Tóm tắt Luận án Nghiên cứu thu nhận, khảo sát cấu trúc và tính chất của Exopolysaccharide sinh tổng hợp từ Lactobacillus Fermentum - Trần Thị Ái Luyến

Mặc dù có rất nhiều đóng góp quan trọng trong công nghiệp và trong y học nhưng EPS từ vi khuẩn vẫn tồn tại một nhược điểm là năng suất thu nhận thấp. Đây là lý do chính khiến khả năng thương mại hóa của EPS từ vi khuẩn nói chung và từ vi khuẩn lactic (LAB-Lactic acid bacteria) nói riêng còn khá hạn chế. Từ khi LAB được "công nhận là vi sinh vật an toàn” (GRAS-Generally Recognized As Safe), việc cải thiện quá trình thu nhận, tách chiết EPS được coi là một phương pháp hữu ích để sản xuất EPS đáp ứng phương diện ứng dụng trong thực phẩm [59]. Nhiều chủng LAB được biết đến là nguồn sản xuất EPS – với những tác động liên quan đến việc cải thiện cấu trúc của các sản phẩm lên men như sữa chua, phomat,... Bên cạnh đó, nhờ những đặc điểm đa dạng trong cấu trúc cũng như sự an toàn đối với sức khỏe con người mà EPS sinh tổng hợp từ vi khuẩn lactic 2 (LAB) được quan tâm nhiều hơn so với EPS từ các loài khác. Nhiều nghiên cứu đã kết luận rằng, thành phần monosaccharide, vị trí liên kết trong cấu trúc và những tính chất có tiềm năng ứng dụng của các EPS sinh tổng hợp bởi các chủng thuộc LAB khác nhau phụ thuộc vào loại chủng, điều kiện nuôi cấy và thành phần môi trường [74], [102], [104], [126],. Như vậy, sự đa dạng trong cấu trúc của các loài vi khuẩn khác nhau có thể liên quan đến nguồn phân lập vi khuẩn, thành phần các chất dinh dưỡng trong quá trình lên men cũng như điều kiện nuôi cấy và thu nhận. Sự đa dạng này sẽ tạo nên những ảnh hưởng không nhỏ đến các hoạt tính sinh học cũng như những tính chất chức năng trong công nghệ thực phẩm. Chính vì vậy, để nâng cao hiệu quả thu nhận EPS và đặc biệt là cung cấp một số thông tin chi tiết hơn về các đặc tính cấu trúc của các EPS sinh tổng hợp từ một trong các chủng LAB nói chung và một số chủng Lactobacillus fermentum nói riêng, chúng tôi đã thực hiện đề tài “Nghiên cứu thu nhận, khảo sát cấu trúc và tính chất của exopolysaccharide sinh tổng hợp từ Lactobacillus fermentum”. Với đề tài trong luận án này, chúng tôi sẽ xác định được điều kiện thu nhận EPS từ một số chủng Lb. fermentum hiệu quả nhất; khảo sát một số tính chất có tiềm năng ứng dụng trong công nghệ thực phẩm, đồng thời xác được một số thông tin về phân tử lượng, thành phần đường, mối liên kết của một số EPS mới được tách chiết từ các chủng vi khuẩn nghiên cứu. Với những đặc tính mới được phát hiện, chúng có thể là tiền đề cho các nghiên cứu ứng dụng trong y dược, trong thực phẩm thay thế cho các hợp chất được tổng hợp hóa học. 3 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Tổng quan về polysaccharide 1.1.1. Giới thiệu chung về polysaccharide 1.1.2. Ứng dụng của polysaccharide trong công nghiệp 1.2. Tổng quan về vi khuẩn Lactobacillus fermentum 1.3. Tổng quan về exopolysaccharide từ vi khuẩn lactic 1.3.1. Khái niệm 1.3.2. Phân loại và tính chất lý hóa của exopolysaccharide 