Tóm tắt Luận án Nghiên cứu, thu nhận protein từ sinh khối rong nước lợ (chaetomorpha sp.) để ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm

ƠNG PHÁP 2.1. Vật liệu nghiên cứu Rong Chaetomorpha sp. được thu nhận sau 15 – 20 ngày phát triển, được thu tại các ao nuôi tôm quảng canh tại huyện Giá Rai, Bạc Liêu. Rong được vận chuyển trong thùng xốp trong ngày đến phòng thí nghiệm. Rong được rửa để loại tạp chất, sau đó phơi khô, xay nhỏ và sấy tới độ ẩm 5%, bảo quản trong bình hút ẩm ở nhiệt độ phòng. Enzyme Cellulase của hãng Genecor (Mỹ), tên thương mại là Crestone Conc. có khả năng hoạt động tốt trong vùng pH trung tính từ 6,0 – 7,5, nhiệt độ từ 450C – 550C; có hoạt tính 1.100 UI/ml. 2.2. Sơ đồ nghiên cứu Sơ đồ nghiên cứu thể hiện ở hình 2.2 2.3. Bố trí thí nghiệm 2.3.1. Xác định các nhóm protein trong rong Phương pháp của Hu và Esen (1981) được sử dụng để xác định các nhóm protein trong rong dựa vào khả năng hòa tan của chúng trong các dung môi khác nhau. 2.3.2. Khảo sát ảnh hưởng của quá trình xử lý nguyên liệu đến hiệu suất trích ly protein Các yếu tố được nghiên cứu trong quá trình xử lý nguyên liệu gồm ảnh hưởng của nhiệt độ sấy rong (40-1050C) và kích thước xay rong (0,25-1mm). 6 Khảo sát quá trình xử lý nguyên liệu Sấy, xay nhỏ Enzyme Khảo sát và tối ưu hóa quá trình trích ly nhóm protein tan trong nước Dịch trích protein Trích ly 1 Trích ly 2 Dung môi kiềm Khảo sát và tối ưu hóa quá trình trích ly nhóm protein tan trong kiềm Tủa protein Khảo sát điều kiện kết tủa protein Thẩm tích loại muối Sấy đông khô Hình thái, cấu trúc Tính chất chức năng Tính chất sinh học Giá trị dinh dưỡng Bã rong Dịch trích protein PC tan trong nước và tan trong kiềm Rong nguyên liệu Hình 2.2. Sơ đồ quy trình thu nhận protein concentrate từ rong Chaetomorpha sp. 7 2.3.3. Khảo sát ảnh hưởng của các yếu tố đến quá trình tríc-h ly nhóm protein tan trong nước có sự hỗ trợ của enzyme Các yếu tố khảo sát là loại dung dịch đệm (sử dụng làm dung môi trích ly), pH (5,0-8,0), tỷ lệ nguyên liệu và dung môi (1:5 đến 1:30), nồng độ enzyme (50-150 UI/g), thời gian (1-8 giờ) và nhiệt độ trích ly (300C đến 700C). Hàm mục tiêu là hiệu suất trích ly protein và Phycocyanin. Tối ưu hóa quá trình trích ly: sử dụng mô hình quy hoạch thực nghiệm bậc 2 với sự hỗ trợ của phần mềm Modde 5.0. 2.3.4. Khảo sát ảnh hưởng của các yếu tố đến quá trình trích ly nhóm protein tan trong kiềm Các yếu tố được khảo sát gồm tỷ lệ dung môi và nguyên liệu (1:10 đến 1:30), nồng độ dung môi (0,5-1,5%), nhiệt độ (300C-700C) và thời gian trích ly (30-90 phút). Hàm mục tiêu là hiệu suất trích ly nhóm protein tan trong kiềm. Quá trình trích ly protein tan trong kiềm được tối ưu hóa sử dụng mô hình quy hoạch thực nghiệm bậc 2 với sự hỗ trợ của phần mềm Modde 5.0. 2.3.5. Nghiên cứu quá trình tinh sạch protein Khảo sát quá trình kết tủa protein bằng các phương pháp khác nhau: kết tủa đẳng điện bằng HCl, kết tủa bằng dung môi ethanol, kết tủa bằng muối amoni sulphate và nâng cao độ tinh sạch bằng phương pháp thẩm tích. Hàm mục tiêu là hiệu suất thu sản phẩm và hàm lượng protein trong chế phẩm protein. 