Tóm tắt Luận án Nghiên cứu tổng hợp một số dẫn xuất Tritecpenoit khung lupan và thăm dò hoạt tính sinh học của chúng

betulinic, axit usolic, các dẫn xuất este hóa tại nhóm ancol bậc 2 tại vị trí C-3 trên khung tritecpenoit, và các dẫn xuất khác của tritecpenoit) với thuốc chống HIV -AZT qua cầu triazole . 2.2. Nhiệm vụ của luận án 2.2.1. Nghiên cứu tổng hợp các este của tritecpenoit với propagyl ancol - Tổng hợp este của axit betulinic với propagyl ancol - Tổng hợp este của axit axit usolic với propagyl ancol - Tổng hợp este của các dẫn xuất tritecpenoit khác với propagyl ancol 2.2.2. Nghiên cứu tổng hợp các amit của tritecpenoit với propagyl amin - Tổng hợp amit của axit betulinic với propagyl ancol - Tổng hợp amit của axit axit usolic với propagyl ancol - Tổng hợp amit của các dẫn xuất tritecpenoit khác với propagyl ancol 2.2.3. Nghiên cứu tổng các dẫn xuất lai của tritecpenoit với AZT qua cầu este- triazole - Tổng hợp các hợp chất lai của axit betulinic với AZT qua cầu este-triazole - Tổng hợp các hợp chất lai của usolic với AZT qua cầu este-triazole - Tổng hợp các hợp chất lai của dẫn xuất tritecpenoit khác với AZT qua cầu este- triazole 2.2.4. Nghiên cứu tổng các dẫn xuất lai của tritecpenoit với AZT qua cầu amit- triazole - Tổng hợp các hợp chất lai của axit betulinic với AZT qua cầu amit-triazole - Tổng hợp các hợp chất lai của usolic với AZT qua cầu amit-triazole 2 - Tổng hợp các hợp chất lai của dẫn xuất tritecpenoit khác với AZT qua cầu amit- triazole 2.2.5. Xác định hoạt tính gây độc tế bào của các hợp chất lai Các dẫn chất lai của tecpenoit được thử hoạt tính gây độc tế bào trên 2 dòng tế bào ung thư thực nghiệm bao gồm: tế bào ung thư biểu mô KB (Human epidermic carcinoma), ung thư gan Hep-G2. Các dẫn chất lai của tecpenoit được thử hoạt tính chống HIV trên chủngvirus là HIV-1 NL 4.3 và HIV-2 (ROD) 3. Những đóng góp mới của luận án 1. Luận án đã góp phần nghiên cứu thành công quy trình tổng hợp 12 hợp chất lai mới giữa tritecpenoit với AZT qua cầu nối este-triazole. 2. Luận án đã nghiên cứu thành công quy trình tổng hợp 19 hợp chất lai mới giữa tritecpenoit với AZT qua cầu nối amit-triazole. 3. Đã nghiên cứu hoạt tính gây độc tế bào trên hai dòng tế bào ung thư biểu mô (KB) và ung thư gan (Hep-G2) của các hợp chất lai mới tritecpenoit và AZT qua cầu este- triazol, phát hiện được 5 hợp chất 157a, 159b, 160a, 160c và 161 có hoạt tính mạnh với giá trị 5,9µM <IC50<8,5µM. 4. Đã nghiên cứu hoạt tính gây độc tế bào của các hợp chất tritecpenoit với AZT qua cầu nối amit-triazole trên hai dòng tế bào ung thư biểu mô (KB )và ung thư gan (Hep- G2). Đã phát hiện được 4 hợp chất 184, 185b, 185c và 186b thể hiện hoạt tính gây độc tế bào mạnh với giá trị IC50 <10 µM. 5. Đã thử hoạt tính kháng HIV và khả năng gây độc tế bào của 6 dẫn chất lai triterpenoit-AZT 158a, 157a, 157c, 186b, 187b, 187a. Kết quả thử hoạt tính cho thấy, hầu hết các dẫn chất lai triterpenoit –AZT có độc tính cao (CC50 < 11 µg/ml) và có hoạt tính kháng HIV thấp hơn so với chất đối chứng. 