàng lọc hoạt tính kháng viêm thông qua ức chế sự sản sinh NO trên dòng tế bào BV-2 được kích thích bởi LPS của 18 hợp chất (AH1-AH18). Bảng 2.3. % Ức chế sự sản sinh ra NO trong tế bào BV2 được kích thích bởi LPS của các hợp chất AH1-AH18 tại nồng độ 80 µM Hợp chất Tỷ lệ ức chế (%) Hợp chất Tỷ lệ ức chế (%) Hợp chất Tỷ lệ ức chế (%) AH1 90,1 ± 5,0 AH7 92,0 ± 4,1 AH13 62,2 ± 3,7 AH2 79,8 ± 4,6 AH8 96,7 ± 3,7 AH14 89,6 ± 6,7 AH3 83,2 ± 6,3 AH9 26,2 ± 4,3 AH15 95,3 ± 3,8 AH4 73,1 ± 5,3 AH10 41,8 ± 6,6 AH16 35,4 ± 3,6 AH5 86,5 ± 5,2 AH11 33,7 ± 5,8 AH17 24,0 ± 4,9 AH6 47,4 ± 7,5 AH12 38,7 ± 6,2 AH18 87,5 ± 4,1 ĐC* 85,0 ± 5,1 *ĐC: Butein (10 µM) được sử dụng là chất đối chứng dương. 7 Bảng 2.4. Kết quả đánh giá hoạt tính ức chế sự sản sinh ra NO trong tế bào BV2 được kích thích bởi LPS của các hợp chất AH1-AH5, AH7, AH8, AH13-AH15 và AH18 Hợp chất IC50 (µM) Hợp chất IC50 (µM) AH1 10,8 ± 1,1 AH8 5,3 ± 0,4 AH2 15,1 ± 1,2 AH13 48,2 ± 6,8 AH3 21,2 ± 3,1 AH14 8,6 ± 1,1 AH4 67,9 ± 26,0 AH15 5,0 ± 0,2 AH5 19,0 ± 0,9 AH18 7,4 ± 1,8 AH7 26,3 ± 1,3 ĐC* 3,8 ± 0,6 *ĐC: Butein được sử dụng là chất đối chứng dương. 2.5.3. Kết quả thử hoạt tính kháng viêm của các hợp chất phân lập được từ loài A. ghaesembilla - Kết quả sàng lọc hoạt tính kháng viêm thông qua ức chế sự sản sinh NO trên dòng tế bào BV-2 được kích thích bởi LPS của 14 hợp chất (AG1-AG14). Bảng 2.5. % Ức chế sự sản sinh ra NO trong tế bào BV2 được kích thích bởi LPS của các hợp chất AG1-AG14 tại nồng độ 80 µM Hợp chất Tỷ lệ ức chế (%) Hợp chất Tỷ lệ ức chế (%) Hợp chất Tỷ lệ ức chế (%) AG1 79,0 ± 5,6 AG6 62,4 ± 5,5 AG11 56,0 ± 6,3 AG2 96,0 ± 5,0 AG7 74,3 ± 5,7 AG12 95,0 ± 5,1 AG3 83,3 ± 4,6 AG8 105,0 ± 2,6 AG13 64,7 ± 4,9 AG4 77,2 ± 5,1 AG9 66,3 ± 4,0 AG14 40,1 ± 4,3 AG5 81,2 ± 4,4 AG10 68,3 ± 4,0 ĐC* 85,0 ± 5,1 *ĐC: Butein (10 µM) được sử dụng là chất đối chứng dương. 8 Bảng 2.6. Kết quả đánh giá hoạt tính ức chế sự sản sinh ra NO trong tế bào BV2 được kích thích bởi LPS của các hợp chất AG1-AG13 Hợp chất IC50 (µM) Hợp chất IC50 (µM) AG1 37,3 ± 8,7 AG8 5,4 ± 0,6 AG2 23,8 ± 3,1 AG9 48,3 ± 7,3 AG3 36,3 ± 3,8 AG10 50,2 ± 5,4 AG4 9,5 ± 1,3 AG11 72,7 ± 20,9 AG5 32,4 ± 9,9 AG12 21,4 ± 4,4 AG6 62,4 ± 11,2 AG13 44,3 ± 8,9 AG7 56,6 ± 5,7 ĐC* 3,8 ± 0,6 *ĐC: Butein được sử dụng là chất đối chứng dương. CHƯƠNG 3. THẢO LUẬN KẾT QUẢ 3.1. Xác định cấu trúc hóa học các hợp chất phân lập từ loài A. hainanensis Phần này trình bày kết quả phân tích phổ và xác định cấu trúc của 18 hợp chất được phân lập từ loài A. hainanensis. AH1: (7S,7'R,8S,8'R) -3,3'-Dimethoxy- 7,7'-epoxylignan-4,4',9-triol 4-O-β-D- glucopyranoside (hợp chất mới) AH2: 9-O-formylaviculin (hợp chất mới) 9 AH3: (+)-Isolariciresinol 9-O-β-D- glucopyranoside AH4: (–)-Lyoniresinol AH5: (+)-Lyoniresinol-9-O-β-D- glucopyranoside AH6: 