2.3.6. Nghiên cứu các đặc điểm hình thái và cấu trúc của chế phẩm protein từ rong Protein được tách phân đoạn bằng sắc ký lọc gel, sử dụng cột 50x1,5 cm và hạt Biogel P100 có kích thước 100 – 200 mesh (10 – 40µm). Các phân đoạn protein thu được sau quá trình sắc ký được xác định kích thước phân tử. Chế phẩm protein concentrate cũng được sử 8 dụng để xác định thành phần acid amin và quan sát hình thái trên kính hiển vi điện tử. 2.3.7. Xác định tính chất sinh học của chế phẩm protein concentrate Thử nghiệm hoạt tính kháng khuẩn trên 3 chủng vi khuẩn gây bệnh cho người là: S. aureus, E. coli, P. aeruginosa. Thử nghiệm hoạt tính kháng oxy hoá dựa trên các cơ chế: bắt gốc tự do DPPH, bắt gốc tự do ABTS•+, tương tác với ion Fe2+ và ức chế quá trình peroxy hóa lipid màng tế bào. 2.3.8. Xác định tính chất chức năng của chế phẩm protein Xác định các tính chất chức năng của chế phẩm protein concentrate từ rong bao gồm: khả năng tạo bọt và độ ổn định của bọt; khả năng tạo gel; khả năng hòa tan; khả năng hấp thu nước; khả năng tạo nhũ. So sánh với chế phẩm protein concentrate từ đậu nành. 2.3.9. Đánh giá giá trị dinh dưỡng trong điều kiện in vitro Xác định các chỉ tiêu sau của chế phẩm protein concentrate: - Khả năng tiêu hóa (IVPD) - Chỉ số điểm acid amin (AAS) - Chỉ số tiêu hoá protein dựa theo acid amin (PDCAAS) 2.3.10. Đánh giá giá trị dinh dưỡng trong điều kiện in vivo Mô hình in vivo được thực hiện trên đối tượng chuột bạch, với 4 nhóm có các chế độ ăn riêng biệt. - Nhóm 1: Chế độ ăn không chứa protein - Nhóm 2: Chế độ ăn thường (thức ăn Viện Pasteur cung cấp) - Nhóm 3: Chế độ ăn AIN 93 có chứa protein APC - Nhóm 4: Chế độ ăn AIN 93 có chứa protein từ đậu nành Các chỉ tiêu đánh giá: Hệ số tăng trọng (PER), Tỷ lệ hấp thu protein tịnh (NPR) và giá trị sinh học của protein (BV) 2.4. Phương pháp phân tích 9 - Các thành phần hóa sinh của rong được xác định theo phương pháp LAPS (Standard compositional laboratory analytical procedure) được mô tả bởi Dien và cộng sự, 2010. - Hàm lượng protein hòa tan thu được sau quá trình trích ly được xác định bằng phương pháp Lowry và Bradford. - Hàm lượng Phycocyanin được xác định bằng cách sử dụng thiết bị đo quang phổ UV-Vis (Bennett và Bogorad, 1973). - Cấu trúc của rong nguyên liệu và chế phẩm protein được quan sát bằng kính hiển vi điện tử quét (SEM). - Thành phần acid amin của chế phẩm protein được xác định bằng HPLC, sử dụng cột Aminex của Biorad và đầu dò RI. - Kích thước phân tử của các phân đoạn protein được xác định bằng điện di và LC-MS/MS 2.5. Phương pháp xử lý số liệu Tất cả các thí nghiệm được thực hiện 3 lần lặp lại. Kết quả được xử lý thống kê bằng phần mềm Statghraphics, đánh giá sự khác biệt giữa các kết quả thu được ở mức ý nghĩa α=0,05. Số liệu tối ưu hóa quá trình trích ly bằng quy hoạch thực nghiệm bậc 2 được xử lý bằng phần mềm Moodle 5.0. CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Thành phần protein trong rong 3.1.1. Xác định thành phần sinh hóa