4. Bố cục của luận án Luận án có 131 trang bao gồm: Mở đầu: 2 trang Chương 1: Tổng quan 26 trang Chương 2: Thực nghiệm 62 trang Chương 3: Kết quả và thảo luận 30 trang Kết luận: 1 trang Phần tài liệu tham khảo có 83 tài liệu về lĩnh vực liên quan của luận án, được cập nhật đến năm 2016. 3 Phần phụ lục gồm 83 trang gồm các loại phổ của các chất tổng hợp được. 5. Phương pháp nghiên cứu Các chất được tổng hợp theo các phương pháp tổng hợp hữu cơ hiện đại đã biết, có cải tiến và vận dụng thích hợp vào các trường hợp cụ thể. Sản phẩm phản ứng được làm sạch bằng phương pháp sắc kí cột và kết tinh lại. Cấu trúc của sản phẩm được xác định bằng các phương pháp phổ như: IR, 1H-NMR, 13C-NMR và MS. B-NỘI DUNG CỦA LUẬN ÁN Chương 1. TỔNG QUAN Tổng quan gồm 26 trang, tổng kết tài liệu về tình hình nghiên cứu tổng hợp các dẫn chất lai của tritecpenoit với các hợp chất thuốc đã biết của các tác giả trong và ngoài nước. Chương 2. THỰC NGHIỆM Thực nghiệm gồm 62 trang, trình bày chi tiết về các phương pháp nghiên cứu, quy trình tổng hợp, tinh chế, các tính chất vật lý của các sản phẩm nhận được như: điểm chảy, hình thái, màu sắc, hiệu suất phản ứng và dữ liệu chi tiết các phổ MS, IR, 1H NMR và 13C NMR. 1. Chúng tôi đã đưa ra phương pháp tổng hợp dãy các hợp chất propargyl este của axit betulinic, axit usolic và các dẫn chất tritecpenoit khác. 2. Chúng tôi đã đưa ra phương pháp tổng hợp dãy các hợp chất propargyl este của axit betulinic, axit usolic và các dẫn chất tritecpenoit khác. 3. Chúng tôi đã đưa ra phương pháp tổng hợp dãy các hợp chất lai của tritecpenoit với AZT qua cầu este-triazole. 4. Chúng tôi đã đưa ra phương pháp tổng hợp dãy các hợp chất lai của tritecpenoit với AZT qua cầu amit-triazole. 5. Chúng tôi đã xác định hoạt tính gây độc tế bào và hoạt tính chống HIV của một số Chương 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Cấu trúc lai giữa axit betulinic có hoạt tính chống HIV và thuốc AZT đang được sử dụng điều trị HIV đã được nghiên cứu tổng hợp và thể hiện hoạt tính chống HIV mạnh [31]. Từ ý tưởng trên, luận án này nghiên cứu tổng hợp các hợp chất mới có cấu trúc lai của các tritecpenoit với AZT qua cầu nối este-triazole và qua cầu nối amit-triazole đồng thời nghiên cứu thử hoạt tính gây độc tế bào trên các dòng tế bào ung thư Hep-G2, KB và hoạt tính chống HIV của các sản phẩm lai tổng hợp được nhằm tìm kiếm các hợp chất mới có hoạt tính sinh học lý thú. 4 3.1. Tổng hợp các dẫn chất tritecpenoit với AZT qua cầu nối este-triazole 3.1.1. Tổng hợp cấu trúc lai của axit betulinic với AZT qua cầu este-triazole Việc gắn kết AZT với dẫn xuất của tritecpenoit để tạo thành hợp chất chứa hai thành phần thông qua cầu nối este-triazole được thực hiện thông qua phản ứng click. Phản ứng “click" là phương pháp hiệu quả để tổng hợp các dẫn xuất triazol, đặc biệt là tổng hợp các hợp chất lai có cầu nối triazol [2]. Để thực hiện được quá trình này nhóm cacboxylic của axit betulinic 2 cần được chuyển hóa thành propargyl este 151a bằng cách cho tác dụng với hai đương lượng propargyl bromid trong hỗn hợp dung môi DMF/THF (1:1) tại nhiệt