1.3.3. Tính chất chức năng và ứng dụng của EPS 1.4. Tình hình nghiên cứu về exopolysaccharide từ LAB 1.4.1. Về điều kiện nuôi cấy 1.4.2. Về quá trình tách chiết và tinh chế EPS 1.4.3. Về đặc tính hóa lý của EPS 1.4.4. Tính chất công nghệ và các tác dụng về sức khỏe CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Đối tượng nghiên cứu 2.2. Hóa chất, thiết bị và dụng cụ 2.3. Phương pháp nghiên cứu 2.3.1. Phương pháp xác định mật độ tế bào vi khuẩn bằng phương pháp đo mật độ quang (OD) 2.3.2. Phương pháp nuôi cấy thu nhận sinh khối 2.3.3. Phương pháp thu nhận và tách EPS 2.3.4. Sơ đồ tổng thể về phương pháp nghiên cứu cải thiện hiệu suất thu nhận EPS từ một số chủng Lb. fermentum 2.3.5. Xác định hàm lượng EPS bằng phương pháp phenol – sulfuric 4 2.3.6. Xác định hàm lượng nitơ tổng số bằng phương pháp Kjeldahl 2.3.7. Phương pháp khảo sát một số tính chất có tiềm năng ứng dụng trong công nghệ thực phẩm 2.3.8. Phương pháp xác định khối lượng phân tử và đặc điểm cấu trúc của EPS 2.3.9. Phương pháp xử lý số liệu Chương 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN 3.1. Kết quả nghiên cứu cải thiện hiệu suất thu nhận EPS từ một số chủng Lb. fermentum 3.1.1. Kết quả tuyển chọn một số chủng Lb. fermentum sinh tổng hợp EPS cao. Hình 3.1. Khả năng sinh tổng hợp EPS của một số chủng vi khuẩn lactic (Trong đó: - TC12: Lb. fermentum TC12 - TC20: Lb. fermentum TC20 - TC13: Lb. fermentum TC13 - TC21: Lb. fermentum TC21 - TC14: Lb. fermentum TC14 - MC2: Lb. fermentum MC2 - TC15: Lb. fermentum TC15 - MC3: Lb. fermentum MC3 - TC16: Lb. fermentum TC16 - N9: Lb. fermentum N9 - TC18: Lb. fermentum TC18 - N10: Lb. fermentum N10 - TC19: Lb. fermentum TC19 Các chữ cái a, b, c, d, e, f, g thể hiện sự sai khác về hàm lượng EPS đạt được giữa các chủng 35,484i 119,142a 62,516e 68,980d 116,744a 68,370d 43,248h 50,728g 100,768b 56,581f 88,776c 58,939ef 69,508d 0 20 40 60 80 100 120 140 E P S ( µ g /m l) Chủng vi khuẩn lactic 5 Kết quả Hình 3.1 cho thấy, các chủng Lb. fermentum TC13, TC16, TC21 và Lb. fermentum MC2, MC3) và Lb. fermentum MC3 có khả năng sinh tổng hợp tốt hơn so với các chủng còn lại. Từ kết quả này, bốn chủng được chúng tôi lựa chọn để tiến hành các nghiên cứu tiếp theo trong luận án sẽ là Lb. fermentum (TC13, TC16, TC21, MC3). 3.1.2. Ảnh hưởng của thành phần môi trường lên quá trình sinh EPS của các chủng Lb. fermentum (TC13, TC16, TC21, MC3) 3.1.2.1. Ảnh hưởng của nguồn C và nồng độ của chúng Kết quả từ Hình 3.2 cho thấy rằng, quá trình sinh tổng hợp EPS của Lb. fermentum TC13, TC16, TC21 và MC3 xảy ra tốt hơn khi bổ sung các loại đường với nồng độ tương ứng lần lượt là 4% glucose, 3% sucrose, 4% lactose và 4% glucose. 