của rong Hàm lượng carbohydrate và protein trong sinh khối rong Chaetomorpha lần lượt là 47,19% và 12,68%. Hàm lượng protein trong rong Chaetomorpha sp. không cao (12,68%-20%) khi so sánh với hàm lượng protein trong đậu nành là nguồn nguyên liệu thực vật thường được sử dụng để thu nhận các chế phẩm protein concentrate và isolate. Tuy nhiên việc tách chiết protein từ rong, theo sau đó là sử dụng bã rong 10 sau khi tách protein để sản xuất ethanol sinh học và phân bón vi sinh sẽ tạo ra chuỗi giá trị khép kín của nguyên liệu với nhiều sản phẩm đa dạng, tạo công ăn việc làm cho người nông dân, mở ra hướng phát triển bền vững cho nguồn nguyên liệu hiện đang bị bỏ phí này. 3.1.2. Xác định các nhóm protein trong rong Rong sẽ được xử lý lần lượt bằng nước cất; NaCl 0,5M; ethanol 70% và NaOH 0,1M để xác định các nhóm protein. Kết quả cho thấy trong rong Chaetomorpha sp., nhóm protein tan trong kiềm chiếm tỷ lệ cao nhất 55,27%, nhóm protein tan trong nước chiếm 34,33% so với tổng lượng protein. Hai nhóm protein tan trong muối và cồn có tỷ lệ thấp tương ứng là 6,07% và 4,32%. Kết quả phân tích các nhóm protein trong rong là cơ sở cho việc lựa chọn dung môi thích hợp cho quá trình trích ly protein. Từ kết quả trên, chúng tôi quyết định lựa chọn khảo sát quá trình trích ly của hai nhóm protein có hàm lượng cao trong rong là nhóm tan trong nước và nhóm tan trong kiềm. 3.2. Khảo sát ảnh hưởng của quá trình xử lý nguyên liệu đến hiệu suất trích ly protein Sinh khối rong sau khi thu hoạch cần được phơi sấy để có thể bảo quản trong thời gian dài. Tuy nhiên, nhiệt độ sấy quá cao có thể làm biến tính protein và ảnh hưởng đến thành phần acid amin. Kích thước rong sau khi xay cũng ảnh hưởng đến diện tích tiếp xúc bề mặt giữa nguyên liệu và dung môi, do đó ảnh hưởng đến hiệu quả trích ly. Kết quả cho thấy nhiệt độ sấy ở 600C và kích thước nguyên liệu nhỏ hơn 0,1mm là tốt nhất cho quá trình trích ly protein. 3.3. Khảo sát quá trình trích ly nhóm protein tan trong nước với sự hỗ trợ của cellulase Ở các tế bào thực vật thành tế bào cấu tạo từ cellulose rất chắc chắn, do đó để việc phá vỡ tế bào có hiệu quả, ngoài sự hỗ trợ của các tác 11 động vật lý như sóng siêu âm, enzyme cellulase cũng được sử dụng để cắt đứt các liên kết của thành tế bào và giải phóng protein. Kết quả nghiên cứu cho thấy sử dụng đệm phosphate 0,1M pH 7 với tỷ lệ nguyên liệu:dung dịch đệm 1:20 là thích hợp cho hoạt động của enzyme. Nồng độ cellulase sử dụng là 100UI/g, thời gian và nhiệt độ trích ly tối ưu lần lượt là 60 phút và 500C. Các điều kiện này cũng là điều kiện thích hợp để thu nhận Phycocyanin. Hàm lượng Phycocyanin thu được cao nhất là 0,39 mg/g rong khô, chiếm khoảng 1% so với tổng hàm lượng của nhóm protein tan trong nước thu được trong dịch trích (38,36 mg/g rong khô). Tối ưu hoá quá trình trích ly protein tan trong nước Thủy phân sinh khối rong bằng enzyme là một phản ứng trong hệ dị thể, vì vậy khả năng tiếp xúc của enzyme với cơ chất là vấn đề quan trọng. Tỷ lệ nguyên liệu/cơ chất:dung dịch đệm cao sẽ làm tăng