độ phòng trong sự có mặt của xúc tác Cs2CO3 nhận được hợp chất alkyne 151a (sơ đồ 3.1). Sơ đồ 3.1: Tổng hợp hợp chất lai chất triazole-este AZT-betulinic acid 157a,d Từ hợp chất propargyl este 151a tiến hành phản ứng este hóa của nhóm OH tự do tại vị trí C-3 với các anhydrit khác nhau nhận được 151b-d (sơ đồ 3.1). Cấu trúc của hợp chất 151a được chứng minh bằng các phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân. Trên phổ 1H-NMR của 151a xuất hiện thêm hai cặp tín hiệu doublet-doublet tại 4,69 và 4,64 ppm với hằng số tương tác J=2,5 Hz là đặc trưng của nhóm metylen của propagyl, tín hiệu của nhóm ankin bậc 1 của propagyl cộng hưởng tại 2,42 ppm (t, J=2,5 Hz). 5 Hình 3.1: Phổ 1H-NMR của hợp chất 151a Hình 3.2: Phổ 13C-NMR của hợp chất 151a Ngoài ra trên phổ 13C-NMR của hợp chất 151a xuất hiện thêm hai tín hiệu cacbon của nhóm ankin tại δc ppm: 78,1 (C≡CH) và 74,3 (C≡CH). Các dữ liệu phân tích trên cho phép khẳng định cấu trúc của hợp chất 151a. Tiếp theo, hợp chất lai giữa axit betulinic và AZT qua cầu nối este-triazole được thực hiện thông qua phản ứng click bằng cách cho hợp chất ankin 151a-d tác dụng 6 với 0,8 mol đương lượng AZT trong dung môi t-BuOH, xúc tác CuI (0,2 đương lượng) tại nhiệt độ 70oC trong khoảng 12h nhận được hợp chất triazole-este AZT- betulinic 157a-d với hiệu suất 51-61% (sơ đồ 3.1).Cấu trúc của các sản phẩm 157a được chứng minh bằng các phương pháp phổ hiện đại. Trên phổ 1H-NMR của hợp chất 157a xuất hiện đầy đủ các tín hiệu cộng hưởng của khung terpenoid, triazol và AZT.Tín hiệu cộng hưởng singlet tại 7,76 ppm được gán cho proton duy nhất của khung triazol, giá trị cộng hưởng tại 7,39 ppm dạng singlet được gán cho proton trên vòng thơm thymindine của AZT. Các tín hiệu của khung terpenoid được thể hiện tương tự như của chất 151a. Hình 3.3: Phổ 1H-NMR của hợp chất 157a Phổ 13C-NMR của 157a xuất hiện đầy đủ tín hiệu cộng hưởng của 43 nguyên tử cacbon của phân tử trong đó có ba tín hiệu cộng hưởng của cacbonyl ở các vị trí176,2 ppm được gán cho nhóm cacbonyl của C-28; tín hiệu tại 163,6 ppm được gán cho nhóm cacbonyl của thymidin và tín hiệu cộng hưởng tại 150,3 được gán cho nhóm cacbonyl amit của thymidin. Tín hiệu cộng hưởng vùng trường thấp tại 150,4 được gán cho cacbon olefin tại C-20 của khung cấu trúc. Ngoài ra, tín hiệu cộng hưởng tại 143,6 ppm được gán cho vị trícacbon bậc 4 của khung triazol; tín hiệu tại 137,8 ppm được gán cho nhóm CH của thymidin; tín hiệu cộng hưởng tại 124,1 ppm được gán cho nhóm CH của triazol); tín hiệu cộng hưởng tại 170,3 được gán cho cacbon bậc 4 tiếp theo của khung thymidin và tín hiệu tại 109,7 ppm được gán cho 7 cacbon tại vị trí C-29. Ngoài ra, trên phổ IR mất đi tín hiệu dao động đặc trưng của nhóm ankin bậc 1 trong vùng 2163 cm-1, đồng thời xuất hiện thêm các tín hiệu hấp thụ đặc trưng của C=N và vòng thơm ở 1696; 1460; 1383 cm1. Kết quả phân tích các dữ liệu phổ trên cho phép khẳng định cấu trúc của 157a. Hình 3.4: Phổ 13C-NMR của hợp chất 157a Cơ chế hình thành sản phẩm 157a được giải thích theo phản ứng click như