238.817 216.988 215.159 0 50 100 150 200 250 0 2 3 4 5 6 E P S ( µ g /m l) Nồng độ bổ sung (%) Lb. fermentum TC13 Glucose Lactose Sucrose 224.183231.988 0 50 100 150 200 250 0 2 3 4 5 6 E P S ( µ g /m l) Nồng độ bổ sung (%) Lb. fermentum TC16 Glucose Lactose Sucrose 178.207 0 50 100 150 200 250 0 2 3 4 5 6 E P S ( µ g /m l) Nồng độ bổ sung (%) Lb. fermentum MC3 Glucose Lactose Sucrose 179.752176.581 0 50 100 150 200 250 0 2 3 4 5 6 E P S ( µ g /m l) Nồng độ bổ sung (%) Lb. fermentum TC21 Glucose Lactose Sucrose Hình 3.2. Ảnh hưởng của nguồn carbon và nồng độ bổ sung của chúng vào môi trường MRS đến khả năng tổng hợp EPS của các chủng Lb. fermentum * Kết quả số liệu nghiên cứu cụ thể được trình bày ở phụ lục 4.1 6 3.1.2.2. Ảnh hưởng của nguồn nitrogen và nồng độ của chúng Lượng EPS sinh tổng hợp đạt cao nhất bởi các chủng Lb. fermentum TC16, TC21 đều ở trong môi trường chứa 0,8% cao thịt và ở nồng độ cao nấm bổ sung là 0,4% cho chủng Lb. fermentum TC16 và 0,3% cho chủng Lb. fermentum MC3 (Hình 3.3). 3.1.3. Ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy đến quá trình sinh tổng hợp EPS của các chủng Lb. fermentum TC13, TC16, TC21, MC3 3.1.3.1. Ảnh hưởng của mật độ tế bào nuôi cấy ban đầu Quá trình sinh tổng hợp EPS đạt cao nhất đối với các chủng Lb. fermentum TC16, TC21, MC3 khi mật độ tế bào nuôi cấy ban đầu là 106 cfu/ml và của chủng Lb. fermentum TC13 là 107 cfu/ml (Hình 3.4) Các chủng L. fermentum Hình 3.3. Ảnh hưởng của nguồn N và nồng độ bổ sung của chúng vào MTTH đến khả năng tổng hợp EPS của các chủng Lb. fermentum * Các mức 1, 2, 3, 4, 5 tương ứng với các nồng độ pepton, cao thịt là 0,2%; 0,4%; 0,6%; 0,8%; 1,0% và cao nấm là 0,1%; 0,2%; 0,3%; 0,4%; 0,5% bổ sung vào MTTH 7 3.1.3.2. Ảnh hưởng của pH ban đầu Lượng EPS sinh ra của các chủng Lb. fermentum TC16, TC21, MC3 đều đạt cực đại tại pH 6,0 và tại pH 5,5 đối với chủng TC13 (Hình 3.5). 3.1.3.3. Ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy Hình 3.6. Ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy Hình 3.4. Ảnh hưởng của mật độ tế bào nuôi cấy ban đầu Hình 3.5. Ảnh hưởng của pH ban đầu 4,0 4,5 5,0 5,5 6,0 6,5 ĐC 8 Kết quả Hình 3.6 cho thấy, quá trình sinh tổng hợp EPS của các chủng vi khuẩn khảo sát đều xảy ra tốt trong khoảng nhiệt độ từ 35 – 40 oC. 3.1.4. Đường cong sinh trưởng và ảnh hưởng của thời gian lên men Lượng EPS sinh tổng hợp bởi các chủng Lb. fermentum TC13, TC16, MC3 đạt cực đại sau 48 giờ lên men và sau 36 giờ lên men với chủng Lb. fermentum TC21. Thời điểm EPS tổng hợp được đạt cực đại cũng chính là thời điểm mà giá trị OD của môi trường đạt được là cao nhất. Kết quả Hình 3.7 cũng chỉ ra những mối quan hệ nhất định giữa hàm lượng EPS tổng hợp được, OD và pH của môi trường trong suốt thời gian lên men. Kết luận 1 : Hình 3.7. Ảnh hưởng của thời gian lên men 9 Bảng 3.1. Điều kiện thu nhận EPS cao của các chủng Lb. fermentum nghiên cứu trong luận án Các chủng vi khuẩn Lb. fermentum Điều kiện thu nhận Hiệu suất thu nhận EPS ở các điều kiện đã khảo sát so với MRS (%) Thành phần môi trường Mật độ tế bào nuôi cấy ban đầu (cfu/m l) pH ban đầu Nhiệt độ nuôi cấy (oC) Thời gian lên men (giờ) Nguồn C Nguồn N TC13 4% glc 0,4% cao nấm 107 5,5 40 48 353,56 TC16 3% suc 0,8% cao thịt 106 6,0 35 48 356,95 TC21 4% lac 0,8% cao thịt 106 6,0 35 36 414,51 MC3 4% glc 