Tóm tắt Luận án Nghiên cứu tổng hợp các hợp chất lai của một số triterpenoid có chứa nhóm benzamide và hydroxamate

heo phương pháp của Mossman trên hai dòng tế bào ung thư ở người là KB và Hep-G2. B-NỘI DUNG CỦA LUẬN ÁN CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN Phần tổng quan của luận án gồm 25 trang trình bày các nội dung chính sau: - Các dẫn xuất triterpenoid và hoạt tính sinh học của chúng. - Tổng hợp và hoạt tính sinh học của lớp chất benzamide - Tổng hợp và hoạt tính sinh học của lớp chất hydroxamate CHƯƠNG 2. THỰC NGHIỆM 4 Thực nghiệm gồm 35 trang, trình bày chi tiết về các phương pháp nghiên cứu, quy trình tổng hợp, tinh chế, các tính chất vật lý của các sản phẩm nhận được như: điểm chảy, hình thái, màu sắc, hiệu suất phản ứng và dữ liệu chi tiết các phổ IR, HRMS, 1H-NMR, 13C- NMR, LC-MS/MS. Đi từ các dẫn xuất của một số triterpenoid chúng tôi đã tiến hành tổng hợp được 2 dãy phản ứng: 1 dãy các hợp chất lai của triterpenoid có chứa nhóm benzamide và 1 dãy các hợp chất lai của triterpenoid có chứa nhóm hydroxamate. Phương pháp tối ưu được sử dụng các hợp chất này là sử dụng tác nhân hoạt hóa nhóm cacboxylic là BOP và xúc tác là DMAP trong môi trường bazơ yếu là Et3N và tác nhân phản ứng là các amine trong dung môi DMF. Chúng tôi đã đánh giá hoạt tính gây độc tế bào của các hợp chất tổng hợp được trên 2 dòng tế bào ung thư ở người là KB và Hep-G2. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Mục tiêu của đề tài Đầu tiên thực hiện các chuyển hóa nhóm –OH ở C-28 của một số triterpenoid để tạo thành các dẫn xuất ester và dẫn xuất amide, sau đó cho phản ứng với các amine khác nhau để tạo thành các hợp chất mới có chứa nhóm benzamide và hydroxamate. Một số hợp chất triterpenoid thì được cho phản ứng trực tiếp luôn ở C-28 với các amien khác nhau như trong sơ đồ 3.1. 5 Sơ đồ 3.1: Chiến lược mục tiêu của luận án 3.2. Kết quả tổng hợp các hợp chất lai của một số triterpenoid có chứa nhóm benzamide 3.2.1. Kết quả tổng hợp các hợp chất lai của betulin có chứa nhóm benzamide qua cầu nối ester Để tổng hợp các dẫn chât benzamide qua cầu nối ester, đầu tiên luận án tiến hành tổng hợp các dẫn xuất ester của betulin. Betulin (1) được cho phản ứng với các anhydride acid cacboxylic với tỉ lệ mol là 1:4 trong dung môi CH2Cl2 khan với xúc tác bazơ là triethyl amine, trong thời gian phản ứng là 24 giờ. Các dẫn xuất acid 76a-f thu được là các tinh thể màu trắng, có hiệu suất tổng hợp từ 60% đến 79%. Phổ hồng ngoại (IR) của các hợp chất 76a xuất hiện vân hấp thụ ở 1732 và 1642 cm-1 là đặc trưng của nhóm -C=O trong nhóm chức ester và acid trong khi đó phổ hồng ngoại của betulin không xuất hiện các 6 vân hấp thụ này. Trên phổ cộng hưởng proton 1H-NMR xuất hiện tín Sơ đồ 3.2: Sơ đồ tổng hợp các chất 77a-e hưởng doublet doublet của proton H-3 (3,19 ppm) với hằng số J = 11 và 5 Hz, các tín hiệu ở Ha-28 và Hb-28 xuất hiện lần lượt ở 4,31 và 3,90 ppm; các tín hiệu singlet 1H của Ha-29 và Hb-29 xuất hiện ở 4,68 và 4,58 ppm, 6 nhóm methyl xuất hiện đầy đủ với tín