1-O-(2,4-dihydroxy-6- methoxyphenyl)-6-O-(4-hydroxy-3,5- dimethoxybenzoyl)-β-D-glucopyranoside AH7: 4-O-[6-O-(4-hydroxy-3,5- dimethoxybenzoyl)-β-D-glucopyranosyl]- 3-hydroxyphenethyl alcohol AH8: 4-Hydroxymethyl-2-methoxyphenyl- 6-O-syringoyl-β-D-glucopyranoside AH9: Phenethyl α-L-arabinofuranosyl- (1→6)-O-β-D-glucopyranoside AH10: Syringoyl-O-β-D-glucopyranoside AH11: β-D-Glucopyranosyl phaseate AH12: Ampelopsisionoside 10 AH13: Alangioside A AH14: Alangionoside L AH15: Megastigm-7-ene-3-ol-9-one 3-O- α-L-arabinofuranosyl-(1→6)-O-β-D- glucopyranoside AH16: N–trans-feruloyloctopamide AH17: trans-Linalool-3,6-oxide 7-O-β-D- glucopyranoside AH18: Lotusanine B Dưới đây trình bày chi tiết phương pháp xác định cấu trúc của một hợp chất mới. 3.1.1. Hợp chất AH1 : (7S,7'R,8S,8'R) -3,3'-Dimethoxy-7,7'- epoxylignan-4,4',9-triol 4-O-β-D-glucopyranoside (hợp chất mới) Hợp chất AH1 thu được dưới dạng chất bột, màu vàng nhạt. Công thức phân tử của AH1 được xác định là C26H34O11 bởi sự xuất hiện của píc ion giả phân tử [M+Na]+ tại m/z 545,1995 trên phổ lượng khối phân giải cao HR-ESI-MS (tính toán lý thuyết cho công thức [C26H34O11Na]+: 545,1993). Phổ 1H-NMR của AH1 xuất hiện tín hiệu của sáu proton thơm thuộc hai hệ tương tác spin-spin ABX tại H 6,84 (1H, d, J = 8,5 Hz), 6,97 (1H, dd, J = 1,5, 8,5 Hz), 6,99 (1H, dd, J = 1,5, 8,5 Hz), 7,08 (1H, d, J = 1,5 Hz), 7,10 (1H, d, J = 1,5 Hz) và 7,18 (1H, d, J = 8,5 Hz); hai 11 proton thuộc hai nhóm oxymethine tại δH 4,40 (1H, d, J = 9,0 Hz), 5,20 (1H, d, J = 8,5 Hz); một proton anome của một đơn vị đường tại δH 4,92 (1H, d, J = 7,5 Hz); hai nhóm methoxy tại δH 3,88 (3H, s), 3,91 (3H, s) và một nhóm methyl tại δH 1,14 (3H, d, J = 6,5 Hz). Hình 3.1. Phổ HR-ESI-MS của AH1 Hình 3.2. Phổ 1H-NMR của AH1 Phổ 13C-NMR và DEPT của AH1 xuất hiện tín hiệu 26 carbon, bao gồm: sáu carbon không liên kết trực tiếp với hydro, 15 nhóm methine, hai nhóm methylene và ba nhóm methyl. Sự có mặt của proton anome tại δH 4,92 (1H, d, J = 7,5 Hz) và sáu carbon đặc trưng của đơn vị đường glucopyranose tại C 62,5 (CH2), 71,4 9 (CH), 74,9 (CH), 77,8 (CH), 78,2 (CH), 102,8 (CH) cho phép dự đoán sự có mặt của một phần đường β- glucopranose. Bên cạnh đó các số liệu phổ 1D-NMR, cùng với sự có mặt của hai nhóm oxymethine tại C-7 (δC 82,6), C-7 (δC 89,3) và số liên kết đôi tương đương của AH1 tính được là 10, có thể dự đoán hợp chất AH1 là tetrahydrofuran lignan glycoside [Phytochemistry, 55, 843 (2000)]. Hình 3.3. Phổ 13C-NMR của AH1 Hình 3.4. Phổ DEPT của AH1 12 Phân tích các tương tác trên phổ HSQC cho phép gán tín hiệu của proton liên kết trực tiếp với carbon. Trên phổ 1H-1H COSY, nhận thấy có tương tác giữa H-7 (δH 5,20) với H-8 (δH 2,40); H-8 (δH 2,40) với H-9 (δH 3,29, 3,21)/H-8 (δH 2,08); tương tác giữa H-7 (δH 4,40) với H-8 (δH 2,08) và H-8 (δH 2,08) với H-9 (δH 1,14)/H-8 (δH 2,40) cho phép gắn kết mảnh