0,3% cao nấm 106 6,0 35 48 479,14 3.1.5. Kết quả khảo sát điều kiện tách EPS từ dịch lên men 3.1.5.1. Ảnh hưởng của nồng độ acid trichloroacetic (TCA) lên khả năng loại bỏ protein Hình 3.8. Ảnh hưởng của nồng độ TCA bổ sung lên khả năng loại bỏ protein và lượng EPS tách từ dịch lên men Lb. fermentum TC13 10 Kết quả trên các Hình 3.8, 3.9, 3.10, 3.11 cho thấy, khi nồng độ TCA bổ sung vào tăng lên, lượng protein còn lại trong dịch nuôi cấy đều có xu hướng giảm dần. Hình 3.10. Ảnh hưởng của nồng độ TCA bổ sung lên khả năng loại bỏ protein và lượng EPS tách từ dịch lên men Lb. fermentum TC21 Hình 3.11. Ảnh hưởng của nồng độ TCA bổ sung lên khả năng loại bỏ protein và lượng EPS tách từ dịch lên men Lb. fermentum MC3 Hình 3.9. Ảnh hưởng của nồng độ TCA bổ sung lên khả năng loại bỏ protein và lượng EPS tách từ dịch lên men Lb. fermentum TC16 11 3.1.5.2. Ảnh hưởng của thể tích ethanol so với dịch nổi đến khả năng tách EPS Lượng EPS thu được từ các dịch nổi của các chủng Lb. fermentum TC13, TC16, TC21, MC3 đạt tốt nhất khi tỉ lệ dịch nổi và EtOH là 1:1 (Hình 3.12). 3.1.5.3. Ảnh hưởng của thời gian tủa bằng ethanol lên khả năng tách EPS Kết quả từ Hình 3.13 cho thấy thời gian áp dụng thích hợp và hiệu quả để thu EPS tủa bằng EtOH trong quá trình tách chiết EPS từ dịch nổi là 24 giờ. Hình 3.12. Ảnh hưởng của thể tích ethanol so với dịch nổi đến khả năng tách EPS Các chủng Lb. fermentum Hình 3.13. Ảnh hưởng của thời gian tủa bằng ethanol lên khả năng tách EPS 12 Kết luận 2: Bảng 3.2. Các điều kiện tách EPS từ dịch nuôi cấy của các chủng Lb. fermentum Các chủng Lb. fermentum Nồng độ TCA bổ sung (%) Tỉ lệ dịch nổi: ethanol (v/v) Thời gian tủa bằng Ethanol (giờ) Hiệu suất thu nhận tăng (%) TC13 15 1:1 24 121,19 TC16 35 1:1 24 101,73 TC21 20 1:1 24 110,93 MC3 20 1:1 24 106,81 3.2. Kết quả khảo sát các tính chất của EPS thu được từ các chủng Lb. fermentum (TC13, TC16, TC21, MC3) có tiềm năng ứng dụng trong công nghệ thực phẩm 3.2.1. Khả năng hòa tan trong nước Bảng 3.3. Độ hòa tan trong nước của EPS EPS tách chiết từ các chủng Lb. fermentum Độ hòa tan (%) EPS- TC13 73,33±3,81 EPS-TC16 75,33±5,17 EPS-TC21 64,00±4,97 EPS-MC3 87,00±2,49 Các EPS thu được từ các chủng Lb. fermentum (TC13, TC16, TC21, MC3) đều có khả năng hòa tan trong nước rất tốt. 3.2.2. Khảo sát khả năng giữ nước và giữ dầu Kết quả Bảng 3.4 cho thấy rằng, EPS thu được từ các chủng Lb. fermentum TC13, TC16, TC21, MC3 đều có khả năng giữ nước tốt. 13 Khả năng giữ dầu tương ứng của các EPS từ các chủng Lb. Fermentum TC13, TC16, TC21, MC3 thể hiện ở Bảng 3.5 Bảng 3.4. Khả năng giữ nước của EPS từ các chủng Lb. fermentum EPS tách chiết từ các chủng Lb. fermentum Khả năng giữ nước (%) EPS- TC13 140,55 ± 0,45 EPS-TC16 136,22 ± 0,6 EPS-TC21 120,63 ± 1,99 EPS-MC3 135,70 ± 3,11 Bảng 3.5. Khả năng giữ dầu của EPS từ các chủng Lb. fermentum EPS tách chiết từ các chủng Lb. fermentum Khả năng giữ dầu (%) EPS- TC13 590,78 ± 1,94 EPS-TC16 594,57 ± 1,42 EPS-TC21 608,30 ± 0,45 EPS-MC3 599,97 ± 