độ nhớt môi trường, hạn chế khả năng truyền khối. Ngược lại, sử dụng nồng độ cơ chất thấp sẽ làm loãng dịch trích và gây khó khăn trong quá trình trích ly tiếp theo bằng dung môi kiềm. Trong thí nghiệm này pH 7 và tỷ lệ nguyên liệu/cơ chất:dung môi 1:20 được giữ cố định ở mức tối ưu. Quá trình tối ưu hóa được thiết lập với 3 thông số biến đổi là nồng độ enzyme (X1), nhiệt độ (X2) và thời gian trích ly (X3), sử dụng mô hình tối ưu hóa ba yếu tố trực giao cấp 2 có tâm xoay với 3 thí nghiệm ở tâm. Phương trình hồi quy mô tả hàm lượng protein hòa tan thu được trong dịch trích như sau: Y1 = 37,024 + 3,452 X1 + 2,322 X3 – 3,137 X12 – 1,417 X32 Nồng độ enzyme và thời gian trích ly ảnh hưởng đáng kể đến hiệu suất trích ly protein, tuy nhiên sự tương tác của các yếu tố này lại không có ảnh hưởng đến hàm lượng protein thu được trong dịch trích (p>0.05). Các điều kiện tối ưu của quá trình trích ly là nồng độ enzyme là 121 UI/g cơ chất, nhiệt độ và thời gian trích ly tương ứng là 400C là 12 90 phút. Hàm lượng protein hòa tan dự đoán theo phương trình hồi quy và thu được trong thực nghiệm là 38,921 và 37,651 mg/g rong khô, khác biệt 3,27%. 3.4. Khảo sát quá trình trích ly nhóm protein tan trong kiềm bằng dung môi NaOH Các kết quả khảo sát đơn yếu tố cho thấy, các thông số kỹ thuật phù hợp đối với quá trình trích ly nhóm protein tan trong kiềm bao gồm tỷ lệ cơ chất và dung môi (1:20), nồng độ NaOH 1%, thời gian và nhiệt độ trích ly tương ứng là 60 phút và 500C. Trên cơ sở các kết quả này, quá trình tối ưu hóa được thực hiện theo mô hình trực giao cấp 2 có tâm xoáy với 3 thí nghiệm tại tâm. Các yếu tố có ảnh hưởng lớn tới quá trình trích ly được lựa chọn làm thông số biến đổi là thời gian trích ly (X4) và nồng độ NaOH (X5). Phương trình hồi quy mô tả hàm lượng protein hòa tan thu được trong dịch trích như sau: Y2 = 65,180 + 6,321 X4 + 10,224 X5 – 5,509 X4 X5 – 8,259 X52 Kết quả cho thấy nồng độ NaOH và thời gian trích ly thể hiện ảnh hưởng tương hỗ của đến hàm lượng protein. Khi sử dụng nồng độ NaOH thấp sẽ cần nhiều thời gian để quá trình trích ly đạt hiệu suất tối ưu. Ngược lại khi sử dụng NaOH ở nồng độ cao, quá trình trích ly sẽ nhanh chóng đạt tới trạng thái cân bằng và việc kéo dài thời gian sẽ không làm tăng đáng kể hiệu suất trích ly. Hàm lượng protein hoà tan dự đoán đạt cao nhất 68,651 mg/g rong khô tại nồng độ NaOH là 1,2% và thời gian trích ly là 72 phút, khác biệt 0,8% so với kết quả thực nghiệm. Đánh giá hiệu quả trích ly protein bằng các phương pháp 13 Trong thí nghiệm này, bể siêu âm Elma có tần số sóng 35kHz được sử dụng kết hợp với cellulase để tăng hiệu quả thủy phân thành tế bào. Cấu trúc tinh thể phức tạp của cellulose khiến nó bền với các tác động thủy phân. Khi sử dụng kết hợp với cellulase, sóng siêu âm giúp phá vỡ cấu trúc tinh thể của cellulose, tạo điều kiện để enzyme có thể tiếp cận tốt hơn với cơ chất để thủy phân thành tế bào rong một cách hiệu quả. Chính vì vậy, sử dụng kết hợp cả siêu âm và enzyme giúp tăng hiệu suất trích ly protein từ sinh khối rong một