cấu trúc C-7/C-8/C-9; C-7/C-8/C-9; và sự liên kết giữa hai mảnh cấu trúc này tại C-8/C-8′, góp phần khẳng định AH1 là tetrahydrofuran lignan. Trên phổ HMBC nhận thấy có tương tác giữa H-7 (δH 5,20) với C-1 (δC 135,8)/ C-2 (δC 112,7)/ C-6 (δC 120,7), cho phép xác định giá trị độ dịch chuyển hóa học của C-1, C-2 và C-6. Tương tác HMBC giữa H-2 (δH 7,08) và H-6 (δH 6,99) với C-4 (δC 147,2)/ C-7 (δC 82,6) và giữa H-5 (δH 7,18) với C-1 (δC 135,8)/ C-3 (δC 150,4) cho phép xác định giá trị độ chuyển dịch hóa học của các carbon còn lại (C-3, C-4, C-5) thuộc vòng thơm thứ nhất, gắn với C-7. Tương tự, vị trí và giá trị độ chuyển dịch hóa học của các carbon/proton thuộc vòng thơm còn lại tại C-7 được xác định dựa vào các tương tác HMBC giữa H-7 (δH 4,40) với C-1 (δC 133,0)/ C-2 (δC 111,7)/ C-6 (δC 120,7), giữa H-2 (δH 7,10)/ H-6 (δH 6,97) với C-4 (δC 147,6)/ C-7 (δC 89,3) và giữa H-5 (δH 6,84) với C-1 (δC 133,0)/ C-3 (δC 149,1). Vị trí của các nhóm methoxy và glucopyranose lần lượt tại C-3 và C- 4 được xác định dựa vào tương tác HMBC giữa proton của nhóm 3-OCH3 (δH 3,88) với C-3 (δC 150,4) và giữa proton anome H-1 (δH 4,92) với C- 4 (δC 147,2). Vị trí của nhóm methoxy và nhóm hydroxy lần lượt tại C-3, C-4 được xác định dựa vào tương tác HMBC giữa proton của nhóm 3- OCH3 (δH 3,91) với C-3 (δC 149,1) và độ dịch chuyển hóa học của C-4 (δC 147,6). Vị trí của nhóm hydroxy tự do gắn vào C-9 được xác định dựa vào giá trị độ chuyển dịch hóa học của C-9 (δC 63,6) và tương tác HMBC giữa H-9 (δH 3,21, 3,29) với C-7 (δC 82,6)/ C-8 (δC 54,4)/ C-8 (δC 46,2). Ngoài ra, kết quả thủy phân AH1 trong môi trường acid thu được đường D-glucose (so sánh với đường chuẩn bằng GC) [Chem. Pharm. Bull., 57, 986 (2009)] khẳng định phần đường là D-glucose. 13 Hình 3.8. Các tương tác 1H-1H COSY, HMBC và NOESY chính của AH1 max (mdeg): 238 (+ 0,28) và 223 (-0,36) AH1 λmax (Δε): 236 (+1,60) và 219 (−0,23) Schisphenlignan G (AH1a) Hình 3.9. Cấu trúc và giá trị phổ CD của AH1 và hợp chất tham khảo Cấu hình tuyệt đối của AH1 được xác định dựa trên phân tích các phổ NOESY và CD. Trên phổ NOESY xuất hiện tương tác H-7 (δH 5,20)/ H-8 (δH 2,40)/ H-9 (δH 1,14)/ H-7 (δH 4,40) gợi ý các proton này nằm gần nhau và giả định chúng đều định hướng β. Hơn nữa, trên phổ CD của AH1 có hiệu ứng Cotton dương tại bước sóng 238 (+ 0,28 mdeg) và Cotton âm tại bước sóng 223 (-0,36 mdeg), khá phù hợp với các hiệu ứng Cotton của hợp chất schisphenlignan G (AH1a) tại λmax (Δε): 236 (+1,60) và 219 (−0,23) [Fitoterapia, 86, 171 (2013)] cho phép xác định cấu hình tuyệt đối của AH1 giống với AH1a là 7S,7R,8S,8R. Ngoài ra, cấu hình tuyệt đối tại vị trí C-7/C-7 của hợp chất AH1 còn được xác định dựa vào quy tắc phản xạ bất đối dương (positive exciton chirality) của các hợp chất có cấu trúc hóa học tương tự hợp chất AH1 đã được công bố [J. Nat. Prod. 74, 1444 (2011)]. Từ những phân tích trên, hợp chất AH1 được xác định là (7S,7R,8S,8R)-3,3- dimethoxy-7,7-epoxylignan-4,4,9-triol 14 4-O-β-D-glucopyranoside. Tra cứu trên cơ sở dữ liệu Scifinder cho phép kết luận đây là hợp chất mới. Bảng 3.1. Số liệu phổ NMR của hợp chất AH1 C δCa DEPT δHa (độ bội, J, Hz) 1 135,8 C - 2 112,7 CH 7,08 (d, 1,5) 3 150,4 C - 4 147,2 C - 5 117,4 CH 7,18 (d, 8,5) 6 120,7 CH 6,99 (dd, 1,5, 8,5) 7 82,6 CH 5,20 (d, 8,5) 8 54,4 CH 2,40 (m) 9 63,6 CH2 3,29 (dd, 7,5, 10,5) 3,21 (dd, 6,5, 10,5) 1 133,0 C - 2 111,7 CH 7,10 (d, 1,5) 3 149,1 C - 4 147,6 C - 5 116,2 CH 6,84 (d, 8,5) 6 120,7 CH 6,97 (dd, 1,5, 8,5) 7 89,3 CH 4,40 (d, 9,0) 8 46,2 CH 2,08 (m) 9 16,6 CH3 1,14 (d, 6,5) 3-OCH3 56,7 CH3 3,88 (s) 3-OCH3 56,5 CH3 3,91 (s) 4-OGlc 1 102,8 CH 4,92 (d, 7,5) 2 74,9 CH 3,53 (dd, 7,5, 9,0) 3 77,8 CH 3,49 (dd, 9,0, 9,0) 4 71,4 CH 3,42* 5 78,2 CH 3,42* 6 62,5 CH2 3,71 (dd, 5,0, 12,0) 3,90* a)đo trong CD3OD; *) tín hiệu bị che khuất. 15 3.2. Xác định cấu trúc các hợp chất phân lập từ loài A. acidum Phần này trình bày kết quả phân tích phổ và xác định cấu trúc của 12 hợp chất được phân lập từ loài A. acidum. AC1: Clauszoline B AC2: Clauszoline H AC3: Mukonal AC4: 7-Methoxymukonal AC5: Heptaphyline AC6: 5-Demethyltoddaculin AC7: Xanthoxyletin AC8: Alloxanthoxyletin AC9: (E)-p-Propenylphenol O-β-D-glucopyranoside AC10: p-Methoxycinnamaldehyde AC11: trans-4- Methoxycinnamyl alcohol AC12: Vanilin Dưới đây trình bày chi tiết phương pháp xác định cấu trúc của một hợp chất có hoạt tính mạnh. 3.2.1. Hợp chất AC1 : Clauszoline B Hợp chất AC1 thu được dưới dạng chất bột, màu vàng. Trên phổ 1H- NMR của AC1 cho thấy sự xuất hiện các tín hiệu của sáu proton thuộc hai nhóm methyl tại H 1,51 (6H, s); bốn proton thơm tại H 6,85 (1H, s), 6,92 (1H, d, J = 7,5 Hz), 7,45 (1H, d, J = 7,5 Hz), 8,09 (1H, s); hai proton 16 olefin tại H 5,63 (1H, d, J = 10,0 Hz), 6,48 (1H, d, 10,0 Hz) cho phép dự đoán có mặt một liên kết CH=CH cấu hình Z, một proton tại H 8,37 (1H, s) gọi ý sự có mặt của một nhóm NH và một proton tại H 9,91 (1H, s) gợi ý sự có mặt của nhóm aldehyde. Trên phổ 13C-NMR, DEPT của AC1 cho thấy tín hiệu của 17 carbon. Trong đó, có hai nhóm methyl tại C 28,2; sáu nhóm methine tại C 97,1, 111,7, 119,6, 122,7, 127,4, 129,4; tám carbon không liên kết trực tiếp với hydro tại C 115,6, 118,1, 118,4, 124,9, 129,3, 138,2, 145,8, 161,3; một nhóm aldehyde tại C 195,2. Trên phổ HMBC cho thấy có các tương tác giữa H-5 (H 7,45) với C- 4a (C 118,4)/ C-7 (C 118,1)/ C-8a (C 129,3); giữa H-6 (H 6,92) với C- 5a (C 124,9)/ C-8 (C 138,2) xác định vị trí và giá trị độ chuyển dịch hóa học của các carbon thuộc vòng thơm thứ nhất. Tương tự, vị trí và giá trị độ chuyển dịch hóa học của các carbon thuộc vòng thơm còn lại được xác định dựa vào tương tác HMBC giữa H-1 (H 6,85) với