hiệu singlet ở vùng 0,75 - 1,68 ppm, các tín hiệu này không thay đổi nhiều so với phổ chuẩn của betulin. Ngoài ra trên phổ proton của hợp chất 76a còn xuất hiện đầy đủ các proton ở mạch nhánh (2,71-2,64 ppm, 2H-2’ và 2H-3’). Riêng hợp chất 76e tác nhân phản ứng là anhydride acid cis-1,2,3,6-tetrahydro phtalic khi phản ứng với betulin tạo thành dẫn xuất ester 76e thì thấy rằng hai tín hiệu cộng hưởng của mỗi proton Ha-28 và Hb-28 đã bị tách làm hai tín hiệu doublet với cường độ 0,5H hằng số tương tác J là 11,0 Hz cho phép khẳng định cấu hình cis ở nối đôi của anhydride acid cis-1,2,3,6-tetrahydro phtalic đã chuyển thành cấu hình trans ở hợp chất 76e khi mà cho anhydride acid này phản ứng với betulin. Các hợp chất khác cũng được chứng minh tương tự. So sánh các kết quả phân tích phổ này với tài liệu 7 tham khảo [66] có thể khẳng định cấu trúc của các dẫn xuất ester 76a-f là phù hợp với sắc ký trên phổ đồ. Hình 3.1: Cấu trúc hóa học và một số đặc trưng vật lí của các hợp chất 76a-f Từ các dẫn xuất ester của acid 76a-e, tiếp tục được cho phản ứng với 1,2-diaminobenzene (tỉ lệ mol là 1:1,5) trong dung môi DMF với sự có mặt của BOP/DMAP/Et3N nhận được các sản phẩm 77a-e. Nhóm chức acid -COOH được chuyển hóa thành nhóm amide, phản ứng này xảy ra nhanh và có hiệu suất cao, sản phẩm của phản ứng rất chọn lọc. Cấu trúc của các sản phẩm 77a-e được khẳng định bằng các dữ liệu phổ. Trên phổ IR của hợp chất 77c xuất hiện pic hấp thụ ở 3373 cm-1 đặc trưng của nhóm -NH và có pic hấp thụ mạnh đặc trưng của nhóm -C=O trên nhóm amide ở 1655 cm-1 . Trên phổ 1H-NMR của hợp chất 77c, bên cạnh các tín hiệu của khung lupan còn xuất 8 hiện thêm các tín hiệu của nhóm benzamide như ở tín hiệu singlet 1H (7,55 ppm) là của nhóm -NH. Tín hiệu ở vùng 7,18 - 6,76 ppm là của vòng thơm, cụ thể tín hiệu doublet doublet ở 7,18 ppm (1H), hằng số J = 1,5 Hz là của proton H-6”; 7,06 ppm (1H, td, J = 7,5; 1,5 Hz, H- 4”); 6,78 (1H, dd, J = 7,5; 2,0 Hz, H-3”) và 6,76 (1H, td, J = 7,5; 1,5 Hz, H-5”) ( hình 3.2) Hình 3.2: Phổ giãn 1H-NMR của hợp chất 77c Trên phổ 13C-NMR của hợp chất 77c xuất hiện đẩy đủ tín hiệu của các nguyên tử cacbon có mặt trong phân tử. Ngoài những tín hiệu của khung lupan thì còn xuất hiện thêm các tín hiệu của nhóm cacbonyl của ester và amide và của vòng thơm, cụ thể như ở tín hiệu 175,6 ppm là của nhóm cacbonyl của ester (C-1’); ở tín hiệu 172,7 ppm là của nhóm cacbonyl của amide (C-4’); tín hiệu của các nguyên tử cacbon trong vòng thơm như sau: ở tín hiệu 142,0 ppm là của C- 2”; 127,5 là của C-1”; 123,5 là của C-6”; ở tín hiệu 118,9 là của C- 5”; 117,2 là của C-3” (hình 3.3). Trên phổ khối lượng phân giải cao của hợp chất 77c tìm thấy mảnh m/z [M+H]+ là 661,4883 (hình 3.4) phù hợp với khối lượng tính toán theo lý thuyết cho công thức phân tử C42H65N2O4 của hợp chất 77c là 661,4866. So sánh các kết quả phân tích phổ này với các tài liệu tham khảo đã được công bố trước 9 đó [38, 41, 42, 88-90] có thể khẳng định cấu trúc của hợp chất 77c phù hợp với các dữ liệu trên phổ đồ, cấu