cách rõ rệt so với đối chứng (67,9 so với 43,34 mg/g rong khô). Hình thái cấu trúc của rong nguyên liệu và bã rong sau trích ly được nghiên cứu bằng kính hiển vi điện tử quét (SEM). Khi không có các biện pháp hỗ trợ, thành tế bào rong bị phá vỡ không hiệu quả, nên nhiều tế bào còn nguyên các thành phần nội bào chưa được trích ly (Hình 3.7a). Ngược lại, với sự hỗ trợ của siêu âm Hình 3.5. Hiệu quả trích ly 2 nhóm protein tan trong nước và tan trong kiềm bằng các phương pháp khác nhau a b Hình 3.7. Hình ảnh trên kính hiển vi điện tử quét (độ phóng đại 250x, thang đo 50µm) của bã rong Chaetomorpha sp. sau khi trích ly protein (a) Không sử dụng siêu âm và enzyme (b) Có sử dụng siêu âm và enzyme 14 và enzyme, hầu như tất cả các tế bào rong đều teo lại do đã giải phóng triệt để các thành phần nội bào (Hình 3.7b). 3.5. Nghiên cứu quá trình tinh sạch protein Quá trình kết tủa đẳng điện và kết tủa bằng dung môi ethanol cho hiệu suất thu protein không cao, độ tinh sạch của kết tủa protein < 50%. Khi sử dụng muối (NH4)2SO4 bão hòa 70%, hiệu suất tủa và độ tinh sạch của nhóm protein tan trong nước đạt tương ứng 62,86% và 58,77%, của nhóm protein tan trong kiềm đạt tương ứng 65,29% và 62,29%. Mẫu được đem thẩm tích bằng màng bán thấm cellophane có kích thước lỗ 14kDa để loại bỏ muối, hiệu suất thu hồi nhóm protein tan trong nước và tan trong kiềm tương ứng là 70,81%, 71,08%; độ tinh sạch tương ứng là 72,80% và 75,50%. 3.6. Xác định tính chất của chế phẩm protein concentrate 3.6.1. Thành phần sinh hoá của chế phẩm protein concentrate Để thu nhận chế phẩm protein concentrate, chúng tôi tiến hành trích ly hai phân đoạn protein tan trong nước và tan trong kiềm, sau đó kết tủa bằng muối ammonium và thẩm tích loại muối theo các điều kiện tối ưu. Chế phẩm protein sau khi sấy đông khô đến độ ẩm dưới 10% w/w. Hàm lượng protein trong hai chế phẩm APC-N và APC-K lần lượt là 72,8% và 76,3%. 3.6.2. Thành phần acid amin trong protein của rong Bảng 3.17. Thành phần acid amin trong chế phẩm protein Acid amin Hàm lượng acid amin trong chế phẩm protein (g/100g protein) Chế phẩm APC-N Chế phẩm APC-K Aspatic acid 11,7 ± 0,2 11,5 ± 0,15 Glutamic acid 16,1 ± 0,09 15,7 ± 0,14 Serine 5,3 ± 0,03 5,1 ± 0,1 Histidine 1,4 ± 0,07 1,7 ± 0,25 15 Arginine 5,3 ± 0,15 6,2 ± 0,1 Glycine 4,9 ± 0,18 4,9 ± 0,12 Threonine 4,1 ± 0,16 5,1 ± 0,23 Alanine 7,3 ± 0,11 7,8 ± 0,09 Tyrosine 4,5 ± 0,09 4,1 ± 0,06 Methionine 3,6 ± 0,15 3,5 ± 0,15 Valine 5,4 ± 0,18 6,5 ± 0,09 Phenylanine 5,9 ± 0,34 5,9 ± 0,18 Isoleucine 3,5 ± 0,15 4,6 ± 0,01 Leucine 8,3 ± 0,14 8,6 ± 0,09 Lysine 5,1 ± 0,18 5,6 ± 0,07 Cystine 3,0 ± 0,05 1,8 ± 0,09 Proline 4,6 ± 0,09 1,4 ± 0,05 Hàm lượng các acid amin thiết yếu trong protein của Chaetomorpha sp. chiếm tỷ lệ cao, tổng hàm lượng của 8 acid amin không thay thế trong chế phẩm protein APC-N và APC-K chiếm tương ứng 37,3% và 41,5% so với tổng lượng protein. Hàm lượng các acid amin như methionine, lysine và threonine trong chế phẩm protein từ rong cao hơn so với các protein có nguồn gốc thực vật. 3.6.3. Hình