C-3 (C 115,6)/ C- 4a (C 118,4) và giữa H-4 (H 8,09) với C-1a (C 145,8)/ C-2 (C 161,3). Tương tác HMBC giữa H-4 (H 8,09) với C-5a (C 124,9), giữa H-5 (H 7,45) và proton của nhóm NH (H 8,37) với C-4a (C 118,4) cùng với giá trị độ dịch chuyển hóa học của C-1a (C 145,8) và C-8a (C 129,3) gợi ý hai vòng thơm gắn kết với nhau qua cầu C-4a/C-5a và tại C-1a/C-8a qua cầu nitơ. Cấu trúc khung của AC1 được dự đoán là một carbazole alkaloid. Vị trí của nhóm hydroxy tại C-2 và nhóm aldehyde tại C-3 lần lượt được xác định dựa vào giá trị độ chuyển dịch hóa học của C-2 (C 161,3) và tương tác HMBC giữa proton của nhóm aldehyde (H 9,91) với C-2 (C 161,3)/ C-3 (C 115,6)/ C-4 (C 127,4). Bên cạnh đó, các tương tác HMBC giữa H-1 (H 6,48)/ H-2 (H 5,63) với C-3 (C 77,2) và tương tác giữa H-4/H-5 (H 1,51) với C-2 (C 129,4)/ C-3 (C 77,2) gợi ý sự có mặt của nhóm isoprenyl với liên kết đôi tại C-1/C-2. Tương tác HMBC giữa H-1 (H 6,48)/ H-2 (H 5,63) với C-7 (C 118,1) và giá trị độ dịch chuyển hóa học tại C-8 (C 138,2) gợi ý nhóm isoprenyl liên kết với khung carbazole tại C-1/C-7 và C-3/C-8 thông qua cầu oxy. 17 Bảng 3.20. Số liệu phổ NMR của hợp chất AC1 và hợp chất tham khảo C δC# δCa DEPT δHa (độ bội, J, Hz) 1 96,72 97,1 CH 6,85 (s) 1a 146,58 145,8 C - 2 160,73 161,3 C - 3 115,47 115,6 C - 4 127,68 127,4 CH 8,09 (s) 4a 118,04 118,4 C - 5 111,81 111,7 CH 7,45 (d, 7,5) 5a 125,13 124,9 C - 6 119,21 119,6 CH 6,92 (d, 7,5) 7 118,04 118,1 C - 8 138,23 138,2 C - 8a 129,77 129,3 C - 1′ 122,63 122,7 CH 6,48 (d, 10,0) 2′ 129,35 129,4 CH 5,63 (d, 10,0) 3′ 76,69 77,2* C - 4′ 27,28 28,2 CH3 1,51 (s) 5′ 27,28 28,2 CH3 1,51 (s) 3-CHO 195,76 195,2 CH 9,91 (s) a) đo trong CDCl3; #)C của hợp chất clauszoline B đo trong acetone-d6 [ Chem. Eur. J., 20, 8536 (2014)]. *) Tín hiệu chị che khuất. Hình 3.41. Cấu trúc hóa học và các tương tác HMBC chính của hợp chất AC1 18 So sánh số liệu phổ 13C-NMR của hợp chất AC1 với clauszoline B [Chem. Eur. J., 20, 8536 (2014)] cho thấy số liệu phù hợp cho tất cả các vị trí. Cho phép khẳng định AC1 là clauszoline B. Bên cạnh đó, trên phổ khối lượng ESI-MS xuất hiện píc ion giả phân tử [M+H]+ tại m/z 294, hoàn toàn phù hợp với công thức phân tử: C18H15 O3N (M = 293), điều này càng minh chứng cho kết luận ở trên. Hợp chất clauszoline B được phân lập lần đầu tiên từ loài Clausena excavata [Chem. Pharm. Bull., 44, 2231 (1996)]. Tuy nhiên, đây là lần đầu tiên hợp chất clauszoline B được phân lập từ chi Antidesma. 