1,14 3.2.3. Khả năng chống oxy hóa Bảng 3.6. Tỷ lệ bắt gốc tự do DPPH (%) của các EPS thu được từ các chủng Lb. fermentum (TC13, TC16, TC21, MC3) Nồng độ (mg/mL) Hoạt lực chống oxy hóa (%) Ascorbic acid EPS- TC13 EPS- TC16 EPS- TC21 EPS- MC3 Nồng độ (mg/mL) Hoạt lực chống oxy hóa (%) 1,0 - - 36,94 ± 0,35 - 1,5 - - 57,14 ± 0,32 27,14 ± 0,30 2,0 29,14 ± 0,52 27,34 ± 0,32 67,41 ± 0,30 47,66 ± 0,55 0,00125 27,05 ± 0,12 2,5 38,56 ± 0,37 35,95 ± 0,52 78,99 ± 0,30 68,05 ± 0,47 0,0025 58,3 ± 0,17 3,0 55,01 ± 0,25 51,08 ± 0,22 - 80,93 ± 0,45 0,0050 89,57 ± 0,1 3,5 76,01 ± 0,35 72,11 ± 0,45 - - 0,1250 93,12 ± 0,12 IC50 2,85 2,96 1,32 2,06 0,00217 14 Kết quả từ Bảng 3.6 cho thấy, các EPS sinh tổng hợp từ 4 chủng Lb. fermentum TC13, TC16, TC21, MC3 đều có khả năng chống oxy hóa. Khả năng chống oxy hóa tăng dần theo chiều tăng của nồng độ EPS và sự thay đổi này là không giống nhau khi so sánh giữa các EPS từ các chủng khác nhau. 3.3. Kết quả phân tích khối lượng phân tử và một số đặc điểm về cấu trúc của các EPS sinh tổng hợp từ Lb. fermentum MC3 3.3.1. Khối lượng phân tử EPS sinh tổng hợp từ Lb. fermentum MC3 có khối lượng phân tử khoảng 98,5 kDa (Hình 3.14) 3.3.2. Đặc điểm về cấu trúc của các EPS - Thành phần monosaccharide của các EPS Bảng 3.7. Các dẫn xuất monosaccharide thu được từ EPS sinh tổng hợp bởi Lb. fermentum MC3 STT Hợp chất Thời gian lưu (phút) Diện tích peak 1 1,5,6-tri-O-acetyl-2,3,4-tri-O- methyl-D- glucitol 5,134 6665390 2 1,3,5-tri-O-acetyl-2,4,6-tri-O- methyl-D-mannitol 6,025 6034772 a) Khối lượng trung bình (kDa) Hình 3.14. Sắc kí đồ khối lượng phân tử của EPS-MC3 bằng phương pháp sắc ký thẩm thấu gel 15 Kết quả Bảng 3.7 cho thấy thành phần monosaccharide tương ứng trong cấu trúc của EPS-MC3 gồm D-glucose, D- mannose. Dữ liệu Bảng 3.8 thể hiện tỷ lệ và thành phần phần trăm của các monosacharide có trong cấu trúc của EPS-MC3. Bảng 3.8. Tỷ lệ, thành phần (%) các monosaccharide trong cấu trúc EPS sinh tổng hợp bởi Lb. fermentum MC3 STT Thành phần Tỷ lệ Thành phần (%) 1 D-glucose 1,00 52,48 2 D-mannose 0,91 47,52 - Xác định vị trí liên kết glycoside trong các EPS bằng GC-MS Bộ khung của EPS-MC3 sinh tổng hợp được có dạng manno- glucan với hai liên kết chủ yếu là (1→6) glucoside và (1→3) mannoside (Bảng 3.9). Bảng 3.9. Các dẫn xuất methyl alditol acetate monosaccharide thu được và liên kết glycoside tương ứng của EPS sinh tổng hợp bởi Lb. fermentum MC3 STT Hợp chất Liên kết glycoside Tỷ lệ 1 1,5,6-tri-O-acetyl- 2,3,4-tri-O-methyl- D-glucitol →6)-D- glucopyranoside-(1→ 1,00 2 1,3,5-tri-O-acetyl- 2,4,6-Tri-O-methyl- D-mannitol →3)-D- mannopyranoside-(1→ 0,91 - Sử dụng phổ cộng hưởng từ hạt nhân để xác định đặc điểm về cấu trúc của EPS-MC3 16 Kết quả phân tích phổ NMR thể hiện ở hình 3.16, hình 3.17, hình 3.18, hình 3.19, hình 3.20, hình 3.21 Các tín hiệu trong phổ 1H-NMR của EPS-MC3 cho thấy, trong vùng từ  4,5 đến  4,9 có sự hiện diện của 2 thành phần đường thông qua các tín hiệu đặc trưng của hai proton anomer ở độ chuyển dịch 