thái cấu trúc của chế phẩm protein concentrate Hình 3.9 cho thấy cấu trúc của chế phẩm protein concentrate có dạng tấm. Chế phẩm protein tan trong nước APC-N có cấu trúc tấm phẳng và lớn, trong khi chế phẩm protein tan trong kiềm APC-K có cấu trúc dạng tấm nhỏ hơn, bề mặt gồ ghề và xốp. Thông thường các tấm có cấu trúc nhỏ và xốp sẽ có độ hoà tan cao hơn. Cấu trúc vi mô của hai loại protein concentrate có thể được dùng để giải thích khả năng hoà tan của chúng (Hu và cộng sự, 2013). 16 3.6.4. Xác định kích thước và khối lượng phân tử của các phân đoạn protein Chế phẩm protein concentrate từ rong sẽ được phân đoạn bằng sắc ký lọc gel và xác định kích thước phân tử bằng điện di SDS-PAGE. Các phân tử protein có cấu trúc rất phức tạp. Cấu trúc không gian của protein cũng như khả năng bị biến tính trong môi trường chứa SDS có thể ảnh hưởng đến khả năng di động của protein. Bên cạnh đó, protein còn có thể liên kết với các thành phần phi protein khác và rất khó để có thể tách riêng protein ra khỏi các thành phần này trong các điều kiện chạy điện di SDS-PAGE thông thường. Sự ảnh hưởng của hình dạng và kích thước của các thành phần liên kết phi protein đến tính di động của protein là rất khó dự đoán. Theo nhiều nghiên cứu, các protein trong rong thường có bản chất là các glycoprotein. Glycoprotein là các protein có chứa các oligosaccharide/ polysaccharide liên kết cộng hóa trị với các acid amin thích hợp. Các glycoprotein có độ linh động điện di thấp và trọng lượng phân tử cao, do đó tạo ra hiện tượng kéo thành dải trong gel điện di. Hai mẫu protein tan trong nước và tan trong kiềm được gửi đến phòng thí nghiệm Sinh hoá, trường ĐH Khoa học Tự Nhiên, ĐH Quốc a b c d Hình 3.9. Hình ảnh trên kính hiển vi điện tử quét của protein concentrate ở độ phóng đại 500x, thang đo 50µm và ở độ phóng đại 1000x, thang đo 10µm. (a), (b) chế phẩm APC.N; (c), (d) chế phẩm APC.K 17 gia Tp.HCM để xác định kích thước phân tử bằng phương pháp LC- MS/MS, sử dụng kĩ thuật ion hoá mẫu bằng tia lửa điện (ESI) và xác định khối lượng phân tử bằng QTOF. Sắc ký đồ của hai mẫu protein khi phân tích LC/MS/MS thể hiện ở hình 3.15 và hình 3.16. Kết quả phân tích khối phổ của các peak này như sau. - Mẫu protein tan trong nước chứa các mảnh protein có kích thước lần lượt là 11,4 kDa, 13,6 kDa, 15,4 kDa, 27,2 kDa và 38,6 kDa (Hình 3.15) - Mẫu protein tan trong kiềm chứa các mảnh protein có kích thước lần lượt là 11,4 kDa, 21,1 kDa, 27,2 kDa, 34,1 kDa 40,5 kDa và 63,8 kDa (Hình 3.16). 3.7. Xác định tính chất sinh học của protein 3.7.1. Thử nghiệm hoạt tính kháng vi sinh vật Những chủng vi khuẩn kiểm định gây bệnh ở người do ATCC cung cấp: S.aureus, E.coli, P.aeruginosa. Khi so sánh với đối chứng là kháng sinh Kanamycin với nồng độ khuyến nghị là 10µg/ml, hiệu quả kháng khuẩn của protein concentrate từ rong là khá tốt đối với vi khuẩn S. aureus và P. aeruginosa (Đường kính vòng kháng khuẩn đối với 2 vi khuẩn này tương ứng là 6 mm và 6,33 mm). Kháng sinh có hiệu quả kháng vi khuẩn E. coli cao hơn gấp đôi so với khi sử dụng