trúc của các hợp chất 77a-b, 77d-e cũng được khẳng định tương tự. Hình 3.3: Phổ giãn 13C-NMR của hợp chất 77c Hình 3.4: Phổ khối lượng LC-MS/MS của hợp chất 77c C_92 #1377 RT: 4.68 AV: 1 NL: 3.64E7 T: FTMS + p ESI Full ms [50.0000-750.0000] 560 580 600 620 640 660 680 700 m/z 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 R e la ti v e A b u n d a n c e 661.48834 699.44305683.46967 664.49823 600.79724578.81519 706.54669622.78101 644.75861556.83197 10 Cơ chế hình thành hợp chất 77c đầu tiên là quá trình thế nguyên tử hydro của hợp chất 76c trong môi trường bazơ yếu là triethyl amine bằng nhóm (NMe2)3P- trong tác nhân hoạt hóa BOP để tạo thành hợp chất trung gian 76c1, tiếp theo dưới xúc tác DMAP hợp chất 76c1 được chuyển thành hợp chất trung gian 76c2 và sau đó là phản ứng thế bằng tác nhân thế ái nhân là 1,2-diaminobenzene để hình thành sản phẩm 77c (sơ đồ 3.3). Sơ đồ 3.3: Cơ chế hình thành hợp chất 77c 3.2.2. Kết quả tổng hợp các hợp chất lai của diacid pentacyclic triterpenoid có chứa nhóm benzamide Bằng các phương pháp tương tự, luận án tổng hợp các hợp chất lai của diacid pentacyclic triterpenoid có chứa nhóm benzamide với mong muốn tìm kiếm các hợp chất lai mới có hoạt tính sinh học lý thú. Dẫn xuất diacid pentacyclic triterpenoid 78a-b được phân lập từ loài Cheffleraoctophylla ( Ivy tree) [91] được cho phản ứng với tác nhân oxy hóa Jone (Cr3O/H2SO4) trong dung môi acetone nhận được các sản phẩm oxy hóa 79a-b [30, 31] (sơ đồ 3.5). Hợp chất 79b sau 11 đó được cho phản ứng trực tiếp với 1,2-diaminobenzen với tỉ lệ mol là 1:1,5 trong dung môi DMF với sự có mặt của BOP/DMAP/Et3N thu được hợp chất 80 (sơ đồ 3.4). Sơ đồ 3.4: Tổng hợp hợp chất 80 Trên phổ 1H-NMR của hợp chất 80 ngoài các tín hiệu của khung lupan còn xuất hiện thêm tín hiệu của nhóm -NH ở 7,47 ppm; Hình 3.5: Phổ 1H-NMR của hợp chất 80 tín hiệu của 4 proton vòng thơm ở 7,08-6,78 ppm (hình 3.5). Trên phổ 13C-NMR cũng xuất hiện đầy đủ tín hiệu của khung lupan và của vòng thơm. Hai nhóm keton vòng của C-3 và C-11 xuất hiện ở vùng 12 trường yếu 213,2 và 210,8 ppm, nhóm cacbonyl C-28 ở 174,6 ppm, các nguyên tử cacbon của vòng thơm xuất hiện ở vùng 118,5 – 140,9 ppm (hình 3.6). Hình 3.6: Phổ 13C-NMR của hợp chất 80 Hình 3.7: Phổ LC-MS/MS của hợp chất 80 Cấu trúc của hợp chất 80 còn được chứng minh bằng phổ khối lượng, trên phổ khối lượng của hợp chất 80 tìm thấy mảnh m/z [M+H]+ là 545,3702 (hình 3.7) phù hợp với khối lượng tính toán C_82 #880 RT: 2.99 AV: 1 NL: 1.98E8 T: FTMS + p ESI SIM ms [542.5000-545.5000] 542.6 542.8 543.0 543.2 543.4 543.6 543.8 544.0 544.2 544.4 544.6 544.8 545.0 545.2 545.4 m/z 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 80 85 90 95 100 R el at iv e A bu nd an ce 545.3702 544.8902543.3550542.8172 13 theo lý thuyết cho công thức phân tử C35H49N2O3 của hợp chất 80 là 545,3737. Hợp chất 79a được tiến hành khử hóa bằng tác nhân khử NaBH4 với tỉ lệ mol là 1:4 trong dung môi MeOH ở nhiệt độ phòng thì nhóm C=O ở vị trí C-3 được khử thành nhóm -OH có cấu hình 3β-hydroxy (hợp chất 81) theo sơ đồ 3.5. Sơ đồ 3.5: Tổng hợp các hợp chất 83a-b Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-NMR của chất 81 xuất hiện tín hiệu của một proton doublet ở vị trí δH 3,71 ppm (dd, J = 2,5 Hz, H-3β) đặc trưng cho nhóm 3β-OH ở vị trí C-3. Để bảo vệ nhóm 3β- OH này thì trước khi cho phản ứng với 1,2-diaminobenzene, hợp chất 81 được acetyl hóa bằng tác nhân anhydride axetic với tỉ lệ mol là 1:1,5 trong dung môi DCM, nhận được sản phẩm 3-acetyl (82). Hợp chất 82 sau đó được cho phản ứng với 1,2-diaminobenzene với tỉ lệ mol là 1:1,5 trong dung môi DMF trong sự có mặt của BOP/DMAP/Et3N thu được sản phẩm benzamide 83a (sơ đồ 3.5). Để thu thêm được một sản phẩm benzamide mới nữa thì hợp chất 83a 14 tiếp tục được thủy phân bằng bằng tác nhân LiOH trong dung môi MeOH thu được hợp chất 83b (sơ đồ 3.5). Cấu trúc của các hợp chất 83a-b cũng được khẳng định tương tự bằng phổ 1H-NMR và 13C- NMR. 3.2.3. Kết quả tổng hợp các hợp chất lai của betulinic acid có chứa nhóm benzamide Betulinic acid (2) cũng là một dẫn chất của triterpenoid với nhiều hoạt tính sinh học nên luận án cũng tiếp tục khai thác hướng Sơ đồ 3.6: Tổng hợp các hợp chất 84 và 85 nghiên cứu tổng hợp các hợp chất benzamide đi từ betulinic acid. Betulinic acid được cho phản ứng với 1,2-diaminobenzene trong dung môi DMF trong sự có mặt của BOP/DMAP/Et3N nhận được sản phẩm 84 (sơ đồ 3.6). Tiếp theo, betulinic acid (2) được oxi hóa bằng tác nhân Jone (Cr3O/H2SO4) trong dung môi acetone thu được hợp chất 69 (sơ đồ 3.6). Nhóm -OH ở vị trí cacbon số 3 trong phân tử đã bị oxy hóa, điều này được khẳng định trên phổ proton khi tín hiệu đặc trưng của proton H-3 không xuất hiện trên phổ của hợp chất 69. Ngoài ra trên 15 phổ IR của hợp chất 69, xuất hiện tín hiệu hấp thụ đặc trưng của nhóm cacbonyl keton vòng tại bước sóng 1701 cm-1. Như vậy các dữ liệu cho phép khẳng định cấu trúc của hợp chất 69 [30,31]. Hợp chất 69 sau đó được cho phản ứng với 1,2-diaminobenzene trong dung môi DMF trong sự có mặt của BOP/DMP/Et3N nhận được sản phẩm benzamide 85 (sơ đồ 3.6). Cấu trúc của hợp chất 84 và 85 cũng được chứng minh tương tự. 3.2.4. Kết quả tổng hợp các hợp lai của một số triterpenoid khác có chứa nhóm benzamide Ursolic acid (3) và 3-acetoxy-21-oxolup-18-ene-28-oic acid (5) cũng là những dẫn chất triterpenoid được nghiên cứu nhiều. Vì thế luận án tiếp tục nghiên cứu tổng hợp các hợp chất benzamide đi từ các acid này. Ursolic acid đã được acetyl hóa tương tự như hợp chất 81 để thu được hợp chất 86. Sau đó cho hợp chất 86 phản ứng với 1,2-diaminobenzene trong dung môi DMF trong sự có mặt của BOP/DMAP/Et3N nhận được sản phẩm benzamide 87 (sơ đồ 3.7). Hợp chất cuối cùng là hợp chất triterpenoid (5) cũng được cho phản ứng với 1,2-diaminobenzene với tỉ lệ mol là 1:1,5 trong dung môi DMF trong sự có mặt của BOP/DMAP/Et3N thu được hợp chất 88a. Giống như hợp chất 83a, hợp chất 88a cũng được thủy phân bằng LiOH với tỉ lệ mol là 1:5 trong dung môi MeOH thì nhận được hợp chất 88b (sơ đồ 3.8), trên phổ proton của hợp chất 88b không còn thấy tín hiệu singlet 3H ở 2,05 ppm nữa, điều này chứng tỏ nhóm 3β-acetoxy của hợp chất 88a đã chuyển thành nhóm 3β- hydroxy ở hợp chất 88b. Trên phổ 1H-NMR của hợp chất 87 ngoài các tín hiệu của khung ursan còn xuất hiện tín hiệu singlet 1H ở 7,53 ppm là của nhóm -NH, 4 proton của vòng thơm xuất hiện ở vùng từ 7,13 - 6,77 ppm (hình 3.8). 