sau: Sơ đồ 3.2: Cơ chế hình thành chất 157a Như vậy, luận án đã tổng hợp thành công 4 hợp chất lai giữa axit betulinic và AZT qua cầu nối este-triazole 157a-d qua hai và ba bước phản ứng với hiệu suất cao. Từ thành công này, luận án tiếp tục nghiên cứu tổng hợp các dẫn xuất của tritecpenoit với AZT qua cầu nối este-triazole khác nhằm tìm kiếm các cấu trúc lai mới. 8 3.1.2. Tổng hợp cấu trúc lai của dẫn xuất diaxit pentacyclic tritecpenoit với AZTqua cầu este-triazole Luận án tiếp tục tổng hợp các hợp chất lai của AZT với các dẫn xuất diaxit pentacyclic tritecpenoit chiết tách được từ thực vật qua cầu nối este-triazole nhằm tìm kiếm các hợp chất mới có hoạt tính sinh học lý thú. Quá trình phản ứng được thực hiện như sau tương tự như các phần đã trình bày ở trên: Dẫn xuất diaxit pentacyclic tritecpenoit 188a-b được phân lập từ cây chân chim (Cheffleraoctophylla) phản ứng với 4 đương lượng tác nhân oxy hóa Jone trong dung môi axeton nhận được sản phẩm oxy hóa 150a-b (sơ đồ 3.3). Sơ đồ 3.3: Tổng hợp hợp chất lai chất triazole-este AZT-tritecpenoit 165a,b 3.1.3. Tổng hợp cấu trúc lai của dẫn xuất axit ursolic và oleanoic với AZTqua cầu este-triazole Axitursolic và oleanoic là các dẫn chất tritecpenoit có nhiều hoạt tính sinh học, do đó luận án cũng tiến hành nghiên cứu tổng hợp các hợp chất lai của ursolic acid và oleanoic acid với AZT qua cầu este-triazole bằng phương pháp tương tự như trên. Hợp chất ursolic acid 3 và oleanoic acid 4 được phản ứng với 2 đương lượng mol propargyl bromide trong hỗn hợp dung môi DMF/THF (1:1) tại nhiệt độ phòng trong sự có mặt của xúc tác Cs2CO3 nhận được hợp chất alkyne 152a và 152b tương ứng. 9 Sau đó, tiến hành phản ứng click của 152avà 152b với AZT (0.8 mol đương lượng) trong dung môi t-BuOH, xúc tác CuI (0.2 equiv) tại nhiệt độ 70oC trong 12h nhận được hợp chất triazole-este AZT-ursolic 159a và oleanoic 159b với hiệu suất lần lượt 53% và 90%. Cấu trúc của sản phẩm được chứng minh bằng các phương pháp phổ hiện đại (sơ đồ 3.4). Sơ đồ 3.4: Tổng hợp dẫn chất của axit ursolic và oleanoic – AZT 159a,b Một dẫn xuất khác của tritecpenoit là hợp chất oxo acid 150a được nghiên cứu chuyển hóa rồi tiến hành lai hóa với AZT như trong sơ đồ 3.5. Đầu tiên, hợp chất 150a được khử hóa bằng NaBH4 trong MeOH/THF, sau đó tiến hành phản ứng với propagyl bromide trong sự có mặt của hai đương lượng Cs2CO3 trong hỗn hợp dung môi DMF/THF = 1:1 nhận được hợp chất hydroxy este 154 với hiệu suất 56%. Nhóm hydroxyl trong hợp chất 154 được este hóa bằng các tác nhân succinic anhydrit hoặc glutaric anhydrit trong pyridin được các hợp chất 156a và 156b với hiệu suất cao 60 - 96%. Tiếp theo, tiến hành phản ứng tạo vòng triazole Huisgen với xúc tác Cu(I)- giữa các hợp chất alkynes 156a,b và AZT nhận được các hợp chất lai mới 160a và 160b với hiệu suất lần lượt là 50% và 48%. Hợp chất ancol 154 cũng được thực hiện phản ứng click với AZT thu được hợp chất 160c với hiệu suất đạt 56% (sơ đồ 3.5). 