3.3. Xác định cấu trúc các hợp chất phân lập từ loài A. ghaesembilla Phần này trình bày kết quả phân tích phổ và xác định cấu trúc của 14 hợp chất được phân lập từ loài A. ghaesembilla. AG1: Antidesoic acid A (hợp chất mới) AG2: Antidesoic acid B (hợp chất mới) AG3: Vitexin AG4: Orientin AG5: Isovitexin AG6: Homoorientin AG7: Luteolin-4′-O-β-D-glucopyranoside AG8: Amentoflavone 19 AG9: Vanillyl alcohol 4-O- β-D-glucopyranoside AG10: 4-Hydroxy-3,5- dimethoxybenzyl-O-β-D- glucopyranoside AG11: 3-Hydroxy-4,5- dimethoxyphenyl-O-β-D- glucopyranoside AG12: 3,4,5- Trimethoxyphenyl-O-β-D- glucopyranoside AG13: Sinapyl alcohol 4- O-β-D-glucopyranoside AG14: (–)-Syringaresinol 3.4. Hoạt tính sinh học của các hợp chất phân lập được 3.4.1. Hoạt tính gây độc tế bào của các hợp chất phân lập từ loài A. acidum Mười hai hợp chất (AC1-AC12) phân lập được từ loài A. acidum được đánh giá hoạt tính gây độc tế bào ung thư máu cấp (HL-60) (Bảng 2.1. và 2.2.). Kết quả cho thấy hợp chất AC1 thể hiện hoạt tính mạnh nhất với giá trị IC50 là 4,8 µM (tương đương với chất đối chứng dương mitoxantrone, IC50 là 6,8 µM). Các hợp chất AC3-AC8, AC10 thể hiện hoạt tính yếu hơn với giá trị IC50 trong khoảng 8,0 µM đến 44,7 µM. Bên cạnh đó, các hợp chất này đều được kiểm tra khả năng gây độc trên dòng tế bào mô phổi thường HEL-299 (Bảng 2.2.). Kết quả cho thấy, các hợp chất này đều ảnh hưởng đến sự phát triển bình thường đối với dòng tế bào thử nghiệm (HEL-299) với giá trị IC50 >100 µM. Hợp chất AC1 có hoạt tính mạnh nhất được lựa chọn để nghiên cứu cơ chế gây chết tế bào. Tế bào ung thư HL-60 được xử lý với hợp chất AC1 (4,8 µM) trong 24 giờ và 48 giờ. Kết quả cho thấy ở mẫu được xử lý với AC1 trong 24 giờ đã xuất hiện các biểu hiện đặc trưng về hình thái nhân tế bào chết theo chương trình như sự co lại và phát sáng khi nhuộm với thuốc thử Hoechst 33342, sự gia tăng các tế bào siêu lưỡng bội ở giai 20 đoạn sub-G1. Các thể đặc trưng này xuất hiện nhiều hơn ở mẫu thử được xử lý với hợp chất AC1 trong 48 giờ. Một số protein đặc trưng cho quá trình tế bào chết theo chương trình như: Bcl-2, Bax, Caspase-3, Caspase-9, PARP Ở cấp độ protein, khi xử lý với hợp chất AC1 (4,8 µM) trong 24 giờ và 48 giờ, chúng tôi quan sát thấy sự thay đổi trong biểu hiện của các protein liên quan đến quá trình tự chết của tế bào như: tăng cường biểu hiện của Bax, Caspase-3 và PARP, giảm độ biểu hiện của Bcl-2. Những kết quả này cho thấy hợp chất AC1 gây nên quá trình chết theo chương trình của tế bào thông qua làm thay đổi mức độ biểu hiện của các protein liên quan trong tế bào ung thư HL-60 (tăng biểu hiện của Bax, Caspase-3, PARP và giảm biểu hiện Bcl-2). Con đường tín hiệu PI3K/AKT điều hòa sự sống, tăng trưởng và quá trình chết của tế bào. Đặc biệt, AKT dạng hoạt hóa tham gia vào quá trình sống và tăng trưởng của tế bào ung thư thông qua protein c-myc, một loại protein thường biểu hiện mạnh ở nhiều dạng khối u. Nhằm tìm hiểu xem con đường tín hiệu nội bào nào bị ảnh hưởng bởi AC1, chúng tôi phân tích quá trình photphorin hóa của AKT và độ biểu hiện của c-myc bằng thí nghiệm Western-blot. Kết quả cho thấy, sau khi xử lý với hợp chất AC1, quá trình photphorin hóa của AKT bị giảm đi, dẫn