16 Sơ đồ 3.7: Tổng hợp hợp chất 87 Sơ đồ 3.8: Tổng hợp các hợp chất 88a-b Trên phổ 13C-NMR cũng xuất hiện đầy đủ tín hiệu của các nguyên tử cacbon, nhóm cacbonyl ở C-28 xuất hiện ở 176,6 ppm, nhóm cacbonyl ( CH3C=O) xuất hiện ở tín hiệu 171,0 ppm, 6 nguyên tử cacbon của vòng thơm xuất hiện ở vùng trường mạnh hơn, ở tín hiệu 140,6 ppm là của C-2’; ở tín hiệu 126,6 ppm là của C-1’; ở tín hiệu 126,1 ppm là của C-4’; ở tín hiệu 124,7 ppm là của C-6’; ở tín hiệu 119,4 ppm là cuả C-5’ và ở tín hiệu 118,2 ppm là của C-3’ (hình 3.9). 17 Hình 3.8: Phổ 1H-NMR của hợp chất 87 Hình 3.9: Phổ 13C-NMR của hợp chất 87 Cấu trúc của hợp chất 87 còn được chứng minh bằng phổ khối lượng phân giải phân giải cao. Trên phổ khối lượng phân giải cao của hợp chất 87 tìm thấy mảnh m/z [M+H]+ là 589,4329 (hình 18 3.10) phù hợp với khối lượng tính toán theo lý thuyết cho công thức phân tử C38H57N2O3 của hợp chất 87 là 589,4363. Như vậy, dựa vào các dữ liệu trên có thể khẳng định cấu trúc của hợp chất 87 phù hợp với các dữ liệu trên phổ đồ. Cấu trúc của các hợp chất 88a-b cũng được chứng minh tương tự bằng các phương pháp phổ hiện đại. Hình 3.10: Phổ LC-MS/MS của hợp chất 87 Như vậy, luận án đã nghiên cứu tổng hợp thành công 13 hợp chất lai của một số triterpenoid có chứa nhóm benzamide và đó là những hợp chất mới, các hợp chất thu được với hiệu suất khá cao. Cấu trúc của các sản phẩm đã được chứng minh bằng các phương pháp phổ hiện đại như IR, 1H-NMR, 13C-NMR và LC-MS/MS. 3.3. Kết quả tổng hợp các hợp lai của một số triterpenoid có chứa nhóm hydroxamate Mặc dù nhiều dẫn xuất của acid triterpenoid đã được điều chế và sàng lọc hoạt tính gây độc tế bào của chúng [92-99] nhưng các hợp chất lai của triterpenoid có chứa nhóm hydroxamate thì được mô tả rất ít cho đến nay. Acid hydroxamic là nhóm được nghiên cứu rộng rãi với nồng độ ức chế nằm trong khoảng micromol đến nanomol. Chính vì thế với việc nghiên cứu thành công quy trình tổng hợp các hợp chất lai của một số triterpenoid có chứa nhóm benzamide, bằng các phương pháp tương tự luận án tiếp tục đặt ra hướng nghiên cứu C-94 #1690 RT: 5.74 AV: 1 NL: 1.65E8 T: FTMS + p ESI SIM ms [587.5000-590.5000] 587.6 587.8 588.0 588.2 588.4 588.6 588.8 589.0 589.2 589.4 589.6 589.8 590.0 590.2 590.4 m/z 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 80 85 90 95 100 R el at iv e A bu nd an ce 589.4329 590.4356 588.4661587.5426 19 tiếp theo là tổng hợp các hợp chất lai của một số triterpenoid có chứa nhóm hydroxamate nhằm mục tiêu tìm ra những hợp chất mới có hoạt tính sinh học lý thú. 3.3.1. Kết quả tổng hợp các hợp chất lai của betulin có chứa nhóm hydroxamate qua cầu nối ester Các dẫn xuất ester 