10 Sơ đồ 3.5: Tổng hợp dẫn chất lai chất triazole-este AZT160a-c 3.1.4. Tổng hợp cấu trúc lai của dẫn xuất tecpenoids 164 với AZT qua cầu este- triazole Hợp chất cuối cùng là hợp chất terpenoids 164, phân lập từ Ngũ Gia Bì Acanthopanaxtrifoliatus được luận án nghiên cứu tạo phân tử lai hóa. Theo quy trình tương tự như trên, hợp chất 164 được thực hiện phản ứng este hóa với propargyl bromide trong hỗn hợp dung môi DMF/THF (1:1) nhận được hợp chất este 155, tiếp theo hợp chất 155 tạo liên kết với AZT bằng phương pháp click nhận được hợp chất lai tritecpenoit-AZT 161 với hiệu suất cao 67% (sơ đồ 3.6). Sơ đồ 3.6: Tổng hợp dẫn chất lai chất triazole-este AZT 161 3.1.5. Hoạt tính sinh học của các dẫn chất lai tritecpenoit với AZT qua cầu nối este-triazole 11 Từ các hợp chất trung gian và sản phẩm lai tritecpenoit với AZT qua cầu nối este-triazole nhận được ở trên, luận án tiến hành nghiên cứu hoạt tính gây độc tế bào của các dẫn chất tổng hợp được từ đó có thể đưa ra sự liên quan giữa cấu trúc của các hợp chất với hoạt tính sinh học.11 dẫn chất tritecpenoit trung gian 151a-d, 152a,b, 162a,b, 159a,b, 107 và 12 hợp chất lai hóa AZT-triazole-tritecpenoit157a-d, 159a-b, 158a-b, 160a-c, 161 được nghiên cứu hoạt tính gây độc tế bào in vitro trên hai dòng tế bào ung thư người KB, Hep-G2. Bảng 3.1: Kết quả thử hoạt tính của các hợp chất lai tritecpenoit-AZT qua cầu nối triazole-este STT Hợp chất IC50 (µM) KB IC50 (µM) Hep-G2 STT Hợp chất IC50 (µM) KB IC50 (µM) Hep-G2 1 AZT >479 >479 18 96b >255 >255 2 3 27.5 23.85 19 150a 7.68 11.20 3 151a >259 180.06 20 150b 51.36 70.48 4 151b 21.18 50.00 21 162a >267 >267 5 151c 28.70 19.150 22 162b 64.02 59.61 6 151d 12.50 186.38 23 158a >171 >171 7 157a 5.92 7.04 24 158b >168 >168 8 157b 24.69 20.60 25 154 40.10 133.33 9 157c 20.37 18.36 26 156a 10.65 11.41 10 157d 170.46 35.24 27 156b 9.88 27.28 11 163a 31.50 42.86 28 160a 7.31 7.81 12 163b >280 >280 29 160b >148 >148 13 152a 38.05 36.55 30 160c 34.05 7.34 14 152b 24.151 >259 31 164 46.77 58.0 15 159a 28.51 34.04 32 107 21.96 39.67 16 159b 6.26 7.37 33 161 136.66 8.55 17 96a 178.09 222.9 34 Ellipticine 1.21 1.22 12 Kết quả chỉ ra rằng hầu hết các hợp chất đều có hoạt tính gây độc tế bào, trong đó có một số hợp chất lai AZT có hoạt tính gây độc tế bào mạnh. Đặc biệt, ba hợp chất lai AZT-triazole tritecpenoits 157a, 159b và 160a có họat tính gây độc tế bào mạnh trên dòng tế bào KB với giá trị IC50 đạt 5.92 µM-7.31 µM. 5 hợp AZT-triazole tritecpenoits 157a, 159b, 160a, 160c và 161 thể hiện hoạt tính gây độc tế bào mạnh trên dòng tế bào ung thư Hep-G2 với giá trị 7.04 µM < IC50<8.55 µM. Đây là những kết quả rất có giá trị, có ý nghĩa khoa học cao trong lĩnh vực nghiên cứu ung thư của các hợp chất lai. Các hợp chất tritecpenoit-AZT qua cầu triazole-este có hoạt tinh sinh học cao 3.2. Tổng hợp các dẫn chất lai của tritecpenoit với AZT qua cầu nối amit- triazole Từ việc nghiên cứu thành công quy trình tổng hợp hợp chất lai tritecpenoit- AZT qua cầu nối este-triazole xuất phát từ nguyên liệu tritecpenoit propargyl este, bằng phương pháp tương tự luận án tiến hành nghiên cứu tổng hợp hợp chất lai tritecpenoit-AZT qua cầu nối