đến các tế bào tự chết. Hơn nữa, mức độ biểu hiện của c-myc cũng đồng thời thấp hơn. Đây là những bằng chứng cho thấy tác dụng làm các tế bào chết theo chương trình của hợp chất AC1 là thông qua sự giảm mức độ biểu hiện của p-AKT và c-myc. 3.4.2. Hoạt tính kháng viêm của các hợp chất phân lập từ loài A. hainanensis Trong các hợp chất phân lập được từ loài A. hainanensis, các hợp chất AH8, AH14, AH15 và AH18 gây ức chế sự sản sinh NO trong tế bào BV2 mạnh với giá trị IC50 lần lượt là 5,3, 8,6, 5,0 và 7,4 µM so với chất đối chứng dương (butein, IC50 = 3,8 µM). Các hợp chất AH1-AH3, AH5 và AH7 thể hiện hoạt tính yếu hơn với các giá trị IC50 từ 10,8 đến 26,3 µM. Trong các hợp chất phân lập được từ loài A. hainanensis, các hợp chất lignan glycoside (AH1-AH3, AH5) có hoạt tính ức chế sự sản sinh NO tốt hơn so với hợp chất lignan không có phần glycoside (AH4). Bên cạnh đó, 21 các hợp chất megastigmane có nhóm carbonyl tại C-9 (AH14, AH15) thể hiện hoạt tính mạnh hơn hẳn so với các hợp chất megastigmane không có nhóm carbonyl tại C-9 (AH11-AH13). Như vậy trong các hợp chất phân lập được, đối với các hợp chất ligan sự có mặt của phần đường và nhóm carbonyl tại C-9 của các hợp chất dạng khung megastigmane làm tăng hoạt tính ức chế sự sản sinh NO trong tế bào BV2. 3.4.3. Hoạt tính kháng viêm của các hợp chất phân lập từ loài A. ghaesembilla Kết quả đánh giá hoạt tính kháng viêm thông qua ức chế sự sản sinh NO trong tế bào BV2 được kích thích bởi LPS của 14 hợp chất (AG1- AG13) cho thấy, các hợp chất AG4 và AG8 thể hiện hoạt tính mạnh với giá trị IC50 lần lượt là 9,5 và 5,4 µM so với chất đối chứng dương (butein, IC50 = 3,8 µM). Ngoài trừ hợp chất AG14 không thể hiện hoạt tính, 11 hợp chất còn lại (AG1-AG3, AG5-AG7, AG9-AG13) có hoạt tính ở mức trung bình với giá trị IC50 trong khoảng 21,4 µM đến 72,7 µM. KẾT LUẬN Đây là công trình nghiên cứu đầu tiên về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của ba loài A. hainanensis, A. acidum và A. ghaesembilla ở Việt Nam. 1. Nghiên cứu về thành phần hóa học Sử dụng kết hợp các phương pháp sắc ký và các phương pháp phổ hiện đại đã phân lập và xác định cấu trúc 44 hợp chất từ các loài A. hainanensis, A. acidum, A. ghaesembilla. Cụ thể: - Từ loài A. hainanensis đã phân lập và xác định cấu trúc 18 hợp chất. Trong đó, có hai hợp chất mới là (7S,7R,8S,8R)-3,3- dimethoxy- 7,7-epoxylignan-4,4,9-triol 4-O-β-D-glucopyranoside (AH1) và 9-O- formylaviculin (AH2); ba hợp chất lần đầu tiên phân lập được từ họ Euphorbiaceae là β-D-glucopyranosyl phaseate (AH11), megastigm-7- ene-3-ol-9-one 3-O-α-L-arabinofuranosyl-(1→6)-O-β-D-glucopyranoside (AH15), lotusanine B (AH18); ba hợp chất lần đầu tiên phân lập được từ chi Antidesma là (+)-isolariciresinol 9-O-β-D-glucopyranoside (AH3), (+)-lyoniresinol-9-O-β-D-glucopyranoside (AH5), ampelopsisionoside 