4,87 ppm và 4,55 ppm; các proton của nhóm O- methyl từ H 3,00 đến 3,62 ppm (Hình 3.16). Hai monosaccharide này được chúng tôi kí hiệu là A và B theo chiều giảm dần của độ chuyển dịch hóa học. Từ giá trị về độ chuyển dịch của proton anomer trong 1H NMR, cấu trúc của EPS-MC3 chỉ chứa liên kết glycoside dạng β-pyranose [9]. Hình 3.17. Phổ 13C-NMR của EPS-MC3 Hình 3.16. Phổ 1H-NMR của EPS-MC3 17 Kết quả ở Hình 3.17 của phổ 13C –NMR cho thấy EPS-MC3 có sự xuất hiện của hai tín hiệu carbon ở độ chuyển dịch hóa học là 94,1 và 94,0 ppm và các vùng carbon trong mạch vòng của nó từ 61,5 đến 77,2 ppm. Kết hợp các kết quả công bố trước đây [9], [41], [49], [108] và từ phổ 1H, 13C-NMR của EPS-MC3 có tín hiệu carbon anomer ở  94,1 nên có thể được quy cho là của β-D- mannopyranose và tín hiệu ở C1 94,0 sẽ là β-D-glucopyranose. Các đỉnh của đường cắt ngang trong phổ HSQC giúp xác định được vị trí của các phân tử carbon anomer và proton anomer trong cấu trúc dạng vòng từ 1 đến 6 của chúng (Hình c) Hình 3.18. Phổ HSQC (a, b, c) của EPS-MC3 b) a) 18 3.18). Điều này cho phép xác định vị trí của proton nối với nguyên tử carbon trong cấu trúc phân tử của EPS-MC3. Những tương tác 1H → 1H trong phổ COSY đã chỉ ra các tương tác giữa các proton của carbon cận kề nhau trong cấu trúc EPS-MC3 sinh tổng hợp bởi Lb. fermentum MC3. Từ đó cho phép thiết lập trật tự liên kết carbon trong các thành phần đường tương ứng trong cấu trúc phân tử của EPS-MC3 là (Hình 3.19) Bảng 3.10. Độ chuyển dịch hóa học 1H –NMR và 13C – NMR của EPS-MC3 đo trong DMSO Đơn vị: ppm →6)-β- D- glucopyranoside-(1→ 4,87 3,53 3,62 3,49 3,28 3,51 A →3)-β-D- mannopyranoside- (1→ 4,55 3,01 3,47 3,27 3,50 3,43 B Phần đường C-1 C-2 C-3 C-4 C-5 C-6 →6)-β- D- glucopyranoside-(1→ 94,0 71,6 61,5 70,6 73,8 71,4 A →3)-β-D- mannopyranoside- (1→ 94,1 77,2 73,2 67,1 67,4 61,5 B Đối chiếu với các tài liệu tham khảo [41], [54], [101], [137], [142] cùng những phân tích trên các phổ 1H -NMR, 13C – NMR, Hình 3.19. Phổ đồ COSY của EPS-MC3 19 COSY và HSQC, chúng tôi đã xác định được độ chuyển dịch hóa học của các thành phần đường trong EPS-MC3 (Bảng 3.10). Các tương tác của proton anomer và các nguyên tử C trên phổ HMBC (Hình 3.20) và NOESY (Hình 3.21) đã chỉ ra các mối liên kết glycoside trong cấu trúc của EPS-MC3 tương ứng là A(1→3)B và B(1→6)A. Thông tin này cho phép chúng tôi định vị được các gốc đường (Bảng 3.11) Bảng 3.11. Các dạng liên kết trong cấu trúc của EPS-MC3 qua phổ NOESY, HMBC Đơn vị: ppm Phần đường Ký hiệu H1 NOESY HMBC Mối liên kết (1→6)-β-D-glucopyranoside A 4,87 3,47 73,2 A: H1 với B: H3 A: H1 với B: C3 (1→3)-β-D- mannopyranoside B 4,55 3,51 71,4 B: H1 với A: H6 B: H1 với A: C6 Từ kết quả phân tích phổ cộng hưởng từ hạt nhân và phân tích thành phần monosacharide của EPS-MC3 cho phép sắp xếp Hình 3.20. Phổ đồ HMBC của EPS-MC3 Hình 3.21. Phổ đồ NOESY của EPS-MC3 20 đơn vị mắt xích lặp lại với dạng liên kết cụ thể như sau: [6)-β- D-Glcp-(13)-β-D-Manp-(16)-β-D-Glc-(1]n (Hình 3.22) EPS sinh tổng hợp từ Lb. fermentum MC3 là một PS mới. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 1. Kết luận Từ các kết quả nghiên cứu thu được trong luận án cho phép chúng tôi có những kết luận như sau: 1.1. Về hiệu suất thu nhận EPS: 1.1.1. Từ các chủng LAB sử dụng nghiên cứu, chúng tôi đã chọn ra được 04 chủng có khả năng sinh tổng hợp EPS tốt. Đó là các chủng Lb. fermentum TC13, Lb. fermentum TC16, Lb. fermentum TC21 và Lb. fermentum MC3. 1.1.2. Đối với các chủng vi khuẩn lựa chọn nghiên cứu, chúng tôi đã xác định được nguồn dinh dưỡng (nguồn C, N) và điều kiện nuôi cấy (mật độ gieo cấy ban đầu, pH ban đầu, nhiệt độ, thời Hình 3.22. Các đơn vị lặp lại trong cấu trúc của EPS-MC3 đã được thủy phân một phần 21 gian) thích hợp và hiệu quả cao cho quá trình sinh tổng hợp EPS của các chủng vi khuẩn sử dụng. Cụ thể như sau: + Chủng Lb. fermentum TC13 có khả năng sinh tổng hợp EPS cao khi phát triển trong môi trường MRS có bổ sung thêm 4% glucose, 0,4% cao nấm với điều kiện lên men ở 40 oC, pH ban đầu 5,5, mật độ tế bào nuôi cấy ban đầu 107 CFU/mL trong thời gian 48 giờ. + Chủng Lb. fermentum TC16 có khả năng sinh tổng hợp EPS cao trong môi trường MRS có bổ sung thêm 3% sucrose, 0,8% cao thịt sau 48 giờ ở điều kiện lên men bao gồm mật độ tế bào nuôi cấy ban đầu là 106 CFU/mL, pH ban đầu 6,0 và nhiệt độ nuôi cấy là 35 oC. + Chủng Lb. fermentum TC21 có khả năng sinh tổng hợp EPS cao sau 36 giờ lên men ở nhiệt độ 35 oC, pH ban đầu 6,0, mật độ tế bào nuôi cấy ban đầu 106 CFU/mL trong môi trường MRS có bổ sung thêm 4% lactose, 0,8% cao thịt. + Ở điều kiện nuôi cấy là 35 oC, pH ban đầu 6,0, mật độ tế bào nuôi cấy ban đầu 106 CFU/mL trong thời gian 48 giờ với môi trường MRS có bổ sung thêm 4% glucose, 0,3% cao nấm, chủng Lb. fermentum MC3 có khả năng sinh tổng hợp EPS cao nhất. 1.1.3. Từ dịch lên men thu nhận được bởi các chủng Lb. fermentum (TC13, TC16, TC21, MC3) chúng tôi đã xác định được điều kiện tách EPS hiệu quả tương ứng. + Nồng độ TCA bổ sung vào dịch lên men của các chủng Lb. fermentum TC13, TC16, TC21, MC3 phù hợp nhất nhằm loại bỏ protein và thu EPS tốt được làm sáng tỏ trong nghiên cứu này lần lượt tương ứng là 15%, 35%, 20% và 20%. 22 + Quá trình tách EPS đạt hiệu quả tốt khi thời gian tủa bằng EtOH được thực hiện trong 24 giờ với tỉ lệ dịch nổi và EtOH là 1:1 cho tất cả các chủng sử dụng nghiên cứu. 1.2. Về một số tính chất có tiềm năng ứng dụng trong công nghệ thực phẩm: Các EPS sinh tổng hợp từ các chủng Lb. fermentum (TC13, TC16, TC21, MC3) đều thể hiện tốt các tính chất có tiềm năng ứng dụng trong công nghệ thực phẩm. Cụ thể là: - Khả năng hòa tan trong nước của các EPS thu nhận được từ các chủng Lb. fermentum TC13, TC16, TC21, MC3 theo thứ tự giảm dần như sau: EPS-MC3 > EPS-TC16 > EPS-TC13 > EPS-TC21. - Khả năng giữ nước của các EPS này tăng theo trình tự như sau: EPS-TC21 < EPS-MC3 < EPS-TC16 < EPS-TC13. - Khả năng giữ dầu của các EPS đạt được trong nghiên cứu này là tương đối cao. EPS có khả năng giữ dầu cao nhất là