protein concentrate từ rong. Tuy nhiên, giá trị Hình 3.15. Kết quả phân tích MS mẫu APC-N Hình 3.16. Kết quả phân tích MS mẫu APC-K 18 MIC (nồng độ thấp nhất tại đó chế phẩm thể hiện hoạt tính kháng khuẩn) của chế phẩm protein từ rong cao hơn nhiều so với đối chứng là kháng sinh Kanamycin. Điều đó cũng cho thấy, hoạt tính kháng khuẩn của chế phẩm protein từ rong còn khá thấp, chưa đủ để có thể đưa vào ứng dụng thực tế. 3.7.2. Thử nghiệm hoạt tính kháng oxi hoá Khả năng chống oxi hoá của hai chế phẩm Chaetomorpha protein concentrate được thử nghiệm theo các cơ chế khác nhau. Ở cùng một nồng độ, chế phẩm APC.N có hoạt tính bắt gốc tự do DPPH cao hơn hẳn chế phẩm APC.K. Ở cùng nồng độ thử nghiệm là 78,125 µg/ml thì tỉ lệ % hoạt tính bắt gốc tự do DPPH của hai mẫu chế phẩm APC.N và APC.K lần lượt là 73,97% và 22,22%. Hoạt tính bắt gốc tự do DPPH của chế phẩm APC-K ở nồng độ thử nghiệm 312,55 µg/ml là 55,18%. Hoạt tính bắt gốc tự do DPPH của chế phẩm APC.N cao hơn có thể là do trong nhóm protein tan trong nước có chứa Phycocyanin là nhóm protein có hoạt tính kháng oxi hoá. Ngoài ra, phân tử protein thu nhận từ rong cũng có thể chứa các thành phần acid amin có khả năng kháng oxy hóa như cysteine (chứa nhóm thiol), các acid amin chứa nhóm phenolic như tyrosin. Với mục tiêu đánh giá khả năng ứng dụng chế phẩm APC-N trong thực phẩm chức năng giàu chất chống oxi hóa, APC-N tiếp tục được sử dụng để nghiên cứu sâu hơn về khả năng chống oxi hoá bằng các cơ chế khác nhau. Các thí nghiệm được thực hiện tại Phòng thí nghiệm Sinh hoá Trung tâm Sâm và Dược liệu, ĐH Y Dược, Tp HCM. Tóm lại các thí nghiệm đánh giá khả năng kháng oxy hóa của chế phẩm protein tan trong nước từ rong Chaetomorpha sp. cho thấy, APC-N có khả năng kháng oxy hóa bằng nhiều cơ chế khác nhau. Chế phẩm APC-N là protein concentrate với hàm lượng protein 72,8% w/w. Ngoài protein tan trong nước và phycocyanin, chế phẩm APC-N 19 cũng có thể chứa các thành khác có thể đóng góp vào hoạt tính kháng oxy hóa như các polysaccharide hòa tan, polyphenol thực vật, chlorophyll Do còn chứa tạp chất, nên hoạt tính kháng oxy hóa của chế phẩm APC-N so với đối chứng là các hóa chất tinh khiết như vitamin C, Na2EDTA của Sigma còn thấp (thấp hơn khoảng 5-20 lần). Tuy nhiên, trong thí nghiệm trên tế bào màng não chuột, APC-N lại thể hiện khả năng ức chế peroxy hóa lipid màng tế bào tương tự Trolox tinh khiết (Calbiochem Ltd. Co.). Nhìn chung, hoạt tính chống oxi hoá của chế phẩm APC-N theo thứ tự từ mạnh đến yếu dựa trên các cơ chế khả năng bắt gốc tự do DPPH, ức chế peroxy hóa lipid màng tế bào, khả năng liên kết với ion Fe2+, và khả năng trung hoà gốc tự do ABTS•+ với các giá trị IC50 tương ứng là 19,11 µg/ml, 21,52 µg/ml, 31,46 µg/ml và 52,24 µg/ml. Khả năng kháng oxy hóa tốt bằng nhiều cơ chế khác nhau ở nồng độ µg/ml cho thấy triển vọng ứng dụng chế phẩm APC-N để kháng oxy hóa trong thực phẩm chức năng. 3.8. Xác định tính chất chức năng của protein Độ hòa tan là chỉ số khá quan trọng của protein được sử dụng trong công nghệ đồ uống. Protein