22 (AH12) và 10 hợp chất đã biết khác (–)-lyoniresinol (AH4), 1-O-(2,4- dihydroxy-6-methoxyphenyl)-6-O-(4-hydroxy-3,5- dimethoxybenzoyl)-β-D-glucopyranoside (AH6), 4-O-[6-O-(4- hydroxy-3,5-dimethoxybenzoyl)-β-D-glucopyranosyl]-3-hydroxy phenethyl alcohol (AH7), 4-hydroxymethyl-2-methoxyphenyl-6-O- syringoyl-β-D-glucopyranoside (AH8), phenethyl α-L-arabinofuranosyl- (1→6)-O-β-D-glucopyranoside (AH9), syringoyl-O-β-D-glucopyranoside (AH10), alangioside A (AH13), alangionoside L (AH14), N–trans- feruloyloctopamide (AH16) và trans-linalool-3,6-oxide 7-O-β-D- glucopyranoside (AH17). - Từ loài A. acidum đã phân lập và xác định cấu trúc 12 hợp chất. Trong đó, có một hợp chất lần đầu tiên phân lập được từ tự nhiên là 5- demethyltoddaculin (AC6); bảy hợp chất lần đầu tiên phân lập được từ chi Antidesma là clauszoline B (AC1), clauszoline H (AC2), mukonal (AC3), 7- methoxymukonal (AC4), heptaphyline (AC5), xanthoxyletin (AC7), alloxanthoxyletin (AC8) và bốn hợp chất đã biết khác là (E)-p-propenylphenol O-β-D-glucopyranoside (AC9), p-methoxycinnamaldehyde (AC10), trans-4- methoxycinnamyl alcohol (AC11), vanilin (AC12). - Từ loài A. ghaesembilla đã phân lập và xác định cấu trúc 14 hợp chất. Trong đó, có hai hợp chất mới là antidesoic acid A (AG1) và antidesoic acid B (AG2); tám hợp chất lần đầu tiên phân lập được từ chi Antidesma là vitexin (AG3), orientin (AG4), isovitexin (AG5), homoorientin (AG6), 4-hydroxy-3,5-dimethoxybenzyl-O-β-D- glucopyranoside (AG10), 3-hydroxy-4,5-dimethoxyphenyl-O-β-D- glucopyranoside (AG11), 3,4,5-trimethoxyphenyl-O-β-D-glucopyranoside (AG12), sinapyl alcohol 4-O-β-D-glucopyranoside (AG13) và bốn hợp chất đã biết khác là luteolin-4′-O-β-D-glucopyranoside (AG7), amentoflavone (AG8), vanillyl alcohol 4-O-β-D-glucopyranoside (AG9), (–)-syringaresinol (AG14). 2. Nghiên cứu về hoạt tính sinh học - Đã tiến hành đánh giá hoạt tính gây độc tế bào ung thư máu HL-60 của 12 hợp chất (AC1- AC12) phân lập được từ loài A. acidum. Kết quả 23 cho thấy, các hợp chất AC1 và AC4 thể hiện hoạt tính gây độc tế bào mạnh với giá trị IC50 lần lượt là 4,8 µM và 8,0 µM (tương đương với đối chứng dương mitoxantrone, IC50 = 6,8 µM). Các hợp chất AC3, AC5-8 có hoạt tính ức chế dòng tế bào HL-60 ở mức độ trung bình với giá trị IC50 trong khoảng từ 22,5 đến 28,1 µM và hợp chất AC10 có hoạt tính yếu hơn với giá trị IC50 = 44,7±3,3 µM. Nghiên cứu cơ chế gây chết tế bào ung thư HL-60 của hợp chất AC1 theo hình thái tế bào cũng như nghiên cứu ở cấp độ phân tử đã chỉ ra hợp chất này gây chết theo chương trình thông qua sự thay đổi trong biểu hiện của các protein liên quan đến quá trình tự chết của tế bào như: tăng cường biểu hiện của Bax, Caspase- 3 và PARP, giảm độ biểu hiện của Bcl-2, p-AKT và c-myc. - Đã nghiên cứu hoạt tính kháng viêm thông qua ức chế sự sản sinh NO trong tế