76a, 76b, 76e và 76f thu được khi cho betulin phản ứng với các anhydride acid khác nhau (sơ đồ 3.2) được cho phản ứng với H2NOH.HCl hoặc HNMeOMe.HCl với tỉ lệ mol là 1:2 trong dung môi DMF trong sự có mặt của BOP/DMAP thu được các sản phẩm hydroxamate 89a-h (sơ đồ 3.9). Sơ đồ 3.9: Tổng hợp các hợp chất 89a-h Cấu trúc của các hợp chất 89a-h được chứng minh bằng các phương pháp phổ hiện đại. Trong phân tử của các hợp chất này đều có chứa nhóm chức -CONHOH hoặc -CONMeOMe (gọi chung là nhóm hydroxamate). 20 Trên phổ 1H-NMR của hợp chất 89a ngoài xuất hiện đầy đủ tín hiệu proton của khung lupan, còn xuất hiện thêm tín hiệu singlet 1H ở vùng trường yếu 10,39 ppm là đặc trưng của nhóm -NH, tín hiệu singlet 1H ở 8,69 ppm là của nhóm -OH trong -CONHOH (hình 3.11). Trên phổ 13C-NMR ngoài các tín hiệu của khung lupan, đặc biệt là nhóm cacbonyl của ester xuất hiện ở 172,8 ppm còn xuất hiện nhóm cacbonyl ở 168,3 ppm là của nhóm cacbonyl trong -CONHOH (hình 3.12). Trên phổ hồng ngoại IR cũng xuất hiện tín hiệu ở 3354 cm-1 với đỉnh nhọn là đặc trưng của nhóm -NH, ngoài nhóm cacbonyl của ester C-28 ở tín hiệu 1706 cm-1 còn xuất hiện thêm tín hiệu ở 1698 cm-1 là của nhóm cacbonyl trong -CONHOH. Hình 3.11: Phổ 1H-NMR của hợp chất 89a Trên phổ khối lượng của hợp chất 89a tìm thấy mảnh m/z [M+H]+: 558,3437 (hình 3.13) phù hợp với khối lượng tính toán theo lý thuyết cho CTPT C34H56NO5 là 558,3458. So sánh các kết quả phân tích phổ này với các tài liệu tham khảo đã được công bố trước đó [62, 63], có thể khẳng định cấu trúc của hợp chất 89a phù hợp với dữ liệu phổ đồ. 21 Hình 3.12: Phổ 13C-NMR của hợp chất 89ª Hình 3.13: Phổ LC-MS/MS của hợp chất 89a C-B21L2 #5920 RT: 14.88 AV: 1 NL: 4.90E6 T: FTMS + p ESI SIM ms [556.5000-559.5000] 556.6 556.8 557.0 557.2 557.4 557.6 557.8 558.0 558.2 558.4 558.6 558.8 559.0 559.2 559.4 m/z 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 80 85 90 95 100 R e la ti v e A b u n d a n c e 558.3437 559.3469 557.5972 557.8488 558.1019557.3305 558.6008 559.0940556.5800 558.8276557.2203 22 Sơ đồ 3.10:Cơ chế hình thành sản phẩm 89a Hình 3.14: Phổ 1H-NMR của hợp chất 89b Đối với hợp chất 89b trên phổ 1H-NMR ngoài tín hiệu của khung lupan còn xuất hiện thêm tín hiệu singlet 3H ở 3,72 ppm là đặc 23 trưng cho nhóm -NMe và tín hiệu singlet 3H ở 3,17 ppm là của nhóm -OMe (hình 3.14). Trên phổ 13C-NMR ngoài nhóm -C=O của este (C-28) ở tín hiệu 173,3 ppm, còn xuất hiện thêm tín hiệu ở 171,1 ppm là của nhóm -C=O trong nhóm -CONMeOMe (hình 3.15). Trên phổ IR xuất hiện hai tín hiệu ở 1733 và 1667 cm-1 là của hai nhóm - C=O này. Hình 3.15: Phổ 13C-NMR của hợp chất 89b Hình 3.16: Phổ LC-MS/MS của hợp chất 89b Hợp chất 89b còn được chứng minh bằng phổ khối lượng phân giải cao, trên phổ khối lượng tìm thấy mảnh m/z [M+H]+: 586,2869 (hình C-B28 #4569 RT: 11.49 AV: 1 NL: 1.59E5 T: FTMS + p ESI SIM ms [584.5000-587.5000] 585.5 585.6 585.7 585.8 585.9 586.0 586.1 586.2 586.3 586.4 586.5 586.6 586.7 586.8 586.9 587.0 587.1 587.2 m/z 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 