EPS- TC21, tiếp đến là EPS-MC3, tiếp theo là EPS-TC16 và thấp hơn cả là EPS-TC13. - Khả năng chống oxy hóa của các EPS sinh tổng hợp được từ các chủng Lb. fermentum khác nhau theo trình tự giảm dần như sau: EPS-TC21 > EPS-MC3 > EPS-TC13 > EPS-TC16. Cụ thể là, tỉ lệ bắt gốc tự do DPPH của các EPS đạt 50% tại các nồng độ 1,32 mg/mL đối với Lb. fermentum TC21, 2,06 mg/mL đối với Lb. fermentum MC3, 2,85 mg/mL đối với Lb. fermentum TC13 và 2,96 mg/mL đối với Lb. fermentum TC16. 1.3. Về khối lượng phân tử và một số đặc điểm cấu trúc của EPS tách chiết từ chủng Lb. fermentum MC3 (EPS-MC3) 23 - Đã xác định được khối lượng phân tử của EPS-MC3 là 98,5 kD nhờ phương pháp sắc ký thẩm thấu gel. - EPS sinh tổng hợp từ Lb. fermentum MC3 là một PS mới. Một số thông tin mới về cấu trúc của EPS-MC3 bao gồm thành phần, tỉ lệ các monosaccharide và các loại liên kết chủ yếu trong bộ khung đã lần lượt được làm sáng tỏ. Cụ thể: + Thành phần monosaccharide có trong EPS-MC3 bao gồm các đơn vị lặp đi lặp lại là D-glucose, D-mannose với tỉ lệ phân tử tương ứng là 1,00:0,91. + Các loại liên kết glycoside chủ yếu tạo nên bộ khung chính của EPS-MC3 là (1→6) glucoside và (1→3) mannoside. 2. Kiến nghị Do thời gian tiến hành đề tài nghiên cứu có hạn, đồng thời, trong quá trình thực hiện luận án, chúng tôi đã gặp một số khó khăn về vấn đề trang thiết bị do đó chúng tôi vẫn chưa thể thực hiện sâu hơn các thông tin liên quan đến kết quả cũng như phạm vi ứng dụng thực tiễn. Vì vậy, để các kết quả từ luận án này có thể được ứng dụng tốt hơn trong thực tiễn, chúng tôi xin được phép kiến nghị tiếp tục: 1. Nghiên cứu ảnh hưởng của các nguồn dinh dưỡng khác nhau lên đặc điểm về cấu trúc của các EPS sinh tổng hợp được từ các chủng Lb. fermentum này. 2. Tiến hành nghiên cứu ứng dụng của EPS thu được lên một số sản phẩm lên men cụ thể về việc cải thiện tính chất lưu biến của sản phẩm như khả năng giữ nước, khả năng tạo gel, khả năng làm đặc,... 24 3. Tiến hành nghiên cứu một số tính chất sinh lý tác động đến sức khỏe con người của các EPS này như: khả năng kháng khuẩn, tác động làm giảm cholesterol, hoạt tính chống khối u,... 25 DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH KHOA HỌC CÓ LIÊN QUAN ĐÃ CÔNG BỐ 1. Trần Thị Ái Luyến, Trần Bảo Khánh, Đỗ Thị Bích Thủy, Trần Thị Văn Thi (2017), Nghiên cứu điều kiện tách chiết và đặc điểm về cấu trúc của các exopolysaccharide sinh tổng hợp từ Lactobacillus fermentum MC3 và Lactobacillus plantarum W12, Tạp chí Hóa học, Số 55 (4E23), 243-249. 2. Trần Bảo Khánh, Trần Thị Ái Luyến, Đỗ Thị Bích Thủy (2017), Xác định khối lượng phân tử và một số tính chất lý hóa của các exopolysaccharide được sinh tổng hợp bởi Lactobacillus fermentum MC3 và Lactobacillus plantarum W12, Tạp chí Hóa học, Số 55 (4E34), 17-21. 3. Trần Thị Ái Luyến, Đỗ Thị Bích Thủy (2016), Optimal conditions for the production of exopolysaccharide by Lactobacillus fermentum TC16, Tạp chí Khoa học kỹ thuật nông lâm nghiệp, Đại học Nông lâm Thành phố Hồ Chí Minh, số