amit-triazole. Axit betulinic 3 được chuyển hóa thành hợp chất propargyl amit 169a bằng cách phản ứng với 1,5 mol đương lượng của propargyl amin, 1,5 mol đương lượng của DCC (N,N'-dicyclohexylcarbodiimide), 1,5 mol đương lượng của HOBt (1- hydroxybenzotriazole) và 2,0 mol đương lượng của DIPEA (N,N- diisopropylethylamin) trong dung môi DMF tại nhiệt độ phòng trong thời gian12h, 13 hiệu suất phản ứng đạt 76% (sơ đồ 3.7). Cấu của hợp chất propargyl amit 169a được chứng minh bằng các phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân. Từ hợp chất propargyl amit 169a đã được tổng hợp tiến hành phản ứng este hóa của nhóm OH tự do tại vị trí C-3 với các anhydrit khác nhau nhận được 169b-c với hiệu suất lần lượt là 93 và 39% (sơ đồ 3.7). Sơ đồ 3.7: Tổng hợp dẫn chất lai chất triazole-amit AZT178a-c Trên phổ 1H-NMR của 169a xuất hiện thêm hai cặp tín hiệu doublet-doublet tại 4,08 và 3,98 ppm với hằng số tương tác J = 2,5 Hz là đặc trưng của nhóm metylen của propagyl, tín hiệu của nhóm ankin bậc 1 của propagyl cộng hưởng tại 2,20 ppm (t, J = 2,0 Hz). 14 Hình 3.8: Phổ 1H-NMR của hợp chất 169a Hình 3.9: Phổ 13C-NMR của hợp chất 169a Ngoài ra trên phổ 13C-NMR của hợp chất 169a xuất hiện đầy đủ các tín hiệu cộng hưởng của 33 nguyên tử cacbon có mặt trong phân tử, đặc biệt là sự xuất hiện của hai nguyên tử cacbon của nhóm ankin tại 80,2 ppm (C≡CH) và 71, 2 ppm (C≡CH). Các dữ liệu phân tích trên cho phép khẳng định cấu trúc của hợp chất 169a. Cơ chế hình thành sản phẩm 169a được thể hiện như sơ đồ sau: Sơ đồ 3.8: Cơ chế hình thành sản phẩm 169a 15 Tiếp theo, thực hiện phản ứng click của hợp chất ankin 169a-c với 0,8 mol đương lượng AZT trong dung môi t-BuOH, xúc tác CuI 0,2 đương lượng tại nhiệt độ 70oC trong 12h nhận được hợp chất triazole-amit AZT-betulinic 178a-c với hiệu suất từ 20-56%. Cấu trúc của các sản phẩm 178a-c được chứng minh bằng các phương pháp phổ hiện đại. Trên phổ 1H-NMR của hợp chất 178a xuất hiện đầy đủ các tín hiệu cộng hưởng của khung terpenoid, triazole và AZT. Hình 3.10. Phổ 1H-NMR của hợp chất 178a Tín hiệu cộng hưởng singlet tại 7,75 ppm được gán cho proton duy nhất của khung triazole, giá trị cộng hưởng tại 7,44 ppm dạng singlet được gán cho proton trên vòng thơm thymindine của AZT. Tín hiệu doublet-boublet của hai proton của nhóm metylen ở cầu nối CONHCH2 cộng hưởng tại các vị trí 4,52 ppm và 4,50 ppm (dd, J = 2,5, 11,0 Hz, CONHCH2). Ngoài ra, trên phổ 1H-NMR còn xuất hiện thêm các tín hiệu đặc trưng của khung terpenoid được thể hiện tương tự như của chất 169a. Trên phổ 13C-NMR của 178a xuất hiện đầy đủ tín hiệu cộng hưởng của 43 nguyên tử cacbon của phân tử trong đó tín hiệu cacbon của ba nhóm CO ở các vị trí 177,2 ppm được gán cho nhóm cabonyl tại C-28; tín hiệu cộng hưởng tại 164,6 ppm là của nhóm cacbonyl của khung thymidin; tín hiệu cộng hưởng tại 150,6 là tín hiệu của nhóm cacbonyl amit của vòng thymidin. 