80 85 90 95 100 R el at iv e A bu nd an ce 586.2869 586.0152 586.7262 24 3.16) phù hợp với khối lượng tính toán theo lý thuyết cho CTPT C36H60NO5 là 586,2866. So sánh với các dữ liệu phổ ở một số tài liệu đã được công bố trước đó [62, 63], có thể khẳng định cấu trúc dự kiến của hợp chất 89b như trên phổ đồ. Cấu trúc của các hợp chất khác cũng được khẳng định tương tự. 3.3.2. Kết quả tổng hợp các hợp chất lai của một số triterpenoid khác có chứa nhóm hydroxamate qua cầu nối amide Đầu tiên là tổng hợp các dẫn xuất amide 91, 93, 95: Betulinic acid (2), 3-acetoxy-21-oxolup-18-ene-28-oic acid (5) và hợp chất 81 được cho phản ứng với 6-aminohexanoic acid với tỉ lệ mol là 1:2 trong dung môi DMF, trong sự có mặt của tác nhân BOP và xúc tác DMAP trong khoảng thời gian 24 giờ thu được các dẫn xuất amide 91, 93, 95. Hình 3.17: Phổ 1H-NMR của hợp chất 91 Trên phổ 1H-NMR của các hợp chất này ngoài các tín hiệu của khung lupan còn xuất hiện thêm tín hiệu vân phổ có dạng triplet 1H ứng với độ dịch chuyển từ 5,67-5,80 ppm (trong dung môi CDCl3), điều này cho thấy nhóm cacboxylic của các acid 2, 5 và 81 đã được chuyển thành nhóm amide (hình 3.17). Các hợp chất 91, 93, 95 sau đó được cho phản ứng với H2NOH.HCl hoặc HNMeOMe.HCl 25 với tỉ lệ mol là 1:2 trong dung môi DMF trong sự có mặt của BOP/DMAP thu được các hợp chất hydroxamate 92a-b, 94a-b và 96a-b (sơ đồ 3.11; 3.12 và 3.13). Sơ đồ 3.11: Tổng hợp các hợp chất 90a-b, 92a-b 26 Sơ đồ 3.12: Tổng hợp các hợp chất 94a-b Sơ đồ 3.13: Tổng hợp các hợp chất 96a-b Cấu trúc của các hợp chất cũng được chứng minh bằng các phương pháp phổ hiện đại. Trên phổ 1H-NMR của hợp chất 92a ngoài các tín hiệu của khung lupan còn xuất hiện thêm tín hiệu singlet 1H ở 10,30 ppm là đặc trưng của nhóm -NH và tín hiệu 27 singlet 1H ở 8,61 ppm là của nhóm -OH trong nhóm hydroxamic - CONHOH, ngoài ra còn xuất hiện tín hiệu triplet 1H ở 7,37 ppm là đặc trưng của nhóm -NH trong nhóm amide ở cầu nối ankyl (do tương tác với 2 proton của nhóm -CH2 ở vị trí 1’(phần cầu nối ankyl) nên vân phổ có dạng triplet và cộng hưởng ở trường mạnh hơn) (hình 3.18). Hình 3.18: Phổ 1H-NMR của hợp chất 92a Hình 3.19: Phổ 13C-NMR của hợp chất 92a 28 Trên phổ 13C-NMR của hợp chất 92a ngoài tín hiệu 206,9 ppm của nhóm xeton vòng và 170,1của CH3CO- còn xuất hiện thêm tín hiệu nhóm cacbonyl của amid ở C-28 tại tín hiệu 173,1 ppm và nhóm cacbonyl trong nhóm hydroxamic ở 172,8 ppm (hình 3.19). Trên phổ khối lượng phân giải cao tìm thấy mảnh m/z [M+H]+: 641,4489 (hình 3.20) phù hợp với khối lượng tính toán theo lý thuyết cho CTPT C38H61N2O6 là 641,4429. Như vậy, cấu trúc dự kiến của hợp chất 92a phù hợp với phổ đồ. Cấu trúc của các hợp chất khác cũng được chứng minh tương tự. Hình 3.20: Phổ LC-MS/MS của hợp chất 92a Khi nghiên cứu thực nghiệm về 2 proton trong nhóm chức hydroxamic -CONHOH tác giả Rachel Cold [100] đã cho thấy rằng trong dung môi không proton như DMSO, H của N-H hoạt động như là ptoton acid hơn là N-OH. Do linh động hơn nên -NH cộng hưởng ở trường yếu hơn (δ = 10,30-12,37 ppm). Hơn nữa các proton này rất linh động và dễ bị trao đổi hoặc hỗ biến cho nhau nên một số chất cho tín hiệu -NH, -OH rất yếu như ở hợp chất 89g hai tín hiệu cộng hưởng của mỗi proton -NH và -OH bị tách làm hai tín hiệu doublet với cường độ 0,5H hoặc có trường hợp không cho tín hiệu trên phổ đồ như chất 89e. C-44 #1146 RT: 3.90 AV: 1 NL: 6.78E8 T: FTMS + p ESI SIM ms [639.5000-642.5000] 639.6 639.8 640.0 640.2 640.4 640.6 640.8 641.0 641.2 641.4 641.6 641.8 642.0 642.2 642.4 m/z 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 80 85 90 95 100 R el at iv e A bu nd an ce 641.4489 642.4512 640.4673 29 Ngoài các nhóm trên thì một nhóm các proton quan trọng khác trong cấu trúc của các dãy chất trên là các proton mạch nhánh. Đa số các chất đều có đủ số proton mạch nhánh với độ dịch chuyển hóa học của các nhóm -CH2 trong khoảng 1,25-3,94 ppm. Các chất được đo trog dung môi DMSO nên do ảnh hưởng của các proton của nhóm methyl trong dung môi DMSO deuteri hóa không hoàn toàn ( = 2,50 ppm) nên trong một số chất không quan sát được 2 proton của nhóm -CH2 cho tín hiệu tại vị trí khoảng 2,50 ppm. Như vậy, chúng tôi đã nghiên cứu tổng hợp thành công 16 hợp chất lai của một số triterpenoid có chứa nhóm hydroxamate qua cầu nối ester và cầu nối amide. Các hợp chất mới tổng hợp đước đã được chứng minh bằng các phương phổ hiện đại như phổ hồng ngoại IR, phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-NMR và 13C-NMR, phổ khối lượng LC-MS/MS. 3.4. Hoạt tính chống ung thư của các hợp chất lai Với mong muốn tổng hợp các hợp chất lai có hoạt tính sinh học nhằm tìm kiếm các hợp chất mới có hoạt tính chống ung thư nên các hợp chất lai của một số triterpenoid có chứa nhóm benzamide và hydroxamate sau khi được tổng hợp đã được tiến hành thử hoạt tính gây độc tế bào in vitro đối với hai dòng tế bào ung thư ở người là KB (ung thư biểu mô) và Hep-G2 (ung thư gan), cùng với phép thử hoạt tính của chất chuẩn Ellipticine. Quá trình khảo sát hoạt tính gây độc tế bào được thực hiện tại phòng Hóa Sinh Ứng Dụng của Viện Hóa Học. Kết quả thử hoạt tính của các hợp chất được trình bày trong bảng 3.1 và bảng 3.2. 30 Bảng 3.1: Kết quả thử hoạt tính của các hợp chất lai có chứa nhóm benzamide STT Hợp chất IC50 (µM) KB IC50 (µM) Hep-G2 1 77a 202,2 202,2 2 77b 197,9 166,0 3 77c 193,7 115,6 4 77d 193,7 128,9 5 77e 186,9 108,0 6 80 214,0 234,9 7 83a 222,7 168,5 8 83b 240,2 176,8 9 84 15,4 12,1 10 85 234,9 234,9 11 87 216,6 158,7 12 88a 68,2 137,1 13 88b 152,5 209,0 14 Ellipticine 1,3 1,5 31 Bảng 3.2: Kết quả thử hoạt tính của các hợp chất lai có chứa nhóm hydroxamate STT Hợp chất IC50 (µM) KB IC50 (µM) Hep-G2 1 89a 29,76 23,39 2 89b 55,71 93,25 3 89c 8,5 67,11 4 89d 87,71 65,77 5 89g 52,25 71,75 6 89h 58,14 113,70 7 89e 7,60 97,0 8 89f 63,84 9,13 9 90a 23,15 24,72 10 90b 50,09 141,03 11 92a 3,06 4,22 12 92b 68,2 137,1 13 94a 43,71 64,42 14 94b 103,76 106,66 15 96a 35,08 45,07 16 96b 5,18 6,21 17 Ellipticine 1.3 1,5 32 Kết quả thử hoạt tính của các sản phẩm lai đã được thể hiệ