từ rong có khả năng hòa tan trong môi trường trung tính và kiềm, trong khi protein từ đậu nành có thể tan tốt ở cả môi trường acid, trung tính và kiềm. Chế phẩm APC-N có khả năng hòa tan cao hơn chế phẩm APC-K (12,6 và 10,3% tại pH7), nguyên nhân có thể do tỉ lệ các nhóm ưa nước trên bề mặt phân tử protein trong chế phẩm APC-N cao hơn. Khả năng hấp thu nước của chế phẩm protein APC-K khá thấp (18,5%), thấp hơn so với chế phẩm APC-N (57,8%) và chế phẩm protein đậu nành (49,33%). Phân tử protein trong chế phẩm APC.N có thể có những vùng ưa nước trải rộng hoặc có cấu trúc xoắn cuộn để che giấu các vùng kị nước bên trong. Những vùng ưa nước là nơi sẽ 20 hình thành liên kết hydro với các phân tử nước xung quanh, giúp hấp thu nước lên đại phân tử protein. Khả năng tạo gel có vai trò trong việc tạo ra các tính chất kết cấu của nhiều loại thực phẩm. Gel cũng làm tăng độ nhớt, độ bám dính, và cải thiện liên kết nước và dầu/chất béo. Kết quả cho thấy cả hai chế phẩm protein APC-N và APC-K từ rong Chaetomorpha sp. đều có nồng độ tạo gel tối thiểu (LGC) là 10%, thể hiện khả năng tạo gel tốt so với protein đậu nành và nhiều loại protein thực vật khác. Chế phẩm APC-K có khả năng tạo bọt và làm bền bọt rất tốt. Chế phẩm protein APC-N và protein concentrate từ đậu nành mặc dù có khả năng tạo bọt tương đương với chế phẩm APC-K (40-43%) do khả năng hòa tan tốt tại pH 7, nhưng có thể do thiếu các nhóm acid amin kị nước có thể tương tác tốt với bề mặt phân chia pha (giúp tạo lớp màng protein bao quanh các bọt khí dai, bền) nên hệ bọt tạo ra có độ bền kém hơn (75-78% so với 90%). Chế phẩm APC-K cũng có khả năng tạo nhũ và làm bền hệ nhũ cao. Các nhóm kị nước chiếm tỷ lệ cao trong protein tan trong kiềm giúp chúng tương tác tốt với pha dầu của các giọt béo, đồng thời tỷ lệ các acid amin như aspartic acid, glutamic acid khá cao trong protein của rong Chaetomorpha sp. có thể giúp tạo nên lực đẩy tĩnh điện giữa các giọt béo và cải thiện khả năng làm bền hệ nhũ tương thực phẩm. 3.9. Đánh giá giá trị dinh dưỡng trong điều kiện in vitro Nghiên cứu này tìm hiểu về giá trị dinh dưỡng trong điều kiện in vitro của protein concentrate từ rong lục Chaetomorpha sp. để đánh giá tiềm năng sử dụng chúng như là một nguồn protein thực vật mới trong thực phẩm. Với hàm lượng protein đạt 76,3% và khả năng tiêu hóa IVDP hơn 83,8%, chế phẩm APC-K có giá trị PDCAAS của các acid amin thiết yếu lớn hơn 1 ngoại trừ histidine. Hàm lượng histidine trong chế phẩm APC- 21 K đáp ứng 95% nhu cầu của người trưởng thành theo khuyến cáo của WHO (2007). Chế phẩm APC-N có hàm lượng protein 72,8%, khả năng tiêu hóa IVDP là 79. Chế phẩm này bị thiếu hụt hai acid amin thiết yếu gồm lysine và histidine với chỉ số PDCAAS tương ứng là 0,95 và 0,73. Như vậy, chế phẩm APC-K có giá trị về mặt dinh dưỡng cao hơn chế phẩm APC-N. 3.10. Đánh giá giá trị dinh dưỡng của chế phẩm APC-K trong điều kiện in vivo Sau 4 tuần, mức độ tăng trọng lượng cơ thể của 3 nhóm chuột có sự khác biệt; nhóm chuột ăn thức ăn chứa protein đậu nành và chế phẩm A