16 Hình 3.11. Phổ 13C-NMR của hợp chất 178a Ngoài ra, tín hiệu của 6 nguyên tử cacbon anken tại các vị trí 150,7 ppm được gán cho vị trí C-20; tín hiệu tại 145,6 ppm được gán cho nguyên tử cacbon bậc IV lai hóa có lai hóa sp (=C= triazol); tín hiệu cộng hưởng tại 137,8 ppm được gán cho nhóm metilen của khung thymidin; tín hiệu cộng hưởng tại 122,1 ppm là của nhóm metilen của khung triazole; tín hiệu tại 170,3 ppm là nguyên tử cacbon bậc IV lai hóa sp2 của vòng triazole; tín hiệu cộng hưởng tại 109,7 được gán cho nguyên tử cacbon tại vị trí C-29. Kết quả phân tích các dữ liệu phổ trên cho phép khẳng định cấu trúc của 178a. Như vậy, luận án đã tổng hợp thành công hợp 3 chất lai giữa axit betulinic và AZT qua cầu nối amit-triazole qua hai và ba bước phản ứng. Đây là thành công quan trọng để luận án tiếp tục nghiên cứu tổng hợp các dẫn xuất của tritecpenoit với AZT qua cầu nối amit-triazole. 3.2.2.Tổng hợp chất lai của ursolic với AZT qua cầu nối amit-triazole Axit ursolic 3 là dẫn chất thuộc nhóm tritecpenoit có nhiều hoạt tính sinh học quý như năng ức chế sự phát triển của tế bào ung thu, giảm béo được nhiều nhà khoa học quan tâm nghiên cứu. Trong phần này luận án tiếp tục được nghiên cứu chuyển hóa axit usolic thành các hợp chất lai với AZT qua cầu amit-triazole nhằm tìm kiếm các hợp chất có cấu trúc mới và hoạt tính sinh học lý thú. Tương tự như tổng hợp các hợp chất lai của axit betulinic, axit usolic phản ứng propargyl amin nhận được amit 170, tiếp theo amit 170 phản ứng click với AZT trong sự có mặt của xúc tác CuI-nhận được hợp chất 179 với hiệu suất phản ứng đạt 64% (sơ đồ 3.9). 17 Sơ đồ 3.9: Tổng hợp dẫn chất lai của ursolic AZT 179 3.2.3.Tổng hợp chất lai của tritecpenoit khác với AZT qua cầu nối amit-triazole Áp dụng quy trình tương tự như trên, các hợp chất axit tritecpenoit 150a, 150b được nghiên cứu lai hóa AZT qua cầu nối amit-triazole. Hợp chất tritecpenoit 150a, 150b được phản ứng với 1,5 mol đương lượng của propargyl amin, 1,5 mol đương lượng của DCC (N,N'-dicyclohexylcar bodiimide), 1,5 mol đương lượng của HOBt (1-hydroxybenzotriazole) và 2,0 mol đương lượng của DIPEA (N,N- diisopropylethylamin) trong dung môi DMF tại nhiệt độ phòng trong khoảng 12h nhận được hợp chất propargyl amit 171a, 171b, hiệu suất phản ứng đạt 68% và 93%. Tiếp theo, thực hiện phản ứng click của hợp chất hợp chất propargyl amit 171a, 171b với 0,8 mol đương lượng AZT trong dung môi t-BuOH, xúc tác CuI (0,2 mol đương lượng) tại nhiệt độ 70oC trong thời gian 12h nhận được hợp chất triazole-amit AZT- tritecpenoit 180a, 180b với hiệu suất 43% và 38% (Sơ đồ 3.10). Cấu trúc của các sản phẩm được chứng minh tương tự bằng các phương pháp phổ hiện đại. 18 Sơ đồ 3.10: Tổng hợp dẫn chất lai triazole-amit AZT 180a,b Tương tự, hợp chất tritecpenoit 176 được tiến hành phản ứng với propagyl amin, sau đó là phản ứng este hóa của nhóm bằng các tác nhân succinic anhydrit, glutaric anhydrit hoặc methyl glutaric anhydrit trong pyridin được các hợp chất 177a-c với hiệu suất cao 56-90%. Tiếp theo, tiến hành phản ứng tạo vòng triazole Huisgen với xúc tác Cu(I)- giữa các hợp chất alkynes 177a-c với AZT nhận được các hợp chất lai mới 181a-c với hiệu suất cao 50-60%. Hợp chất amit 172 cũng được lai hóa với AZT bằng phản ứng click được hợp chất 181d với hiệu suất 48% (Sơ đồ 3.11). Cấu trúc của sản phẩm được chứng minh bằng các phương pháp phổ hiện đại. Sơ đồ 3.11: Tổng hợp chất181a-d 19 Hợp chất tritecpenoit 164, phân lập từ Ngũ Gia Bì Acanthopanaxtrifoliatus có hoạt tính chống ung thư nên được nhiều nhà khoa học quan tâm nghiên cứu. Trong phần này luận án nghiên cứu tổng hợp các hợp chất lai với AZT qua cầu triazole amit nhằm tìm kiếm các hợp chất mới có hoạt tính sinh học lý thú. Tương tự, hợp chất 164 được thực hiện phản ứng amit hóa với propargyl amin nhận được hợp chất amit 173, tiếp theo hợp chất amit 173 tạo liên kết với AZT bằng phản ứng click nhận được hợp chất lai tritecpenoit-AZT 182 với hiệu suất cao 67% (Sơ đồ 3.12). Cấu trúc của 182 được chứng minh bằng các phương pháp phổ hiện đại. (a) propargyl amin, DCC, HOBt, DIPEA, nhiệt độ phòng , DMF, 12h; (b)0,2 mol đương lượng AZT, CuI, t-BuOH, 70oC, 12h. Sơ đồ 3.12: Tổng hợp dẫn chất lai triazole-amit AZT 182 Tương tự, dẫn chất tritecpenoit 166 là sản phẩm chuyển hóa từ betulin cũng được phản ứng với propargyl amin nhận được sản phẩm amit 174. Tiếp theo, amit 174 lai hóa với AZT nhận được hợp chất lai mới 184 với hiệu suất đạt 67%. Điều kiện và tác nhân: (a) propargyl amin, DCC, HOBt, DIPEA, t0 phòng, DMF, 12h; (b) 0,2 mol đương lượng AZT, CuI, t-BuOH, 70oC, 12h. 20 Sơ đồ 3.13: Tổng hợp dẫn chất lai triazole-amit AZT 184 Nhóm hydroxyl tại vị trí C3 của betulinic acid 2 được luận án khai thác mở rộng bằng phản ứng acyl hóa với chloroformyl este (2 mol đương lượng) trong dung môi CH2Cl2, xúc tác DMAP trong 24h nhận được các hợp chất dieste 167a-c với hiệu suất cao từ 78-81%. Sau đó, hợp chất tritecpenoit 167a-c được tạo lai hóa với AZT qua hai bước phản ứng tương tự: giai đoạn đầu tiên là amit hóa với propargyl amin trong DMF tại nhiệt độ phòng trong khoảng 12h với sự có mặt của 1,5 mol đương lượng của DCC (N,N'-dicyclohexylcarbodiimide), 1,5 mol đương lượng của HOBt (1- hydroxybenzotriazole) và 2,0 mol đương lượng của DIPEA (N,N- diisopropylethylamin) nhận được các hợp chất amit 175a-c, tiếp theo là phản ứng click của amit 175a-c với nhóm azit của AZT nhận được các hợp chất lai 185a-c với hiệu suất từ 45-64% (sơ đồ 3.14). Sơ đồ 3.14: Tổng hợp dẫn chất lai triazole-amit AZT185a-c Hợp chất tritecpenoit cuối cùng được luận án nghiên cứu tạo lai hóa với AZT qua cầu nối amit-triazole là các dẫn chất của hợp chất 176. Hợp chất 176 có nhóm OH tại vị trí C3 cũng được nghiên cứu chuyển hóa tạo acyl hóa với chloroformyl este như trên được các hợp chất dieste 168a-b. Tiếp theo là phản ứng amit hóa với propargyl amin và phản ứng click với AZT nhận được hai hợp chất lai mới tritecpenoit-AZT 186a-b với hiệu suất phản ứng đạt 38-40%. Thủy phân nhóm metyl 21 bằng LiOH trong MeOH nhận được hai hợp chất lai hóa 187a-b (sơ đồ 3.15). Cấu trúc của các hợp chất 187a-b được chứng minh bằng các phương pháp phổ. Sơ đồ 3.15: Tổng hợp dẫn chất lai triazole-amit AZT186a,b và 187a,b Như vậy, luận án đã nghiên cứu thành công quy trình tổng hợp